Polysaccharide und Melanoidine im Kaffeegetränk: unberücksichtigte Ballaststoffquellen

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1 Polysaccharide und Melanoidine im Kaffeegetränk: unberücksichtigte Ballaststoffquellen Mirko Bunzel Michael Blaut Diana Gniechwitz Nicole Reichardt

2 Kaffee - Physiologische Effekte epidemiologische Studien: moderater Kaffeekonsum (3-4 Tassen/Tag) wirkt sich nicht negativ auf die Gesundheit aus unberücksichtigt bleiben hierbei spezielle Risikogruppen (e.g. Senioren, Kinder, Bluthochdruckpatienten, Schwangere) sogar positive physiologische Effekte in der Diskussion Herz-Kreislauf-Erkrankungen? Krebserkrankungen? Typ II Diabetes mellitus? Parkinson sche Krankheit?

3 Zuammensetzung des Kaffeegetränks Niedermolekulare Inhaltsstoffe: 4% Hochmolekulare Inhaltsstoffe: 30% Chlorogensäuren Mineralstoffe Koffein Trigonellin Nichtflüchtige Säuren Kohlenhydrate Lipide Flüchtige Säuren Aromastoffe Niacin... Unbekannte Substanzen: 29% Arabica Filterkaffee, mittel geröstet, 50 g gemahlener Kaffee/L Waser Polysaccharide Proteine

4 Hochmolekulare Inhaltsstoffe des Kaffeegetränks Polysaccharide : Proteine Melanoidine Arabinogalactane/Arabinogalactan-Proteine und Galactomannane

5 Hochmolekulare Inhaltsstoffe des Kaffeegetränks Galactomannane: HO HO O HO HO O HO HO O HO O β-d-mannopyranose β-d-glucopyranose α-d-galactopyranose α-l-arabinofuranose 2 4)-β-D-Manp-(4)-β-D-Manp-(4)-β-D-Manp-(4)-β-D-Manp-(4)-β-D-Manp-(4)-β-D-Manp-( 4)-β-D-Glcp-(4)-β-D-Manp-( α-d-galp α-l-araf Ac

6 Hochmolekulare Inhaltsstoffe des Kaffeegetränks Typ II Arabinogalactane: HO HO O β-d-galactopyranose HO O α-l-arabinofuranose β-d-galp 5 α-l-araf 5 α-l-araf α-l-araf-(3)-β-d-galp β-d-galp α-l-araf 3)-β-D-Galp-(3)-[β-D-Galp-(3)] 2 -β-d-galp-(3)-[β-d-galp-(3)] 2 -β-d-galp-(3)-[β-d-galp-(3)] 2 -β-d-galp-(3)-[β-d-galp-(3)] 2 -β-d-galp-( β-d-galp-(3 )-β-d-galp-(3 )- α-l-araf β-d-galp-(3 )-β-d-galp-(3 )- α-l-araf α-d-glcpa HO HO β-d-galp β-d-galp CO O β-d-glucopyranuronsäure α-l-rhap HO H 3 C O α-l-rhamnopyranose

7 Hochmolekulare Inhaltsstoffe des Kaffeegetränks Polysaccharide : Proteine Melanoidine Arabinogalactane/Arabinogalactan-Proteine und Galactomannane Kaffeemelanoidine: heterogenes Gemisch aus hochmolekularen Maillard- Reaktionsprodukten Strukturbestandteile: Poly- bzw. Oligosaccharidstrukturen, Protein- bzw. Peptidstrukturen, phenolische Komponenten, chromophore Komponenten Heterogenität in Bezug auf: Molekulargewicht, Anteile und Charakteristika der o.g. Struktureinheiten

8 Ballaststoffe Definition der American Association of Cereal Chemists (200): Ballaststoffe bestehen aus essbaren Pflanzenteilen oder analogen Kohlenhydraten, die gegenüber der Verdauung und Absorption im menschlichen Dünndarm resistent sind und im Dickdarm teilweise oder vollständig fermentiert werden. Ballaststoffe beinhalten Polysaccharide, Oligosaccharide, Lignin und assoziierte Pflanzensubstanzen. Ballaststoffe unterstützen gesundheitsfördernde Prozesse wie die Senkung des Cholesterinspiegels und/oder die Regulierung des Blutzuckerspiegels und/oder besitzen abführende Eigenschaften.

9 Fermentation von Ballaststoffen im Dickdarm Ileum und Zäkum: KBE/mL Bifidobacterium Bacteroides Lactobacillus Streptococcus Enterobactericeae Staphylococcus Clostridium Hefen Kolon: KBE/g Bacteroides Eubacterium Clostridium Peptostreptococcus Streptococcus Bifidobacterium Fusobacterium Lactobacillus Enterobactericeae Staphylococcus Hefen Fermentation von Ballaststoffen: erhöhtes Bakterienwachstum Bildung kurzkettiger Fettsäuren mgl. Einfluss auf Zusammensetzung der Mikrobiota

10 Hintergrund und Zielsetzung AiF/FEI-Projekt AiF 4085 BG: Kooperation mit dem Deutschen Institut für Ernährungsforschung (DiFE), Nuthetal; Abteilung Gastrointestinale Mikrobiologie Mittelpunkt der Untersuchungen: hochmolekulare Inhaltsstoffe des Kaffeegetränks und deren Fermentierbarkeit im Dickdarm Gewinnung unterschiedlicher, hochmolekularer Kaffeefraktionen Chemiche Charakterisierung der hochmolekularen Kaffeefraktionen (Polysaccharide, Proteine, Melanoidine) Untersuchung der mikrobiellen Abbaubarkeit hochmolekularer Kaffeefraktionen, Beeinflussung der Darmmikrobiota Klärung der Relevanz des Kaffeegetränks als Ballaststoffquelle Einfluss der Fermentation auf die antioxidative Kapazität der Kaffeemelanoidine ( antoxidativ wirksame Ballaststoffe ) Ermittlung von Faktoren, die den Gehalt und die Strukturcharakteristika von Kaffeeballaststoffen beeinflussen

11 Methoden zur Gewinnung hochmolekularer Kaffeefraktionen Gestufte Ultrafiltration Enzymatisch-gravimetrisches Verfahren zur Gewinnung von Ballaststoffen >00, 50-00, 0-50 und 3-0 kda Hydrophobe Interaktionschromatographie Ballaststoffe Ultrafiltration bzw. Dialyse Kaffeemelanoidinfraktionen nicht als Ballaststoffe erfasste hochmolekulare Kaffeefraktion Gelpermeationschromatographie Unterfraktionen

12 Methoden zur Charakterisierung hochmolekularer Kaffeefraktionen Kohlenhydratanteil, Monosaccharidzusammensetzung, glykosidische Bindungstypen: Phenol-Schwefelsäure-Methode (Photometrie) Alditolacetat-Methode (GC-FID) Methylierungsanalyse (GC-FID, GC-MS) Stickstoffanteil: Kjeldahl-Stickstoff (Photometrie) Aminosäurezusammensetzung: nach Säurehydrolyse (HPLC-Fluoreszenzdetektion) Weitergehende Strukturcharakterisierung (2D-NMR) Braunfärbung und UV-Aktivität: Extinktion bei 405 und 280 nm (Photometrie) Farbverdünnungsanalyse Antioxidative Kapazität in vitro Ferricyanid-Methode (Photometrie) TEAC-Test (Photometrie) Leukomethylenblau-Methode (Photometrie)

13 Ergebnisse: Kaffeeballaststoffe Standard-Kaffeegetränk : 50 g Arabica-Kaffee (mittlerer Röst- und Mahlgrad) L Leitungswasser Enzymatisch-gravimetrisches Verfahren zur Bestimmung von Ballaststoffen: Inkubation mit α-amylase, Proteinase, Amyloglucosidase Fällung der Ballaststoffe in ca. 80% Ethanol Gravimetrie und Korrektur des Asche- und Restproteingehaltes Lösliche Ballaststoffe: 0,35 g/00 ml 400 ml =,4 g Ballaststoffe/Tag Empfehlung der DGE: 30 g Ballaststoffe/Tag Aufnahme (Erwachsene): (SCHULZE et al., 200) Frauen: 9,4 g/tag (,3-58, g/tag) Männer: 2,9 g/tag (,4-5,2 g/tag)

14 Zusammensetzung der Kaffeeballaststoffe Charakteristika: Kohlenhydratanteil: 2% d.h. 38% gehen auf unbekannte Komponenten zurück (Maillardprodukte?) Monosaccharidzusammensetzung: 50,% Mannose 38,9% Galactose 8,8% Arabinose,0% Rhamnose 0,7% Glucose

15 Kaffeeballaststoffe: Kohlenhydratzusammensetzung Charakteristika: Methylierungsanalyse: terminal, (4)- und (4,)-gebundene Mannopyranose terminal, (3)-, () und (3,)-gebundene Galactopyranose terminal und (5)-gebundene Arabinofuranose terminal gebundene Rhamnopyranose (4)-gebundene Glucopyranose Galactomannan/Arabinogalactan-Verhältnis:,3 Galactomannane: Substitutionsgrad 4% Arabinogalactane: Arabinoseanteil 27%, davon 75% terminal und 25% (5)- gebunden; 25% der Galactosereste sind (3,)-gebunden

16 Kaffeeballaststoffe: Fermentierbarkeit unter Dickdarmbedingungen Die in-vitro-fermentationen (anaerob) mit humanen Fäzeszellsuspensionen wurden am DIfE (Nuthetal) durchgeführt. Fäzesprobe (4 gesunde Probanden) ml Fäzessuspension 0%ig (w/v) Verdünnen in PBS-Puffer (reduziert) Zellpellet Fermentationsansatz (dreifach) Substratkonzentration:,5 mg/ml 3 x Waschen in PBS-Puffer (reduziert) und zentrifugieren (3 min, 000g) Überführen in Fermentationsgefäße mit Minimalmedium [ph = 7,5; begast mit N 2 /CO 2 (80/20, v/v)] + Substrat Inkubation bei 37 C 0 h-probe 3 h-probe h-probe 2 h-probe 24 h-probe

17 Kaffeeballaststoffe: Fermentierbarkeit unter Dickdarmbedingungen Inulin Kaffeeballaststoffe Kontrolle Inulin Kaffeeballaststoffe OD00,2 0,8 0,4 0, Zeit [h] % Kohlenhydrate (bezogen auf 0h-Probe) [%] a Arabinose Galactose Mannose Zeit Zeit [h] [h] Kohlenhydratabbau nach 24 h: 85% (Inulin: 00%) Bildung von Acetat, Propionat und Butyrat (8:5:4) Galactomannane nach 2 bzw. 24 h stärker abgebaut als Arabinogalactane

18 Kaffeeballaststoffe: Fermentierbarkeit unter Dickdarmbedingungen Methylierungsanalyse: Arabinogalactan- und Galactomannan-Abbau im Detail Fäzesprobe A Fäzesprobe B Fäzesprobe C Fäzesprobe D 0 h h 2 h 0 h h 2 h 0 h h 2 h 0 h h 2 h (3-Galp+-Galp)/3,-Galp,8 2,5 4,0,8 2,3 3,7,9 2,3 3,4,8 2, 2,9 T-Araf/5-Araf 2,4 2,0,0 2,2,4 0,7 2,4,7 0,8 2,4,7,0 Manp/4,-Manp 24,7 23,2 2,7 25,2 23, 2,8 9,8 3,7 23, 20,7 7,9 20,8

19 Kaffeeballaststoffe: Fermentierbarkeit unter Dickdarmbedingungen β-d-galp 3)-β-D-Galp-(3)-[β-D-Galp-(3)] 2 -β-d-galp-(3)-[β-d-galp-(3)] 2 -β-d-galp-(3)-[β-d-galp-(3)] 2 -β-d-galp-(3)-[β-d-galp-(3)] 2 -β-d-galp-( β-d-galp-(3 )-β-d-galp-(3 )- α-l-araf β-d-galp-(3 )-β-d-galp-(3 )- α-l-araf β-d-galp β-d-galp β-d-galp α-l-araf-(3)-β-d-galp β-d-galp α-l-araf (3-Galp+-Galp)/3,-Galp: zunehmend T-Araf/5-Araf: abnehmend α-l-araf α-l-rhap 5 α-l-araf 5 α-l-araf

20 Ballaststoffgehalte diverser Kaffeegetränke Einfluss der Sorte Einfluss der Zubereitung LBS [g/00 ml] 0,4 0,3 0,2 0, 0,0 Robusta (India) Arabica (Colombia) Ballaststoffe [g/00 ml] 0,4 UBS LBS 0,3 0,2 0, 0,0 20 L 0 L L 3min min Großbrühmaschine HKM French-Press Espressotopf LBS [g/00 ml] 0,4 0,3 0,2 0, 0,0 Einfluss des Röstgrads hell mittel dunkel Ballaststoffe [g/00 ml] 0,5 0,4 0,3 0,2 0, 0,0 UBS LBS Einfluss des Mahlgrads mittel fein mittel fein

21 Ballaststoffe in diversen Kaffeegetränken Einfluss der Zubereitungsmethode auf Strukturcharakteristika der Ballaststoffpolysaccharide: Anteil an Polysacchariden [mol%] Galactomannane Arabinogalactane 20 L 0 L L 3 min min Großbrühmaschine HKM French-Press Espressotopf Methylierungsanalyse: zunehmender Ballaststoffgehalt: zunehmender Galactomannan-Anteil

22 Ballaststoffe in diversen Kaffeegetränken Einfluss der Zubereitungsmethode auf Strukturcharakteristika der Ballaststoffpolysaccharide: Anteil an Polysacchariden [mol%] Galactomannane Arabinogalactane 20 L 0 L L 3 min min 20 L 0 L L 3 min min 4,0% 3,7% 3,4% 3,% 3,% 3,2% Großbrühmaschine HKM French-Press Espressotopf Methylierungsanalyse: zunehmender Galactomannan-Anteil: abnehmender Substitutionsgrad

23 Nicht als Ballaststoffe erfasste hochmolekulare Fraktion niedermolekulare Fraktion (< kda) ethanollöslicher Überstand Ultrafiltration bzw. Dialyse hochmolekulare Fraktion (> kda) Ballaststoffe ethanollösliche Kohlenhydrate?: Ballaststoffe! Melanoidine mit geringen Kohlenhydratanteilen?: Ballaststoffe? Melanoidine ohne Kohlenhydratanteile?: Ballaststoffe??

24 Nicht als Ballaststoffe erfasste hochmolekulare Fraktion: Charakterisierung Gehalt [g/00 ml] LBS 0, 0,5 0,4 0,3 0,2 0, 0,0 nicht als BS erfasste hochmolekulare Fraktion hell mittel dunkel Röstgrad Weitergehende Untersuchungen anhand der Fraktion des mittel gerösteten Kaffees: Charakterisierung Untersuchung der Fermentierbarkeit Charakteristika: Komponenten über großen Molekulargewichtsbereich verteilt (bis >00 kda) 20% Proteine (Summe der Aminosäuren) 2% Kohlenhydrate, hauptsächlich Arabinogalactane Arabinogalactanstrukturen unterschieden sich deutlich von denen der Ballaststoffe 2% Stickstoff aus unbekannten Komponenten

25 Nicht als Ballaststoffe erfasste hochmolekulare Fraktion: Fermentierbarkeit Fermentierbarkeit unter Dickdarmbedingungen: schlechter verwertbar als Ballaststoff-Fraktion Kohlenhydratabbau nach 48 h: % Proteinabbau nach 48 h: 3% Abbau unbekannter Komponenten: Abnahme der UV-Aktivität und Braunfärbung Abnahme des Gehaltes an Nicht-Protein-Stickstoff Verfolgung des Fermentationsverlaufes mittels 2D-NMR ( H- 3 C-Korrelationsexperiment, HSQC):

26 Nicht als Ballaststoffe erfasste hochmolekulare Fraktion: Fermentierbarkeit, NMR Kaffeefraktion 0 h Kaffeefraktion 24 h Kaffeefraktion 48 h

27 Nicht als Ballaststoffe erfasste hochmolekulare Fraktion: Fermentierbarkeit, NMR Kaffeefraktion 0 h Rutinose Cellobiose Kaffeefraktion 24 h Lärchen-Arabinogalactan α-rhamnopyranose β-glucopyranose β-galactopyranose β-mannopyranose α-arabinofuranose Kaffeefraktion 48 h Carob-Galactomannan

28 Nicht als Ballaststoffe erfasste hochmolekulare Fraktion: Fermentierbarkeit, NMR Kaffeefraktion 0 h Kaffeefraktion 24 h Kaffeefraktion 48 h

29 Zusammenfassung Kaffeegetränke enthalten beachtliche Mengen an löslichen Ballaststoffen, die ein gutes Substrat für die humane Dickdarmmikrobiota darstellen Sorte, Röstgrad und Zubereitung des Kaffees beeinflussen den Ballaststoffgehalt signifikant Galactomannane werden nach 24 h Fermentation stärker abgebaut als Arabinogalactane Arabinogalactan-Seitenketten werden im Zuge der Fermentation leicht abgespalten, (5)-gebundene Arabinosereste sind am schlechtesten abbaubar Kaffee enthält weiteres hochmolekulares Material, welches mittels enzymatisch-gravimetrischen Verfahrens ( 4 LFBG) zur Bestimmung der Ballaststoffe nicht erfasst wird Kaffeepolysaccharide sind das bevorzugte Substrat für Dickdarmbakterien, aber auch unbekannte, farbige hochmolekulare Komponenten werden verwertet bzw. modifiziert

30 Danksagung FEI/AiF den Mitgliedern des projektbegleitenden Ausschusses Dr. Allan Bradbury, Dr. Jochen Wilkens, Dr. Wolfram Steffan, Dr. Ingo Lantz Prof. John Ralph, Prof. Dirk Selmar, Dr. Gerhard Bytof die Tchibo Manufacturing GmbH & Co. KG Frau Petia Vladimirova, Frau Anne Büsing, Herrn Dennis Löwel, Frau Birgit Brückel und Herrn Ernst Meiß

31 00 Anstieg der Optischen Dichte nach 24 h 80 [%] nicht als BS erfasste hochmolekulare Fraktion LBS

32 0 90 control inulin coffee fiber * difference t 24 t 0 [%] * * * * * EREC Clept Fprau Bac Bfra Bvulg Bif Lab

33 Deutscher Pro-Kopf-Verbrauch in Litern (200): Quellen: Deutscher Kaffeeverband e.v., Wirtschaftvereinigung Alkoholfreie Getränke e.v., Statistisches Bundesamt, Deutsches Weininstitut GmbH

34 Einfluss der Zubereitungsmethode auf Strukturcharakteristika der Ballaststoffpolysaccharide: Anteil an Polysacchariden [mol%] Galactomannane Arabinogalactane 2,3 2,4,9 2,0 2,0,9 (3-Galp+-Galp)/3,-Galp 24% 27% 27% 27% 2% 27% Großbrühmaschine HKM French-Press Espressotopf Arabinose 24% 24% 22% 22% 22% 9% davon 5-Araf Methylierungsanalyse: Unterschiede in Strukturcharakteristika der AG