Mikroskop. Der Kehrwert des Auflösungsvermögens ist der kleinste Abstand, den zwei Punkte haben dürfen, damit sie noch getrennt wahrgenommen werden.

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1 Versuch 10 Mikroskop Versuchsziel: Nach dem Modell der geometrischen Optik kann man durch immer stärkeres Heranführen eines Gegenstands an die Brennweite einer Sammellinse beliebig große Bilder auf einem Schirm erzeugen. Eine solche Anordnung als Mikroskop zu verwenden ist aus praktischen Gründen nicht möglich. Es müsste ein unbequem langer Tubus verwendet werden, das Bild würde zunehmend lichtschwächer, die Abbildungsfehler nähmen stark zu und das Gesichtsfeld wäre sehr klein. Daher besteht das Mikroskop im Prinzip aus einer Kombination zweier Sammellinsen. Mit dem Objektiv wird von einem beinahe in der Brennebene liegenden Gegenstand ein vergrößertes Bild erzeugt. Dieses reelle Zwischenbild wird mit dem Okular als Lupe betrachtet. Die Gesamtvergrößerung des Mikroskops ergibt sich damit multiplikativ aus der Vergrößerung des Objektivs und des Okulars. Befindet sich in der Zwischenbildebene ein geeichter Maßstab, kann man damit die Größe eines Objekts messen. Im Teil 1 des Versuchs soll nach diesem Verfahren die Dicke eines Haares bestimmt werden. Formal sollte man mit einem Mikroskop beliebige Vergrößerungen erzeugen können. In der Praxis zeigt sich, dass ab einer bestimmten Vergrößerung die, wegen der Welleneigenschaft des Lichts, auftretenden Beugungserscheinungen eine weitere Strukturauflösung unmöglich machen. Zwar könnte man noch durch das Mikroskop fotografieren und das Bild auf eine Leinwand projizieren, aber dadurch erhielte man nur eine geometrische Vergrößerung ohne neue Detailinformation. Daher spricht man in diesem Fall von einer leeren Vergrößerung. Die Grenze für die Auflösung durch ein optisches Gerät ist durch das Auflösungsvermögen definiert. Es gilt A: Auflösungsvermögen A = n sinα 0,6 λ n sinα : Numerische Apertur λ: Wellenlänge des verwendeten Lichts Der Kehrwert des Auflösungsvermögens ist der kleinste Abstand, den zwei Punkte haben dürfen, damit sie noch getrennt wahrgenommen werden. Die numerische Apertur ist eine dimensionslose Größe und hat für ein bestimmtes Objektiv einen festen Wert (etwa 1). Das Auflösungsvermögen und damit die maximale Vergrößerung kann hauptsächlich durch Verkürzung der Wellenlänge gesteigert werden. Durch die Verwendung von UV-Licht kann es etwa verdoppelt werden. Dann kann das Bild allerdings nicht mehr direkt mit dem Auge betrachtet werden und das Mikroskop muss mit einer teuren Quarz-optik ausgerüstet sein. Trotzdem sind solche Mikroskope im Einsatz. Da Proteine und DNA in verschiedenen UV-Bereichen absorbieren, kann beim Betrachten einer Gewebeprobe unter zwei Wellenlängen auf das Verhältnis von DNA zu Protein in den Zellen geschlossen werden. Ein Spezialist kann daraus sofort erkennen, ob die Probe von einem malignen Tumor stammt. (Während der Operation!) Eine wesentliche Verkürzung der Wellenlänge erreicht man mit dem Elektronenmikroskop. Als Linsen dienen in diesem Fall Magnetfelder. Es können mit dem ELMI Vergrößerungen um den Faktor 10 5 erzeugt werden, wogegen man mit dem Lichtmikroskop praktisch nur die fache Vergrößerung erreicht. Der Zwischenbereich wird durch das Röntgenmikroskop abgedeckt. Auch bei diesem Mikroskop können keine

2 herkömmlichen Linsen verwendet werden, da das Röntgenlicht seine Ausbreitungsgeschwindigkeit in Materie praktisch nicht ändert und daher keine Brechung auftritt. Zur Ablenkung des Röntgenlichts werden Zonenplatten (radialsymmetrische Transmissionsbeugungsgitter) verwendet. Inzwischen existieren transportable Röntgenquellen, die ein genügend intensives Röntgenlicht erzeugen können. Damit ist die Anwendung des Röntgenmikroskops nicht mehr an ein Elektronensynchrotron gebunden. Versuchsteile: 1. Aufbau eines Mikroskops 2. Eichung des Okularmaßstabs und Messung der Haardicke 3. Direkte Bestimmung der Vergrößerung des Mikroskops 4. Bestimmung der Vergrößerung in Abhängigkeit von der Tubuslänge. Durchführung: Teil 1: Im ersten Teil soll an einer optischen Bank ein Mikroskop aufgebaut werden. In den nachfolgenden Teilen nutzt man dann ein kompaktes fertiges Mikroskop. Auf der optischen Bank wird eine Lampe bei der Markierung 3cm und ein Kondensor direkt vor der Lampe (8,5cm- 9cm) aufgebaut. Die Lampe wird angeschlossen und bei einer Spannung von 12 V und einem max. Stromfluss von 1A betrieben. Als Objekt dient ein Präparat eines Flohs, das Präparat wird mit der Halterung hinter dem Kondensor aufgebaut. Das Objektiv besteht aus einer Linse mit f=50mm Brennweite die bei der 20cm Markierung auf der optischen Bank montiert wird. Nun wird der Floh mit Hilfe der Objektivlinse abgebildet. Als erstes bringen sie das Objekt an die passende Stelle, damit das entstehende reelle Bild ungefähr bei der Markierung 70cm scharf abgebildet wird. Nutzen hier sie als Schirm ein Blatt Papier. Nun stellen sie eine Linse mit einer Brennweite von 100mm an die passende Stelle um dieses reelle Bild wie mit einem Okular abzubilden. Bevor sie nun durch das Okular die Vergrößerung des Flohs betrachtet drehen sie den max. Stromfluss auf ca. 0,6A um nicht geblendet zu werden. Betrachten sie nun durch das Okular das Objekt. Evtl. müssen sie den Objektträger ein wenig verschieben um ihn wahrnehmen zu können. Wenn sie das Okular etwas verschieben was ändert sich? Bringen sie nun anstelle der f=100 mm Linse eine Linse mit f=50mm als Okular ein. Wie verändert sich die Vergrößerung? Verändern sie nun die Tubuslänge, indem sie dafür sorgen, dass das reale Bild bei 50cm scharf abgebildet wird. Nutzen sie das f=100mm Okular. (Drehen sie zur Einstellung den Stromfluss auf 1A und verringern sie ihn wieder bevor sie durch das Okular schauen!) Was verändert sich?

3 Teil 2: In der Zwischenbildebene des Monookulars ist ein Maßstab eingebaut, der mit den drei vorhandenen Objektiven geeicht werden soll. Dazu dient ein Objektmikrometer mit einer Teilung von 100 Strichen auf 1 mm. Für jede Kombination ist von jedem mit jeweils neuer Einstellung abzulesen, wie viele Teilstriche des Objektmikrometers 50 Teilstrichen des Okularmaßstabs entsprechen. Der Tubus soll genau auf 17 cm Länge eingestellt werden. Achtung: Beim Mikroskopieren unter Verwendung des Objektivs mit 50facher Vergrößerung berührt das Objektiv fast das Objekt. Durch unvorsichtige Handhabung kann das Objektmikrometer zerbrochen werden. Daher immer das Objektiv vorsichtig herunterdrehen, bis es das Objekt berührt und dann durch Wegdrehen in Beobachterrichtung das Bild scharf stellen. Als Ergebnis ist die Eichung des Okularmaßstabs in µm pro Skalenteil anzugeben. Mit Hilfe des nun bekannten Eichfaktors ist durch Ausmessen unter der Okularskala die Dicke eines Haares zu ermitteln. Mit jedem Objektiv sind von jedem eine Messung durchzuführen. Bei der stärksten Vergrößerung ist die Schärfentiefe kleiner als der Haardurchmesser. Es muss daher auf maximale Haardicke eingestellt werden. Teil 3: Die Größe, unter der ein Objekt dem Betrachter ohne optische Hilfsmittel erscheint, hängt vom Abstand des Auges vom Objekt ab. Als deutliche Sehweite S o hat man einen Abstand von 25 cm gewählt und festgelegt, dass ein Gegenstand im Abstand der deutlichen Seh-weite vom Auge dem Betrachter unter der Vergrößerung V = 1 erscheint. Unter der Vergrößerung des Mikroskops versteht man dann das Verhältnis des Sehwinkels mit Instrument zu dem Sehwinkel in 25 cm Abstand ohne Instrument. Betrachtet man mit dem rechten Auge durch das Mikroskop den Maßstab des Objektmikro-meters und blickt gleichzeitig mit dem linken Auge auf einen makroskopischen Maßstab, der sich in 25 cm Entfernung vom oberen Okularrand befindet, so kann man durch Vergleich beider Maßstäbe auf einfache Weise die Vergrößerung des Mikroskops messen. Bestimmen Sie die Vergrößerung des Mikroskops für die 3 Objektive. Jeder Praktikant führt mind. eine Messung durch. Mit etwas Mühe kann der Versuch auch von Brillenträgern durchgeführt werden. Das Okular kann durch leichtes Drehen am oberen Rand auf das Auge abgestimmt werden. Teil 4: Die Vergrößerung eines Mikroskops ist mit folgender Gleichung beschreibbar: V = V V ob ok V = ob t f ob V = ok S f o ok t = Tubuslänge S o = deutliche Sehweite f ob = Brennweite des Objektivs f ok = Brennweite des Okulars Bei gegebenem Okular und Objektiv ist demnach die Vergrößerung der Tubuslänge direkt proportional. Dieser Zusammenhang soll geprüft werden. Dazu muss für alle 3 Objektive bei den Tubuslängen zwischen 15 und 19 cm, im Abstand von 1 cm, die Anzahl der Skalenteile pro mm des Objektmaßstabs bestimmt werden. Das Messergebnis ist graphisch darzustellen. Mit der in Teil 2 bestimmten Vergrößerung für die Tubuslänge von 17 cm berechnen Sie bitte für die 3 Objektive die bei einer Tubuslänge von 19 cm erreichte Vergrößerung. Ist zu erwarten, dass durch Änderung der Tubuslänge die Vergrößerung wesentlich gesteigert werden kann?

4 Fourier Optik Optische Filterung 4f Anordnung Versuchsziel: Dieser Versuch soll Ihnen die Grundprinzipien der Fourier-Optik vermitteln. Die Fourier-Optik ist ein Teilbereich der Optik, in dem die Ausbreitung von Licht mit Hilfe der Fourier-Analyse untersucht wird. Die Fourier-Optik berücksichtigt die Wellennatur des Lichtes, vernachlässigt aber z. B. die Polarisation. Fourier-Theorie besagt, dass jedes Signal - in unserem Fall Bilder - als Summe einer Reihe von Sinuskurven ausgedrückt werden kann. Im Fall von Bildern sind diese Sinuskurven Helligkeitsschwankungen in diesem Bild. Die räumliche Frequenz, die Amplitude (positiv oder negativ) und die Phase der Sinuskurven werden in einem Fourier-Term erfasst und beinhalten alle Bildinformationen. Graph zweier Sinuskurven und ihrer Summe Die räumliche Frequenz ist die Frequenz mit der die Helligkeit moduliert wird. Zum Beispiel zeigt das linke Bild eine Sinuskurve mit einer niedrigeren räumlichen Frequenz als das rechte Bild. Die Amplitude (Höhe der Sinuskurve) entspricht dem Kontrast oder die Differenz zwischen dem dunkelsten und dem hellsten Wert des Bildes. Die Phase stellt dar, wie die Sinuskurve relativ zum Ursprung verschoben wird, in unserem Fall, nach links oder nach rechts. Eine Fourier-Transformation (FT) kodiert nicht nur eine einzelne Sinuskurve, sondern gleichzeitig eine ganze Reihe von Sinuskurven räumlicher Frequenzen in einem Bild. Ein (Sinuskurven-)Signal, das nur eine einzige räumliche Frequenz einer Frequenz f beinhaltet wird als einzelner Peak im Punkt f entlang der Raumfrequenz-Achse dargestellt, die Höhe des entsprechenden Peaks entspricht der Amplitude oder dem Kontrast des Sinuskurvensignals. Der "DC term", entspricht der räumlichen Frequenz Null. An dieser Stelle ist die durchschnittliche Helligkeit des gesamten Bildes dargestellt. Man kann die FT einer einzigen Zeile des Helligkeitsbildes, also ein eindimensionales Signal berechnen. Um eine vollständige zweidimensionale FT eines Bildes zu erhalten, führt man eine eindimensionale FT für jede Zeile und anschließend für jede Spalte des Bildes durch. Das Ergebnis ist ein 2D-Fourier-Bild, das die gleiche Größe wie das Originalbild hat. Das linke der beiden rechten Bilder zeigt ein Helligkeitsbild und seine zweidimensionale FT. Jeder Pixel des Fourier-Bildes stellt den Ortsfrequenzwert dar; die Größe dieses Wertes wird in der Helligkeit des Pixels kodiert. In diesem Fall gibt es einen hellen Pixel im Zentrum, der DC-Term und zwei helle Pixel um das Zentrum, dass die Kodierung des Sinuskurvenmusters wiedergibt. Je heller die Punkte im Fourier-Bild sind, desto höher ist der Kontrast im Helligkeitsbild. Da es nur ein Fourier-Term in diesem einfachen Bild gibt, sind alle anderen Werte in dem Fourier-Bild schwarz dargestellt - gleich Null.

5 Die Ausrichtung der Sinuskurve korreliert mit der Ausrichtung der Peaks im Fourier-Bild in Bezug auf den zentralen DC term (rechtes Bild). Ein weiteres Helligkeitsbild, diesmal mit einer höheren räumlichen Frequenz wird in seiner zweidimensionalen Fourier-Transformation mit drei Punkten dargestellt. Die zwei Punkte befinden sich ferner vom zentralen DC term, was auf eine höhere räumliche Frequenz hinweist. Verschiedene Fourier-Koeffizienten werden additiv kombiniert und erzeugen so Kombinationsmuster. Zum Beispiel ist das untere sinusförmige Bild das Ergebnis der Summe der Sinuskurven der beiden rechten Bilder. + = Das Wesentliche bei der FT ist, dass das Fourier-Bild exakt die gleichen Informationen wie die Helligkeitsbild codiert. Die inverse FT des Fourier-Bildes erzeugt eine exakte Kopie des ursprünglichen Helligkeitsbilds. Die Helligkeits- und die Fourier-Bilder sind also austauschbar, weil sie genau gleiche Informationen enthalten. Das kombinierte Helligkeitsbild (oben) könnte durch eine Pixel-für-Pixel-Addition der beiden Helligkeitsbilder erstellt worden sein, oder durch eine Pixel-für-Pixel-Addition der entsprechenden Fourier-Bilder. Schwingungen höherer Ordnung Die Grundlage für die Fourier-Transformation ist die sinusförmige Funktion; jede Form kann damit beschrieben werden. Die rechte Abbildung zeigt vier sinusförmige Helligkeitsbilder von Ortsfrequenz 1, 3, 5 und 7. Die erste Abbildung mit der Ortsfrequenz 1 stellt das grundlegende Helligkeitsbild dar; die anderen Bilder bestehen aus Schwingungen höherer Ordnung, die aus dem ganzzahligen Vielfachen der Grundfrequenz bestehen. Darunter ist die Fourier-Transformation für jedes dieser Muster dargestellt.

6 Die nächste Bildreihe zeigt das Ergebnis der Addition des Grundbildes mit Schwingungen höherer Ordnung. Die optische Fourier-Transformation und Fourier-Filterung Durch die einfache Anwendung der FT mit einer Linse entsteht das Fourier-Bild (links). Durch die doppelte Anwendung der FT mit einer Linse entsteht ein sogenannter Fourier-Filter. Im gemeinsamen Brennpunkt der Linsen kann das beobachtete Objekt im Frequenzraum manipuliert werden. Im rechten Bild sehen Sie das Bild und sein Fourier-Bild. Durch die Rücktransformation (inverse FT) erhalten Sie das identische ursprüngliche Bild. Läßt man nur Frequenzen mit geringer räumlicher Frequenz passieren, so entsteht ein Fourier-geflitertes Bild mit einem Tiefpassfilter. Das Rücktransformierte Bild ist unscharf, da die scharfen Kanten und Konturen verloren gehen. Mathematisch gesehen entspricht die Tiefpassfilterung einer optischen UnschärfeFunktion. Das Gegenteil, ein Hochpassfilter, lässt nur Hochfrequenzen. Nach der Durchführung der inversen Transformation entsteht ein Bild mit scharfen Kanten (rechts). Die FT und die Rücktransformation eines Bildes sehen Sie schematisch in der unteren Skizze.

7 Versuchaufbau: Der Laserstrahl wird durch den Spiegel M1 durch den Strahlaufweiter zum M2 gelenkt. Das kohärente Licht durchstrahlt das Bild in der Objektebene P1 und wird dann durch die Linse L1 auf die Fourier- und Filterebene P2 projiziert. Durch die Linse L2 wird das rücktransformierte, gefilterte Bild auf der Beobachtungsebene SC abgebildet. Durchführung: Sicherheits- und Handhabungshinweise für den Versuchsleiter Lasersicherheit: Der eingesetzte Laser (Helium-Neon-Laser) ist ein Laser der Klasse 3 und damit prinzipiell gefährlich für das menschliche Auge. Beachten Sie daher in jedem Fall folgende Hinweise. Am Versuch stehen Laser-Justierbrillen für eine Gruppe zur Verfügung. Die Justierbrillen werden während der gesamten Versuchsdurchführung getragen, um die Intensität der Strahlung abzuschwächen. Das bedeutet nicht, dass ein direkter Blick in den Laser mit diesen Brillen ungefährlich ist; es wird lediglich die Zeit bis eine Schädigung eintritt verlängert. Die Laserstrahlung ist auch durch die Brillen noch so gut sichtbar, dass der Fleck des Lasers auf einer Blende oder einem Schirm beobachtbar ist. Um zu vermeiden, dass der Laserstrahl in ihr Auge gelangt dürfen keine Uhren, Ringe oder ähnliche reflektierende Gegenstände getragen werden, die mit dem Laserstrahl in Berührung kommen könnten. Begeben Sie sich niemals auf Augenhöhe mit der Laserstrahlung. Beim Bücken Augen abschirmen oder schließen! Es dürfen sich keine Praktikumsteilnehmer ohne Justierbrillen in dem Raum aufhalten. Wird eine Optik z.b. ein Umlenkspiegel in den Strahl gebracht, sollte der Laserstrahl vorher geblockt werden. Ist dies nicht möglich, da z.b. die Position des Laserstrahls auf einem Spiegel beobachtet werden muss, achten Sie darauf, den Halter mit der Optik vorsichtig und gerade in den Strahl zu schieben, so dass es nicht durch ein Verkippen zur Reflektion nach oben kommen kann. Anmerkung: Der Versuchsleiter führt den Versuch vollständig vor. Dabei werden nur der Bildschirm SC gedreht, sowie die in den Ebenen P1 und P2 befindlichen Dias oder Filter angepasst oder ausgetauscht.

8 SC Schematische Darstellung des Versuchs 1. Spannen Sie das Bild vom Kaiser Maximilian und das Dia mit dem Strichgitter (50 Linien/mm) in der Objektebene (P1) hintereinander ein. Linse 1 erzeugt in der Fourier-Ebene das dazugehörige Fourier-Bild. 2. Befestigen Sie das Dia mit der Lochblende mit dem Durchmesser 1-2 mm als Tiefpass-Filter in die Fourier-Ebene (P2); durch den Einsatz dieser Blende werden tiefe Frequenzen des Objektes entfernt (gefiltert). 3. Die Rücktransformation durch die Linse 2 liefert Ihnen das gefilterte Bild in der Beobachtungsebene SC. 4. Beobachten Sie das Bild auf dem Bildschirm SC und vergleichen Sie dieses mit der Theorie. Fragen zu den Versuchen: 1. Lupe, Fernrohr und Mikroskop sind optische Hilfsmittel, mit denen die begrenzten Fähigkeiten des Auges erweitert werden. Was erreicht man mit ihrer Hilfe? 2. Wie ist die Vergrößerung eines optischen Geräts definiert? 3. Was versteht man unter deutlicher Sehweite? 4. Konstruieren Sie den Strahlengang von Lupe und Mikroskop und erklären Sie deren Wirkungsweise. 5. An welcher Stelle des Strahlenganges würden Sie einen Vergleichsmaßstab zur Größenbestimmung eines Objektivs anbringen? Markieren Sie diese Stelle im Strahlengang. 6. Wodurch unterscheiden sich Fernrohr und Mikroskop im konstruktiven Aufbau? Wie ändert sich jeweils die Objektivvergrößerung mit der Brechkraft? 7. Meist hat man am Mikroskop mehrere Objektive und Okulare zur Vergrößerung. Wie kann man die Gesamtvergrößerung des Mikroskops aus den Einzelvergrößerungen der Elemente errechnen? 8. Welche Vergrößerung kann man mit dem Lichtmikroskop maximal erzielen und welche ist sinnvoll zu wählen? 9. Wodurch wird die nutzbare Vergrößerung des Mikroskops begrenzt? 10. Was versteht man unter dem Auflösungsvermögen? 11. Was ist die numerische Apertur des Objektivs? 12. Welches ist der kleinste Abstand, den zwei Punkte haben dürfen, die man mit dem Mikroskop noch auflösen kann? Wellenlänge des Lichts: 500 nm; numerische Apertur: 1,4; umgebendes Medium: Luft 13. Wodurch kann das Auflösungsvermögen des Mikroskops verbessert werden (Auflösungsvermögen des Elektronenmikroskops)? 14. Was ist ein Immersionsobjektiv? 15. Nennen Sie einige Anwendungen des Lasers in der Medizin. 16. Warum ist es häufig notwendig in optischen Anwendungen Filter einzusetzen?