Molekularpathologische HPV-Detektion Methodische und differentialdiagnostische Aspekte

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1 Molekularpathologische HPV-Detektion Methodische und differentialdiagnostische Aspekte Richter, K., und Katrin Henneicke Institut für Pathologie, Berliner Allee 48, Hannover Die Ätiologie der dysplastischen und neoplastischen kondylomatösen Läsionen sowohl der weiblichen als auch der männlichen Anogenitalregion durch humane Papillomaviren gilt seit mehreren Jahren als gesichert. Die Pathogenese jedoch weist noch viele Interpretations- und Kenntnisslücken auf. Diesem Problem war u.a. ein großer Teil des Weltkongresses für zervikale Pathologie und Kolposkopie im Herbst 1999 in Buenos Aires gewidmet. Im wesentlichen bestehen die Methoden der HPV-Detektion in Hybridisierungen Polymerase-Kettenreaktion Fragment- und Restriktionsanalysen DNA-Sequenzierungen Diese Methoden können in den verschiedensten Modifikationen und Kombinationen angewendet werden. Jede dieser Methoden besitzt Vor- und Nachteile. Oft führt erst eine Methodenkombination zu einem befriedigenden Ergebnis. Trotz langjähriger und ausgiebiger Untersuchungen in größeren Studien schwanken die Angaben vor allem über die Häufigkeit von HPV-Infektionen in Verbindung mit präneoplastischen und neoplastischen Läsionen immer noch erheblich. Sie reichen von 65.5 % (Graf et al. 2000) bis nahezu 100% (Cottage et al. 2001). Bosch et al. (1995) konnten in einer weltweiten Studie bei 93% der Gebärmutterhalskrebstumoren humane Papillomviren nachweisen. Eine Studie von Walboomers et al. (1999) gibt an, daß bei Kombination verschiedener Methoden zum HPV-Nachweis der Anteil HPV-positiver Tumoren auf 99,7% ansteigt. Interessanterweise konnten sie bei einem großen Anteil der in der BOSCH-Studie negativen HPV-Fälle durch Kombination von HPV-Serologie, HPV-E7-typspezifischer und L1- bzw. E1-Consensus-PCR doch humane Papillomaviren als Auslöser nachweisen. Danach ist ein negatives HPV-Ergebnis je nach Nachweismethode und Zielsequenz kritisch zu interpretieren und ggf. eine zusätzliche Methode heranzuziehen. In unserem Institut wurden von 1994 bis jetzt unterschiedliche PCR- und/oder Hybridisierungsmethoden zum HPV-Nachweis durchgeführt und falls erforderlich - auch mehr als eine Methode angewandt. Die Schwierigkeit in der HPV-Diagnostik besteht in der großen Anzahl von HPV-Typen und damit im Erfassen möglichst vieler dieser Typen, insbesondere derjenigen mit mittlerem bis hohem kanzerogenem Potential, so daß für die Routinediagnostik in der Regel eine Consensus-PCR erforderlich ist. Die weltweit verbreitetste Methode ist hierbei eine PCR für die L1-Region der HP-Viren mit den sog. degenerierten MY09/11- Primern. Dieses Screeningverfahren wurde in unserem Institut 1994 eingeführt. Zusätzlich wurden die in diesem Verfahren positiven Fälle mit Hilfe einer nested PCR auf die drei häufigsten high-risk-gruppen 16, 18 und 33 untersucht, um eine prognostische Aussage über die Progredienz der Zervixläsionen machen zu können. Auch konnten mit Hilfe der in-situ-hybridisierung, die ebenfalls parallel durchgeführt

2 wurde, die Typen 6/11 (low risk), 16/18 (high risk) sowie 31/35/51 (high risk) differenziert werden. Der Arbeitsablauf war folgender: Zunächst wurde die Consensus-PCR mit den MY09/11-Primern durchgeführt, d. h. der Nachweis eines L1-Fragmentes und parallel dazu die in-situ-hybridisierung. Die Amplifikate der Consensus-PCR wurden elektrophoretisch ausgewertet und positive Fälle erneut im nested PCR-Verfahren - Nachweis des E6-ORF - untersucht, so daß die wichtigsten high-risk-gruppen - 16/18/33 - erfaßt werden konnten. Durch die Kombination dieser drei Methoden (Consensus-PCR L1-Region, nested PCR E6- Region und in-situ-hybridisierung) konnte die Sicherheit in der Diagnostik im Hinblick auf eventuell falsch negative Fälle erhöht werden. Überwiegend zeigte sich mit den drei Methoden ein übereinstimmendes Bild. War bei einer der Methoden ein negatives Ergebnis vorhanden, so konnte mit einer der anderen beiden Methoden sehr oft ein positives Ergebnis erzielt werden, so daß die Anzahl falsch negativer Ergebnisse so gering wie möglich gehalten werden konnte. Für die Routinediagnostik zeigte sich jedoch, daß der Aufwand durch die hohe Anzahl an PCR-Ansätzen und elektrophoretischen Nachweisen, die durchgeführt werden mußten sowie das arbeitsund zeitintensive in-situ-hybridisierungsverfahren insgesamt sehr hoch und zeitaufwendig war - abgesehen von den damit verbundenen hohen Personal- und Sachkosten. HPV-Typisierung am Institut für Pathologie : Consensus -PCR für die L1-Region + in-situ-hybridisierung (Primer My09/11) (HPV6/11, 16/18, 31/35/51) positiv in der Elektrophorese negativ in der Elektrophorese HPV-negativ nested PCR (E6-Region) positives Ergebnis negatives Ergebnis HPV 16/18 oder 33 16/18/33-negativ, evt. pos. für 6/11 o. 31/35/51 (in-situ-hybrid.) > high risk > low risk o. high risk pos. o. HPV undefinierter Typisierg. pos. Beispiele für gel-elektrophoretische Nachweise von Virus-DNA nach Consensus- und/oder nested-pcr sowie DNA-in situ-hybridisierung

3 Gel-Elektrophorese mit Positiv- und Negativ -Kontrolle bei HPV Nachweis der high risk-gruppe: Line 1+2 : Positivekontrollen Line 3+4 : Negativkontrollen Gel-Elektrophorese mit Positiv- und Negativ-Kontrolle nach nested-pcr Für HPV-DNA der high risk-gruppe Beispiel einer DNA-in situ- Hybridisierung für HPV 31/35/51 am histologischen Schnittpräparat eines Viruskondyloms HPV 31/35/ kam ein nichtradioaktives Detektionssystem für PCR-Produkte von der amerikanischen Firma Digene auf den Markt, das SHARP (solution hybridization assay for PCR products) SIGNAL System. Mit Hilfe dieses Kits konnten PCR-Produkte der MY09/11-Consensus-PCR auf 16 verschiedene HPV-Typen, die in zwei Gruppen, high risk und low risk, eingeteilt waren, untersucht werden. Zum einen ließ sich jetzt also ein größeres Spektrum von HP-Viren erfassen, zum anderen konnte auch eine große Anzahl von Proben im Mikrotiterplattenverfahren durchgesetzt werden. Das Digene SHARP Signal System ist ein colorimetrisches Detektierungssystem, das im Sandwichverfahren Hybridisierungsprodukte detektiert. Einer der beiden Primer, in diesem Falle MY11, muß 5`-biotinyliert vorliegen. Die so markierten PCR-Produkte werden dann mit einer

4 spezifischen Einzelstrang-RNA-Sonde hybridisiert und diese RNA-/DNA-Hybride durch Biotin auf der Oberfläche von Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten-Vertiefungen gebunden. Zu den immobilisierten Hybriden werden dann anti-hybrid-antikörper hinzupipettiert, an die alkalische Phosphatase gebunden ist. Diese wird dann durch ein colorimetrisches Substrat (PNPP = para- Nitrophenylphenol) detektiert. Die Auswertung erfolgt photometrisch. Die Intensität der entstehenden Farbe ist dabei proportional zur Menge an biotinyliertem PCR-Produkt. In dem kommerziell erhältlichen Kit sind zwei Sondengemische enthalten in zwei sogenannten Sets: Set A enthält Sonden für low-risk-hpv-typen 6/11/42/43 und 44. Set B enthält Sonden für high-risk- HPV-Typen 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56 und 58. Es können also 16 der am häufigsten genital vorkommenden HPV-Typen erfaßt werden und in zwei wichtige Risikogruppen eingeteilt werden. Der Vorteil dieses Verfahrens ist der für die Routinediagnostik gut durchführbare hohe Probendurchsatz, das im Vergleich zu unseren zuvor durchgeführten Methoden größere nachweisbare Virusspektrum sowie die höhere Sensitivität der der Hybrisisierung vorgeschalteten PCR im Vergleich zur in-situ-hybridisierung, Nachteil jedoch auch hier das eventuelle Vorhandensein falsch negativer Fälle, da jetzt nur noch ein Genabschnitt (L1-Region) zum Nachweis zur Verfügung steht. Einzelfälle, die im SHARP-SIGNAL-System ein negatives Ergebnis erbrachten, stellten sich in der Elektrophorese ihrer PCR-Produkte jedoch positiv dar. Die Sequenzierung dieser PCR-Produkte ergab in einem Teil dieser Fälle dann ein positives Ergebnis, wie in Tabelle 1 ersichtlich ist. Fälle, die in der Sequenzierung als "nicht auswertbar" bezeichnet werden, weisen auf überlagerte Sequenzen hin, die entweder aus unspezifischen Amplifikaten bestehen können oder auch das Ergebnis einer HPV-Mischinfektion sein können, die in der Sequenzierung ja ebenfalls zu überlagerten Sequenzen führen muß. Eine eindeutige Aussage ist in diesen Fällen nicht treffbar. Tabelle 1: HPV-Typisierung mittels "SHARP-SIGNAL-System" und Sequenzierung Eingangs-Nr. Zytologie Histologie HPV-Typisierung mittels SHARP-SIGNAL- System HPV-Typisierung mittels Sequenzierung E11449/00 IVa CIS neg. HPV33 (high risk) E7331/00 IIID CIS neg. HPV16 (high risk) E8869/00 IVa CIS neg. HPV 16 (high risk) E4576/00 IVa CIS neg. HPV 16 (high risk) H29168/00 IVa CINIII neg. nicht auswertbar E1525/00 IVa CIS neg. HPV16 E621/00 IVa CIS neg. neg. H23585/00 IVa CINIII low risk - H20631/00 IVa CINIII neg. nicht auswertbar H13687/00 IVa CINIII neg. nicht auswertbar

5 H6044/00 IVa CIS neg. nicht auswertbar E18572/00 IIID CIS neg. nicht auswertbar H51242/00 IVa CIS neg. nicht auswertbar H2572/00 IVa CIS low risk HPV related to epidermodysplasia verruciformis (ADX2) = HPV 5 related (low risk) H2081/00 IIID CINIII neg. HPV 69 (low risk) E34549/00 IIID CINII neg. nicht auswertbar H7827/00 IIID CINII neg. nicht auswertbar H20592/00 IIID CIS neg. nicht auswertbar E17348/00 IIID CINIII neg. nicht auswertbar E31165/00 IVa CINIII neg. neg. E37669/00 CINIII neg. (HCII) nicht auswertbar CIS = Carcinoma in situ CIN I - III = cervical intraepithelial neoplasia grade I - III nicht auswertbar = in der Sequenzierung überlagerte Sequenzen HCII = Hybrid Capture Test II durchgeführt statt SHARP SIGNAL System Cervikale intraepitheliale Neoplasien werden insbesondere von HP-Viren der high-risk- Gruppen verursacht. In den meisten Studien ist in ca. 90% der Läsionen HPV-DNA nachweisbar (zur Hausen u. de Villiers 1994), wobei HPV 16 am häufigsten vorkommt. Eigene Untersuchungen (u.a. nested PCR und Sequenzierung) bestätigen dieses ebenfalls. Bei den in der oben angegebenen Tabelle aufgeführten Fällen, die im Nachweis mit dem SHARP-SIGNAL-System negativ waren bzw. in zwei Fällen HPVlow-risk aufwiesen, hätte man nach dem zytologischen bzw. histologischen Befund eher HP-Viren der high-risk-gruppe erwarten können. Die Tabelle enthält in dem Jahr 2000 gesammelte im SHARP SIGNAL System HPV-negative bzw. zwei low-risk positive Fälle zusammen, bei denen aufgrund eines positiven zytologischen bzw. histologischen Befundes auch ein positives HPV-Ergebnis hätte erwartet werden könnten. In 1/3 der Fälle konnte durch die Sequenzierung gezeigt werden, daß durchaus HP-Viren (überwiegend der high-risk-gruppe) vorhanden waren. 2/3 dieser Fälle blieben jedoch negativ bzw. nicht nachweisbar für HPV. In unserem Jahresdurchschnitt finden sich ca. 10% solcher Konstellationen. Nach einer Studie von Walloomers et al. (1999) kann sich eine mögliche Erklärung darin ergeben, daß Unterbrechungen oder Deletionen in der Integration der HPV-DNA auf der Ebene des L1-ORF vorhanden sein können, so daß die Zielsequenz für die PCR schon inadäquat sein kann. Bei etwa 50% der in ihrer Studie für die L1-Region negativen Fälle konnte die Gruppe bei Verwenden einer PCR für die E7-Region dagegen positive Ergebnisse erzielen. Sie interpretierten daraus, daß die E7-Region eine stabilere Integration in das Wirtsgenom aufweist als die L1- Region. Die beiden Onkogene E6 und E7, die in hohem Maße an der Modifikation des Wirtszellgenomes beteiligt sind, werden als sogenannte "early genes" gerade zu Beginn der neoplastischen Entartung in den proliferierenden Zellen exprimiert (zur Hausen u. de Villiers 1994). Dagegen findet die Expression der sogenannten "late genes" (L1) auf der Ebene der Differenzierung der Zellen bzw. der Replikation der viralen DNA statt. D. h. zu einem bestimmten Zeitpunkt der Untersuchung, zumindest in Initialstadien der

6 Entartung, kann vermutet werden, daß die L1-Expression noch nicht vollständig ist, so daß es zu einem negativen Ergebnis im HPV-Nachweis kommen kann. Auch die Immunabwehrlage der Patientinnen spielt eine Rolle. Eine durch HP-Viren induzierte Zellproliferation kann letztendlich auch ohne weitere virale Stimulation selbstständig fortschreiten, so daß im Tumor tatsächlich kein Virus mehr vorhanden sein kann. Weitere Gründe für negative Ergebnisse können die Formolfixation, die im allgemeinen zu DNA-Brüchen führt und somit eine ohnehin schon niedrige Virusausgangsmenge weiter reduzieren kann, sein oder auch stark nekrotisches Material mit schlechter DNA- Qualität. Fünf der in der oben angebenen Tabelle aufgeführten Fälle zeigten im SHARP-SIGNAL- System ein negatives Ergebnis, jedoch in der Sequenzierung ein positives Ergebnis für HPV 16 bzw. 33, beides HPV-Typen, die eigentlich mit dem Sondengemisch von Set B des Kits hätten erfaßt werden müssen. Eine Erklärung wäre in einer zu niedrigen Amplifikatmenge zu suchen, die unter der Sensitivitätsgrenze der Sonden liegen könnte, oder eine so hohe Amplifikatmenge, die zu Hemmungsmechanismen innerhalb des Sondengemisches führen könnte. Ein Fall eines Carcinoma in situ, der im SHARP-SIGNAL-System ein low-risk-ergebnis erbrachte, ließ sich in der Sequenzierung ebenfalls als ein low-risk-virus (HPV-5- related) verifizieren. In einem weiteren Fall eines CINIII, der im SHARP-SIGNAL-System negativ war, konnte mit Hilfe der Sequenzierung HPV 69 nachgewiesen werden, ein low-risk-virus, das in den Sondengemischen nicht vorhanden war. Hier ergab die Sequenzierung ein zusätzliches Ergebnis, das mit dem SHARP-SIGNAL-System nicht hätte erzielt werden können. Um ein noch größeres Spektrum von HPV-Typen erfassen zu können, insbesondere solcher mit kanzerogenem Potential, sind wir im letzten Jahr auf das Hybrid-Capture-II- System von Digene übergegangen, einem Hybridisierungsverfahren, dem normalerweise keine PCR vorausgeht bzw. vorausgehen muß, bei dem 18 statt vormals 16 verschiedene HP-Viren erfaßt werden können. Zusätzlich zu den oben schon für das SHARP-SIGNAL-System genannten HPV-Typen lassen sich hiermit zwei weitere highrisk-hpv-typen erfassen, HPV 59 und 68. Auch dieses Verfahren arbeitet, wie bei dem SHARP-SIGNAL-System auf der Basis von RNA-DNA-Hybriden, die auf mit anti-rna- DNA-Hybrid-Antikörpern versehenen Capture-Platten immobilisiert werden und anschließend in einem Chemilumineszenzverfahren detektiert werden. Ursprünglich ist dieser Test für Cervikalabstriche vorgesehen, läßt sich aber auch auf entsprechend vorbehandeltes und in Paraffin eingebettetes Gewebematerial anwenden. Laut Hersteller soll die Sensitivität dieses Testverfahrens dem einer PCR vergleichbar sein. Untersuchungen des Vorgängers dieses Hybrid-Capture-II-Tests kamen auf bis zu 86% Übereinstimmung mit der MY09/11- PCR (Farthing et al. 1994, Sun et al. 1995). Riethmuller et al. (1999) verglich - neben einem normalen und einem dysplasiefreien Patientinnenkollektiv - steigende Grade intraepithelialer cervikaler Neoplasien mit Ergebnissen des Hybrid capture II (HC-II) und der PCR. Sie fanden mit steigenden Dysplasiegraden eine zunehmende Übereinstimmung der zwei Nachweismethoden von ca. 65% bis 100%. Um die wenig geringere Sensitivität dieses Hybrid capture-tests gegenüber den PCR- Verfahren ausgleichen zu können, werden alle aufkommenden Proben bei uns parallel der Consensus-PCR mit den Primern MY09/11 für die L1-Region unterzogen. Proben, die in der Elektrophorese ein positives Ergebnis erbringen, jedoch im Hybrid Capture- Test II negativ sind, werden sequenziert, um auch hier die Zahl möglicher falsch negativer Fälle gering zu halten. Etwa 10% im Gesamtprobenauf- kommen zeigen eine solche Konstellation. Bei etwa 2,5% dieser im Hybrid-Capture-TestII im Vergleich zum

7 Gesamtaufkommen negativen Fälle lassen sich mittels der Sequenzierung HP-Viren nachweisen, dabei oftmals HPV 16, der eigentlich durch den Capture-Test miterfaßt werden müßte. Diese Ergebnisse unterstützen daher die These einer geringeren Sensitivität dieses Tests im Vergleich zur PCR. Die Darstellungen zweier Sequenzierungselektropherogramme zum einen eines zytologischen Ausstriches eines PAP IVa (E50179/00) und eines histologischen Präparates eines CINIII (4187/01) geben zwei Beispiele solcher im Hybrid-Capture-Test II negativen, jedoch in der Sequenzierung positiven Fälle ab. In beiden Fällen konnte HPV 16 nachgewiesen werden. Beispiel einer DNA-Sequenzierung eines Abschnittes des HPV 16- Genoms :

8 Anschließende Übermittlung der Sequenzen an die Datenbank Blast Search Result mit folgender Rückantwort : Gesamt läßt sich aussagen, daß für die Durchführung einer Routine-Diagnostik ein gut durchführbares Screeningsystem auf der Basis einer Consensus-PCR oder eines Hybridisierungsverfahrens mit Sondengemischen, die möglichst viele HPV-Typen erfassen, zu empfehlen (u.a. Terai,et al. 2001) ist. Auch hierbei möglicherweise

9 auftretende negative Ergebnisse gerade im Zusammenhang mit auffälligen Cervikalabstrichen und cervikalen intraepithelialen Neoplasien sollten durch ergänzende Detektionsmethoden geprüft werden. Referenzen: Bosch, FX et al., J. Natl. Cancer Inst. 1995; 87: Cottage,A., S. Dowen, I. Roberts, M. Pett, N. Coleman, M. Stanley, Genes Chromosomes Cancer 2001; 30(1): 72-9 Farthing, A et. al., J. Clin. Pathol. 1994; 47: Graf, AH, AL Cheung, C Hauser-Kornberger, N. Dandachi, RR Tubbs, O. Dietze, GW Hacker, Appl Immunohistochem Molecul Morphol 2000;8(4): zur Hausen, H u. de Villiers E-M, Annu. Rev. Microbiol. 1994;48: Riethmuller, D, A Gay, X Bertrand, D. Bettinger, JP Schaal, JP Carbillet, C Lassabe, P Arveux, E Seilles, C Mougin, Diagnostic Molecular Pathology 1999; 8(3): Sun, X-W et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 1995; 173: Terai, M., RD Burk, Virology 2001;5;279(1): Walboomers J M M et al., J. Pathol. 1999; 189: Prof. Dr. med. Klaus Richter Dr. med. vet. Katrin Henneicke Institut für Pathologie Berliner Allee 48, Hannover richter@pathologie-richter.de Internet : Vorgetragen auf der Tagung für zervikale Pathologie und Kolposkopie in Jesteburg (Leitung Dr.med.Schomann)