Beitrag zum Bösartigen Katarrhalfieber bei Wiederkäuern in zoologischen Gärten

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1 Aus dem Institut für Virologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und dem Zoologischen Garten Leipzig Beitrag zum Bösartigen Katarrhalfieber bei Wiederkäuern in zoologischen Gärten Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Talena Matzat aus Göttingen Leipzig, 2012

2 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. Uwe Truyen Betreuer: Prof. Dr. Klaus Eulenberger, Prof. Dr. Hermann Müller Gutachter: Prof. Dr. Klaus Eulenberger, Zoo Leipzig GmbH, Pfaffendorfer Straße 29, Leipzig Prof. Dr. Hermann Müller, Institut für Virologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig, An den Tierkliniken 29, Leipzig Prof. Dr. Mathias Ackermann, Universität Zürich, Virologisches Institut, Winterthurerstraße 266 a, CH-8057 Zürich Tag der Verteidigung:

3 Meiner Familie

4 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis IV VI VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht Geschichtliches Herpesviren Unterteilung der Herpesviren Die Latenz eine Besonderheit der Herpesviren Unterteilung der Gammaherpesviren Genus Macavirus Allgemeiner Aufbau der Herpesviren Aufbau und Größe der DNS von Herpesviren Aufbau der DNS von BKF-Viren Open reading frames (ORF) in der Diagnostik Übertragung von BKF-Viren Übertragung von AlHV-1 unter Gnus Übertragung von AlHV-1 auf Fehlwirte Übertragung von OvHV-2 unter Schafen Übertragung von OvHV-2 auf Fehlwirte Übertragung anderer BKF-Viren Übertragung von BKF-Viren unter Fehlwirten Vorgänge in der Wirtszelle Verhalten von BKF-Viren im Reservoirwirt Verhalten von BKF-Viren im Fehlwirt Anfälligkeit für klinisches BKF bei Fehlwirten Symptome Klinik Kopf-Augen Form Perakute Form Intestinale Form Abortive Form Hautform Leichtere Formen Pathologisch-anatomische Befunde Histopathologische Befunde 17 I

5 2.5 Differentialdiagnosen Nachweis von BKF Gesamtdiagnose Polymerasekettenreaktion Prinzip Nested und semi-nested PCR Consensus PCR Realtime-PCR nach CUNHA et al. (2009) Probenmaterial für die PCR Weiterverarbeitung der PCR-Produkte CI-ELISA In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie Tierversuche Blutbild Therapie Prophylaxe 23 3 Tiere, Material und Methoden Tiere Material Geräte Verbrauchsmaterial Vorgefertigte Systeme (Kits) Software Reagenzien und Herstellung der Gebrauchslösungen Reagenzien Medium für die Probenlagerung Mastermix für die Realtime PCR (Rt-PCR) Mastermix für die cpcr Primer und Sonden Molekulargewichtsmarker λhaeiii Positivkontrollen OvHV AlHV Methoden Probenentnahme DNS-Isolierung Spektrophotometrie zur Bestimmung des DNS-Gehalts 41 II

6 3.3.4 Rt-PCR Protokoll nach CUNHA et al. (2009) cpcr Protokoll nach ROVNAK et al. (1998) Agarosegel-Elektrophorese Aufreinigung der PCR Produkte und Sequenzierung 42 4 Ergebnisse Vorversuche Positivkontrollen Ergebnisse der Probenuntersuchungen Ergebnisse der Rt-PCR Ergebnisse der cpcr Messung des Gesamt-DNS-Gehalts bei positiven Proben Ergebnisse der Sequenzierung Zusätzliche Untersuchungen und Ergebnisse Anzahl der Tiere Unterteilung der Proben Altersverteilung der beprobten Tiere Zusammenfassung der Ergebnisse Nachweis von AlHV Nachweis von OvHV Nachweis von CpHV Nachweis von MCFV-WTD 68 5 Diskussion Methodik der Probenuntersuchung Ergebnisse der Probenuntersuchung Schlussbetrachtung 74 6 Zusammenfassung 76 7 Summary 78 8 Literaturverzeichnis 80 9 Anhang Danksagung 98 III

7 Abkürzungsverzeichnis A a AlHV ASS BHQ BHV BKF BLAST CpHV ds-dns EDTA C CD CI-ELISA cpcr Ct Adenin Jahre Alcelaphines Herpesvirus Acetyl-Salicylsäure Blackhole quencher Bovines Herpesvirus Bösartiges Katarrhalfieber Basic local alignment search tool Caprines Herpesvirus Doppelstrang-Desoxyribonukleinsäure Ethylendiamintetraessigsäure Cytosin Cluster of differentiation Competitive inhibitory enzyme linked immunosorbent assay Consenus PCR Cycle of treshold CY5 TM Cyanin 5 d Tage et al. et alii f. Forma FAM TM 6-FAM-phosphoramidit G Guanin H Heavy HEX TM 5-Hexachloro-Fluorescein HiHV Hippotragines Herpesvirus HV Herpesvirus IE Internationale Einheiten ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IHC Immunhistochemie ISH In-situ-Hybridisierung Kbp Kilobasenpaare L Light Ln., Lnn. Lymphknoten LUA Landesuntersuchungsanstalt MCF Malignant catarrhal fever MCFV Malignant catarrhal fever virus MHC Major histocompatibility complex MKS Maul- und Klauenseuche n Anzahl NCBI National Center for Biotechnology Information neg. npcr Negativ Nested PCR IV

8 Nr. Nummer ORF Open reading frame OvHV-2 Ovines Herpesvirus 2 PCR Polymerase chain reaction pos. Positiv RNA Ribonukleinsäure Rt-PCR Realtime PCR snpcr Semi-nested PCR sp Subspezies SpHV Springbock-Herpesvirus SuHV Suides Herpesvirus T Thymin TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer Tr Texas Red TM WTD White-tailed deer ZNS Zentrales Nervensystem V

9 Abbildungsverzeichnis Abbildung Titel Seite 1 Weltweite Verbreitung von BKF 1 2 Herpesvirion, Skizze 6 3 Herpesviren, Elektronenmikroskop 6 4 Mitteleuropa, Herkunft der Tiere 25 5 OvHV-2 und partielles DNS-Polymerasegen mit Angabe der Nukleotidpositionen 36 der Primer- und Sondenbindungsstellen 6 AlHV-1 und partielles DNS-Polymerasegen mit Angabe der Nukleotidpositionen 36 der Primer- und Sondenbindungsstellen 7 CpHV-2 und partielles DNS-Polymerasegen mit Angabe der Nukleotidpositionen 37 der Primer- und Sondenbindungsstellen 8 MCFV-WTD und partielles DNS-Polymerasegen mit Angabe der Nukleotidpositionen 37 bekannter Primerbindungsstellen der cpcr 9 Molekulargewichtsmarker λhaeiii Positivkontrollen B1, B2, B3, B4 in der Rt-PCR Standardkurve Positivkontrollen B1, B2, B3, B4 in der Rt-PCR Positivkontrollen J1, J2, J3, J4 in der Rt-PCR Standardkurve Positivkontrollen J1, J2, J3, J4 in der Rt-PCR Gelelektrophoresebilder der Positivkontrollen B0-B4, G1 und J 2-4 cpcr Proben 17N, 22N, 23N, 26N, 29N Rt-PCR und cpcr Proben 126N, 127A, 127N, 127R, 129A, 129N Rt-PCR und cpcr Proben 132N, 136N, 242N Rt-PCR und cpcr Proben 243N, 245N, 248N, 261N, 264A, 265A, 265N Rt-PCR und cpcr Proben 266N, 267N, 268R, 270N, 270R, 272N Rt-PCR und cpcr Probe 17N verglichen mit GenBanknummer AF MCFV-WTD Probe 26N verglichen mit GenBanknummer AF MCFV-WTD Probe 243N verglichen mit GenBanknummer AF CpHV Probe 265N verglichen mit GenBanknummer EU Probe 266N verglichen mit GenBanknummer EU Probe 267N verglichen mit GenBanknummer EU Probe 270R verglichen mit GenBanknummer EU VI

10 27 Probe 272N verglichen mit GenBanknummer EU Gesamtübersicht über Anzahl und Prozentsatz positiver und negativer Tiere Gesamtübersicht über Anzahl und Prozentsatz positiver und negativer Proben 30 Aufteilung positiver Proben Positive Proben Altersverteilung der beprobten Tiere VII

11 Tabellenverzeichnis Tabelle Titel Seite 1 BKF-Viren 93 2 Tierarten, die Reservoirwirte für BKF-Viren sind bzw. die Antikörper gegen BKF-Viren ohne Symptomatik aufwiesen; Tierarten, bei denen BKF symptomatisch auftrat 3 Art, Anzahl und Alter der untersuchten Tiere 26 4 Primer- und Sondensequenzen für die Rt-PCR und cpcr 34 5 Probenanzahl und Aufteilung 40 6 Vergleich Sensitivität cpcr und Rt-PCR der Proben A bis J 43 7 Liste der positiven Proben in der Rt-PCR 48 8 Tiere und Probennummer der positiven Proben in der Rt-PCR und cpcr 54 9 Vergleich der Ergebnisse der Rt-PCR und der Sequenzierung von positiven Proben 10 Übersicht über die Ergebnisse aus Rt-PCR, cpcr und Sequenzierung Ergebnisse zusätzlicher Untersuchungen Art, Anzahl und Alter aller beprobten Tiere sowie Art, Anzahl und Alter der positiven Tiere 64 VIII

12 Literaturübersicht 1 Einleitung Bösartiges Katarrhalfieber (BKF) ist eine Viruskrankheit, die weltweit bei verschiedenen Arten der Ordnung Artiodactyla auftreten kann und meist tödlich verläuft. Die Morbidität ist im Allgemeinen gering. Dennoch kann es zu Epidemien kommen, die schwere ökonomische Verluste, beispielsweise auf Farmen und in zoologischen Gärten, nach sich ziehen. Die Symptomatik der Krankheit ist sehr vielfältig und wird pathophysiologisch durch Lymphoproliferation und Vaskulitis bedingt. Auslöser von BKF sind eng verwandte BKF-Viren aus der Familie der Gammaherpesviren. Zu den latenten Trägern und auch zu Überträgern der Viren zählen Wiederkäuer verschiedener Arten, wie zum Beispiel Gnus, Schafe und Ziegen. Unter ihnen scheinen Jungtiere, aber auch immunschwache Adulte, maßgeblich an der Verbreitung beteiligt zu sein, wobei die Übertragungswege nur teilweise bekannt sind. Die Abbildung 1 zeigt die weltweite Verbreitung von BKF. Abbildung 1: Weltweite Verbreitung von BKF Länder, in denen von BKF berichtet wurde, sind schwarz markiert. ALBINI et al. 2003, BARNARD et al. 1994, BRENNER et al. 2002, CLARK et al. 1970, COLLERY u. FOLEY 1996, CRAWFORD et al. 2002, DECARO et al. 2003, DRIEMEIER et al. 2002, FRITZ et al. 1992, FRÖLICH et al. 1998, GULLAND et al. 1989, HÄNICHEN et al. 1998, HATKIN 1980, KALUNDA et al. 1981, KIUPEL et al. 2004, LI et al. 2006, LØKEN et al. 1998, MACKINTOSH 1992, MÜLLER-DOBLIES et al. 2001, SYRJÄLÄ et al. 2006, WANI et al. 2006, WIYONO et al. 1994, ZARNKE et al Problemstellung der hier vorliegenden Arbeit: Bei Wildtieren und in zoologischen Gärten im deutschsprachigen Raum traten immer wieder Fälle von BKF auf, bei denen der Reservoirwirt nicht ermittelt werden konnte, wie beispielsweise bei einer Giraffe eines deutschen Zoos. Da dieser Zoo weder Gnus noch Schafe in unmittelbarer Umgebung der Giraffen hält, lag die Vermutung nahe, dass eventuell noch andere Wiederkäuer als bisher unerkannte latente Träger von BKF-Viren in Frage kommen, da beispielsweise bei gesunden Säbelantilopen und Kuhantilopen BKF-Viren nachgewiesen wurden (siehe Tabelle 1). Untersuchungen von FLACH et al. (2002) erhärten diesen Verdacht, da sie nachwiesen, dass verschie- 1

13 Literaturübersicht dene Wiederkäuerarten Gammaherpesviren asymptomatisch beherbergen. Unklar ist allerdings, ob und unter welchen Bedingungen diese Wirte (Tabelle 1) BKF-Viren ausscheiden und so andere Wiederkäuer gefährden. Die hier vorliegende epidemiologische Studie sollte untersuchen, inwiefern unterschiedliche Wiederkäuer in verschiedenen Zoos und Wildparks Träger und Ausscheider der momentan wichtigsten BKF-Viren sind. Dazu wurden von neugeborenen und adulten Wiederkäuern, die im Rahmen der Jungtierprophylaxe bzw. anderer notwendiger Behandlungen gefangen wurden, Tupferproben von Nasen-, Augen und Analschleimhaut genommen und mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) auf Alcelaphines Herpesvirus 1 (AlHV-1), Ovines Herpesvirus 2 (OvHV-2), Caprines Herpesvirus 2 (CpHV-2) und Malignant catarrhal fever virus White tailed deer (MCFV-WTD) untersucht. 2

14 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Geschichtliches BKF war in Deutschland früher als so genannte Kopfkrankheit des Rindes bekannt (MOEBIUS 1887). GÖTZE et al. (1930) erkannten erstmals einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von BKF bei Rindern und gesunden Schafen (Ovis sp.), die scheinbar verantwortlich für das Auftreten der Krankheit waren. Im Gegensatz dazu entdeckte 1904 ein afrikanischer Viehzüchter den Zusammenhang zwischen dem Auftreten von BKF bei Rindern (Bos sp.), die engen Kontakt zu Gnus hatten, da sie Ammen für Kälber von Weißschwanzgnus (Connochaetes gnou) waren (BARNARD et al. 1994). Weitere frühe Berichte über BKF stammen aus Südafrika (DU TOIT und ALEXANDER 1938; DE KOCK und NEITZ 1950), Kenia (DAUBNEY und HUDSON 1936) und der Schweiz (WYSSMANN 1934). 2.2 Herpesviren Unterteilung der Herpesviren Die Familie der Herpesviridae gehört mit den Familien Alloherpesviridae und Malacoherpesviridae zur Ordnung der Herpesvirales. Nach dem Internationalen Komitee für die Taxonomie von Viren (ICTV) werden die Herpesviridae aufgrund ihrer biologischen Eigenschaften in die Unterfamilien Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae und Gammaherpesvirinae unterteilt: Alphaherpesviren haben breite Wirtsspektren, kurze Replikationszyklen, vermehren sich schnell in vitro, zerstören ihre Wirtszelle sehr effizient und können in Ganglienzellen persistieren (ROIZMAN et al. 1981). Betaherpesviren haben im Gegensatz zu den Alphaherpesviren enge Wirtsspektren, einen langsamen Replikationszyklus, breiten sich in Zellkultur nur langsam aus und führen bei infizierten Zellen regelmäßig zu Zytomegalie. Viren dieser Familie persistieren in Zellen lymphoretikulärer Organe und möglicherweise auch in Zellen von Speicheldrüsen, Nieren und anderen Geweben (ROIZMAN et al. 1981). Gammaherpesviren lassen sich häufig mit einer bestimmten Tierfamilie oder art, die die Viren latent beherbergen, assoziieren (ROIZMAN et al. 1981). Darüber hinaus können sie Tiere anderer Arten infizieren und bei diesen schwere klinische Reaktionen hervorrufen (so genannte Fehlwirte) (ACKERMANN 2006). Gammaherpesviren haben unterschiedlich lange Replikationszyklen und lassen sich schwer oder gar nicht auf Zellkultur anzüchten. Daher stellen genaue Studien dieser Unterfamilie eine große Herausforderung dar (ACKERMANN 2006). Einige Gammaherpesviren replizieren in vitro in Lymphozyten, manche auch in Epithelzellen oder Fibroblasten (ROIZMAN et al. 1981). 3

15 Literaturübersicht Die Latenz eine Besonderheit der Herpesviren Während Alpha- und Betaherpesviren dazu tendieren sich zu replizieren, sobald sie eine Zelle infiziert haben und nur ein Teil der Viren ins latente Stadium übergeht, gehen Gammaherpesviren häufig erst in die latente Phase über (ACKERMANN 2006). Latente Infektionen durch Gammaherpesviren wurden in vivo in B- und T- Lymphozyten sowie in Monozyten nachgewiesen (ROIZMAN et al. 1981; ACKERMANN 2006). Durch den Übergang in das latente Stadium können sich die Viren der Reaktion des Immunsystems entziehen. Außerdem werden während der Latenz bestimmte Proteine produziert, mit denen das Virus die Immunreaktion der Wirtes manipuliert (FIELD et al. 2003). Während der Latenz liegt das Genom zirkulär, in der Replikationsphase hingegen linear vor (PFOFFENBERGER et al. 1985). OEHMIG (2004) hat festgestellt, dass sich Gammaherpesviren im Wirt seltener in der lytischen als in der latenten Phase befinden, und dass eine symptomatische Erkrankung eher durch Viren im lytischen Stadium zu befürchten ist. Auf die Latenzzeit folgt eine Phase der Virusvermehrung, die mit der Freisetzung der Viren endet. Diese Phase geht unweigerlich mit der Zerstörung der Wirtszelle einher (ROIZMAN et al. 1992; ACKERMANN 2006). Dies scheint aber nicht nur für das Auftreten von klinischen Symptomen beim Fehlwirt verantwortlich zu sein. Vielmehr scheint die Modulation des Immunsystems durch das Virus eine bedeutende Rolle in der Entwicklung der Symptomatik zu spielen (MC CORMICK und GANEM 2005) Unterteilung der Gammaherpesviren Durch den Vergleich der Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, der Genomstruktur sowie der immunologischen Reaktion auf bestimmte Virusoberflächenantigene können die Gammaherpesviren weiter in verschiedene Genera unterteilt werden (ROIZMAN et al. 1992). Zu den Gammaherpesviren gehören die Genera Lymphocryptovirus, Rhadinovirus, Macavirus, Percavirus sowie noch nicht eindeutig zugeordnete Gammaherpesviren (ICTV 2009). Zum Genus Macavirus gehören die meisten BKF-Viren. Li et al. (2005a) untersuchten die Desoxyribonukleinsäure (DNS) von verschiedenen Gammaherpesviren im offenen Leserahmen (ORF) 9 bzw. die mitochondriale DNS der zugehörigen Reservoirwirte auf Parallelen. Dabei stellte sich heraus, dass die Verwandtschaftsgrade unter den Gammaherpesviren weitgehend mit denen ihrer Reservoirwirte übereinstimmen. Vermutlich mussten die Viren sich während der Evolution stets an Veränderungen ihrer Reservoir-Wirte anpassen und sich zeitgleich mit diesen weiterentwickeln. So bekamen Virus und Wirt die Möglichkeit, sich aneinander anzupassen. Aus dieser Anpassung resultiert womöglich, dass heute fast jede Tierart ihr eigenes Herpesvirus beherbergt ohne zu erkranken. Infiziert sich ein artfremdes Tier mit dem Herpesvirus einer anderen Tierart, hat das meist fatale Folgen für diesen Fehlwirt (CRAWFORD et al. 2002). Es ist noch wenig darüber bekannt, welche Tierarten Reservoirwirte für Herpesviren darstellen (HÄNICHEN et al. 1998). 4

16 Literaturübersicht Genus Macavirus Zum Genus Macavirus gehören laut ICTV (2009) folgende Virusarten: Alcelaphines Herpesvirus 1 und 2 (AlHV-1,2), Bovines Herpesvirus 6 (BHV-6), Caprines Herpesvirus 2 (CpHV-2), Hippotragines Herpesvirus 1 (HiHV-1), Ovines Herpesvirus 2 (OvHV-2) und Suides Herpesvirus 3, 4 und 5 (SuHV-3, 4, 5). Aus diesem Genus sind folgende Viren für bestimmte Tierarten (siehe Tabelle 2 im Anhang) pathogen und es gibt Berichte über natürliche Infektionen, die BKF auslösten: OvHV-2, AlHV-1 und CpHV-2 (LI et al. 1999b; PLOWRIGHT 1960; KEEL et al. 2003). Im Gegensatz dazu ist für HiHV-1 und ein OvHV-2-ähnliches Virus von Säbelantilopen bisher nur bekannt, dass sie im Tierversuch bei Kaninchen BKF auslösten (SCHOCK und REID 1995; FLACH et al. 2002). Von natürlichen Infektionen durch diese Viren gibt es bisher keine Fallberichte. Weitere Gammaherpesviren, die BKF auslösen (Tabelle 1), konnten bisher nicht eindeutig einem Genus zugeordnet werden. Dazu gehört u.a. ein AlHV-2 ähnliches Virus und das MCFV-WTD, das bei einem Rothirsch (KLIEFORTH et al. 2002) bzw. bei Weißwedelhirschen (LI et al. 2000) zu BKF führte. Die Tabelle 1 im Anhang liefert einen Überblick über die bisher bekannten BKF-Viren. Hier ist angegeben, um welches Virus es sich handelt, welches der Reservoirwirt ist und ob eine Pathogenität für andere Tierarten bekannt ist. Außerdem ist angegeben, in wieweit die Viren untereinander verwandt sind, basierend auf der Homologie des hochkonservierten DNS-Polymerase- Gens (siehe Punkt ) im ORF 9. Auch sind Viren aufgeführt, von denen bisher nicht bekannt ist, ob sie BKF auslösen, obwohl diese aufgrund ihrer deutlichen Homologie im ORF 9 zu anderen BKF-Viren sowie dem Vorhandensein der Epitop 15 A (siehe Punkt 2.2.4) auf der Virushülle zu den BKF-Viren zählen. In Tabelle 2 im Anhang sind Tierarten aufgelistet, von denen bekannt ist, dass sie latente Träger eines BKF-Virus sind oder bei denen BKF symptomatisch auftrat. Außerdem sind Tiere aufgelistet, die Träger von Gammaherpesviren sind, die eng mit den BKF-Viren verwandt sind und vermutlich zu den BKF-Viren gehören (FLACH et al. 2002). Diese Gammaherpesviren sind noch nicht endgültig taxonomisch zugeordnet. Der Virusnachweis erfolgte mittels PCR. War dies nicht möglich, wurde anhand der Gegebenheiten auf den wahrscheinlichen Erreger rückgeschlossen: z. B. AlHV-1 bei Anwesenheit von Gnus, OvHV-2 bei Anwesenheit von Schafen. Die Diagnose der Krankheit wurde anhand der histopathologischen Befunde bestätigt Allgemeiner Aufbau der Herpesviren Die Zuordnung eines Virus zur Familie Herpesviridae basiert auf der Architektur der Virions, die sich bei allen Herpesviren gleicht. Das Virion besteht aus mehreren Einheiten: 1. einer linearen ds-dns mit Kilobasenpaaren (Kbp), die auf einen bikonkaven Innenkörper (engl. Core) aufgewickelt ist (FURLONG et al. 1972). 1 siehe Histopathologische Befunde 5

17 Literaturübersicht 2. einem ikosaedrischen Kapsid aus 162 Polypeptidketten, an dem die DNS durch Fibrillen fixiert ist. Die Polypeptidketten des Kapsids werden im Nukleus der Wirtszelle gebildet und finden sich hier zum Kapsid zusammen (MC COMBS et al. 1971; ROIZMAN 1992). 3. dem Tegument, welches aus globulären Proteinen besteht und das Kapsid umgibt (ROIZMAN und FURLONG 1974). Sowohl die Dicke des Teguments als auch der Zustand der Hülle (s. 4.) bestimmen letztendlich die Gesamtgröße des Virions, welche 120 bis 300 nm betragen kann (ROIZMAN und FURLONG 1974). Dabei erscheint ein Virion mit beschädigter Hülle im Elektronenmikroskop größer als ein Virion mit intakter Hülle (ROIZMAN 1992). 4. einer lipidhaltigen Hülle, die das Virion umschließt. Sie entsteht durch das sogenannte Budding an der Kernmembran, ein Vorgang bei dem sich das Kapsid an die Kernmembran anlagert, diese nach außen stülpt und schließlich ganz von ihr umhüllt wird. Durch Abschnürung wird das vollständige Viruspartikel frei. Die Hülle ist mit viralen Glykoproteinpeplomeren besetzt und ruft die Immunreaktion des Wirtes hervor (FALKE et al. 1959; STANNARD et al. 1987). Eines dieser Glykoproteine, das Epitop 15A, ist bei BKF-Viren hochkonserviert. Von Plasmazellen gebildete Antikörper richten sich bei der Immunreaktion des Wirtes gegen dieses Glykoprotein (LI et al. 1994). Die folgenden Abbildungen zeigen eine schematische Darstellung eines Herpesvirus (Abbildung 2), sowie ein Bild von Herpesviren unter dem Elektronenmikroskop (Abbildung 3). Abbildung 2: Herpesvirion, Skizze (BUTLER 2005) Abbildung 3: Herpesviren, Elektronenmikroskop (FENNER 2009) Aufbau und Größe der DNS von Herpesviren Die Länge des viralen Genoms ist abhängig von der Art des Herpesvirus und kann 124 bis 235 Kbp betragen. Die Anzahl der Basenpaare kann innerhalb einer Virusart in bis zu 10 Kbp variieren (ROIZMAN et al. 1992). Die ds-dns lässt sich in einen Abschnitt mit niedrigem G-C-Gehalt, L (light) -DNS, und mehrere repetitive Abschnitte mit hohem G-C-Gehalt, H (heavy) -DNS, einteilen. 6

18 Literaturübersicht Der Abschnitt mit niedrigem G-C-Gehalt kodiert für über einhundert Proteine, die durch sich zum Teil überlappende offene Leserahmen exprimiert werden (WAGNER 1999). Die repetitiven Sequenzen im Abschnitt mit hohem G-C-Gehalt sind für die Verpackung des Genoms notwendig (STAMMINGER et al. 1987). Sie können auf sechs verschiedene Weisen angeordnet sein und sich am Ende des DNS-Stranges befinden oder den kodierenden Abschnitt mit niedrigem G-C-Gehalt unterbrechen (ROIZMAN et al. 1992) Aufbau der DNS von BKF-Viren Die DNS ist nur bei wenigen Herpesviren vollständig sequenziert, unter den BKF-Viren bisher nur die DNS des AlHV-1 und des OvHV-2 (ENNSER et al. 1997; HART et al. 2007). Beim CpHV-2 und MCFV-WTD konnten bisher nur Abschnitte der viralen DNS veröffentlicht werden. Dabei handelt es sich um die Gene für das Glykoprotein B (LI et al. 2003b) und die DNS-Polymerase (LI et al. 2001b, KLEIBOEKER et al. 2002) vom CpHV-2 und MCFV-WTD sowie dem Gen für ein Packaging Protein (MCFV-WTD, KLEIBOEKER et al. 2002) bzw. für eine Terminase (CpHV-2, CHMIELEWICZ et al. 2001). Das Genom vom AlHV-1 weist 70 ORF auf, von denen 61 signifikante Ähnlichkeiten mit anderen Herpesviren haben. Die anderen neun ORF sind spezifisch für AlHV-1. Diese spezifischen ORF sind vermutlich für die spezielle Symptomatik von BKF im Vergleich zu anderen, ebenfalls von Herpesviren ausgelösten Krankheiten verantwortlich (COULTER et al. 2001). Das Genom von OvHV-2 enthält 73 ORF, von denen 62 Homologien mit den ORF anderer Herpesviren und neun ORF Homologien mit den ORF vom AlHV-1 aufzeigen. Drei spezifische ORF kommen nur beim OvHV-2 vor (HART et al. 2007). Bei einigen ORF von AlHV-1 und OvHV-2 konnte ebenfalls ermittelt werden, für welche Proteine sie kodieren (ENSSER et al. 1997). Hierbei handelt es sich um für das Virus wichtige Strukturproteine und Enzyme z. B. DNS-Polymerase, Helikase, Primase, Origin-binding-Protein welche für die Nukleinsäuresynthese, den DNS-Metabolismus, die Vermehrung und Verbreitung des Virus gebraucht werden. Interessanterweise bildet jedes Herpesvirus eine für sich spezifische Protease und eine variable Anzahl an Proteinkinasen (ROIZMAN et al. 1992), so auch AlHV-1 und OvHV-2 (ENSSER et al. 1997) ORF in der Diagnostik Einige ORF sind evolutionär bei allen Herpesviren hochkonserviert und können mittels Polymerasekettenreaktion nachgewiesen zu werden. Für den Nachweis von viraler DNS in mit BKF-Viren infiziertem Gewebe eignen sich unter anderem: - ORF 75, welcher für ein Tegumentprotein kodiert (BAXTER et al. 1993; CHMIELEWICZ et al. 2001) und - ORF 8, welcher für das Glykoprotein b auf der Virushülle kodiert (DUNOWSKA et al. 2001). 7

19 Literaturübersicht Momentan ist allerdings der ORF 9 für die Diagnostik von BKF von größter Bedeutung. Der ORF 9 kodiert für die DNS-Polymerase (ENNSER et al. 1997; VAN DEVANTER et al. 1996; ROVNAK et al. 1998) und wurde bereits bei vielen verschiedenen Herpesviren sequenziert und in der internationalen Datenbank GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) erfasst. VAN DEVANTER et al. (1996) entwickelten eine Consensus PCR (cpcr), die auf der Erkennung und Vervielfältigung des DNS-Polymerase-Gens im OFR 9 basiert. Durch diese cpcr lassen sich bis dato unbekannte Herpesviren identifizieren. Diese können anschließend sequenziert und einer der drei Herpesvirenfamilien zugeordnet werden. Für die endgültige phylogenetische Einteilung der Viren in Form eines Stammbaums sind diese Methoden jedoch noch zu ungenau, da jeweils nur ein kleiner Teil der viralen DNS nachgewiesen wird (MC GEOCH und COOK 1994). 2.3 Übertragung von BKF-Viren Über die genauen Übertragungswege der BKF-Viren ist noch wenig bekannt. Sie wurden bisher beim AlHV-1, OvHV-2 und CpHV-2 genauer untersucht, wenngleich die Informationen keinesfalls vollständig genug sind, um ein komplettes Bild von den möglichen Übertragungswegen zu erhalten. Die Tabellen 1 und 2 liefern zwar einen Überblick über weitere bisher bekannte BKF-Viren und deren Reservoirwirte, ob und unter welchen Bedingungen diese Reservoirwirte aber Virus ausscheiden und somit empfängliche Tierarten gefährden, ist noch nicht bekannt. Unterschiedliche Inkubationszeiten erschweren die Erforschung der Übertragungswege. Es kann vorkommen, dass ein Fehlwirt an BKF erkrankt, die Infektion aber so weit zurückliegt, dass weder der Reservoirwirt noch der Übertragungsweg eindeutig identifiziert werden können (MÜLLER-DOBLIES et al. 1998) Übertragung von AlHV-1 unter Gnus Gnukälber (Connochaetes sp.) können bereits intrauterin im Zuge der peripartalen Immunsuppression des Muttertieres infiziert werden (PLOWRIGHT 1965a, 1965b; CASTRO et al. 1984). Nach der Geburt erfolgt die Infektion horizontal durch Nasen- und Augensekrete anderer, meist unter vier Monate alter Kälber. Dies wurde durch den Nachweis von AlHV-1 mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) in Lungenalveolen bei Kälbern von Streifengnus (Connochaetes taurinus) (MICHEL et al. 1993) sowie in Nasen- und Augensekret von gesunden Gnukälbern (MUSHI et al. 1980a, 1980b) untermauert. In Speichel und Urin von Gnukälbern konnte hingegen kein AlHV-1 nachgewiesen werden (MUSHI et al. 1980a). Bei über vier Monate alten Kälbern sinkt die Anzahl der zellfreien Viren im Sekret und steigt später nur noch bei Gnus, die hochgradig durch Gravidität, hohe Temperaturen oder Gefangenschaft gestresst sind (PLOWRIGHT 1986; RWEYEMAMU et al. 1974). Die auffallende Saisonalität von gnuassoziierten BKF Fällen ist wahrscheinlich durch die Kalbesaison der Gnus bedingt (BARNARD et al. 1989). 8

20 Literaturübersicht Übertragung von AlHV-1 auf Fehlwirte Mit dem aus einem Gnu isolierten Virus ist es gelungen, experimentell per Aerosol Rinder zu infizieren. Eine horizontale Übertragung des Virus von diesen Rindern auf weitere Artgenossen fand aber nicht statt, obwohl im Nasensekret und im Speichel der Rinder virale DNS nachgewiesen wurde. Die Vermutung liegt daher nahe, dass Fehlwirte ungenügend zellfreies Virus ausscheiden, oder dass das ausgeschiedene Virus nicht stabil genug ist, um Artgenossen zu infizieren (KALUNDA et al. 1981a). Dagegen ist die Übertragung von AlHV-1 von Rind zu Rind mit infiziertem Blut oder Gewebe experimentell gelungen, natürlicherweise findet die Übertragung von Rind zu Rind über den Blutweg aber nicht oder extrem selten und dann transplazentar statt (PLOWRIGHT 1972). Da auch über eine Übertragung von AlHV-1 von Gnus auf Rinder über eine größere Entfernung berichtet wurde, kann man die Übertragung durch Vektoren nicht ausschließen (BARNARD 1984). Für BKF empfängliche Wildwiederkäuer in zoologischen Gärten erkrankten ebenfalls durch AlHV-1 an BKF 2. Meist handelte es sich hierbei um Zootiere, die in der Nähe von Gnus gehalten wurden. Allerdings wurde bisher nicht von BKF Fällen bei empfänglichen Wildwiederkäuern in der Wildbahn berichtet (BARNARD et al. 1994) Übertragung von OvHV-2 unter Schafen OvHV-2 wird unter Schafen hauptsächlich respiratorisch und sexuell übertragen (ACKERMANN 2005; HÜSSY et al. 2002; LI et al. 2001a). Große Mengen viraler DNS wurden außerdem im Dünndarm von latent infizierten Schafen gefunden (HÜSSY et al. 2002). Eine Infektion über die Fäzes kann somit nicht ausgeschlossen werden, obwohl OvHV-2 bisher nicht in Kotproben nachgewiesen wurde. Ein Bericht über durch OvHV-2 erkrankte Rentiere festigt diese These. Diese Rentiere hielten sich nachts in einem Gehege auf, zu dem tagsüber Lämmer Zugang hatten. Es bestand kein direkter Kontakt zwischen den beiden Tierarten, dennoch wurden die Rentiere infiziert, möglicherweise durch den Kot der Lämmer (KIUPEL et al. 2004). Lämmer scheinen ohnehin eine übergeordnete Rolle bei der Verbreitung von OvHV-2 zu spielen. Im Alter von sechs bis neun Monaten erreicht die Virusausscheidung über das Nasensekret ihren Höhepunkt (LI et al. 2004). Die Ausscheidung erfolgt phasenweise. Eine Phase dauert weniger als 24 Stunden. In dieser Zeit lassen sich ein signifikanter Anstieg und ein darauf folgender Abfall der Virusmenge im Nasensekret nachweisen. Lämmer durchlaufen innerhalb von drei Monaten mindestens eine Ausscheidungsphase, adulte Schafe scheiden weniger häufig OvHV-2 aus (LI et al. 2004). Die intermittierende Virusausscheidung ist eine mögliche Erklärung für das sporadische Auftreten von BKF mit unterschiedlichen Inkubationszeiten innerhalb einer Herde von Fehlwirten (LI et al. 2001a). Auch im Augensekret von Schafen wurde OvHV-2 nachgewiesen. Ein deutlicher Anstieg und Abfall der Virusmenge während einer Ausscheidungsphase bestand aber nicht (LI et al. 2004). Noch bevor virale DNS im Nasen- und auch im Augensekret nachweisbar ist, kann sie mittels PCR in Leukozyten nachgewiesen werden (HÜSSY et al. 2002). Die Zeit zwischen der Infektion und 2 siehe Tabelle 2, Anhang 9

21 Literaturübersicht dem ersten Auftreten von viraler DNS im Blut scheint direkt von der Infektionsdosis, der die Tiere ausgesetzt waren, abhängig zu sein (TAUS et al. 2005). Die Infektion über infizierte Muttermilch oder Kolostrum wie auch die diaplazentare sind theoretisch möglich, allerdings konnten in entsprechenden Proben keine signifikanten Mengen an infektiösem Virus nachgewiesen werden. Diese Übertragungswege spielen daher eine untergeordnete Rolle (LI et al. 2004; HÜSSY et al. 2002). Schafe jeden Alters können sich bei ihren Artgenossen infizieren und das Virus horizontal durch Kontakt oder Aerosol verbreiten. Die Infektion findet jedoch selten vor dem zweiten bis dritten Lebensmonat statt (LI et al. 1999a; WANI et al. 2006) Übertragung von OvHV-2 auf Fehlwirte Fehlwirte, darunter viele Wildwiederkäuer, werden wahrscheinlich ebenfalls durch das Nasensekret von Virus ausscheidenden Schafen infiziert (HÜSSY et al. 2002; LI et al. 2006a; ALBINI et al. 2003), wobei sowohl das Alter als auch die Anzahl der infizierten Schafe einen Einfluss auf den Infektionsdruck der empfänglichen Tiere haben (LI et al. 2006a). Da BKF auch ohne Kontakt zu Schafen bei empfänglichen Spezies auftrat, wird über einen indirekten Übertragungsweg, womöglich durch Vektoren, spekuliert (BARNARD et al. 1989). Auch die Übertragung von OvHV-2 via Aerosol über große Distanzen von bis zu fünf Kilometern hinweg wird für möglich gehalten (IMAI et al. 2001; LI et al. 2006a; LI et al. 2008). Weiteren Einfluss könnten mechanische Übertragungswege wie Fahrzeuge, außerdem gemeinsame Wasserquellen und klimatische Bedingungen haben (LI et al. 2006a). Zur Saisonalität gibt es keine aussagekräftigen Beobachtungen. Es existieren Berichte über gehäuftes Auftreten von BKF im Sommer und Herbst, einige Monate nach der Ablammzeit von Schafen (CRAWFORD et al. 1999), im Frühjahr (MÜLLER-DOBLIES et al. 2001a) sowie ganzjährig (LI et al. 2001a) Übertragung anderer BKF-Viren CpHV-2 wird wahrscheinlich hauptsächlich durch Nasensekrete auf andere Ziegen und Fehlwirte übertragen. Hierbei besteht ein Zusammenhang zwischen dem Alter der Ziegen und der Inkubationszeit. Einen Hinweis darauf gibt die Nachweisbarkeit viraler DNS im Blut: Bei adulten Ziegen ist das Virus schon 14 Wochen post infectionem im Blut nachweisbar, bei Jungtieren erst nach 40 Wochen. Unklar ist jedoch, ob dies ausschließlich mit dem Alter der Tiere zusammenhängt, oder ob die Infektionsdosen, denen die Tiere ausgesetzt waren, unterschiedlich hoch waren. Ein weiterer Grund für die unterschiedlichen Inkubationszeiten könnte sein, dass bei Jungtieren eventuell maternale Antikörper vorhanden waren, die zu einer verlängerten Inkubationszeit führten. Eine transplazentare Übertragung bei Ziegen konnte bisher nicht nachgewiesen werden (LI et al. 2005b). Das CpHV-2 hat bisher bei Sika- und Weißwedelhirschen zu BKF geführt (CRAWFORD et al. 2002; KEEL et al. 2003; LI et al. 2003b). Das bei Jackson Kuhantilopen nachgewiesene AlHV-2-ähnliche Virus wird höchstwahrscheinlich ebenfalls über Nasensekret verbreitet (KLIEFORTH et al. 2002). 10

22 Literaturübersicht Wie beim AlHV-1 und OvHV-2 könnten auch bei anderen BKF-Viren mechanische Übertragungswege eine Rolle spielen (LI et al. 2006a) Übertragung von BKF-Viren unter Fehlwirten Fehlwirte können BKF-Viren wahrscheinlich nicht weiterverbreiten (ACKERMANN 2006; REID et al. 1986; FRÖLICH et al. 1998; LI et al. 2006a). Rinder und auch Sitatungas, welche sich von der Krankheit erholten, blieben zwar persistent mit OvHV-2 infiziert, weitere Fälle bei Herdenmitgliedern traten aber nicht auf (BAXTER et al. 1993; O TOOLE et al. 1997; FLACH et al. 2002). Das liegt laut KLEIBOEKER et al. (2002) vermutlich daran, dass Fehlwirte keine ausreichenden Mengen an zellfreiem, infektiösem Virus ausscheiden, um Herdenmitglieder zu infizieren, oder dass das ausgeschiedene Virus nicht stabil genug ist (KALUNDA et al. 1981a, b). Hingegen haben ALBINI et al. (2003) bei erkrankten Schweinen auf der Nasenschleimhaut virale DNS nachgewiesen und schließen nicht aus, dass Schweine OvHV-2 auf ihre Artgenossen übertragen können. Dagegen spricht allerdings auch hier das nur sporadische Auftreten der Krankheit. LI et al. (2001a) stellten fest, dass auch Ziegen OvHV-2 inapparent beherbergen können. Ob sie aber auch infektiöses Virus ausscheiden, ist ungewiss. Eine Übertragung von OvHV-2 unter Ziegen findet aber wahrscheinlich nicht statt (LI et al. 2005b) Vorgänge in der Wirtszelle Das Verhalten des Virus in der Wirtszelle scheint bei Reservoir- und Fehlwirten unterschiedlich zu sein, weshalb erstere nicht erkranken, letztere aber fast immer der Krankheit erliegen (ACKERMANN 2006). Aus mehreren Gründen ist über die Vorgänge in infizierten Zellen noch wenig bekannt (DEWALS et al. 2006; THONUR et al. 2007): Von den BKF-Viren konnte bisher nur das AlHV-1 in Zellkultur vermehrt werden (PLOWRIGHT et al. 1975). Nach mehreren Passagen verliert es allerdings durch Genomumstrukturierung seine Virulenz, wodurch die Erforschung der Pathogenese erschwert wird (WRIGHT et al. 2003). DEWALS et al. (2006) ist es allerdings kürzlich gelungen, AlHV-1 so zu klonen, dass es seine Virulenz in Zellkultur aufrechterhält, wodurch weitere Forschungen zur Pathogenese von BKF möglich werden. OvHV-2 kann durch die Vermehrung infizierter T-Lymphozyten aus Fehlwirten angezüchtet werden. Es ist jedoch noch nicht gelungen, es wie AlHV-1 in Zellkultur zu vermehren (SCHOCK und REID 1996; SWA et al. 2001). Dennoch wird davon ausgegangen, dass das Verhalten der verschiedenen Gammaherpesviren sehr ähnlich ist, sobald sie ihre Zielzellen erreicht haben, und man kann so einige Ergebnisse zur Pathogeneseforschung über andere Gammaherpesviren auf BKF-Viren übertragen (ACKERMANN 2006). 11

23 Literaturübersicht Verhalten von BKF-Viren im Reservoirwirt Über das Verhalten von OvHV-2 im Reservoirwirt ist momentan am meisten bekannt. Nachdem das OvHV-2 in die Zielzellen des Reservoirwirtes CD4+- und CD8+-T-Zellen sowie B- Lymphozyten gelangt ist, geht es in das latente Stadium über (ACKERMANN 2006; HÜSSY et al. 2002; BAXTER et al. 1997). Im latenten Stadium zirkularisiert das virale Genom. Dieser Mechanismus scheint bei Viren allgemein sehr verbreitet zu sein und dient vermutlich der DNS zum Schutz vor eukaryotischen Exonukleasen. Wie genau die Zirkularisierung vonstatten geht, ist noch unbekannt (ROIZMAN et al. 1992; PFOFFENBERGER et al. 1985; ROIZMAN 1985). Während der Latenz werden nur wenige Gene exprimiert. Die Proteine, für die sie kodieren, sichern unter anderem das Überleben der infizierten Zelle und modulieren die Immunantwort des Wirtes (FIELD et al. 2003). Vermutlich kann das Virus die Antigenprozessierung in der Reservoirwirtszelle unterdrücken, wodurch die Antigene nicht durch den Haupthistokompatibilitätskomplex I (MHC+) präsentiert werden. Die infizierte Zelle wird von den CD 8+ Zellen nicht zerstört (BRAATEN et al. 2005). Vermutlich wechselt das Virus dann zu einem geeigneten Zeitpunkt, gefördert durch noch unbekannte Mechanismen, von den Lymphzellen in die Schleimhautepithelzellen über. Dort repliziert es sich und wird schließlich als infektiöses Virus ausgeschieden (LI et al. 2004). Wahrscheinlich kann es aber nicht von einer Epithelzelle aus die nächste infizieren, wodurch der Epithelschaden beim Reservoirwirt gering ist (LI et al. 2004). Die in dieser Phase ablaufenden immunologischen Prozesse dämmen die lokale Infektion schließlich wieder ein, vermögen aber nicht, die latent infizierten Zellen zu beseitigen. Dadurch kommt es vermutlich zu der beobachteten phasenweisen Ausscheidung (BRAATEN et al. 2005; LI et al. 2004). AlHV-1 infiziert ebenfalls CD4+- und CD8+-T-Zellen latent. Eine Zirkularisierung des Genoms wurde bisher nicht gezeigt (DEWALS et al. 2008), ist aber wahrscheinlich (ACKERMANN 2006). Ob AlHV-1 wie OvHV-2 beim Wechsel zwischen dem latenten ins lytische Stadium ebenfalls die Zellart wechselt, bleibt zu erforschen Verhalten von BKF-Viren im Fehlwirt Die Mechanismen, mit denen das Virus beim Fehlwirt die schweren Epithel- und Gefäßläsionen sowie die Lymphzellproliferation auslöst, sind noch nicht ausreichend geklärt. Mehrere Untersuchungen zu diesem Thema wurden im Tierversuch mit AlHV-1 durchgeführt. In T-Lymphozyten konnte dabei vermehrt lineare DNS typisch für das lytische Stadium des Virus nachgewiesen werden (ROSBOTTOM et al. 2002). CD8+-Lymphozyten wurden mit der Vaskulitis in Verbindung gebracht und werden teilweise selbst infiziert (SIMON et al. 2003; ELLIS et al. 1992). Durch die Immunantwort des Wirtes gegen diese infizierten, proliferierenden T-Zellen sowie durch die eigene Zytotoxizität kommt es schließlich zu den Gewebeschäden (DEWALS et al. 2008). Im lytischen Stadium in den Zellen des Fehlwirtes werden andere Gene exprimiert als im latenten Stadium im Reservoirwirt. Es handelt sich hierbei vor allem um virusspezifische Gene. Wie genau dies mit der Pathologie von BKF zusammenhängt, ist noch unbekannt (THONUR et al. 2007). OEHMIG (2004) hat bei anderen Gammaherpesviren festgestellt, dass sie sich seltener in der lytischen als in der latenten Phase befinden, und dass eine Erkrankung eher durch Viren im lytischen Stadium zu befürchten ist. 12

24 Literaturübersicht Anfälligkeit für klinisches BKF bei Fehlwirten Die Anfälligkeit, an BKF zu erkranken, variiert unter den Fehlwirten. Als nicht anfällig gelten Tiere, die seropositiv, aber klinisch unauffällig waren (TRAUL et al. 2007a). Rinder scheinen generell nicht so leicht zu erkranken wie Bisons (Bison sp.) oder Hirsche, die Mortalität ist geringer, der Krankheitsverlauf häufig chronisch und die Rate der Rekonvaleszenz ist höher (CRAWFORD et al. 2002; O TOOLE et al. 1997). Bei Rindern, gelegentlich aber auch bei den empfindlicheren Bisons sowie bei Sitatungas, kommen asymptomatische Infektionen vor. Das Balirind als exotische Rinderrasse ist sehr anfällig, verglichen mit den europäischen Rassen (LI et al. 2006a; FLACH et al. 2002). Unter den Zerviden ist die Anfälligkeit unterschiedlich. Sehr empfänglich sind Milus (Elaphurus davidianus), Weißwedel- (Odocoileus virginianus) Axis- (Axis axis) (LI et al. 2000), Sika- (Cervus nippon) und Sambarhirsche (Cervus unicolor) (FRÖLICH et al. 1998), mittelgradig empfänglich sind dagegen Rothirsche (Cervus elaphus) und Elche (Cervus canadensis) (MACKINTOSH 1993). Relativ resistent sind Damhirsche (Dama dama) (CRAWFORD et al. 2002; MACKINTOSH 1992). Die experimentelle Übertragung von außergewöhnlich hohen Dosen OvHV-2 auf Schafe induzierte auch bei dieser Tierart die typische Symptomatik des BKF (LI et al. 2005c). Die variierende Empfänglichkeit gegenüber der Krankheit äußert sich durch: 1. variable Inkubationszeiten, 2. unterschiedlich lange Krankheitsverläufe und 3. unterschiedlich schwere bis gar keine Symptomatik (LI et al. 2006a). Die Gründe für diese Variationen sind unbekannt. Es kann zum einen an der unterschiedlichen Virulenze der verschiedenen Viren liegen, zum anderen kann es genetisch bedingt sein, dass eine Tierart empfänglicher ist als die andere (LI et al. 2000; CRAWFORD et al. 2002). Der MHC spielt bei der Empfänglichkeit für BKF, wie auch für andere Infektionskrankheiten, wahrscheinlich ebenfalls eine Rolle (TRAUL et al. 2007a). Zudem begünstigen weitere Faktoren vermutlich den Ausbruch von BKF bei Fehlwirten: 1. die während einer Trächtigkeit teilweise herabgesetzte Immunantwort (SYRJÄLA et al. 2006), 2. die Menge der vom Reservoirwirt ausgeschiedenen Viren (LI et al. 2006a; KALUNDA et al. (1981b), 3. der Abstand zwischen Reservoir- und Fehlwirt (LI et al. 2006a), 4. Umweltverhältnisse (KLEIBOEKER et al. 2002) und 5. Vorerkrankungen (LI et al. 1999b). Die bei den Fehlwirten hervorgerufene Symptomatik ist dennoch sehr ähnlich 3. Das Alter der Fehlwirte scheint keinen Einfluss auf den zeitlichen Verlauf der Krankheit von drei bis 23 Tagen zu haben (KALUNDA et al. 1981a). 3 siehe 2.4 Symptome 13

25 Literaturübersicht 2.4 Symptome Klinik BKF äußert sich in verschiedenen Verlaufsformen. Je nach Verlaufsform zeigen sich bei den verschiedenen Fehlwirten weitgehend ähnliche Symptome, die für sich genommen aber nicht pathognomisch sind (LIGGITT und DE MARTINI 1980). Die Einteilung in vier verschiedene Verlaufsformen basiert auf den Beobachtungen bei Rindern, bei denen BKF erstmals beschrieben wurde (GÖTZE 1930). Die folgenden Symptombeschreibungen beziehen sich daher hauptsächlich auf Befunde bei dieser Tierart, sie können aber wahrscheinlich bei allen BKF-anfälligen Tierarten in unterschiedlicher Ausprägung gefunden werden. Die Formen sind manchmal schwer von einander abzugrenzen, da sich die Symptomatik überschneiden kann (ROSENBERGER et al. 1994; DAVID et al. 2005; MULUNEH et al. 1993). Meist erkranken nur einzelne Tiere einer Herde. Dennoch gibt es bei allen Tierarten immer wieder Berichte, bei denen die gesamte Herde erkrankte (BEDELIAN et al. 2007; BRENNER et al. 2002; BROWN und BLOSS 1992; HÄNICHEN et al. 1998; HATKIN 1980; LI et al. 2006a; ORR et al. 1988; TOMKINS et al. 1997). Die am häufigsten auftretende Kopf-Augen Form wird von der perakuten, der intestinalen und der abortiven Form abgegrenzt. Es gibt außerdem Berichte von chronischen Verlaufsformen bei Rindern und Bisons (O TOOLE et al. 1997; SCHULTHEISS et al. 1998) und Hautformen (CRAWFORD et al. 2002; DAVID et al. 2005). Außerdem kommen subakute und chronische Krankheitsverläufe gelegentlich bei Hirschen und Schweinen (Sus sp.) vor (WILSON et. al 1983, KEEL et al. 2003; LØKEN et al. 1998; ALBINI et al. 2003), hier sind aber in der Regel kürzere Verläufe typisch (CRAWFORD et. al 2002). Der Ausgang aller Formen ist fast immer tödlich. Es gibt aber auch Berichte von Tieren, z. B. Rindern, Bisons und Schweinen, welche die Krankheit überlebt haben (O`TOOLE et al. 1997; LI et al. 2006a; SYRJÄLÄ et al. 2006) Kopf-Augen Form Nach einer Inkubationszeit von zwei Wochen bis zehn Monaten treten die ersten Symptome auf und entwickeln sich allmählich (GÖTZE et al. 1930; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998; SELMAN et al. 1978). In den ersten zwei bis sieben Tagen erhöht sich die Körpertemperatur auf 40 C bis 42 C und hält sich über mehrere Tage. Muskelzittern, Fressunlust und starker Durst kommen hinzu. Das Wiederkauen wird eingestellt. Die Tiere speicheln und schmatzen (ROSENBERGER et al. 1994). Es ist ein serös-schleimiger, weißlich trüber, später kruppöser, rötlicher und schließlich eitriggelber Nasenausfluss sichtbar. Die Nasenschleimhaut ist gerötet und teils verkrustet. Die Maulschleimhaut ist ebenfalls hyperämisch und ödematös. In der Maulhöhle sind häufig unregelmäßig begrenzte, oberflächliche Schleimhautdefekte zu sehen, auch Petechien oder stecknadelkopfgroße Bläschen kommen vor. Diese Bereiche werden bald nekrotisch (KALUNDA et al. 1981a). Beidseitige Veränderungen der Augen treten auf. Zuerst ist muköser Augenausfluss zu sehen, der später eitrig wird und dann verkrustende Sekretstraßen bildet. Konjunktivitis mit stark injizierten Episkleralgefäßen kommt vor. Die Augenlider sind geschwollen und die Tiere zeigen eine Photophobie (KALUNDA et al. 1981a). Nach fünf bis sechs Tagen kommen Keratitis, Iridozyklitis und Korneatrübung bis hin zu Erblindung hinzu (LEUPOLD et al. 1989). DAVID et al. (2005) berichten 14

26 Literaturübersicht zudem von Exophthalmus. Bei Weißwedelhirschen kamen periokuläre und nasale Epithelerosionen, aber keine Korneatrübung vor (LI et al. 2000). Infolge der durch Schleim verlegten Atemwege kommt es zur Dyspnoe. Der Atem hat einen üblen Geruch (MULUNEH et al. 1993). Einige Tiere zeigten auch ein submandibuläres Ödem (KALUNDA et al. 1981a). Häufig sind durch eine Enzephalitis bedingte zentralnervöse Störungen wie schwere Depression, Erregung, Zwangsbewegungen (ROSENBERGER et al. 1994), Paralyse der Halsmuskulatur, Inkoordination, Nystagmus (KALUNDA et al. 1981a), Ataxien bis hin zum Festliegen und Hyperästhesien (ALBINI et al. 2003) zu beobachten. Bei Ziegen kam es zu tonisch-klonischen Krämpfen, Tremor und Desorientierung (JACOBSEN et al. 2007). Häufig kommt Diarrhoe hinzu, die sich mit Kotverhalten abwechselt. Die Scheidenvorhofschleimhaut ist stets mehr oder weniger stark gerötet und verdickt (DECURTINS 1940). Eine Hämaturie kann auftreten (MÜLLER-DOBLIES et al. 2001b; SYRJÄLÄ et al. 2006). Die Lymphknoten sind mittel- bis hochgradig geschwollen. Beim chronischen Verlauf der Krankheit können die Lymphknoten wieder abschwellen (KALUNDA et al. 1981a). Der Tod tritt innerhalb von zehn (ROSENBERGER et al. 1994) bzw. 25 bis 50 Tagen (KALUNDA et al. 1981a; LI et al. 2000) ein. Schweine mit der Kopf-Augen Form verendeten bereits innerhalb von 24 Stunden (SYRJÄLÄ et al. 2006), Mähnenspringer nach einer Woche (YERUHAM et al. 2004) Perakute Form Diese Form verläuft zu Beginn ähnlich wie die Kopf-Augen Form mit hohem Fieber und schlechtem Allgemeinbefinden. Die Episkleralgefäße sind injiziert. Der Kot ist mitunter wässrig, übel riechend und blutig. Fibrilläres Muskelzittern tritt auf. Der Kreislaufzustand verschlechtert sich rapide und die Atemfrequenz steigt stark an. Die Tiere sterben am ersten bis dritten Tag nach Beginn der Krankheit (KALUNDA et al. 1981a; LI et al. 1999b; LI et al. 2006; KIUPEL et al. 2004). Ausgeprägte Schleimhautveränderungen zeigen sich dann noch nicht. Es kommt vor, dass Tiere noch vor dem Auftreten ausgeprägter Symptome verenden (REID et al. 1989; CRAWFORD et. al 2002; LI et al. 1999b). Bei akuten und perakuten Fällen kann es außerdem vorkommen, dass die Tiere bei der Sektion nur untypische Läsionen aufweisen (LØKEN et al. 1998). Bei Hirschen wurde beobachtet, dass die perakute Form häufiger auftritt als die Kopf-Augen Form (HEUSCHELE 1988) Intestinale Form Diese Form zeichnet sich durch ihren akuten Verlauf mit starkem, wässrigem, übel riechendem, oft hämorrhagischem Durchfall aus. Die Maulschleimhaut und die Konjunktiven sind diffus gerötet. Es kommt zu Tränenfluss und Lichtscheu. Gelegentlich ist die Nasenschleimhaut gerötet und es entsteht schleimiger Nasenausfluss (HEUSCHELE 1988). Die palpierbaren Lymphknoten können leicht vergrößert sein. Nach vier bis neun Tagen sterben die Tiere. 15

27 Literaturübersicht Abortive Form Diese Form verläuft vergleichsweise harmlos. MULUNEH et al. (1993) berichten lediglich von einem leichten Anstieg der Körpertemperatur. Beim abortierten Fetus einer Giraffe war in Brust- und Bauchhöhle blutiges Sekret zu sehen (POL et al. 1993). Schweine, die aufgrund einer BKF- Erkrankung abortierten, erholten sich und zeigten auch ohne Behandlung keine weiteren Symptome (SYRJÄLÄ et al. 2006) Hautform Diese chronische, ebenfalls letal verlaufende Form wurde bei Sikahirschen und Rindern beobachtet (CRAWFORD et al. 2002; DAVID et al. 2005). An der wenig behaarten Haut, wie am Hornansatz, am Interdigitalspalt, an Zitzen und Hoden, treten zunächst kleinfleckige Rötungen auf. Später entstehen meist einzeln an den Zitzen, am Euter und an den Schenkelinnenfläche flache, kleinknopfgroße Papeln mit eintrocknendem Zentrum (CRAWFORD et al. 2002). Eine exsudative Dermatitis mit haarlosen Stellen wurde von DAVID et al. (2005) beobachtet und breitete sich über den gesamten Körper aus. Die Haut wurde bräunlich und trocken. Dazu kamen mehrere kleine Ulzerationen an Zunge und Nasenschleimhaut Leichtere Formen Neben den schweren Fällen können auch leichtere Erkrankungen vorkommen, bei denen die klinischen Erscheinungen weniger kennzeichnend sind. Diese beschränken sich dann oft auf ein bis zwei Tage anhaltendes Fieber mit geringgradiger katarrhalischer Entzündung und Hyperämie der Augen-, Nasen- und Maulschleimhaut. Außerdem können hierbei Erytheme und leichte Schwellungen der Haut mit nachfolgendem, länger anhaltendem, schuppendem Exanthem vorkommen. Allgemeinbefinden und Fresslust der Tiere sind nur mäßig gestört. Diese Fälle gehen nach drei bis neun Tagen fast immer in Heilung über (KALUNDA et al. 1981a; O TOOLE et al. 1997). Genesene Tiere bleiben lange Zeit, wenn nicht sogar lebenslang, immun (O TOOLE et al. 1997) Pathologisch-anatomische Befunde Bei allen Formen fällt eine leichte Leber- und Milzschwellung auf. Die Lymphknoten, besonders die Mesenteriallymphknoten, sind aufgrund von Ansammlungen mononukleärer Zellen fast regelmäßig geschwollen und ödematös (KALUNDA et al. 1981a). Bei der Kopf-Augen Form sind die Befunde sehr deutlich. Die starken inflammatorischen Veränderungen der Nasen- und Maulschleimhaut sowie der Konjunktiven entsprechen den klinischen Symptomen (s.o.). Es kann auch zu Blutungen aus Maul- und Nasennebenhöhlen und am Augenlid kommen (POL et al. 1993). Erhebliche entzündliche Auflockerung der Rachenschleimhaut, Herzmuskeldegeneration und gelegentlich Zystitis kommen vor. Ödeme und Petechien in Trachea und Lunge treten auf (YERUHAM et al. 2004). 16

28 Literaturübersicht Bei der perakuten Form sind bis auf die oben genannten klinischen Erscheinungen nur wenige Veränderungen wie partielle Darmentzündungen, Herzmuskelentartungen und geringgradiger Katarrh der Kopfschleimhäute zu sehen (KALUNDA et al. 1981a). Von Belägen auf der Maulschleimhaut und dem Pharynx bei Schweinen berichten ALBINI et al. (2003). Bei der intestinalen Form sieht man regelmäßig eine katarrhalische bis hämorrhagische Gastroenteritis mit verdickter Darmwand (POL et al. 1993; SCHENZ et al. 2000). Gelegentlich lassen sich auch eine Blasenentzündung sowie eine geringgradige katarrhalische Inflammation der Kopf- und Scheidenschleimhäute beobachten (HÄNICHEN et al. 1998; ROSENBERGER et al. 1994). Die pathologisch-anatomischen Befunde der Hautform entsprechen den klinischen Symptomen. Unabhängig von der Verlaufsform berichten KALUNDA et al. (1981) von Erosionen und Ulzera im Labmagen bei 84%, Erosionen im Ösophagus bei 64%, Perikarditis bei 50% und Herde in den Nieren bei 20 % der Tiere. Eine Verdickung der Darmwand kam vor. Bei Giraffen fielen zudem eine pseudomembranöse Entzündung der Trachea und Blutungen des Epi- und Endokards auf. Ähnliche Befunde kommen auch bei abortierten Feten vor (POL et al. 1993). Bei Schweinen fallen außerdem meistens hyperämische Nieren sowie Aufhellung und interstitielle Zeichnung des Leberparenchyms und bei Abortfällen eine hyperämische Uterusschleimhaut auf (SYRJÄLÄ et al. 2006) Histopathologische Befunde Berichte von Lymphoproliferation, Vaskulitis und Perivaskulitis mit lymphozytärer Zellinfiltration in den Gefäßen diverser Organe sind überall in der Literatur, auch bei perakuten Fällen, als histologische Hauptbefunde zu finden (LIGGITT und DE MARTINI 1980; LI et al. 2006a; KLEIBOEKER et al. 2002). Die Vaskulitis kann in ihrem Erscheinungsbild variieren. Von lediglich geringgradiger Hypertrophie des Endothels über Zerstörung der Lamina elastica interna (LI et al. 2000) oder der Tunica media (KLEIBOEKER et al. 2002), bis hin zur proliferativen Arteriopathie, die diese Befunde vereint und zusätzlich eine Hypertrophie und Hyperplasie der Adventitia aufweist, wurde berichtet (LI et al. 2000). Bei Schweinen betraf die Vaskulitis vornehmlich die Media und Adventitia von mittelgroßen und kleinen Arterien (LØKEN et al. 1998). Je länger die Krankheit andauerte, desto fortgeschrittener war die Vaskulitis (KALUNDA et al. 1981a; POL et al. 1993). Sie kann in verschiedenen Organen vorkommen, u. a. im Respirations-, Verdauungs- und Urogenitaltrakt. Bei Rentieren waren die Läsionen in Nieren, Ösophagus, Trachea, Konjunktiva, Abomasum und Vagina besonders prominent (KIUPEL et al. 2004), bei Sikahirschen dagegen in Nieren und Netzmagen (CRAWFORD et al. 2002; KEEL et al. 2003). Auch in der Skelettmuskulatur war die Vaskulitis nachweisbar (KLEIBOEKER et al. 2002). LI et al. (2000) beobachteten verschiedene Grade von Vaskulitis und Perivaskulitis, fibrinoide arterielle Nekrose und Gefäßthrombosen außerdem in Herz, Nebennieren, Leber, Milz, Hypophyse, Mesenteriallymphknoten und Schilddrüse. Bei Schweinen wurde die typische Vaskulitis auch in der Harnblase und erstmals im Uterus gefunden (SYRJÄLÄ et al. 2006). 17

29 Literaturübersicht Bei keinem der von KLIEFORTH et al. (2002) untersuchten Atlashirsche war die typische Vaskulitis nachzuweisen. Dies lag vermutlich daran, dass die Tiere bereits 48 Stunden nach Auftreten der ersten Symptome euthanasiert wurden. Die histopathologische Untersuchung der Nieren ergab eine Glomerulonephritis und eine multifokale, interstitielle Nephritis (KALUNDA et al. 1981a). Viele mitotische Stadien von mononukleären Zellen waren sichtbar, typisch für eine lymphoproliferative Erkrankung. In den Gefäßen waren venöse Thromben und Endothelproliferationen der Arterien zu sehen. Diese Nierenveränderungen waren auch bei infizierten, klinisch noch unauffälligen Hirschen zu erkennen (LI et al. 2000). Auch die Hirngefäße, besonders im Kleinhirn, zeigten eine mononukleäre Infiltration mit gleichzeitiger Meningoenzephalitis. Von einer stark ausgeprägten disseminierten, nichteitrigen Enzephalitis als regelmäßiger Befund berichten auch ROSENBERGER et al. (1994) und DAVID et al. (2005). Bei Schweinen wurde eine Perivaskulitis der Meningen des Rückenmarks festgestellt (ALBINI et al. 2003). Die Sinusoide in Leber und Nebennieren waren bei Rindern zum Teil dilatiert (ROSENBERGER et al. 1994). Bei Mähnenspringern, die an der Kopf-Augen Form litten, kamen Blutungen im Hoden vor (YERUHAM et al. 2004). KLEIBOEKER et al. (2002) beschreiben bei Weißwedelhirschen grau-weiße Knoten in Herz, Niere und Leber, in denen in histologischen Schnitten Lymphozyten nachzuweisen waren. KLIEFORTH et al. (2002) fielen bei Atlashirschen mit neutrophilen Granulozyten gefüllte Sinus der Lymphknoten auf. Bei der Hautform konnte eine diffuse Hyperkeratose mit neutrophiler und histiozytärer Infiltration, vorwiegend in Schweißdrüsen und an den Haarwurzeln, festgestellt werden (CRAWFORD et al. 2002; DAVID et al. 2005). 2.5 Differentialdiagnosen Als Differentialdiagnosen sind bei Wiederkäuern folgende Krankheiten in Betracht zu ziehen: Maulund Klauenseuche, Bovine Virusdiarrhoe, Rinderpest, Salmonellose, zu schwerer Enteritis führende Vergiftungen (ROSENBERGER et al. 1994), Stomatitis vesiculosa (DIRKSEN 2002), Blauzungenkrankheit und Infektiöse Bovine Rhinotracheitis (BRENNER et al. 2002) wegen der erosiven und ulzerierenden Veränderungen am Atmungs- bzw. Verdauungstrakt; Listeriose und Bovine Spongiforme Enzephalopathie (MÜLLER-DOBLIES et al. 2001b) beim Auftreten zentralnervöser Störungen; Infektiöse Keratokonjunktivitis (ROSENBERGER et al. 1994). Beim Schwein kommen folgende Differentialdiagnosen in Frage: Europäische Schweinepest, Aujeszky sche Krankheit, Teschen-Talfan-Disease (Porcines Enterovirus Typ 1), Parvovirose (ALBINI et al. 2003). 18

30 Literaturübersicht 2.6 Nachweis von BKF Gesamtdiagnose Besteht der Verdacht einer BKF-Erkrankung bei einem Fehlwirt, sollte zunächst geklärt werden, ob dieser mit einem Reservoirwirt Kontakt hatte. Zur Abklärung der Diagnose haben sich als intra vitam Methoden die PCR (s.u.) und der CI-ELISA (s.u.) bewährt (CLARK et al. 1970; LI et al. 2000; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998; YERUHAM 2004). Das Differentialblutbild ist weniger geeignet, da es stark variieren kann (s.u.). Bevor moderne Labormethoden etabliert waren, wurden zur Diagnostik Kaninchen mit dem Blut des erkrankten Tieres infiziert (s.u.) (POL et al. 1993). Die post mortem Diagnose erfolgt durch die histopathologische Untersuchung in Kombination mit der PCR, da makroskopische Befunde häufig nicht eindeutig sind 4. Auch die In-situ- Hybridisierung und die Immunhistochemie (IHC) wurden zur Diagnostik herangezogen Polymerasekettenreaktion Prinzip Die PCR dient dazu, DNS Abschnitte zu vervielfältigen = amplifizieren. Ist ein Virus mit anderen Methoden in einer Zelle nicht nachweisbar, weil es in zu geringen Mengen vorliegt, ermöglicht diese Methode, aus dem Originalstück der viralen DNS mehrere Kopien herzustellen und diese anschließend nachzuweisen. Voraussetzung ist, dass die Sequenz der viralen DNS bekannt ist. Anhand dieser Sequenz wird ein Vorwärts- und ein Rückwärtsprimer synthetisiert, der aus bis zu 30 Nukleotiden besteht, die die selbe Reihenfolge aufweisen wie der Anfang bzw. das Ende der nachzuweisenden DNS Stücke. Die Primer binden an die DNS Sequenz und geben so der DNS- Polymerase das Signal zur Vervielfältigung des Abschnitts, der zwischen den Primern liegt. Der Virusnachweis mittels PCR ist schon bei sehr geringen Mengen von viraler DNS in der Probe möglich, sogar bereits in der Inkubationszeit und bis zu zwei Jahre nach dem Abklingen der klinischen Symptome bei Fehlwirten (LI et al. 2005c; MÜLLER- DOBLIES et al. 1998) npcr und snpcr Die nested 5 bzw. semi-nested PCR (npcr bzw. snpcr) dient dazu, die Spezifität und Sensitivität der PCR zu erhöhen. Sie ist eine Kombination aus zwei aufeinander folgenden, kombinierten PCR- Reaktionen. Die erste PCR-Reaktion wird wie oben beschrieben durchgeführt. Anschließend wird das in dieser Reaktion entstandene Amplifikat in einer 2. Reaktion als Vorlage = Template genutzt. In der 2. Reaktion werden neue Primer benutzt, basierend auf der neu erkannten Nukleotidsequenz, die innerhalb der Primerpositionen der 1. Reaktion liegen. Die snpcr ist eine Modifikation der npcr, bei der in der 2. Reaktionsrunde ein Primerpaar aus einem Primer der 1. Runde und einem neuen internen Primer verwendet wird. 4 siehe Histopathologische Befunde 5 nested= verschachtelt 19

31 Literaturübersicht Für den Nachweis vom AlHV-1 und OvHV-2 wurde eine snprc von HSU et al. (1990) bzw. von BAXTER et al. (1993) entwickelt. Für AlHV-1 und AlHV-2 entwickelten KATZ et al. (1991) eine npcr. Diese Methode hat die Diagnostik von klinischen Fällen präziser und einfacher gemacht (CRAWFORD et al. 1999; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998; MURPHY et al. 1994; O TOOLE et al. 2002). Die snprc ist sehr spezifisch und sehr sensitiv und gilt daher als Goldstandard zur Diagnostik von BKF (BAXTER et al. 1993; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998). Bereits in der Inkubationszeit und bis zu zwei Jahre nach dem Abklingen der klinischen Symptome konnte mittels PCR virale DNS in Organmaterial nachgewiesen werden (LI et al. 2005c; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998). BAXTER et al. (1993) konnten mit der OHV-2 spezifischen PCR 35 Genomäquivalente nachweisen. Die Spezifität ihrer Primer lag bei 94 bis 100 % (MÜLLER-DOBLIES et al. 1998). Zur Identifikation von möglichen Reservoirwirten ist die snpcr ebenfalls geeignet, wobei jedoch vorher bekannt sein muss, welches BKF-Virus nachgewiesen werden soll (LAHIJANI et al. 1994). Die Kombination mit einem CI-ELISA zur serologischen Untersuchung ist von Vorteil (LI et al. 2003a) cpcr VAN DEVANTER et al. (1996) entwickelten eine cpcr, mit der bisher unbekannte Herpesviren nachgewiesen werden können, die möglicherweise klinische Erkrankungen und latente Infektionen auslösen (LI et al. 2000; LI et al. 2003a). Diese PCR wurde von ROVNAK et al. (1998) weiterentwickelt und für die Diagnostik von BKF-Viren etabliert. Anschließend an die PCR bietet sich eine Sequenzierung der PCR Produkte an, um zu bestimmen, um welches BKF-Virus es sich sich handelt. VAN DEVANTER et al. (1996) konnten mit ihrer cpcr virale DNS im Bereich von 100 Viruskopien pro 100 ng DNS detektieren. Die cpcr ist eher durch Kontaminationen gefährdet als die nested- oder die Realtime-PCR (Rt- PCR) Rt-PCR nach CUNHA et al. (2009) Eine deutliche Erleichterung der Diagnostik wurde durch die Entwicklung der Rt-PCR geschaffen. Bei dieser Methode kann schon während der Reaktion festgestellt werden, ob sich die gesuchte DNS in der Probe befindet. Für die PCR werden ein Vorwärts- und ein Rückwärtsprimer sowie je eine Sonde für jede gesuchte Virusart verwendet. Die Sonden sind mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert. Befindet sich eines der gefragten Viren in der Probe, bindet die Sonde zwischen den beiden Primern. Während die Polymerase die DNS-Sequenz zwischen den Primern amplifiziert, verdrängt sie die Sonde, der fluoreszierende Farbstoff wird frei und kann gemessen werden. Da die Farbstoffe alle eine unterschiedliche Wellenlänge haben, lässt sich anhand der gemessenen Wellenlänge auf den Farbstoff und damit auf die Sonde und das in der Probe vorhandende Virus rückschließen. 20

32 Literaturübersicht Die Rt-PCR ist durch die speziellen Sonden sehr spezifisch und kann sogar 50 Viruskopien pro 100 ng DNS detektieren. Durch Verdünnungsreihen konnten CUNHA et al. (2009) eine Sensitivität von 97,2% in Proben von klinisch erkrankten Tieren bestimmen. Die Rt-PCR eignet sich daher für die Diagnostik klinischer Fälle (TRAUL et al. 2007b). Sie ist weiterhin eine wertvolle Methode zur Erforschung des Ausscheidungsverhaltens und der Übertragungsmechanismen, da sie über die Quantität der Viren in einer Probe Auskunft geben kann (LI et al. 2004) Probenmaterial für die PCR Als Probenmaterial eignet sich die Leukozytenfraktion aus EDTA-Blut von Reservoir- und Fehlwirten (BAXTER et al. 1993; LI et al. 2000; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998) sowie frische, gefrorene und paraffinfixierte Gewebeproben von Milz (LI et al. 2000; KLEIBOEKER et al. 2002) und Lymphknoten (Ln. parotideus, Ln. mesenterialis, Ln. tracheobronchialis) (KLEIBOEKER et al. 2002; SCHENZ et al. 2000; MÜLLER-DOBLIES et al. 2001b) erkrankter Fehlwirte (LI et al. 2003b; CRAWFORD et al. 1999). In geringeren Mengen wurde virale DNS bei Fehlwirten in Niere, Leber, Gehirn, Ganglion Trigeminale, Nebenniere (KALUNDA et al. 1981a; SCHENZ et al. 2000), bei einigen Tieren auch im Nasensekret nachgewiesen (KALUNDA et al. 1981a). Zur intra vitam Identifikation von Reservoirwirten mittels PCR eignet sich als Ausgangsmaterial Nasen-, Augensekret und Blut (TRAUL et al. 2005; HÜSSY et al. 2002; LI et al. 2001a; KLIEFORTH et al. 2002), zur Diagnose post mortem Organproben aus Dünndarm, Lymphknoten, Milz, Lunge (HÜSSY et al. 2002), Kornea (BAXTER et al. 1997) und Speicheldrüsen (KLIEFORTH et al. 2002) Weiterverarbeitung der PCR-Produkte Eine Verarbeitungsmöglichkeit ist die Anwendung von Restriktionsendonukleasen. Sie erkennen an den DNS Stücken bestimmte Sequenzen und schneiden sie an dieser Stelle durch. Jede Endonuklease wählt eine spezifische Schnittstelle aus, weshalb meistens zwei oder drei verschiedene Endonukleasen benutzt werden. Die amplifizierte DNS wird in kleinere Stücke geschnitten. Diese Stücke haben je nach genutzter Endonuklease eine bestimmte Länge. Die erhaltenen Stücke werden durch Gelelektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt. Dadurch entstehen Balken in dem Elektrophoresegel, die mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden können. Jede Art von DNS zeigt ihr ganz spezifisches Schnittmuster CI-ELISA Der CI-ELISA (competitive inhibitory enzyme linked immunosorbent assay) für die Detektion von Antikörpern gegen BKF-Viren im Serum wurde von LI et al. (1994) entwickelt. Er basiert auf einem monoklonalen Antikörper gegen das Epitop 15A in der Hülle der BKF-Viren. Andere Viren haben dieses Protein nicht in ihrer Außenhülle und können selbst dann nicht zu falsch positiven Ergebnissen führen, wenn ein Tier mit mehreren Viren gleichzeitig infiziert ist (CRAWFORD et al. 2002). 21

33 Literaturübersicht Da aber alle BKF-Viren das Epitop 15 A tragen, lässt sich durch den CI-ELISA nicht feststellen, um welchen BKF-Virus es sich bei dem infizierten Tier handelt: Die Antikörper reagieren kreuz. Der CI- ELISA hat sich besonders bei epidemiologischen Übersichtsstudien bewährt, in denen mit hoher Spezifität eine große Anzahl an Tieren in kurzer Zeit identifiziert werden kann, die Kontakt zu BKF- Viren hatten (FRÖHLICH et al. 1998; LI et al. 1994; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998). Zur Diagnostik klinischer Fälle sollten die Ergebnisse immer im Zusammenhang mit einer PCR oder einer histopathologischen Untersuchung interpretiert werden. Beim perakuten oder akuten Verlauf der Krankheit verenden die Tiere häufig bevor sie Antikörper bilden konnten und reagieren im CI-ELISA trotz bestehender Infektion negativ (LI et al. 2006a). Dies kommt auch bei inapparent infizierten Tieren vor, wenn sie keine Antikörper ausbilden (LI et al. 1999a; O TOOLE et al. 1997). Bei einer positiven Reaktion im CI-ELISA muss die Todesursache nicht zwingend BKF gewesen sein. Die Antikörper können auch von einer früheren BKF-Virus Infektion herrühren, von der sich das Tier erholt hat (LI et al. 2006a) In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie Mit ISH und IHC können BKF-Viren in Gewebeproben nachgewiesen werden. Versuche von BRIDGEN et al. (1992) (ISH), PATEL und EDINGTON (1981) und ROSSITER (1980) haben aber gezeigt, dass das Gewebe virale DNS teilweise in zu geringen Mengen enthält, als dass diese mit den oben genannten Methoden nachgewiesen werden könnte. Die PCR ist in dieser Hinsicht viel sensitiver. KIUPEL et al. (2004) wiesen vor allem im Bereich der perivaskulären Infiltrationen und der Epithelläsionen Viren in Lymphozyten nach. Auch in Gewebeproben von Speicheldrüsen (KLIEFORTH et al. 2002) und Lungenalveolen (MICHEL et al. 1993) konnte der Virusnachweis erbracht werden. Für die ISH und die IHC wird standardmäßig ein anti-alhv-1 Antikörper benutzt. Daher können BKF-Viren nicht differenziert werden. Diese Methoden sind sehr zeitaufwändig und fehleranfällig. Die nötigen Gewebeproben können in der Regel nur vom toten Tier entnommen werden. Deswegen eignen sie sich nicht zur intra vitam Diagnostik von BKF (MÜLLER-DOBLIES et al. 1998) Tierversuche Bevor moderne Labormethoden etabliert waren, wurden zur Diagnostik Kaninchen mit dem Blut des erkrankten Tieres infiziert (POL et al. 1993; KALUDA 1981). Sobald typische Symptome auftraten, wurden sie seziert und makroskopisch sowie histopathologisch auf BKF-typische pathologische Veränderungen untersucht 6. 6 siehe Klinik und Histopathologische Befunde 22

34 Literaturübersicht Blutbild Beim BKF wurde bei einem Teil der Tiere eine Leukopenie in Korrelation mit dem ersten Temperaturanstieg nach der Infektion nachgewiesen (BRENNER et al. 2002; LEUPOLD et al. 1989; PLOWRIGHT 1964). Die Anzahl der neutrophilen Granulozyten und der Lymphozyten sank. Darauf folgte eine Leukozytose mit Mononukleose und Neutropenie (PLOWRIGHT 1964). Bei anderen Tieren wurde eine initiale Leukozytose mit Linksverschiebung beobachtet (REID et al. 1985; ROSSITER 1985). In der Endphase der Erkrankung konnte eine Eosinopenie beobachtet werden (ROSSITER 1985; BLOOD et al. 1999). Bei Exsikkose durch Diarrhoe stieg der Hämatokrit an (REID et al. 1985; PLOWRIGHT 1990). 2.7 Therapie In der Literatur gibt es nur wenige Berichte über die erfolgreiche Behandlung von Tieren mit BKF. Da keine Virostatika für Tiere erhältlich sind, bleibt nur die Möglichkeit der symptomatischen Behandlung. Beim perakuten Verlauf kommt jeglicher Behandlungsversuch zu spät, was unter anderem darauf zurückzuführen ist, dass die Tiere keine eindeutigen Symptome zeigen (LI et al. 1999b). Rinder mit chronischem Krankheitsverlauf erholten sich in seltenen Fällen von der Krankheit, wobei genaue Aufzeichnungen zur Behandlung nur teilweise vorhanden sind (O TOOLE et al. 1997). ROBERTSON (1961) berichtet von der erfolgreichen Behandlung erkrankter Rinder mit Tetracyclin zum Schutz vor Sekundärinfektionen und Infusionen mit Glukose- und Elektrolytlösungen. Sulfamethazin und Antihistaminika zeigten keine Effekte. Auch andere Autoren verwendeten zum Schutz vor Sekundärinfektionen Antibiotika wie Neomycin, Penicillin und Gentamicin (MILNE und REID 1990; SHULAW und OGLESBEE 1989). Nasen- und Maulspülungen mit milden Desinfektionslösungen können Linderung verschaffen (ROSENBERGER et al. 1994). Zusätzlich wurden nicht-steroidale Antiphlogistika wie Phenylbutazon oder Acetyl-Salicylsäure (ASS) verwendet (MILNE und REID 1990; KIUPEL et al. 2004) sowie Dexamethason- und Betamethason-haltige Augentropfen appliziert (MILNE und REID 1990). Die systemische Gabe von Kortikosteroiden ist umstritten. Diese führte zwar zum Abschwellen der Schleimhäute und es tritt eine, wenn auch nur kurzfristige, Besserung ein (CRAWFORD et al. 2002; ROSENBERGER et al. 1994), aber sie kann den Ausbruch von BKF induzieren oder bei einem latent infizierten Tier den Wechsel des Virus vom latenten ins lytische Stadium fördern (HEUSCHELE et al. 1985). WIESNER (1978) berichtet von der erfolgreichen Behandlung eines Gaurs, dem Levamisol subkutan verabreicht wurde. 2.8 Prophylaxe Ein Impfstoff ist bislang nicht verfügbar (LI et al. 2006a). Immunisierungsversuche bei Rindern waren sowohl bei der gnu-assoziierten als auch bei der schaf-assoziierten Form bisher erfolglos (PLOWRIGHT 1975; MULUNEH 1993). 23

35 Literaturübersicht Es bleibt die Möglichkeit, empfängliche Arten von Reservoirwirten zu trennen. Dies gilt besonders für zoologische Gärten und Wildparks. Hier werden viele verschiedene Tierarten auf relativ engem Raum, in benachbarten oder vergesellschaftet in demselben Gehege, gehalten. Dadurch ist der Infektionsdruck sehr viel höher als in der Wildbahn (HÄNICHEN et al. 1998). Es ist außerdem möglich, Lämmer virusfrei aufzuziehen. Dazu müssen sie im Alter von ungefähr zweieinhalb Monaten von der Herde abgesondert und nur mit OvHV-2 negativen Schafen zusammengehalten werden (LI et al. 1999a). Auch bei CpHV-2 ist es möglich, Jungtiere von virustragenden Ziegen virusfrei aufzuziehen, wenn man sie im Alter von ca. sieben Tagen von latent infizierten Herdenmitgliedern absondert und den Kontakt zu Virusträgern unterbindet (LI et al. 2005b). Die Aufzucht von virusfreien Tieren scheint, z. B. für Streichelzoos, eine sinnvolle Maßnahme zu sein. Außerdem sollte darauf geachtet werden, bei der Versorgung der verschiedenen Tierarten unterschiedliche Betreuer einzusetzen, die Kleidung vor dem Betreten des Geheges zu wechseln und nicht dieselben Geräte für unterschiedliche Tierarten zu verwenden, um eine indirekte Übertragung zu vermeiden (LI et al. 2006a). Gnus durch die Trennung von Jung- und Muttertier virusfrei aufzuziehen, ist durch die mögliche intrauterine Übertragung von AlHV-1 nicht realisierbar. Durch Sonneneinstrahlung können die Viren relativ schnell inaktiviert werden (ROSSITER et al. 1983). In Fällen, in denen nicht verhindert werden kann, dass Reservoir- und Fehlwirt dieselbe Weide nutzen (KIUPEL et al. 2004), kann möglicherweise die Inzidenz der BKF-Fälle gesenkt werden, indem den Tierarten zeitlich getrennt Zugang zu dem Gelände gewährt wird. Zwischen den Weideperioden sollte eine Zeitspanne von drei Stunden liegen, in der die Weide nicht genutzt wird und die Viren durch die UV-Einstrahlung unschädlich gemacht werden (ROSSITER et al. 1983). 24

36 Tiere, Material und Methoden 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Tiere Insgesamt wurden 218 Wiederkäuer unterschiedlicher Art und Altersklassen aus sieben deutschen, einem schweizer und drei niederländischen Wildparks und zoologischen Gärten untersucht. Die folgende Karte von Mitteleuropa zeigt die Herkunft der Tiere (Abbildung 4). Abbildung 4: Mitteleuropa ( die roten Punkte (A-K) stellen die Tierparks und zoologischen Gärten dar, aus denen die 218 Wiederkäuer für diese Studie stammen. 25

37 Tiere, Material und Methoden In der Tabelle 3 sind die untersuchten Tiere mit Art, Rasse, Anzahl und Alter am Tag der Probenentnahmen aufgeführt. Einige Tiere wurden mehrfach beprobt. Tabelle 3: Art, Anzahl und Alter (a=jahre, d=tage, mo=monate) der untersuchten Tiere Tier Alpensteinbock Capra ibex Anoa Bubalus depressicornis Axishirsch Axis axis Bongo Tragelaphus eurycerus Burenziege Capra aegagrus f. hircus Chinesischer Muntjak Muntjacus reevesi Coburger Fuchsschaf Ovis orientalis f. aries Dahomey Rind Bos primigenius f. taurus Dallschaf Ovis dalli Dik Dik Madoqua sp. Dybowskihirsch Cervus nippon hortulorum Elch Alces alces Elen Taurotragus oryx Giraffe Giraffa cameloparadalis rotschildi gesamt Probenentnahme 1-7 Tage alt 5 5 (0,0,1,1,1d) Anzahl Probenentnahme unter 12 Monate Probenentnahme über 12 Monate 1 1 (3d) 1 (11mo) 2 1 (3d) (0d) 10 6 (2d) (1d) 1 (1,5a) 2 1 (3d) (3d) 5 3 (0,1,7d) 1 (40d) (3d) 5 5 (0,0,1,1,1d) 1 1 (4,5a) 2 1 (2d) 1 (8d) 6 4 (0,0,0,1,2,3d) 2 (12,16d) 26

38 Tiere, Material und Methoden Tier Girgentanaziege Capra aegagrus f. hircus Goral Naemorhedus goral Großer Kudu Tragelaphus strepsiceros Guanako Lama guanicoe Heidschnucke Ovis orientalis f. aries Hirschziegenantilope Antilope cervicapra Impala Aepyceros melampus Kamerunschaf Ovis orientalis f. aries Kleinkantschil Tragulus javanicus Kleiner Kudu Tragelaphus imberbis Leierhirsch Cervus eldii Mähnenspringer Ammotragus lervia Mergellandschaf Ovis orientalis f. aries Moschusochse Ovibos moschatus Nyala Tragelaphus sp. gesamt Probenentnahme 1-7 Tage alt 4 4 (0,0,1,1d) Anzahl 1 1 (7d) (1,2d) Probenentnahme unter 12 Monate Probenentnahme über 12 Monate 6 1 (114d) 5 (3,5a,3,5a,4a,6,5a, 6,5a) 3 3 (0,0,1d) 8 8 (1,1,1,1,1,1,2,2d) (0d), 3 (1,1,2d) (4mo) 1 1 (23d) 1 1 (1,5a) (2d) (0,0,1d) 27

39 Tiere, Material und Methoden Tier Oryx Oryx leucoryx Ovamboziege Capra aegagrus f. hircus Pfauenziege Capra aegagrus f. hircus Reh Capreolus capreolus Rentier Rangifer tarandus Rotbüffel Syncerus caffer nanus Rotkopfschaf Ovis orientalis f. aries Säbelantilope Oryx dammah Schraubenziege Capra falconeri Sikahirsch Cervus nippon Sitatunga Tragelaphus sitatunga Skudde Ovis orientalis f. aries Spießbock Oryx gazella Springbock Antidorcas marsupialis gesamt 1 1 (2d) 2 2 (1d) Probenentnahme 1-7 Tage alt Anzahl Probenentnahme unter 12 Monate Probenentnahme über 12 Monate 6 1 (47d) 5 (2,5a,3a,4a, 9,5a,10,5a) 3 3 (0d) 5 4 (0,1,1,1,d) 1 (17d) 1 1 (1d) 5 3 (1,1,2d) (0d), 7 (1,1,1,3,5,5,6,7d) 5 (11,65,72,117,122d) (1,5a) 18 7 (0d) 6 (1,1,2,2,2,7d) 2 1 (1d) (0d) 3 (1a,1,5a,3a) 5 28

40 Tiere, Material und Methoden Tahr Tier Hemitragus sp. Takin Budorcas taxicolor Texel-Walliser Schaf Ovis orientalis f. aries Ungarisches Steppenrind Bos primigenius f. taurus Waldren Rangifer tarandus fennicus Wapiti Cervus canadensis Wasserbock Kobus ellipsiprymnus Watussirind Bos primigenius f.taurus Weißbartgnu Connochaetes taurinus Weiße Deutsche Edelziege Capra aegagrus f. hircus Wisent Bison bonasus Yak Bos mutus f. grunniens Zwergziege Capra aegagrus f. hircus gesamt 3 3 (0d) 1 1 (0d) Probenentnahme 1-7 Tage alt Anzahl Probenentnahme unter 12 Monate (1d) Probenentnahme über 12 Monate 4 4 (2,4,5,5a) 1 1 (1d) 1 1 (9d) 3 3 (1,1,3d) 1 1 (0d) (1d) 1 (95d) (2d) (0,1,1) 2 (95,107d) 7 29

41 Tiere, Material und Methoden 3.2 Material Geräte Geräte zur Aufbewahrung: Kühl- und Gefrierschränke (Liebherr, Ochsenhausen) Geräte zur Herstellung des Mediums für die Probenaufbewahrung: Sterilwerkbank (Haraeus, Hanau) Magnetrührer (Ikamag, Staufen) ph-elektrode (WTW, Weilheim) Pipetten (Eppendorf, Hamburg; Abimed, Langenfeld) Pipettierhilfe (Hirschmann, Ettlingen) Autoklav (Getinge, Rastatt) Geräte zur DNS-Isolierung: Thermomixer 5436 (Eppendorf, Hamburg) Vortexer (Bender & Hobein, Zürich) Zentrifuge (Haraeus, Hanau) PCR-Geräte: Thermocycler PTC-200 (MJ Research, Hess. Oldendorf) Rt-PCR Gerät MxPro (Stratagene, Amsterdam) Gerät zur Messung des DNS-Gehalts: Spektrophotometer (Beckmann, München) Geräte für die Agarosegel-Elektrophorese: Elektrophoresekammern (Keutz, Reiskirchen) Stromversorgung Elektrophorese (BioRad, München) Transilluminator (Alpha Innotec Corporation) Verbrauchsmaterial Abstrichbesteck (Nerbe, Winsen/Luhe) Agarose (Eurogentec, Köln) Aktivkohle (Merck, Darmstadt) EDTA-Röhrchen (Braun, Melsungen) Filterpapier (Macherey-Nagel, Düren) Filterpipettenspitzen (Greiner, Frickenhausen) Glaskolben (Brand, Wertheim) Glaspipette (Brand, Wertheim) 30

42 Tiere, Material und Methoden Magnetrührstab (IKA, Staufen) Pipettenspitzen (Greiner, Frickenhausen) 0,5 ml Reaktionsgefäße für die PCR (Stratagene, Amsterdam) Spritzenfilter (TPP, Trasadingen) sterile Spritzen (Braun, Melsungen) 1,5 ml und 2 ml Reaktionsgefäße (Greiner, Frickenhausen) Vorgefertigte Systeme (Kits) Aufreinigungskit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Mannheim) DNS-Isolierkit Invisorb Spin Tissue Mini Kit (Invitek, Berlin) Software BLAST (basic local alignment search tool) ( Chromas (Southport Australien) EditSeq (GATC Biotech, Konstanz) MegAlign (GATC Biotech, Konstanz) MxPro (Stratagene, Amsterdam) NCBI GenBank ( AlphaImager 1220 (Cell Biosciences, St. Clara) Reagenzien und Herstellung der Gebrauchslösungen Reagenzien Reagenzien: Bovines Serum Albumin ph 7 (PAA, Cölbe) NaHCO 3 (AppliChem, Darmstadt) Lösungen: DNS-Ladepuffer: Bromphenolblau 0,25 %, Glycerol 50 % in TAE Dream Taq TM Puffer inkl. 20 mm MgCl 2 (Fermentas, St.-Leon-Rot) Ethidiumbromid 10mg/ml Hanks-Salts Lösung (Biochrom, Berlin) TAE: Zusammensetzung TAE 50x: Tris-Base 2 M, Eisessig 5,7 %, EDTA 100 mm, ph 8,5 RNAse-, DNSse- und Protease freies Wasser (5 Prime, Hamburg) Enzyme: Dream Taq TM DNS Polymerase (Fermentas, St.-Leon-Rot) Express qpcr SuperMix Universal (Invitrogen, Karlsruhe) 31

43 Tiere, Material und Methoden Antibiotika und Antimykotika: Amphotericin B (250 µg/ml; Biochrom, Berlin) Gentamicin (10 mg/ml; Biochrom, Berlin) Streptomycin/Penicillin (10 mg Streptomycin, IE Penicillin/ml; Biochrom, Berlin) Medium für die Probenlagerung Für die Herstellung von einem Liter Medium, in dem die Tupferproben bei -20 C lagerten, wurde zunächst Kohlewasser angesetzt. Hierzu wurden 5 l Aqua bidest mit 40 g Aktivkohle versetzt, 6 Stunden mit einem Magnetrührer gerührt und dann stehengelassen bis sich die Kohle abgesetzt hatte. Anschließend wurde die Lösung filtriert, autoklaviert und 800 ml des Kohlewassers in einen Glaskolben gegeben. Dann wurden 100 ml 10x konzentrierte Hanks-Salts Lösung, 5 g Bovines Serum Albumin, 210 mg NaHCO 3, 10 ml Streptomycin/Penicillin, 5 ml Gentamicin und 10 ml Amphotericin B hinzugegeben und im Wasser mit Hilfe eines Magnetrührers gelöst. Abschließend wurde der ph-wert mit einer ph-elektrode gemessen. Dieser sollte zwischen 7,5 und 7,2 liegen und lag bei 7,3. Die Gebrauchslösung wurde mit einem Spritzenfilter sterilfiltriert und auf 2 ml Reaktionsgefäße aufgeteilt Mastermix für die Rt-PCR nach CUNHA et al. (2009) Reaktionsvolumen für einen PCR-Ansatz (20 µl): 3,2 µl Wasser 10 µl Express qpcr SuperMix Universal 200 nm dpol771-forward Primer (Operon, Köln; Tabelle 4) 200 nm dpol831-reverse Primer (Operon, Köln; Tabelle 4) 80 nm OvHV-2 Sonde (Operon, Köln; Tabelle 4) 80 nm CpHC-2 Sonde (Operon, Köln; Tabelle 4) 8 nm AlHV-1 Sonde (Operon, Köln; Tabelle 4) 80 nm MCFV-WTD Sonde (Operon, Köln; Tabelle 4) 100 ng Template-DNS Mastermix für die cpcr nach ROVNAK et al. (1998) Reaktionsvolumen für einen PCR-Ansatz (50 µl): 36,5 µl Wasser 1,25 U Dream Taq TM DNS Polymerase 5µl 10x Dream Taq TM Puffer inkl. 20mM MgCl µm datp (Roche, Mannheim) 400 µm dgtp (Roche, Mannheim) 400 µm dttp (Roche, Mannheim) 32

44 Tiere, Material und Methoden 400 µm dctp (Roche, Mannheim) Primer für den ersten Amplifikationsschritt (A): 2 µm DFA Upstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4) 2 µm ILK Upstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4) 2 µm KG1 Downstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4) Primer für den zweiten Amplifikationsschritt (B): 2 µm TGV Upstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4) 2 µm IYG Downstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4) 100 ng Template-DNS wurden für den ersten Amplifikationsschritt (A) eingesetzt, 4 µl PCR- Produkt aus dem ersten Amplifikationsschritt wurden für den zweiten Amplifikationsschritt (B) verwendet. 33

45 Tiere, Material und Methoden Primer und Sonden Die Tabelle 4 zeigt die Primer- und Sondensequenzen der Rt-PCR und der cpcr. Tabelle 4: Primer- und Sondensequenzen für die Rt-PCR und cpcr Rt-PCR (CUNHA et al. 2009) Primer 5-3 Sequenz Reporterfarbstoff (bindet am 5 Ende der Sonde) / Quencher- Farbstoff (bindet am 3 Ende der Sonde) dpol771-forward Primer dpol831-reverse Primer CACACCCAACTGGAGTATGAC ATGTTGTAGTGGGGCCAGTC Sonden OvHV-2 Sonde ATGTGCGCTTCGACCCTC FAM an 5, BHQ1 an 3 AlHV-1 Sonde TCGGTGGGTGACATTCAATA Cy5 an 5, BHQ2 an 3 CpHV-2 Sonde AGTTCCATTCTGAGCGGGT HEX an 5, BHQ1 an 3 MCFV-WTD Sonde ACTTTAACCCCAACCGTCT Texas Red an 5, BHQ2 an 3 cpcr (ROVNAK et al. 1998) Primer DFA ILK TGV IYG KG1 5-3 Sequenz GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNAA TGTAACTCGGTGTAYGGNTTYACNGGNGT CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT 34

46 Tiere, Material und Methoden Die Abbildungen 5 bis 8 zeigen die Nukleotidpositionen der Primer- und Sondenbindungsstellen. Der DNS-Strang des Genoms von OvHV-2 und AlHV-1 sowie Teile des DNS-Strangs von CpHV-2 und MCFV-WTD sind als Linie dargestellt. Die Zahlen am linken und am rechten Ende der Linie zeigen die Anzahl der Basenpaare insgesamt. Die Primer der cpcr sind blau und die Primer und Sonden der Rt-PCR rot dargestellt und mit den Abkürzungen entsprechend Tabelle 4 bezeichnet. Die Pfeile nach rechts bedeuten, dass es sich um eine Vorwärtsprimer handelt, die Pfeile nach links stellen Rückwärtsprimer dar. Die senkrechten Linien grenzen die Bindungsstellen ein. Die Zahlen oberhalb der Linie geben die Länge der Primer und Sonden sowie die Abstände dazwischen in Basenpaaren an. Die Zahlen unterhalb der Linie zeigen die absoluten Nukleotidpositionen der Bindungsstellen an. 35

47 partielles DNS-Polymerase Gen AF OvHV-2 dpol771f Sonde dpol831r DFA ILK TGV IYG KG Tiere, Material und Methoden Abbildung 5: OvHV-2 (Accessionnumber GenBank: AY , bp ) und partielles DNS-Polymerasegen (Accessionnumber GenBank: AF327831, 1297bp) mit Angabe der Nukleotidpositionen (bezogen auf das Gesamtgenom) der Primer- und Sondenbindungsstellen; rot: Rt-PCR, blau: cpcr 36 partielles DNS-Polymerase Gen AF AlHV-1 dpol771f Sonde dpol831r DFA ILK TGV IYG KG Abbildung 6: AlHV-1 (Accessionnumber GenBank: AF005370, bp) und partielles DNS-Polymerasegen (Accessionnumber GenBank: AF031809, 173 bp) mit Angabe der Nukleotidpositionen (bezogen auf das Gesamtgenom) der Primer- und Sondenbindungsstellen; rot: Rt-PCR, blau: cpcr

48 1 partielles DNS-Polymerase Gen AF CpHV-2 dpol771f Sonde dpol831r DFA ILK TGV IYG KG Länge nicht bekannt Tiere, Material und Methoden Abbildung 7: CpHV-2 mit teilweise bekannter Sequenz (Accessionnumber GenBank: AF283477, 3623 bp) und partielles DNS-Polymerasegen (Accessionnumber GenBank: AF275941, 177 bp) mit Angabe der Nukleotidpositionen (bezogen auf die bekannte Sequenz) der Primer- und Sondenbindungsstellen; rot: Rt-PCR, blau: cpcr partielles DNS-Polymerase Gen AF MCFV-WTD dpol771f Sonde dpol831r TGV IYG KG Länge unbekannt Abbildung 8: MCFV-WTD und partielles DNS-Polymerasegen (Accessionnumber GenBank: AF387516, 361 bp) mit Angabe der Nukleotidpositionen (bezogen auf den bekannten Abschnitt des DNS-Polymerasegens) bekannter Primerbindungsstellen der cpcr; rot: Rt-PCR, blau: cpcr

49 Tiere, Material und Methoden Molekulargewichtsmarker λhaeiii Für die Größenbestimmung der in der cpcr amplifizierten DNS-Fragmente wurde die DNS des Phagen λdv1 (Prof. Dr. Dr. G. Hobom, Gießen) mit dem Enzym Hae III verdaut. Dabei entstehen Fragmente mit den Längen (in bp): 1713, 1310, 890, 535, 460, 362, 352, 272, 223, 213, 212, 178, 142, 132,83, 40 (Abbildung 9) bp 1310 bp 890 bp 535 bp 460 bp 362/352 bp 272 bp 223 bp 178 bp Abbildung 9: Molekulargewichtsmarker λhaeiii Positivkontrollen OvHV-2 Um die cpcr und die Rt-PCR zu testen und zu vergleichen, wurden sechs verschiedene OvHV-2 Isolate von klinischen Fällen (benannt A-F, siehe Ergebnisse) verwendet, die zuvor vom Landesuntersuchungsamt Sachsen als OvHV-2- positiv mittels scpcr (BAXTER et al. 1993) diagnostiziert worden waren und freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden. Diese PCR wurde wiederholt, das Produkt aufgereinigt und im Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung der Universität Leipzig sequenziert. Die erhaltenen DNS-Sequenzen wurden mit bereits bekannten Sequenzen aus der NCBI GenBank mit Hilfe der BLAST Software verglichen. Anschließend wurden Verdünnungsreihen in 2er Stufen (unverdünnt, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80) dieser Proben hergestellt. Die Verdünnungsreihen dienten dazu, sowohl die cpcr (ROVNAK et al. 1998) als auch die Rt-PCR (CUNHA et al. 2009) zu testen und die Sensitivität der beiden PCRs zu vergleichen. Die PCR-Produkte der cpcr wurden ebenfalls aufgereinigt und sequenziert. Diejenige Positivkontrolle, die im Vergleich zu den anderen Kontrollen als erste einen deutlichen Anstieg in der Fluoreszenz (Rt-PCR) bzw. eine deutlich sichtbare Bande auf dem Agarosegel (cpcr) zeigte, wurde anschließend aliquotiert und für die Probenuntersuchung eingesetzt. 38

50 Tiere, Material und Methoden AlHV-1 Zur Auswahl einer zweiten Positivkontrolle wurden vier verschiedene Positivkontrollen für AlHV-1 (Stamm C500) (benannt F-J) und deren Verdünnungsstufen (unverdünnt, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80) analog der Positivkontrollen für OvHV-2 in der cpcr und in der Rt-PCR getestet. Die Positivkontrollen für AlHV-1 wurden aus AlHV-1-infizierten B-Lymphozyten (F), aus Zellkultur (G), aus infizierten Mediastinallymphknoten eines Versuchskaninchens (H) und Zellen aus dem Buffy Coat eines infizierten Rindes (J) gewonnen 1. Wie bei den Positivkontrollen für OvHV-2 wurde diejenige Positivkontrolle, die im Vergleich zu den anderen Kontrollen als erste einen deutlichen Anstieg in der Fluoreszenz (Rt-PCR) bzw. eine deutlich sichtbare Bande auf dem Agarosegel (cpcr) zeigte, anschließend aliquotiert und für die Probenuntersuchung eingesetzt. 1 Freundlicherweise zu Verfügung gestellt von Dawn Grant, Virology Division, Moredun Research Institute, Groß-Britannien 39

51 Tiere, Material und Methoden 3.3 Methoden Probenentnahme Von den in Tabelle 3 aufgeführten Tieren wurden insgesamt 686 Proben genommen. Die folgende Tabelle 5 zeigt die Aufteilung der Proben. Tabelle 5: Probenanzahl und Aufteilung Tupferproben Blutproben Augentupfer Nasentupfer 228 Analtupfer 211 gesamt Diese Proben stammen sowohl von Tieren, die routinemäßig untersucht wurden, etwa zur Neonatenkontrolle, als auch von Tieren, die aus anderen Gründen, etwa wegen Behandlungen oder Impfungen, gefangen wurden. Dazu wurden jeweils separat von Augen-, Nasen-, und Analschleimhaut mit sterilem Abstrichbesteck Tupferproben genommen, bei 17 Tieren nur von Augen- und Nasenschleimhaut. Von 10 Tieren wurden mehrfach Proben genommen. Eine zusätzliche Blutprobenentnahme erfolgte bei 19 Tieren. Die Tupfer wurden zur Probenentnahme mindestens 3 Sekunden auf der Schleimhaut belassen bis sie vollgesogen waren. Anschließend wurden jeweils 2 ml steriles Medium zu den Tupfern hinzu gegeben. Die Proben wurden bis zum Transport bei -20 C gelagert, gut isoliert mit Kühlakkus transportiert und bei Ankunft im Labor bis zur Untersuchung bei -20 C aufbewahrt. Die Entnahme der Blutproben erfolgte mit sterilen Spritzen und EDTA-Röhrchen. Diese Proben wurden bis zur Untersuchung bei 7 C gelagert DNS-Isolierung Zur Untersuchung wurden die Proben aufgetaut und gevortext. Dann wurde mit Hilfe einer Glaspipette und einer Pipettierhilfe 1 ml des Mediums bzw. 1 ml Blut mit den darin enthaltenen Zellen in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß übergeführt und die DNS mit einem DNS-Isolierkit nach Gebrauchsanleitung des Herstellers isoliert. Nach der Herstellung des entsprechenden Mastermixes wurde die virale DNS in den Proben durch eine Rt-PCR für OvHV-2, AlHV-1, CpHV-2 und MCFV-WTD (CUNHA et al. 2009) amplifiziert. 40

52 Tiere, Material und Methoden Spektrophotometrie zur Bestimmung des DNS-Gehalts Nach CUNHA et al. (2009) sollten 100 ng DNS für die PCR eingesetzt werden. Um den DNS- Gehalt der Isolate zu bestimmen, wurde ein Spektrophotometer eingesetzt, mit dem bei 100 Proben der DNS-Gehalt gemessen wurde. Der mittlere DNS-Gehalt wurde berechnet und lag bei 20 ng DNS pro µl Isolat. Demnach wurden pro Reaktion 5 µl Isolat eingesetzt. War eine Probe in der Rt-PCR positiv, bei der der DNS-Gehalt zuvor nicht bestimmt worden war, wurde bei dieser und allen weiteren Proben dieses positiven Tieres zusätzlich der DNS-Gehalt der Probenisolate bestimmt. Isolate, in denen ein Vielfaches von 100 ng DNS pro µl vorhanden war, wurden verdünnt und nochmals in der Rt-PCR untersucht, um falsch negative Ergebnisse durch eine Überladung der PCR mit zu viel DNS zu vermeiden Rt-PCR Protokoll nach CUNHA et al. (2009) Für die Rt-PCR wurden ein Vorwärts- und ein Rückwärtsprimer ( 3.2.6) sowie vier Sonden für die vier nachzuweisenden Viren OvHV-2, AlHV-1, CpHV-2 und MCFV-WTD- verwendet. Die Sonden waren mit vier unterschiedlichen Farbstoffen markiert ( 3.2.6). Befand sich eines der gefragten Viren in der Probe, band die entsprechende Sonde zwischen den beiden Primern. Während die Polymerase die DNS-Sequenz zwischen den Primern amplifizierte, verdrängte sie die Sonde, wobei der fluoreszierende Farbstoff frei wurde und gemessen werden konnte. Da die Farbstoffe an den Sonden alle eine unterschiedliche Wellenlänge besaßen, ließ sich anhand der gemessenen Wellenlänge auf den Farbstoff und damit auf die spezifische Sonde und das vorhandende Virus rückschließen. Die Rt-PCR wurde mit einem MxPro 3000 Rt-PCR Gerät und der dazugehörigen MxPro Software mit folgendem Protokoll durchgeführt: Die PCR begann mit einer Temperatur von 50 C für 2 min. Die erste Denaturierung der DNS erfolgte bei 95 C für 2 min. Anschließend folgten 40 Zyklen mit je einem Denaturierungsschritt bei 95 C für 15 sec, gefolgt von einem Reaktionsschritt bei 60 C für 45 sec, währenddessen die Primer mit der Template-DNS hybridisierten und die Polymerase die zu vervielfältigende DNS amplifizierte. Nach jedem der 40 Zyklen wurde die frei werdende Fluoreszenz gemessen, mit der des vorherigen Zyklus verglichen, die Differenz der beiden Werte in ein Koordinatensystem eingetragen und als Graph dargestellt. Proben, bei denen die Fluoreszenz vor dem 40. Zyklus anstieg und deren Graph als Sättigungskurve verlief, wurden als positiv gewertet (CUNHA et al. 2009). Bei jeder PCR wurden stets die gleichen zwei Positivkontrollen für OvHV-2 (B) und für AlHV-1 (J) in den Verdünnungsstufen 1:10 und 1:40 bzw. 1:10 und 1:80 verwendet. Außerdem wurde stets mindestens eine Negativkontrolle (Wasser) mitgeführt. 41

53 Tiere, Material und Methoden cpcr Protokoll nach Rovnak et al. (1998) Bei Rt-PCR positiven Proben wurde zunächst der DNS-Gehalt bestimmt. Anschließend wurden diese mit einer cpcr für Herpesviren (ROVNAK et al. 1998) untersucht, für die ebenfalls zunächst ein Mastermix hergestellt wurde. Anschließend wurde die cpcr mit folgendem Protokoll in einem PTC-200 Thermocycler Gerät durchgeführt: Die Denaturierung der DNS erfolgte bei 94 C für 3 min. Die Primer hybridisierten an die Template-DNS bei 60 C für 2 min. Die Elongation der zu vervielfältigenden DNS erfolgte bei 72 C für 1 min. Nach 40 Zyklen mit einem Denaturierungsschritt bei 94 C für 30 sec, einem Annealingschritt bei 46 C für 1 min und einem Elongationsschritt bei 72 C für 1 min folgte eine Inkubation der Reaktion von 7 min bei 72 C, um noch nicht beendete Amplifikationen zu beenden. Anschließend wurden die PCR-Produkte bei 4 C gekühlt. Bei der cpcr wurde stets die gleiche, unverdünnte OvHV-2- Positivkontrolle sowie mindestens eine Negativkontrolle (Wasser) mit untersucht Agarosegel-Elektrophorese Jeweils 5 µl der PCR-Produkte wurden für die Elekrophorese mit DNS-Ladepuffer versetzt und auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen. Die Agarose wurde dafür zuvor in TAE (Tris-Acetat-EDTA- Puffer) durch Erwärmung im Mikrowellengerät gelöst und in die vorbereiteten Gelschlitten gegossen. Die Elektrophorese wurde in TAE bei 130V durchgeführt, bis sich das Bromphenolblau des Ladepuffers in der Mitte des Gels befand. Dabei wurden die PCR-Produkte der Größe nach aufgetrennt, wobei sich kleinere PCR-Produkte weiter als große von der Anode auf die Kathode zubewegten, da die großen PCR-Produkte durch die Gelporen zurückgehalten werden. Anschließend wurde das Gel im Ethidiumbromidbad gefärbt, die DNS im Transilluminator mittels UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert. Zur Analyse der Gelelektrophoresebilder diente die Software AlphaImager Im Fall der cpcr lag die zu erwartende Produktgröße einer positiven Probe bei bp. Proben mit Amplifikaten dieser Größe wurden als positiv gewertet Aufreinigung der PCR Produkte und Sequenzierung Die PCR-Produkte dieser positiven Proben wurden mit einem Aufreinigungskit nach Anleitung des Herstellers bearbeitet und im Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung der Universität Leipzig sequenziert. Die erhaltenen DNS-Sequenzen wurden mit bereits bekannten Sequenzen aus der NCBI GenBank mit Hilfe der BLAST Software verglichen. 42

54 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Vorversuche Positivkontrollen Um die Vorgehensweise zur Untersuchung der Proben zu etablieren, wurden zunächst die Proben A bis J in 2er Schritten bis 1:80 verdünnt und deren Gesamt-DNS-Gehalt gemessen. Anschließend wurden alle Verdünnungen sowohl in der cpcr als auch in der Rt-PCR eingesetzt. Die Ergebnisse sind in der folgenden (Tabelle 6) dargestellt. In der linken Spalte sind die verschiedenen Proben eingetragen. Unverdünnt, 1:10, 1:20, usw. stehen für die einzelnen Verdünnungsstufen. Pos bedeutet, dass die entsprechende Probe in der angegebenen Verdünnung und der angegebenen Methode positiv, neg, dass diese Probe negativ war. Die letzte Spalte gibt Auskunft darüber, bis zu welcher Verdünnungsstufe die cpcr bzw. die Rt-PCR positive Proben als positiv erkennt. Durch den Vergleich der Agarosegelbilder mit den Graphen der Rt-PCR entstand folgendes Bild (Tabelle 6). Tabelle 6: Vergleich Sensitivität cpcr und Rt-PCR der Proben A bis J in den Verdünnungsstufen unverdünnt, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 unverdünnt 1:10 1:20 1:40 1:80 PCR cpcr Rt- PCR cpcr Rt- PCR cpcr Rt- PCR cpcr Rt- PCR cpcr Rt- PCR Sensitivität Probe A pos pos pos pos pos neg pos pos neg pos inkonstant Probe B pos pos pos pos neg pos neg pos neg neg Rt-PCR >cpcr Probe C pos pos neg pos neg pos neg pos neg pos Rt-PCR inkonstant>cpcr Probe D / pos pos pos pos pos / / / / Rt-PCR =cpcr Probe E pos pos pos pos neg pos neg neg neg neg Rt-PCR >cpcr Probe F / / neg pos neg pos neg pos neg / Rt-PCR >cpcr Probe G / / pos pos neg pos neg pos neg pos Rt-PCR >cpcr Probe H pos / neg pos neg pos neg pos neg pos Rt-PCR >cpcr Probe J / / / pos neg pos neg pos neg pos Rt-PCR >cpcr 43

55 Ergebnisse Bei den Proben B, C, E, F, G, H und J erwies sich die Rt-PCR als sensitiver gegenüber der cpcr. Bei der Probe D war die Sensitivität in der Rt-PCR und der cpcr gleich. Die Proben A und C ergaben inkonstante Bilder. Aufgrund der besseren Sensitivität der Rt-PCR bestätigte sich die geplante Vorgehensweise, zuerst die Rt-PCR auf alle Proben anzuwenden, Rt-positive Proben mit der cpcr nach zu untersuchen und anschließend die Produkte sequenzieren zu lassen. Als Positivkontrollen für die Probenuntersuchungen eigneten sich die Proben B, D, E, F, G, H und J. Da von den Proben B und J am meisten Isolat zur Verfügung stand, wurden sie in der Rt- PCR als Positivkontrollen eingesetzt, um für alle Versuche in der Rt-PCR die gleichen Kontrollen verwenden zu können. In der cpcr wurde anstatt der Probe J die Probe G verwendet, da die Probe J für die cpcr nicht geeignet war. Die folgenden Abbildungen zeigen die Graphen der Rt-PCR der Positivkontrollen B (Abbildung 10) und J (Abbildung 12) und ihrer Verdünnungsstufen (B1: blau, B2: rot, B3: grün, B4: grau; J1: grau, J2: grün, J3: rot, J4: blau). Auf der x-achse sind die Anzahl der Zyklen aufgetragen, auf der y-achse die Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus. Die horizontale Linie stellt den von der MxPro Software bestimmten Grenzwert dar, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (Cycle of threshold, Ct) (CUNHA et al. 2009). Die zugehörigen Standardkurven finden sich jeweils in der Abbildung darunter (Abbildungen 11 und 13) und wurden mit der MxPro Software berechnet. Auf der x-achse ist die Verdünnungsstufe aufgetragen, auf der y-achse der zugehörige Ct-Wert. Da die Positivkontrollen von Reservoirwirten stammen und die Anzahl an DNS-Molekülen in diesen Proben zuvor nicht bestimmt worden war, diente diese Untersuchung ausschließlich dem Vergleich der Sensitivitäten der einzelnen PCR-Protokolle untereinander. 44

56 Ergebnisse Abbildung 10: Positivkontrollen B1 (blau), B2 (rot), B3 (grün), B4 (grau) in der Rt-PCR; x-achse: Anzahl der durchlaufenen Amplifikationszyklen; y-achse: Differenz der frei gewordenen Fluoreszenz B4 B3 B2 B1 Abbildung 11: Standardkurve Positivkontrollen B1, B2, B3, B4 in der Rt-PCR als logarhytmische Funktion; x-achse: Verdünnungsstufe ; y-achse: Cycle of threshold 45

57 Ergebnisse Abbildung 12: Positivkontrollen J1 (grau), J2 (grün), J3 (rot), J4 (blau) in der Rt-PCR; x-achse: Anzahl der durchlaufenen Amplifikationszyklen; y-achse: Differenz der frei gewordenen Fluoreszenz J4 J3 J2 J1 Abbildung 13: Standardkurve Positivkontrollen J1, J2, J3, J4 in der Rt-PCR als logarhytmische Funktion; x-achse: Verdünnungsstufe ; y-achse: Cycle of threshold 46

58 Ergebnisse Die folgenden Gelbilder (Abbildung 14) zeigen die Ergebnisse der cpcr mit den Positivkontrollen B und J und ihren Verdünnungsstufen 0 bis 4 (vgl. Tabelle 6). M ist der Molekulargewichtsmarker, die Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die PCR-Produkte liegen. Die positiven Banden, um die es sich in der jeweiligen Abbildung handelt, sind mit einem Rahmen markiert. 272 bp 223 bp 272 bp 223 bp M B2 B3 B4 M B0 B1 272 bp 223 bp M G1 272 bp 223 bp M J2 J3 J4 Abbildung 14: Gelelektrophoresebilder der Positivkontrollen B0-B4, G1 und J 2-4 cpcr M: Molekulargewichtsmarker; B0: Positivkontrolle B unvervünnt; B1: Positivkontrolle B 1:10 Verdünnung; B2: Positivkontrolle B 1:20 Verdünnung; B3: Positivkontrolle B 1:40 Verdünnung; B4: Positivkontrolle B 1:80 Verdünnung; G1: Positivkontrolle G 1:10 Verdünnung; J2: Positivkontrolle J 1:20 Verdünnung; J3: Positivkontrolle J 1:40 Verdünnung; J4: Positivkontrolle J 1:80 Verdünnung 47

59 Ergebnisse 4.2 Ergebnisse der Probenuntersuchungen Ergebnisse der Rt-PCR 649 Tupferproben und eine Blutprobe von 214 Tieren wurden zunächst in der Rt-PCR untersucht. Tabelle 7 gibt eine Übersicht über die positiven Proben. Die positiven Tiere sind aufgeführt und die dazugehörigen Proben mit dem Vermerk, welche positiv und welche negativ in der Rt-PCR waren. Außerdem ist aufgeführt, um welches Virus es sich laut Rt-PCR bei der jeweiligen Probe handelt. Tabelle 7: Liste der positiven Proben in der Rt-PCR mit Angabe der Tiere, der dazugehörigen Proben und dem Ergebnis der Rt-PCR Tiere und Probennummern Augentupfer Nasentupfer Analtupfer Virus 0,1 Burenziege 242 neg pos neg MCFV-WTD 0,1 Kamerunschaf 265 pos pos neg OvHV-2 0,3 Kamerunschafe 264, 266, 267 neg pos neg OvHV-2 0,1 Kamerunschaf 268 neg neg pos OvHV-2 0,1 Markhor 129 pos pos neg CpHV-2 0,3 Markhore 126,132,136 neg pos neg CpHV-2 0,2 Pfauenziegen 22,29 neg pos neg CpHV-2 0,3 Pfauenziegen 17, 23,26 neg pos neg MCFV-WTD 0,1 Sikahirsch 127 pos pos pos CpHV-2 0,1 Skudde 270 neg pos pos OvHV-2 0,1 Skudde 272 neg pos neg OvHV-2 2,1 Weiße Deutsche Edelziegen 243, 245, 248 neg pos neg CpHV-2 0,1 Zwergziege 261 neg pos neg OvHV-2 Die folgenden Abbildungen 15 bis 19 zeigen die Ergebnisse der Rt-PCR und der cpcr. Jeder positiven Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cpcr) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist. Die Abkürzungen A, N und R stehen für Augen-, Nasen- und Rektaltupfer. Auf der x-achse der Graphen der Rt-PCR sind die Anzahl der Zyklen aufgetragen, auf der y- Achse die Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus. Die horizontale Linie stellt den von der MxPro Software bestimmten Grenzwert dar, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009). Auf den Gelbildern sind die positiven Banden, um die es sich in der jeweiligen Abbildung handelt, mit einem Rahmen markiert. M ist der Molekulargewichtsmarker, die Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen. 48

60 Ergebnisse 26N (blau), 17N (grün), 23N (rot), 22N (grau); rote Linie: Ct 26N, 17N, 23N; grüne Linie: Ct 22N 272 bp 272 bp 223 bp 223 bp M 17N 23N 26N M Abbildung 15: Rt-PCR und cpcr; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cpcr) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (17N, 22N, 23N, 26N, 29N); N = Nasentupfer; x-achse= Anzahl der Zyklen; y-achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Molekulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR- Produkte liegen 49 29N

61 Ergebnisse 129N (grau), 127A (grün), 126N (gelb), 127R (blau), 127N (rot), 129A (hellblau) 272 bp 223 bp M 129N Abbildung 16: Rt-PCR und cpcr; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cpcr) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (126N, 127A, 127N, 127R, 129A, 129N); A= Augentupfer; N = Nasentupfer; R= Rektaltupfer; x-achse= Anzahl der Zyklen; y-achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Molekulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen. 50

62 Ergebnisse 136N (blau), 132N (rot) 272 bp 223 bp M 132N Abbildung 17: Rt-PCR und cpcr; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cpcr) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (132N, 136N, 242N); N = Nasentupfer; x-achse= Anzahl der Zyklen; y-achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Molekulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen N

63 Ergebnisse 272 bp 223 bp M 243N 243N (grün), 245N (rot), 248N (blau) 272 bp 223 bp M 265N 265N (grün), 265A (grau), 264A (rot), 261N (blau) Abbildung 18: Rt-PCR und cpcr; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cpcr) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (243N, 245N, 248N, 261N, 264A, 265A, 265N; A= Augentupfer; N = Nasentupfer; x-achse= Anzahl der Zyklen; y-achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Molekulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen. 52

64 Ergebnisse 267N (grün), 270N (rot), 266N (gelb), 270R (blau), 272N (grau), 268R (hellblau) 272 bp 223 bp 272 bp 223 bp M 266N 267N M 270R 272N Abbildung 19: Rt-PCR und cpcr; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cpcr) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (266N, 267N, 268R, 270N, 270R, 272N); N = Nasentupfer; R= Rektaltupfer; x-achse= Anzahl der Zyklen; y-achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Molekulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen. 53