DER LABLOEFFLER. NEWS für das LABOR. Heft , Nr. 11

Transkript

1 DER LABLOEFFLER NEWS für das LABOR Heft , Nr. 11

2 Liebe Kolleginnen und Kollegen, moderne Tierseuchendiagnostik hat neben dem Nachweis von altbekannten Infektionskrankheiten zunehmend mit früher als exotisch bezeichneten Erregern zu tun. Dazu kommen bisher gänzlich unbekannte Pathogene wie Schmallenberg Virus oder das neue humanpathogene Bunthörnchen-Bornavirus VSBV-1. Nur durch Einsatz optimierter, modernster Untersuchungsverfahren sind diese Herausforderungen zu bewältigen. In diesem Spannungsfeld bewegen sich auch die Themen der 7. Riemser Diagnostiktage, in dessen Programm wir mit dem aktuellen LABLoeffler einen Einblick bieten wollen. Die Bandbreite reicht von altbekannten Klassikern bis hin zu den allerneuesten Entdeckungen. Wir sind gespannt darauf, wie Ihnen die Kombination aus bewährten Themen und Tagungs-Special gefällt, denn bei positiver Resonanz wollen wir sie bei den nächsten Riemser Diagnostiktagen in zwei Jahren weiterführen. Leider haben wir im zweiten LABLoeffler für dieses Jahr aber auch eine sehr traurige Nachricht zu vermitteln. Der plötzliche und völlig unerwartete Verlust unseres sehr geschätzten Kollegen Dr. Bernd Haas macht uns immer noch sehr betroffen. Ihm zum Gedenken finden Sie einen Nachruf am Ende dieses Heftes. Inhalt Seite 2 Vorwort Seite 3 Inhaltsverzeichnis Seite 4 Ringversuch Echinokokkose Seite 5-7 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Kotproben von Rindern Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. Mettenleiter Prof. Dr. Martin Beer Seiten 8-9 BSE- und Scrapie-Ringversuche 2015 Seiten Ringversuch Chlamydiose 2015 Seiten Steckbrief Bunthörnchen-Borna-Virus 1 Seiten Riemser Diagnostiktage: Grußwort, Programm Seite 20 (Ausgewählte Abstracts Seiten 20-25) Hochpathogene aviäre Influenza in Deutschland: Ausbruch oder Einbruch? Seite 21 Was wir in den letzten Jahren über die ASP gelernt haben Seite 22 BTV ante portas - Neues zur Blauzungenkrankheit Seite 23 Einfluss sprühgetrockneten Blutplasmas im Schweinefutter auf die PRRSV-Antikörperdiagnostik Seiten DetektiVir: Ein neuer integrativer Ansatz zur Verknüpfung NGS-basierter Virendetektion mit der Entwicklung maßgeschneiderter molekularer Diagnostik Seite 25 Impressum, Redaktionsteam Seiten Nationale Referenzlaboratorien Seite 30 Zulassungsstelle Seite 31 Nachruf Dr. Bernd Haas LABLoeffler , Heft 2 Seite 2 LabLoeffler , Heft 2 Seite 3

3 Ringversuch zur Echinokokkose 2015 Pavlo Maksimov, Sebastian Press, Franz J. Conraths Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Epidemiologie, Nationales Referenzlabor für Echinokokkose, Greifswald Insel Riems Anmeldung Das Nationale Referenzlabor für Echinokokkose im Friedrich-Loeffler-Institut teilte den obersten für das Veterinärwesen zuständigen Landesbehörden am mit, dass es beabsichtige, im Jahre 2015 einen Ringversuch zur Echinokokkose (Nachweis von Echinococcus spp. in der Darmschleimhaut eines Endwirts) durchzuführen, und bat um Anmeldung der an einer Teilnahme interessierten staatlichen Untersuchungseinrichtungen im jeweiligen Zuständigkeitsbereich bis zum Darüber hinaus wurden Privatlaboratorien, von denen bekannt war, dass sie Untersuchungen auf Echinokokkose durchführen, die Möglichkeit zur Teilnahme an dem Ringversuch eingeräumt. Insgesamt meldeten sich 16 Einrichtungen für den Ringversuch an. Material und Methoden Das Probenmaterial bestand aus nativer Darmschleimhaut von Füchsen, in denen Adulte von Echinococcus multilocularis enthalten waren oder nicht. Die Proben waren zuvor zur Inaktivierung von E. multilocularis nach dem im NRL für Echinokokkose üblichen Verfahren vorbehandelt worden (mindestens eine Woche Aufbewahrung bei -80 C). Die Voruntersuchung im NRL für Echinokokkose erfolgt mit einer Variante der Intestinal Scraping Technique (Tackmann et al. 2006) blind in fünf unabhängigen Untersuchungen je Kategorie. Den am Ringversuch teilnehmenden Einrichtungen wurde vorgeschlagen, die Proben ebenfalls mit Hilfe der Intestinal Scraping Technique (Deplazes & Eckert, 1996; Eckert et al. 2001; Tackmann et al. 2006) zu untersuchen. Diese Methodik ist auch in der Amtlichen Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs für anzeigepflichtige Tierseuchen (Methodensammlung) beschrieben, die über das Tierseuchen- NachrichtenSystem (TSN) und die Homepage des FLI unter abgerufen werden kann. Die Wahl der Untersuchungsmethode blieb den Einrichtungen jedoch überlassen. Der Versand der Proben erfolgte planmäßig in der 23. Kalenderwoche. Ergebnisse Die vom NRL für Echinokokkose bestimmten Sollwerte für die Proben lauteten: Probe 1: negativ Probe 2: positiv Probe 3: positiv (stark positiv) Von den 16 Einrichtungen, die an dem Ringversuch teilnahmen, beurteilten 15 (93,8 %) die Probe 1 als negativ, 15 (93,8 %) die Probe 2 als positiv und 16 (100 %) die Probe 3 als positiv. Eine von 16 teilnehmenden Einrichtungen hat den Ringtest zur Echinokokkose 2015 nicht bestanden. Die Einrichtung bewertete die Proben 1 und 2 falsch, die Probe 3 wurde aber dennoch als positiv bewertet (Abbildung 1). Abb.1: Ergebnisse zu dem Ringversuch zur Echinokokkose 2015 Abb.2 Anteile der verwendeten Untersuchungsmethoden in dem Ringversuch zur Echinokokkose 2015 Als Untersuchungsmethoden kam die Intestinal Scraping Technique in 15 Einrichtungen (94 %), und die Normsiebtechnik nach Bauer (Eskens, 1997) in einer Einrichtung (6 %) zum Einsatz. (Abbildung 2). Jeder Einrichtung, die am Ringversuch teilgenommen hatte, wurde das im Vergleich zum Sollwert erzielte Ergebnis am und am in einer Teilnahmebestätigung übermittelt. Diskussion Der Ringversuch zeigte, dass die Erkennung E. multilocularis-positiver Proben bei einem geringen bis mittleren Schwierigkeitsgrad des Probenmaterials regelmäßig gelang. Ergebnisse der Laborvergleichsuntersuchung: Nachweis von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Kotproben von Rindern Heike Köhler Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Molekulare Tuberkulose, Nationales Referenzlabor (NRL) für Paratuberkulose, Jena Im Jahr 2014 wurde eine Laborvergleichsstudie organisiert, bei der die Qualität der Methoden geprüft werden sollte, die in der Routinediagnostik für den Nachweis von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in Kotproben von Rindern eingesetzt werden. Methodische Vorgaben für den kulturellen Nachweis von MAP in Kotproben von Rindern sind in der Amtlichen Methodensammlung des FLI niedergelegt. Für den Direktnachweis von MAP-Genom in Kotproben stehen derzeit 3 zugelassene PCR-Kits zur Verfügung, es kommen aber nach wie vor auch diverse In-house-Methoden zum Einsatz. An der Vergleichsstudie nahmen 25 Labors aus dem In- und Ausland sowie das NRL selbst teil. Die Teilnehmer waren aufgefordert, die bereitgestellten Proben mit dem in ihrem Haus etablierten Kulturverfahren und/oder Direkt-PCR-Verfahren zum Nachweis von MAP in Kotproben zu untersuchen. Für die Studie wurden 17 MAP-positive und 5 MAP-negative native Kotproben von Rindern vorbereitet. Die MAPnegativen Proben stammten von Tieren aus Paratuberkuloseunverdächtigen Beständen. Zur Charakterisierung wurden die Proben in zwei aufeinanderfolgenden Durchgängen kulturell untersucht (Kultur 1: ein Aliquot, Kultur 2: fünf Aliquots). Es wurden positive Proben mit hoher (n=6), mittlerer (n=3) und schwacher Belastung (n=8) mit MAP zur Verfügung gestellt (Tabelle 1). Nach dem Versand der Proben an die Labors wurde Tab.1: Ergebnisse der Voruntersuchungen und Charakterisierung der Proben ein weiteres Aliquot im NRL für Paratuberkulosekulturell und mittels Direkt-PCR (zweifach) untersucht. Je 20 Teilnehmer der Studie führten den kulturellen Erregernachweis und/oder den Direktnachweis von MAP mittels PCR durch. Die Kulturverfahren unterschieden sich in der Dauer des Dekontaminationsschritts, der Zentrifugation oder Sedimentation der Proben sowie der Art und Anzahl der Nährmedien (Tabelle 2). Die Speziesbestätigung von MAP erfolgte entweder mittels PCR (11 Labors) oder durch eine Kombination von PCR und kulturellem Nachweis der Mykobaktin-Abhängigkeit (8 Labors). In einem Labor wurde nur Mykobaktin-abhängiges Wachstum untersucht. Beim Direktnachweis mittels PCR kamen 12 verschiedene DNA-Extraktionsprotokolle, 3 zugelassene PCR-Kits sowie 6 andere PCR-Methoden zur Anwendung (Tabelle 3). Mit der kulturellen Anzüchtung und dem Direktnachweis von MAP-Genom stehen den diagnostischen Labors effektive Nachweisverfahren für MAP in Kotproben von Rindern zur Verfügung. Bei Einsatz der kulturellen Anzüchtung erkannten 65 % der beteiligten Labore alle negativen und mindestens 14 der positiven Proben (> 82 %) als positiv (Abbildung 1). Bei der Direkt-PCR wurde diese Effektivität durch 60 % der beteiligten Labore erreicht (Abbildung 2). Die Nachweisrate sank mit abnehmender MAP-Belastung der Proben ab. Eindeutige methodische Einflussfaktoren auf die Nachweisrate der kulturellen Anzüchtung ließen sich nicht identifizieren. Unbefriedigende Ergebnisse scheinen überwiegend durch die praktische Durchführung der Methoden und die geringe Erfahrung des Personals bedingt zu sein (Tabelle 4). Bei der Verwendung zugelassener PCR-Kits in Kombination mit einer vom Hersteller empfohlenen DNA-Extraktionsmethode werden bei der Direkt-PCR hohe Nachweisraten erzielt (Tabelle 5). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Effektivität des Nachweises von MAP in Kotproben in den beteiligten Labors seit der letzten Laborvergleichsuntersuchung 2008/2009 deutlich verbessert hat. LabLoeffler , Heft 2 Seite 4 LabLoeffler , Heft 2 Seite 5

4 Tab.2: Methodische Unterschiede bei der kulturellen Anzüchtung von MAP aus Kotproben zwischen den beteiligten Labors Tab.3: Methodische Unterschiede zwischen den beteiligten Labors beim Direktnachweis von MAP-Genom in Kotproben mittels PCR Erläuterungen: HPC - Hexadecylpyridiniumchlorid Monohydrat; ÜN über Nacht; k. A. keine Angaben; HEYM Herrold s Egg Yolk Medium Tab.4: Einflussfaktoren auf die Ergebnisse der kulturellen Anzüchtung prozentualer Anteil der Labors, die die jeweilige Probe richtig beurteilt haben, bezogen auf den Faktor Tab.5: Einflussfaktoren auf die Ergebnisse des Direktnachweises mittels PCR prozentualer Anteil der Labors, die die jeweilige Probe richtig beurteilt haben, bezogen auf den Faktor Abb.1: Übersicht über die Ergebnisse der kulturellen Anzüchtung von MAP in Kotproben in den Labors, die sich an der Laborvergleichsstudie beteiligt haben (Laborcode verschlüsselt) Erläuterungen: EWZ Einwirkzeit: 1 24 h, 2 > 24 h; Einengung: 1 Sedimentation, 2 Zentrifugation; Medium: 1 industrielle Herstellung, 2 eigene Herstellung; n Röhrchen: (1) 3-4, (2) 5-9; Bestätigungstest: 1 PCR, 2 Mykobaktin-Abhängigkeit + PCR LabLoeffler , Heft 2 Seite 6 Erläuterungen: Extraktionsmethode: 1 Bead-basiert, 2 Silika-Membran-basier; PCR-Methode: 1 zugelassenes Kit, 2 nicht zugelassenes Kit/in-house Methode Abb.2: Übersicht über die Ergebnisse des Direktnachweises von MAP-Genom in Kotproben mittels PCR in den Labors, die sich an der Laborvergleichsstudie beteiligt haben (Laborcode verschlüsselt) LabLoeffler , Heft 2 Seite 7

5 BSE- und Scrapie-Ringversuche Ergebnisse und Interpretation Anne Balkema-Buschmann und Martin H. Groschup Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger, Nationales Referenzlabor für Transmissible Spongiforme Enzephalopathien, Greifswald Insel Riems Im Mai/Juni 2015 führte das Nationale Referenzlabor (NRL) wieder den jährlichen Ringversuch für BSE und Scrapie durch. Nach Abschluss des Ringversuchs erhielten alle teilnehmenden Labors die Zertifikate über die erfolgreiche Teilnahme als Voraussetzung für die Durchführung der amtlichen Untersuchungen bis Ende Juni Vorbereitung und Durchführung des Versuchs Das BSE-Probenset enthielt fünf verschlüsselte Proben: drei negative sowie zwei positive Proben. Dies waren 1:4 und 1:8 Verdünnungen einer klassischen BSE-Probe. Das Scrapie-Probenset enthielt ebenfalls fünf verschlüsselte Proben: neben zwei negativen Proben wurde eine Probe einer klassische Scrapie-Probe in einer Verdünnung von 1:32, sowie zwei Aliquots derselben atypischen Scrapie-Probe in einer Verdünnung von 1:3 versandt. Dies diente der Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in den teilnehmenden Labors. Beide Probensätze wurden vorab am NRL mit beiden im Ringversuch eingesetzten ELISA-Testverfahren sowie durch die jeweiligen Hersteller untersucht. Ergebnisse Am BSE-Ringversuch nahmen 13 Labors teil. Während in 10 Labors der IDEXX BSE EIA zum Einsatz kam (Abb. 1), wurde in zwei Labors der PrioSTRIP-Test und in einem Labor der Bio- Rad TeSeE-Test eingesetzt. Alle Labors erkannten alle Proben in der ersten Untersuchung korrekt. Tendenziell wurden bei Verwendung des Kurzprotokolls minimal höhere OD-Werte erreicht als bei der Verwendung des Ultrakurzprotokolls. Das durchgeführte Protokoll scheint somit keinen gravierenden Einfluss auf die erzielten Ergebnisse bei der Untersuchung von BSE-Proben zu haben. Im direkten Vergleich der mit beiden Testverfahren ermittelten OD-Werte lagen die mit dem IDEXX HerdChek BSE EIA erzielten Werte deutlich über den mit dem TeSeE-Test ermittelten Werten. Am Scrapie-Ringversuch nahmen 12 Labors teil, die alle ebenfalls am BSE-Ringversuch teilnahmen. Für die Untersuchung von Hirnstammproben kleiner Wiederkäuer kommen in Deutschland derzeit nur der IDEXX HerdChek BSE/Scrapie EIA-Test (10 Labors; Abb. 3) und der BioRad TeSeE-Test (zwei Labors) zur Anwendung. Wie schon in der Vergangenheit zeichneten sich auch in diesem Jahr in zwei Labors bei Verwendung des IDEXX HerdChek BSE/Scrapie EIA-Tests Schwierigkeiten in der korrekten Erkennung der atypischen Scrapieproben ab. In einem anderen, den TeSeE-Test einsetzenden Labor, wurde dagegen zunächst die klassische Scrapieprobe nicht korrekt erkannt. Somit wurden lediglich in 9 der 12 Labors alle Proben in der ersten Untersuchung korrekt erkannt. Bei der Untersuchung der beiden Proben derselben Verdünnungsstufe kam es zu Abweichungen von bis zu 50 %, im Durchschnitt wurden Abweichungen um etwa 20 % beobachtet. Bei Verwendung dieses Tests wurde in einem Labor im ersten Durchlauf nur eine der atypischen Scrapieproben als positiv detektiert. In der Wiederholungsuntersuchung eines neuen Probensets konnten dann alle drei positiven Proben korrekt erkannt werden. In einem weiteren Labor wurden die beiden atypischen Scrapieproben zunächst überhaupt nicht erkannt, die OD-Werte unterschieden sich nicht von denen der negativen Kontrollproben. Auch nach Untersuchung eines zweiten Probensets änderte sich dies nicht. Daraufhin wurde ein Besuch des Testlabors durch Mitarbeiter des Testherstellers vereinbart, und die einzelnen Schritte des Testablaufs wurden gemeinsam besprochen. Einige kleinere Änderungen in der Testdurchführung führten schließlich dazu, dass das dritte Probenset anschließend auch ohne Anwesenheit der Mitarbeiter des Testherstellers zufriedenstellend erkannt wurde. Diese gemeinsam mit dem Testhersteller durchgeführte Optimierung der Arbeitsabläufe wurde dokumentiert und dem NRL anschließend zur Verfügung gestellt. Nachdem sich schon im Scrapie-Ringversuch 2014 abgezeichnet hatte, dass der Einsatz des Ultrakurzprotokolls möglicherweise die Erkennung schwacher atypischer Scrapieproben negativ beeinflussen kann, wurde dieses Protokoll zunächst noch bei drei der 10 Labors eingesetzt. In einem dieser Labors wurde eine wiederholte Untersuchung der Proben notwendig, diese wurde dann unter Verwendung des Kurzprotokolls erfolgreich durchgeführt. Die Ergebnisse dieser beiden Testdurchführungen lassen jedoch keine eindeutigen Schlüsse daraufhin zu, dass das Nicht-Erkennen einer der atypischen Scrapieproben in der ersten Untersuchung durch die Anwendung des Ultrakurzprotokolls bedingt war, da die OD-Werte für die klassische Scrapieprobe bei Verwendung dieses Protokolls sogar höher lagen als bei Verwendung des Kurzprotokolls. Seitens des Testherstellers wird nicht von der Verwendung des Ultrakurzprotokolls bei der Untersuchung atypischer Scrapieproben abgeraten. Bei Verwendung des TeSeE-Tests wurde dagegen im ersten Durchlauf sowie in der Wiederholungsuntersuchung eines anderen Probensets die klassische Scrapieprobe zunächst nicht erkannt, auch hier lagen die OD-Werte im Bereich der negativen Kontrollen. Nach Wechsel des Testkits innerhalb derselben Charge konnten in der zweiten Wiederholung alle Proben korrekt erkannt werden. Eine plausible Erklärung hierfür konnte weder seitens des teilnehmenden Labors noch seitens des hierüber informierten Testherstellers gefunden werden. Abb. 1: Vergleichende Darstellung der Ergebnisse des BSE- Ringversuchs 2015, die in den zehn teilnehmenden Labors erzielt wurden, in denen der IDEXX HerdChek BSE EIA eingesetzt wird Abb. 3: vergleichende Darstellung der Ergebnisse des Scrapie- Ringversuchs 2015, die in den zehn teilnehmenden Labors erzielt wurden, in denen der IDEXX HerdChek BSE/Scrapie EIA eingesetzt wird Schlussfolgerung Aus der Auswertung des BSE-Ringversuchs 2015 ergibt sich eine gleichbleibend hohe diagnostische Qualität bei der Erkennung klassischer BSE-Proben. Aus den Erfahrungen im NRL lässt sich ableiten, dass auch keine nennenswerten Schwierigkeiten in der Erkennung atypischer BSE-Fälle zu erwarten wären. Leider konnte in diesem Jahr keine atypische BSE-Probe in den BSE-Ringversuch integriert werden, für die folgenden Ringversuche wird dies jedoch hoffentlich hin und wieder möglich sein. Die Ergebnisse des diesjährigen Scrapie-Ringversuchs lassen erkennen, dass es zumindest in zwei Labors zunächst deutliche Schwierigkeiten bei der korrekten Erkennung der positiven Proben gab. Dies konnte in einem Fall durch Optimierung der Arbeitsabläufe behoben werden. Die kritischen Punkte wurden identifiziert und gegenüber dem NRL dokumentiert. Im zweiten Fall schien das Nicht-Erkennen mit einer fehlerhaften Performance der Testreagenzien einer Kitpackung zusammenzuhängen, die Ursachen hierfür konnten im Nachhinein nicht mehr nachvollzogen werden. Auch für die Testhersteller zeigt diese Situation, dass die unverändert hohen Qualitätsstandards der Reagenzien bestehen bleiben müssen. Der Ausgang des diesjährigen Ringversuchs unterstreicht deutlich die Notwendigkeit solcher regelmäßigen Überprüfungen, da dies angesichts der erfreulicherweise stark zurückgegangenen Fallzahlen für die meisten Labors inzwischen die einzige Möglichkeit bietet, anhand von positivem Material die diagnostische Qualität ihrer Untersuchungen zu überprüfen. Die im Testkit enthaltenen Positivkontrollen können nur die korrekte Durchführung des ELISAs belegen, nicht jedoch die der Probenaufreinigung. Daher ist das NRL bemüht, auf Anfrage geringe Mengen positiven Materials für den Zweck der internen Qualitätssicherung zur Verfügung zu stellen. Abb. 2: Vergleich der in den Anwenderlabors mit dem IDEXX HerdCheck BSE Antigen EIA (IDEXX) erzielten Mittelwerte und der in einem teilnehmenden Labor mit dem BioRad TeSeE (TeSeE) erzielten Messwerte im BSE-Ringversuch Abb. 4: Vergleich der in den Anwenderlabors mit dem IDEXX HerdCheck BSE Antigen EIA (IDEXX) und dem BioRad TeSeE (TeSeE) erzielten Messwerte im Scrapie-Ringversuch LabLoeffler , Heft 2 Seite 8 LabLoeffler , Heft 2 Seite 9

6 Serologische Diagnostik von Chlamydieninfektionen in Wiederkäuern: Ringversuch des Nationalen Referenzlabors für Chlamydiose 2015 Evelyn Schubert und Christiane Schnee Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Molekulare Pathogenese, Nationales Referenzlabor für Chlamydiose, Jena Serologische Methoden zum Nachweis von Chlamydien- Antikörpern werden in der Tiermedizin seit mehreren Jahrzehnten in der Routinediagnostik eingesetzt. Studien zeigen allerdings, dass zwischen einer vorliegenden Infektion und der entsprechenden Serologie oft nur eine schlechte Übereinstimmung besteht. Hinzu kommen tierartspezifische Unterschiede, die es bei serologischen Verfahren zu berücksichtigen gilt. Dennoch ist es gerade die Serologie, die in der Routinediagnostik für das Screening auf Herdenbasis breite Anwendung findet. Der Ringversuch des Nationalen Referenzlabors (NRL) für Chlamydiose 2015 bot den teilnehmenden Laboren die Möglichkeit, ihre Leistungsfähigkeit nicht nur beim direkten DNA-Nachweis von Chlamydien, sondern erstmals auch beim Antikörpernachweis gegen C. abortus einzuschätzen. Darüber hinaus sollten die erhobenen serologischen Daten für den Vergleich und die Bewertung unterschiedlicher serologischer Testverfahren herangezogen werden, um die Untersuchungseinrichtungen bei der Testauswahl entsprechend beraten zu können. Der Ringversuch wurde in Zusammenarbeit mit dem Schweizer Nationalen Referenzlabor für ovine Chlamydiose (Prof. N. Borel) und der AVID-Arbeitsgruppe für Molekularbiologische Methoden in der Tierseuchendiagnostik organisiert und ausgewertet. Insgesamt meldeten 29 Labore ihre Teilnahme am Ringversuch für serologische Nachweisverfahren an, darunter 22 aus Deutschland und fünf aus der Schweiz. Serumproben Es sollten 20 Serumproben auf das Vorhandensein von C.- abortus-spezifischen Antikörpern geprüft werden, davon stammten 11 Schafseren aus einer Herde mit Abortgeschehen (S7 bis S16) und 6 Seren aus einem Rinderbestand ohne auffällige Klinik (S1-S6). Drei Seren wurden doppelt versandt (S4 = S20, S5 = S19, S6 = S18). Die getroffene Auswahl der Seren und die festgelegte Probenidentität (ID) erfolgte vom NRL auf Basis der größtmöglichen Übereinstimmung der mit verschiedenen Methoden erzielten Ergebnisse. Tabelle 1 entschlüsselt die im Ringversuch eingesetzten Serumproben nach ihrer Charakterisierung in den drei Nachweisverfahren: IDEXX Chlamydiosis Total Ab Test, ID Screen Chlamydophila abortus Indirect sowie einem neuartiger Peptidarray des NRL. Aufgrund von Kreuzreaktionen mit anderen Chlamydien im IDEXX ELISA musste bei der Bestimmung der Probenidentität eine Erweiterung hinsichtlich der Angabe von C.-abortusspezifischen hin zu allgemein Chlamydien-Antikörperhaltigen Seren vorgenommen werden. Tab.1: Serumproben: Probenidentität - Charakterisierung mit verschiedenen serologischen Nachweisverfahren Testverfahren und Ergebnisse Die Auswahl des serologischen Testverfahrens blieb den Ringversuchsteilnehmern überlassen. Insgesamt wurden 12- mal der ID Screen und 16-mal der IDEXX ELISA durchgeführt. Die Komplementbindungsreaktion wurde 9-mal und der Streifentest der Firma Mikrogen sowie der Peptidarray jeweils einmal zur Antikörperbestimmung eingesetzt. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die durchgeführten serologischen Methoden sowie die Leistungserfüllung der einzelnen Labore. ID Screen Chlamydophila abortus indirect (FLI-B 519) Bei dem eingesetzten ELISA handelt es sich um einen zugelassenen Test zum Nachweis von Antikörpern gegen Chlamydia abortus in Seren von Schafen, Rindern und Ziegen. Durch die Verwendung eines synthetischen Peptids eines Oberflächenantigens (MOMP), soll die Häufigkeit von nicht-spezifischen Reaktionen deutlich verringert sein. Die Auswertung erfolgt über den S/P-Prozentsatz (S/P % unter oder gleich 50 % = negativ, zwischen 50 und 60 % = fraglich, über oder gleich 60 % = positiv). Tab.2: Durchgeführte serologische Nachweise und Leistungserfüllung der Labore (% Richtige) Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der teilnehmenden 12 Labore. Die vier vom NRL als C. abortus-positiv verschickten Seren (S7, S10, S13 und S16) wurden problemlos von allen Laboren als positiv erkannt. Unspezifische Kreuzreaktionen zu anderen Chlamydien traten nicht auf. Nur einer der 12 Teilnehmer befundete ein negatives Serum (S9) als positiv. Eine Besonderheit stellte die Serumprobe 8 dar, die vom NRL mittels ID Screen zwar als fraglich bestimmt, aber aufgrund des auch durchgeführten IDEXX ELISAs und des Peptidarrays als negativ eingeordnet worden war. Allerdings wies auch der Mikrogen-Test die Probe als positiv aus (siehe auch Tabelle 1). Für dieses Serum wurden deshalb sowohl ein positiver als auch ein negativer Befund als korrekt bewertet. Alle zwölf teilnehmenden Labore erfüllten die Leistungsvorgaben des Ringtests für die Anwendung des ID Screen Chlamydophila abortus indirect, indem mindestens 85 % der Proben richtig befundet wurden. Elf Teilnehmer erreichten sogar 100 % richtige Ergebnisse (siehe Tabelle 2). IDEXX Chlamydiosis Total Ab (BGVV-B 245) Zur Beschichtung der Testplatten des ELISAs der Firma IDEXX wird inaktiviertes Erregerantigen von C. abortus eingesetzt. Wie beim ID Screen werden die um die Negativkontrolle korrigierten Werte der Proben auf den korrigierten Wert der positiven Kontrolle (=100 %) bezogen, und die Auswertung erfolgt über den S/P-Prozentsatz. Seren mit einem S/P % unter oder gleich 30 % werden als negativ, Seren zwischen 30 und 40 % als fraglich, und Seren über oder gleich 40 % werden als positiv interpretiert. Erwartungsgemäß traten bei Anwendung des Tests im Vergleich zum ID Screen mehr positive Befundungen auf, da neben C. abortus auch Antikörper anderer Chlamydien- Spezies detektiert werden. Alle 16 Labore identifizierten diejenigen Seren, bei denen Chlamydienantikörper vorhanden waren. Schwierigkeiten gab es nur bei zwei Seren mit negativer Probenidentität (Serum 1 und Serum 6=18), die von einigen Teilnehmern fraglich bzw. positiv befundet wurden. Überraschenderweise zeigte die im ID Screen fünfmal als positiv und zweimal fraglich bewertete Serumprobe 8 bei allen Ringversuchsteilnehmern einen negativen Befund, den auch der Mikroarray-Test bestätigte. Tabelle 4 fasst die Ergebnisse der teilnehmenden Labore zusammen. Die Leistungsvorgaben des Ringtestes (mindestens 85 % Richtige) wurden von allen Teilnehmern bis auf einen (Labor 16) erfüllt, wobei fünf Teilnehmer 100 % der Proben korrekt befundeten (siehe Tabelle 2). Komplementbindungsreaktion (KBR) Die von 9 Laboren übermittelten KBR-Titer wiesen eine sehr große Streuung auf. Drei Labore verzichteten auf eine Befundung der Seren, so dass eine korrekte Auswertung durch das NRL nicht möglich war. Um dennoch die übermittelten Titer der Labore vergleichen zu können, wurden die Werte in ein Punktesystem überführt. Dabei wurde der Titer übernommen, bei dem mindestens eine Reaktion mit ++ auftrat. Bei einer Reaktion mit + wurde der nächst niedrigere Punktewert eingetragen (Tabelle 5). Die Korrelation der KBR-Ergebnisse mit denen der anderen serologischen Testverfahren ist gering. Weder wurden alle C.-abortus- bzw. Chlamydiaceae-positiven Proben richtig erkannt, noch wurden die entsprechenden Antikörper in den negativen Proben immer ausgeschlossen, was für eine geringe Sensitivität und Spezifität der KBR spricht. Auf eine Einzelbewertung der Leistung der Labore in der KBR musste deshalb verzichtet werden. Mikrogen RecomLine Chlamydia abortus Im Rahmen des Ringversuches wurden die zu testenden Seren auch mittels Teststreifen-Immunoassay mit rekombinanten Antigenen (MOMP, TARP, CPAF) zur Bestimmung von IgG- Antikörpern untersucht. Diese Methode wurde nur von einem Teilnehmer durchgeführt und erkannte alle als positiv vorgegebenen C.-abortus-Seren (Tabelle 1). Peptidarray Am NRL wird zurzeit ein neuartiges serologisches Testverfahren für den Spezies-spezifischen Nachweis von Chlamydieninfektionen entwickelt. Als Testplattform kamen Biochips der Firma Alere Technologies mit synthetischen LabLoeffler , Heft 2 Seite 10 LabLoeffler , Heft 2 Seite 11

7 Peptiden zum Einsatz, die auf immunodominanten B-Zellepitopen beruhen. Für den spezifischen Nachweis von C. abortus waren Peptide des MOMP und IncA-Proteins gespottet. Schlussfolgerungen Die Rückmeldung der Teilnehmer im Rahmen des Ringversuches lieferte erstmalig einen Überblick über die in den Untersuchungsämtern durchgeführten serologischen Chlamydien-Nachweise. Es zeigte sich, dass sowohl die beiden ELISAs als auch die klassische KBR als Einzelmethoden Anwendung finden. Viele Labore nutzen aber auch eine Kombination aus zwei oder drei Verfahren (Tabelle 2). Mit beiden ELISA-Verfahren wurden von den Laboren im Rahmen des Ringversuchs gute und sehr gute Ergebnisse erzielt. Da diese beiden kommerziell verfügbaren ELISAs der Firmen IDEXX und ID Vet Serumproben unterschiedlich positiv bewerten und dementsprechend mit dem IDEXX ELISA regelmäßig mehr positive Befunde erstellt werden, kam es in letzter Zeit vermehrt zu Anfragen an das NRL in Jena. In der Auswertung des Ringversuches war es deshalb wichtig herauszustellen, bei Befundungen darauf zu achten, dass der IDEXX ELISA mit hoher Wahrscheinlichkeit neben C.- abortus-antikörpern auch Antikörper anderer Chlamydien- Spezies detektiert und deshalb für ein C.-abortus-Screening oder eine Verdachtsabklärung nur eingeschränkt geeignet ist. Zwar ist dieser ELISA für den speziellen Nachweis von C. abortus nicht zu empfehlen, könnte aber eventuell gut für ein allgemeines Screening auf Chlamydien im Bestand geeignet sein. Der Ringversuch bestätigte, dass die KBR beim Nachweis von Chlamydieninfektionen im Vergleich zu anderen Untersuchungsmethoden eine schlechtere Sensitivität (u.a. auch aufgrund von Eigenhemmung) und Spezifität besitzt. Deshalb wurde sie am NRL in den letzten Jahren durch andere Methoden (ELISAs, Peptidarray) ersetzt, was ausdrücklich auch den Ringversuchsteilnehmern empfohlen wurde. Besonderer Dank gilt den Mitarbeiterinnen im NRL in Jena, ohne deren tatkräftigen Einsatz die Durchführung des Ringversuches nicht möglich gewesen wäre, sowie den teilnehmenden Laboren, die mit der Übermittlung ihrer Daten wesentlich zum Verständnis der serologischen Problematik beigetragen haben. Tab.4: Ergebnisse serologischer Nachweis mittels IDEXX Chlamydiosis Total Ab (BGVV-B 245) Tab.3: Ergebnisse serologischer Nachweis mittels ID Screen Chlamydophila abortus indirect (FLI-B 519) Tab.5: Ergebnisse serologischer Nachweis mittels KBR LabLoeffler , Heft 2 Seite 12 LabLoeffler , Heft 2 Seite 13

8 Steckbrief zu Bunthörnchen- Borna-Virus-1 online Elke Reinking, Kristin Schalkowski Bunthörnchen-Borna-Virus 1 Variegated squirrel bornavirus 1 (VSBV) Friedrich-Loeffler-Institut, Pressestelle Greifswald Insel Riems Empfängliche Arten Das Bunthörnchen-Borna-Virus 1 (Variegated Squirrel Bornavirus 1, VSBV-1) wurde bei mehreren Bunt- und Schönhörnchen und bei drei Züchtern von Bunthörnchen nachgewiesen. Umfangreiche molekularbiologische und immunhistologische Untersuchungen deuten darauf hin, dass es sich bei VSBV-1 um einen neuen zoonotischen Erreger handelt und sich die drei verstorbenen Züchter bei ihren infizierten Bunthörnchen angesteckt haben. Aktuell ist unklar, ob VSBV-1 in anderen Tieren vorkommt. Untersuchungen zur Identifizierung weitere empfänglicher Arten sowie des Erregerursprungs werden durchgeführt. Verbreitungsgebiet Die mit VSBV-1 infizierten Menschen und Hörnchen stammen aus Sachsen-Anhalt und Niedersachsen. Ob sich die Tiere in Deutschland angesteckt haben oder der Erreger mit Tierimporten nach Deutschland gekommen ist, ist nicht bekannt. Erreger Das neu entdeckte VSBV-1 gehört zur Gattung Bornavirus in der Familie Bornaviridae und ist genetisch eng verwandt mit Bornaviren der Art Mammalian 1 bornavirus, die bei verschiedenen Säugetieren ebenfalls Erkrankungen mit zentralnervöser Symptomatik auslösen. Bornaviren von Vögeln und Reptilien weisen eine geringere genetische Verwandtschaft zu VSBV-1 auf. Auf der Internetseite des Friedrich- Loeffler-Instituts (FLI) stehen unter der Rubrik Publikationen in den Informationen zu Tierseuchen und Tierkrankheiten so genannte Steckbriefe zu verschiedenen Infektionserregern zur Verfügung. Die Steckbriefe fassen alle relevanten Fakten zu einer Infektionskrankheit auf zwei Seiten zusammen. Sie informieren überblicksartig über den jeweiligen Erreger, die empfänglichen Arten sowie über die Verbreitung, Übertragung, Symptomatik, Diagnostik und Bekämpfung der Tierkrankheit. Der Schwerpunkt liegt bei Infektionskrankheiten von Lebensmittel-liefernden Tieren. Ziel ist es, für alle in den Nationalen Referenzlaboren des FLI untersuchten Infektions- und weiteren ausgewählten Erregern entsprechende Steckbriefe zu erstellen. Neben der Rubrik Publikationen sind die Steckbriefe auf der Seite des jeweiligen Referenzlabors zu finden. Der aktuelle Steckbrief zum Bunthörnchen-Borna-Virus-1 bildet aus gegebenem Anlass eine Ausnahme: dieses erst Anfang des Jahres erstmals beschriebene Virus mit zoonotischem Charakter wurde kürzlich bei einer weiteren Hörnchenart festgestellt. Abb.1: Originalsteckbrief Bunthörnchen Seite 1 Abb.1: Originalsteckbrief Bunthörnchen Seite 2 Übertragung Symptomatik Diagnostik Ähnliche Krankheitsbilder Bekämpfung Die Übertragungswege von VSBV-1 zwischen den Hörnchen sowie auf den Menschen sind aktuell unbekannt. Am wahrscheinlichsten ist die direkte Übertragung durch Kratz- oder Bissverletzungen. Die mit VSBV-1 infizierten Bunt- und Schönhörnchen zeigten keine Krankheitssymptome. Die betroffenen Hörnchen-Züchter erkrankten an einer schweren Gehirnentzündung, die 2 bis 4 Monate nach Auftreten der ersten klinischen Erscheinungen zum Tod der Patienten führte. Das FLI hat molekulardiagnostische und serologische Untersuchungsmethoden zum Nachweis des Virusgenoms und von gegen den Erreger gerichteten Antikörpern entwickelt und validiert. Da ein direkter Zusammenhang zwischen dem Virusnachweis im Speichel und der Infektion der Hörnchen gefunden wurde, empfiehlt das FLI zur Lebenduntersuchung von Bunt- und Schönhörnchen die Einsendung von zwei trockenen Maultupfern. Bei Todesfällen von Hörnchen mit unklarer Ursache sollte der komplette Tierkörper im gekühlten oder gefrosteten Zustand übersandt werden. Sollte die Möglichkeit der Gewinnung von EDTA-Blut/Serum bestehen, kann zur weiteren Absicherung des Infektionsstatus zusätzlich auch eine serologische Untersuchung durchgeführt werden. Bisher gibt es keine Hinweise darauf, dass neben Bunt- und Schönhörnchen auch andere Hörnchen-Arten betroffen sein könnten. Allerdings kann nach derzeitigem Kenntnisstand eine Infektion bei anderen Hörnchenarten nicht ausgeschlossen werden. Untersuchungsproben sollten an das Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, Greifswald-Insel Riems, zu Händen Dr. Bernd Hoffmann (bernd. hoffmann@fli.bund.de) geschickt werden. Die Untersuchung am FLI ist kostenfrei, allerdings sind die Kosten für die Probenentnahme und den Versand an das FLI von jedem Halter/ Einsender selbst zu tragen. Bei Fragen zur Diagnostik beim Menschen sollte das Bernhard-Nocht-Institut in Hamburg (Dr. Dennis Tappe (tappe@bni-hamburg.de) kontaktiert werden. Da ein eindeutiges Krankheitsbild bei den infizierten Bunthörnchen bisher nicht festgestellt werden konnte, ist die Darstellung ähnlicher Krankheitsbilder nicht möglich. Das FLI empfiehlt, positiv getestete Hörnchen einzuschläfern und dem FLI für weitere Untersuchungen gekühlt zu übersenden. Daher sollte bei der Testung eine eindeutige Probenzuordnung sichergestellt werden. Um weitere Infektionen innerhalb des Bestandes ausschließen zu können, wird eine Wiederholung der Beprobung des ganzen Bestandes im Abstand von mindestens 3 Monaten empfohlen. LabLoeffler , Heft 2 Seite 14 LabLoeffler , Heft 2 Seite 15

9 7. Riemser Diagnostiktage am 26. und 27. November 2015 in Greifswald Zu den 7. Riemser Diagnostiktagen bieten wir den Praktikern des Laboralltags in staatlichen und privaten Untersuchungseinrichtungen ein spannendes Programm an. Neben den bewährten Berichten aus den Referenzlaboren und Neuigkeiten zu Diagnostikthemen begegnen uns diesmal einige neue Infektionserreger, aber auch alte Bekannte, die wir nicht aus den Augen verlieren sollten. Erstmalig präsentieren wir das komplette Programm sowie ausgewählte Abstracts zu Vorträgen im pünktlich zu den Diagnostiktagen erscheinenden LAB-Loeffler vielleicht ein Anreiz für alle, die bisher nicht teilgenommen haben. Eine rechtzeitige Anmeldung empfiehlt sich, denn die Tagung war bei Drucklegung des LAB-Loefflers bereits ausgebucht. Dies freut uns als Veranstalter sehr und zeigt, dass die Riemser Diagnostiktage sich als Fachveranstaltung fest etabliert haben. Das Institut für Virusdiagnostik des Friedrich-Loeffler-Instituts richtet die Tagung in bewährter Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID) bereits zum siebten Mal aus. Diese Tradition werden wir auch zukünftig fortführen. Allen Teilnehmerinnen und Teilnehmern wünschen wir an dieser Stelle eine gelungene Tagung und einen anregenden Erfahrungsaustausch. Prof. Dr. Martin Beer Institutsleiter, Institut für Virusdiagnostik Institut für Virusdiagnostik Institute of Diagnostic Virology Dr. Bernd Hoffmann Vorstand AVID, Institut für Virusdiagnostik 08:00 Registrierung 7. Riemser Diagnostiktage November 2015 Alfried-Krupp-Wissenschaftskolleg Greifswald Tagungsprogramm Donnerstag, 26. November 08:45 Begrüßung (T. C. Mettenleiter, Präsident Friedrich-Loeffler-Institut; M. Beer, Leiter Institut für Virusdiagnostik; B. Hoffmann, AVID-Vorstandsvorsitzender) 08:55 Überreichung Ernst-Forschner-Gedächtnispreis (B. Hoffmann) 09:00 09:30 Tierseuchengesetzgebung (Moderation: T. C. Mettenleiter) Die Regelungen des Tiergesundheitsgesetzes und ihre Auswirkungen auf die veterinärmedizinische Diagnostik (H.-J. Bätza, BMEL, Bonn) 09:30 10:30 Themenkomplex Berichte aus den Referenzlaboratorien (Moderation: T. C. Mettenleiter) 09:30 09:50 Hochpathogene aviäre Influenza in Deutschland: Ausbruch oder Einbruch? (T. Harder, FLI Insel Riems) 09:55 10:05 Passive Surveillance der Schweineinfluenza in Europa: Stand der Untersuchungen (D. Henritzi, FLI Insel Riems) 10:10 10:25 Dotterantikörper für die serologische AIV-Diagnostik: Präparation, Reaktivität und Validierung (Ch. Grund, FLI Insel Riems) 10:30 11:00 Tee-/Kaffeepause 11:00 12:45 Themenkomplex Berichte aus den Referenzlaboratorien (Moderation: A. Hlinak) 11:00 11:15 Was wir in den letzten Jahren über die ASP gelernt haben (A. Petrov, FLI Insel Riems) 11:20 11:35 Fallbeispiele der Pockenvirus-Diagnostik (D. Hoffmann, FLI Insel Riems) 11:40 11:55 Postmortale Diagnostik der Enzootischen Rinderleukose (G. Kotterba, FLI Insel Riems) 11:55 12:10 Aktuelles zu den Themen BHV-1, BVDV und RHDV (P. König, FLI Insel Riems) 12:15 12:30 WNV/USUV Surveillance bei Wildvögeln in Deutschland und Aktuelles aus dem NRL (U. Ziegler, FLI Insel Riems) LabLoeffler , Heft 2 Seite 16 LabLoeffler , Heft 2 Seite 17

10 12:30 12:40 Letale Usutu-Virus-Infektionen bei Bartkauzen im Zoologischen Garten Berlin (S. Bilk, LLBB Frankfurt (Oder)) 12:45 14:00 Mittagsimbiss 14:00 15:30 Themenkomplex Neue Viren und alte Bekannte (Moderation: J. Böttcher) 14:00 14:15 Melegrivirus A: vom mehrjährigen Monitoring enteraler Viren bei Huhn und Pute zum Impfstoffkandidaten (M. Liman, Anicon Hoeltinghausen) 14:15 14:30 Erfahrungen im BHV-1-Geschehen 2015 in Bayern (A. Neubauer-Juric, LGL Oberschleißheim) 14:30 14:45 Anmerkungen zur BHV-1-Sammelmilch-Diagnostik (H.-H. Schöttker-Wegner, LAVES Oldenburg) 14:45 15:00 Value of BHV-1 gc, gd and ge ELISA for the confirmation of unexpected single reactors with BHV-1 gb ELISA (P. Pourquier, IDvet Montpellier, Frankreich) 15:00 15:15 PEDV in Deutschland ein Überblick (S. Blome, FLI Insel Riems) 15:15 15:25 Phylogenie der deutschen PEDV-Stämme (D. Hanke, FLI Insel Riems) 15:30 16:00 Tee-/Kaffeepause 16:00 18:00 Themenkomplex Moderne Diagnostikmethoden (Moderation: M. Beer) 16:00 16:15 Technisches Update zum Next-Generation-Sequencing (NGS) (D. Höper, FLI Insel Riems) 16:20 16:30 Anwendungsmöglichkeiten von NGS in der Virologie (O. Goldenberg, Illumina) 16:35 16:50 DetektiVir: Von NGS-basierter Virendetektion zur maßgeschneiderten Diagnostik (A. Pohlmann, FLI Insel Riems) 16:50 17:00 Einfluss sprühgetrockneten Blutplasmas im Schweinefutter auf die PRRSV- AK Diagnostik (T. Sattler, AGES Mödling, Österreich) 17:05 17:20 Eignung von Oral fluids und Bluttupfern als alternative Probenmaterialien für die PRRSV-und PCV-2 RT-qPCR-Diagnostik (A. Steinrigl, AGES Mödling, Österreich) 17:25 17:40 Eignung kommerzieller DNA-Extraktionskits zum Nachweis von Echinococcus multilocularis- Eiern in Fuchskotproben (P. Maksimov, FLI Insel Riems) 17:45 18:00 Tierabhängige und methodische Einflussfaktoren auf den Interferon-Gamma-Freisetzungstest (IGRA) zur Diagnostik der Rindertuberkulose (H. Köhler, FLI Jena) 18:05 18:15 Einsatz des SNT zur Klärung von Pharmacovigilanzfällen (V. Gotter, IDT Biologika, Dessau-Rosslau) Freitag, 27. November 08:30 09:15 Themenkomplex Qualitätssicherung und Datenverarbeitung (Moderation: B. Hoffmann) 08:30 08:55 N.N. 09:00 09:10 Nutzung und Nutzen elektronisch generierter Untersuchungsanträge aus der HI-Tier Datenbank aus Anwendersicht (B. Gehrmann, LAV Sachsen-Anhalt Stendal) 09:15 10:30 Themenkomplex Exotische Tierseuchen vektorübertragene Krankheiten Zoonosen (Moderation: H.-H. Schöttker-Wegner) 09:15 09:30 FSME bei Schafen (G. Böhm, TGD Bayern Poing) 09:30 09:45 Pest der Kleinen Wiederkäuer (PPR) - die nächste fatale Tierseuche in Europa? (C. Schulz, FLI Insel Riems) 09:50 10:05 BTV ante portas - Neues zur Blauzungenkrankheit (B. Hoffmann, FLI Insel Riems) 10:05 10:10 Haben Kühe, die nach Februar 2012 geboren wurden, BTV-Antikörper? (B. Motsch, TGD Bayern Poing) 10:15 10:30 Ein neues Bornavirus bei Hörnchen (M. Beer, FLI Insel Riems) 10:30 11:00 Tee-/Kaffeepause 11:00 12:30 Themenkomplex Exotische Tierseuchen vektorübertragene Krankheiten Zoonosen (Moderation: S. Blome) 11:00 11:15 Neues bovines Astrovirus in Zusammenhang mit Enzephalitis (K. Schlottau, FLI Insel Riems) 11:20 11:35 Ergebnisse einer bundesweiten Querschnittsstudie zur Rindertuberkulose (T. Homeier, FLI Insel Riems) 11:40 11:55 Aktuelles zur Schmallenberg-Virus-Infektion (K. Wernike, FLI Insel Riems) 12:00 12:10 Schweinepest-Diagnostik schnell, einfach, innovativ (St. Fritsche, Qiagen, Leipzig) 12:15 12:30 Hepatitis E in (Wild-) Tieren: Untersuchungen zur Übertragbarkeit und der epidemiologischen Bedeutung in Deutschland (M. Eiden, FLI Insel Riems) 12:30 12:55 Abschlussdiskussion 12:55 13:00 Schlusswort (M. Beer, Leiter Institut für Virusdiagnostik) 13:00 Mittagsimbiss 19:30 Gemeinsames Abendessen im Theatercafé LabLoeffler , Heft 2 Seite 18 LabLoeffler , Heft 2 Seite 19

11 7. Riemserdiagnostiktage November Riemserdiagnostiktage November 2015 Hochpathogene Influenza in Deutschland: Ausbruch oder Einbruch? Timm Harder 1, Klaas Dietze 2, Christian Grund 1, Timo Homeier 2, Anja Globig 2, Anne Pohlmann 1, Elke Starick 1, Christoph Staubach 2, Detlef Höreth-Böntgen 2, Carola Sauter-Louis 2, Franz Conraths 2, Martin Beer 1 1 Institut für Virusdiagnostik und 2 Institut für Epidemiologie, Friedrich-Loeffler- Institut, Insel Riems Die klassische Geflügelpest, ausgelöst durch hochpathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) der Subtypen H5 und H7, bleibt eine beständige Bedrohung der Geflügelhaltungen weltweit. Auch Deutschland war 2014 und 2015 von HPAIV Infektionen betroffen. Im November 2014 wurde in Deutschland erstmals HPAIV des Subtyps H5N8 in einer Putenhaltung in Mecklenburg-Vorpommern (MV) nachgewiesen. Dieses Virus wurde phylogenetisch der Klade des asiatischen HPAIV des Subtyps H5 zugeordnet, was auf einen Ursprung im östlichen China bzw. der koreanischen Halbinsel hinweist. Weitere Infektionen mit H5N8 Viren dieses Clusters wurden aus Niedersachsen (jeweils ein Enten- und Putenbestand) sowie aus Mecklenburg- Vorpommern gemeldet (2 Kleinhaltungen von Hühnern, Zoovögel im Zoo Rostock). Die betroffenen kommerziellen Geflügelhaltungen waren sämtlich geschlossene Stallhaltungen, so dass der Begriff Virus- Einbruch durchaus zutrifft. Retrospektive epidemiologische Analysen wiesen keine handelsassozierten Aktivitäten als Eintragsquelle nach, konnten aber die genauen Umstände der Einschleppung erregerhaltiger Materialien in die betroffenen Haltungen nicht eindeutig klären. Die zeitliche Koinzidenz mit dem einsetzenden Wildvogelzug in Europa, der Nachweis von HPAIV H5N8 in einzelnen Wildvögeln sowie zeitlich gestaffelte Einträge in andere EU-Länder sowie nach Nordamerika, lassen jedoch einen indirekten Eintrag über HPAIV-infizierte Wildvögel in den Fokus rücken. Im Juli 2015 wurde ein weiterer Fall von klassischer Geflügelpest aus einem geschlossenen Legehennenbestand in Niedersachsen gemeldet. In diesem Fall handelte es sich um HPAIV des Subtyps H7N7. Dieses Virus entwickelte sich vermutlich in dem betroffenen Bestand selbst de novo aus niedrigpathogenen Vorläufern. Die weitere Übertragung dieser Viren, also sekundäre Fälle, konnten durch frühzeitige Verdachtsäußerung und -bestätigung sowie das rasche Einleiten von Maßnahmen zur Bekämpfung der Tierseuche unterbunden werden. Das mutmaßliche LPAI Vorläufervirus war zuvor in einem Nachbarbestand nachgewiesen worden und trotz Maßregelung dieses Betriebes in den späteren HPAI Bestand eingebrochen. Beide HPAI-Szenarien unterstreichen die Brisanz von AIV-Infektionen und verweisen auf weiterhin ungeklärte Fragen in der Epidemiologie der aviären Influenza, nämlich das Problem der letzten Meter : Wie gelangen AIV/HPAIV in geschlossene Geflügelhaltungen? Wie lassen sich Bestände besser schützen? Warum und wann entstehen HPAIV aus LPAIV? Wie lassen sich LPAIV Infektionen besser erkennen und Bestände sicherer überwachen? Die diagnostischen Instrumente und auch die Maßnahmen zur Bekämpfung der anzeigepflichtigen AI haben sich als leistungsstark erwiesen. Es gilt, den frühzeitigen Einsatz dieses Instrumentariums bei Überwachungsuntersuchungen, in der Differentialdiagnostik und bei der Abklärung von Verdachtsfällen sicher zu stellen. Was wir in den letzten Jahren über die ASP gelernt haben Anja Petrov und Sandra Blome Friedrich-Loeffler-Institut, Nationales Referenzlabor für Afrikanische Schweinepest, Institut für Virusdiagnostik, Greifswald-Insel Riems Seit 2007 hat sich die Afrikanische Schweinepest (ASP) kontinuierlich über die transkaukasischen Länder und Russland in Osteuropa ausgebreitet. Im Januar 2014 erreichte die hierzulande als exotisch geltende Tierseuche dann die Wildschweinepopulation der EU und setzte ihre Ausbreitung bislang auf vier Mitgliedstaaten fort (Litauen, Lettland, Polen, Estland). Sie betrifft inzwischen Haus- und Wildschweine. Derzeit stellt die ASP eine in höchstem Maße alarmierende Bedrohung für die gesamte Europäische Schweineindustrie und den Schwarzwildbestand dar. Das Virus der Afrikanischen Schweinepest (ASPV) ist das bislang einzige bekannte durch Arthropoden übertragbare DNA-Virus (ARBO-Virus) und nutzt die Lederzecke der Gattung Ornithodoros als potentiellen Wirt und Vektor. Hierzulande kommt jedoch der Übertragung via direktem oder indirektem Tierkontakt die größere Bedeutung zu. Insbesondere der Kontakt zu Blut oder bluthaltigen Ausscheidungen entpuppte sich im Rahmen bisheriger tierexperimenteller Studien, die mit aktuell kursierenden (vor allem osteuropäischen) ASPV-Isolaten des Genotyps 2 unter Einbeziehung von Haus- und Wildschweinen unterschiedlicher Altersgruppen durchgeführt wurden, als Schlüssel zur effizienten Infektion. Unabhängig von Spezies oder Alter konnte eine extrem hohe Virulenz dieser Isolate nachgewiesen werden. Nach Entwicklung schwerer unspezifischer klinischer Symptome einschließlich hohen Fiebers erlagen alle Tiere binnen weniger Tage nach Auftreten erster klinischer Anzeichen der Erkrankung. Für die orale Infektion konnte hierbei kein Dosiseffekt nachgewiesen werden. Während sehr niedrige Infektionsdosen insbesondere bei schwachen Tieren ausreichend waren, blieb in anderen Fällen bei Einsatz wesentlich höherer Dosen eine Infektion aus. Die Kontagiosität erwies sich entgegen der allgemeinen Lehrmeinung als moderat und der Infektionsverlauf in Gruppen konnte mehrere Wochen in Anspruch nehmen. Bisher erbrachten weder Untersuchungen mit dem sardischen noch mit baltischen Isolaten konkrete Hinweise auf eine Attenuierung. Ein einzelnes rekonvaleszentes Tier wird derzeit eingehend untersucht. Obgleich vereinzelt über attenuierte ASPV- Stämme mit Schutzwirkung berichtet wurde, gibt es bis heute keinen tatsächlich aussichtsreichen Impfstoffkandidaten. Die Abwesenheit neutralisierender Antikörper stellt dahingehend einen maßgeblich verkomplizierenden Faktor dar. Dennoch verdeutlicht der unaufhaltsame Seuchenzug der ASP durch Europa und die bisherige Keulungsstrategie als einzig verfügbare effiziente Bekämpfungsmethode den dringenden Bedarf erfolgsversprechender neuer Ansätze in der ASPV Vakzine- Entwicklung. LabLoeffler , Heft 2 Seite 20 LabLoeffler , Heft 2 Seite 21

12 7. Riemserdiagnostiktage November Riemserdiagnostiktage November 2015 Einfluss sprühgetrockneten Blutplasmas im Schweinefutter auf die PRRSV-Antikörperdiagnostik Tatjana Sattler 1,2, Jutta Pikalo 1, Doris Verhovsek 3, Eveline Wodak 1, Friedrich Schmoll 1 1 AGES, Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Mödling, Österreich, 2 Universität Leipzig, Medizinische Tierklinik, 3 Veterinärmedizinische Universität Wien, Lehr- und Forschungsgut Medau, Österreich Sprühgetrocknetes Blutplasma wird in der Schweinefütterung als Quelle hochwertigen Proteins für Absetzferkel oder im Milchaustauscher verwendet. Das in der EU gewonnene Plasma stammt aus zugelassenen Schlachthöfen und unterliegt strengen Kontrollen. Schweine, von denen Plasma gewonnen wird, wurden als tauglich für den Verzehr durch den Menschen eingestuft. Da das Blutplasma von einer großen Zahl an Schweinen aus verschiedenen Beständen gewonnen wurde, ist damit zu rechnen, dass es Antikörper gegen die unterschiedlichsten Infektionskrankheiten enthält. Im Folgenden wird ein Fall vorgestellt, in dem der Einsatz von sprühgetrockneten Plasma die Antikörperdiagnostik in Speichelproben maßgeblich beeinflusst hat. Zum Vergleich wurden weiterhin verschiedene Futtermittel mit und ohne Zusatz von Plasma auf das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern untersucht. Es zeigte sich, dass die Futtermittel mit Plasmazusatz zum Großteil positive Ergebnisse im PRRSV-Antikörper-ELISA zeigten, während Futtermittel ohne Plasmazusatz immer negativ blieben. Der Einfluss dieser Befunde auf die Diagnostik wurde bei einer Untersuchung von Speichelproben, die von Saugferkeln und Absetzern aus einem PRRSVunverdächtigen Betrieb entnommen wurden, bestätigt. Bei Schweinen, die Futter mit Zusatz von sprühgetrocknetem Plasma erhielten, konnten PRRSV-Antikörper im Speichel nachgewiesen werden. Bei Fütterung ohne Plasmazusatz war dies nicht der Fall. Das Serum aller in diesem Betrieb untersuchten Schweine war PRRSV- Antikörper-negativ. Die Untersuchung von Speichelproben wird gerade bei Absetzferkeln zur Infektionsdiagnostik mehr und mehr beworben. Der gewonnene Speichel enthält immer auch Futterreste aus dem Maul der Schweine. Wurde dem Futter sprühgetrocknetes Plasma zugesetzt, besteht die Möglichkeit falsch-positiver Ergebnisse besonders hinsichtlich der PRRSV-Antikörperdiagnostik. BTV ante portas - Neues zur Blauzungenkrankheit Bernd Hoffmann, Claudia Schulz und Martin Beer Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems In Mitteleuropa wurde die Blauzungenkrankheit (BT) erstmalig im Sommer 2006 bei Wiederkäuern festgestellt und breitete sich in den Jahren 2007 und 2008 auch über große Teile Deutschlands aus. Als Ursache wurde ein BT-Virus vom Serotyp 8 (BTV- 8) ermittelt. Durch die Einführung einer verpflichtenden Impfung mit inaktivierten Impfstoffen ab 2008 gelang es, die Seuche zu tilgen. Seit dem wurde kein BT-Fall mehr in Deutschland festgestellt und ab dem konnte Deutschland sich offiziell als BTV-frei erklären. Im Gegensatz dazu war und ist BTV in den südeuropäischen Ländern nach wie vor ein Problem. So wurden in den Jahren 2014/2015 weiterhin Restriktionszonen für die BTV-Serotypen 1, 2, 4, 8, 16 in Portugal, Spanien, Frankreich, Italien, den Balkan-Staaten, Ungarn, Griechenland und Zypern eingerichtet. Herausragende Bedeutung hat hierbei sicher der BTV-4-Seuchenzug in Südosteuropa. Ausgehend von den ersten Fällen in Griechenland im Frühjahr 2014, hat sich das Virus sehr schnell über Bulgarien auf der ganzen Balkan-Halbinsel bis nach Ungarn ausgebreitet. Im September und Oktober 2015 haben Kroatien, Rumänien und Ungarn weitere Fälle bei Rindern und Kleinwiederkäuern gemeldet. Die ungarische Restriktionszone reicht jetzt bis zur österreichischen Grenze. Es bleibt abzuwarten, ob durch die angewandten Impfstrategien und die natürliche Durchseuchung der empfänglichen Population die Ausbreitung von BTV-4 in Richtung Norden und Westen gestoppt werden kann. Hilfreich bei der Minimierung der auch für die Ausbreitung von BTV-4 wichtigen Vektorausbreitung sind hier sicher auch die natürlichen geographischen Barrieren (Alpen und Westkarpaten). Sehr überraschend dagegen war das neue Auftreten von BTV-8 in Zentral-Frankreich. Am 11. September 2015 meldete Frankreich einen ersten Fall im Departement Allier, rund 250 km von der Schweizer Grenze entfernt. Mitte Oktober 2015 hat Frankreich mehr als 50 infizierte Bestände gemeldet. Das Festland von Frankreich war schon längere Zeit frei von BT und so überrascht das erneute Auftreten von BTV-8 in diesem Gebiet. Erste Sequenzanalysen zeigen, dass das neue BTV-8 sehr hohe genetische Ähnlichkeiten zum BTV-8 aus 2006 hat. Aktuell kann noch nichts über die Herkunft des neuen BTV-8 gesagt werden. Neben dem unerkannten Überleben des Virus in empfänglichen Tieren oder Vektoren kann auch eine Neueinschleppung nicht ausgeschlossen werden. Interessant ist zudem, dass das neue BTV-8 kaum klinische Erscheinungen bei Rindern und Schafen verursacht und sich somit zumindest die Pathogenese zu BTV-8 aus 2006 unterscheiden könnte. Ob dies durch geringe Sequenzunterschiede der beiden BTV-8 bedingt ist oder ob dieser Umstand durch die nicht-naive Wiederkäuer-Population in Frankreich hinsichtlich BTV-8 begründet ist, kann aktuell nicht definiert werden. BTV-8 in Frankreich und BTV-4 in Südosteuropa haben beide das Potential nach Deutschland vorzudringen und hier eine anzeigepflichtige Tierseuche auszulösen. Aus den aktuell vorliegenden Daten ist zu vermuten, dass BTV-4 eine höhere Morbidität und Mortalität aufweist und somit für die BTV-4-naive Wiederkäuer- Population in Deutschland das größere Problem darstellen könnte. LabLoeffler , Heft 2 Seite 22 LabLoeffler , Heft 2 Seite 23