Aus der Frauenklinik des Universitätsklinikum Erlangen Direktor: Prof. Dr. med. Matthias W. Beckmann

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1 Methoden der Statistik zur Analyse von Single Nucleotide Polymorphism (SNP) anhand der Auswertung von Genotypdaten aus einer neoadjuvanten Chemotherapiestudie Aus der Frauenklinik des Universitätsklinikum Erlangen Direktor: Prof. Dr. med. Matthias W. Beckmann Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. biol. hum. vorgelegt von Anne Engel aus Bielefeld

2 Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nünberg Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Gutachter: Prof. Dr. Peter A. Fasching Gutachter: Prof. Dr. Matthias W. Beckmann Tag der mündlichen Prüfung: 21. Oktober 2015

3 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 Abstract 3 1 Einleitung Überblick Fragestellung Aufbau der Arbeit Material und Methoden Die Studie Das Patientinnenkollektiv DNA Extraktion und Genotypisierung Qualitätskontrolle Statistik Grundlagen Grundlagen der Genetik DNA RNA Genexpression Transkription Translation Single Nucleotide Polymorphismen Genotypen und Haplotypen Methoden der Biotechnologie DNA Extraktion Microarrays Statistische Methoden Qualitätskontrolle Missing call rate (MCR) Allelverteilung und Minor Allele Frequency (MAF) Genotyp-Clusterplot Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) Linkage Disequilibrium (LD) Korrelationskoezient D von Lewontin Haplotypenrekonstruktion Parsimony Methode Expectation-Maximization(EM)-Algorithmus i

4 INHALTSVERZEICHNIS ii Phase Reconstruction Method Blockbildung für die Haplotypenrekonstruktion Das mathematische Modell Logistische Regression Korrektur für multiples Testen mit der Methode von Bonferroni-Holm Kriterien zur Beurteilung der Modellgüte Aikaike-Informationskriterium (AIC) Likelihood-Ratio-Test (LRT) Area under the Curve (AUC) Brier-Sore Statistiksoftware R Bioconductor R Pakete gap genetics haplo.stats HardyWeinberg LDheatmap mapld NCBI2R snp.plotter Ergebnisse Studienpopulation Genotypen Genomweite Assoziationsanalyse (GWAS) Top-SNPs LD-Blöcke und Haplotypenrekonstruktion Modellvergleiche Diskussion Ergebnisse der univariaten Assoziationstests Ergebnisse der Modellvergleiche Literaturverzeichnis 57 Abbildungsverzeichnis 63 Tabellenverzeichnis 64 Abkürzungsverzeichnis 65 Anhang 67 Danksagung 109

5 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele In den letzten drei Jahrzehnten hat eine rasante Entwicklung der Technologien stattgefunden, mit denen genetische Merkmale untersucht werden können. Parallel dazu hat die Entwicklung statistischer Methoden, mit denen diese immer gröÿer werdenden Datensätze analysiert werden können, ebenso stark zugenommen. Diese Entwicklungen haben auch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) ermöglicht, die eine groÿe Anzahl von Single Nucleotide Polymorphism (SNP) quer über das gesamte Genom genotypisieren, um die Variationen auf einen Zusammenhang mit einer Krankheit zu untersuchen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit einigen Methoden zur Assoziation von genetischen Einüssen auf ein Krankheitsrisiko am Beispiel eines genomweiten SNP-Datensatzes aus einer neoadjuvanten Chemotherapiestudie. Dabei stehen zwei Fragestellungen im Vordergrund: Lässt sich das Auftreten oder Ausbleiben von Nebenwirkungen während der ersten vier Zyklen neoadjuvanter Chemotherapie durch genetische Unterschiede zwischen den Patientinnen erklären? Und: Lässt sich durch bestimmte Veränderungen des genetischen Datenmodells die Aussagekraft der Ergebnisse verbessern? Material und Methoden An der GeparQuinto-Studie, einer Studie zur Kombination von Bevacizumab, Everolimus oder Lapatinib mit einer neoadjuvanten Chemotherapie, nahmen im Zeitraum von November 2007 bis Juli 2010 insgesamt Patientinnen mit primärem Mammakarzinom teil. Blutproben von Patientinnen wurden genotypisiert und Datensätze mit SNPs generiert. Nach einer Datenbereinigung im Sinne von Qualitätskontrollen verblieben SNPs im Datensatz, die im Rahmen einer genomweiten Assoziationsanalyse auf einen Zusammenhang mit dem Auftreten von Nebenwirkungen in den ersten Behandlungszyklen neoadjuvanter Chemotherapie untersucht wurden. Auf Grundlage dieser Tests wurden die 20 SNPs mit den kleinsten p-werten ausgesucht um einen Vergleich des univariaten Modells mit zwei multivariaten Modellen anzustellen. Damit sollte untersucht werden, ob die Ergebnisse durch Erweiterung der Modelle um zusätzliche genetische Variablen verbessert werden können. Ergebnisse und Beobachtungen Nach einer Korrektur für multiples Testen ergab sich für keinen Assoziationstest ein signikantes Ergebnis. Im Modellvergleich zeigten sich für keines der Modelle deutliche Unterschiede 1

6 ZUSAMMENFASSUNG 2 hinsichtlich der Güte des Modells. Praktische Schlussfolgerungen In dieser Analyse hat die Erweiterung der Modelle um zusätzliche genetische Variablen keine Verbesserung hinsichtlich der Aussagekraft bewirkt. Dieses Ergebnis lässt sich allerdings nicht so ohne weiteres verallgemeinern oder auf andere Datensätze übertragen. Die Erforschung und Entwicklung von Methoden zur Analyse von genomweiten Datensätzen geht nach wie vor weiter und wird in den nächsten Jahren sicherlich weitere interessante Ansätze hervorbringen.

7 Abstract Background Over the last three decades, a rapid development of technologies for analyzing genetic marker has taken place. Simultaneously, a development of statistical methods to analyze the increasing data sets was going on. These developments made genome wide association studies (GWAS) possible, which genotypes a huge number of Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) across the whole genome to analyze the associations of these variations with a disease. This study examines some methods for association of genetic factors with disease risk on the basis of a genome wide SNP data set from a neoadjuvant chemotherapy study. Two main questions are of interest: Can the occurrence of side eects during the rst four cycles of neoadjuvant chemotherapy be explained by genetic dierences between the patients? Furthermore: Is it possible to improve the informative value of the results by modifying the genetic data model? Methods Between November 2007 and July 2010, a total of patients took part in the GeparQuinto study, a study for the combination of Bevacizumab, Everolimus or Lapatinib with neoadjuvant chemotherapy. Blood samples from patients were genotyped and data sets with SNPs were generated. After data cleaning in the sense of quality control SNPs remained in the data sets. With a genome wide association study these SNPs were tested for an association between the occurrences of side eects during the rst four treatment cycles. On the basis of these tests the top 20 SNPs with the smallest p-values were selected for a comparison of this univariate model with two multivariate models. By this means it shall be investigated if the results could be improved by extending the models to additional genetic variables. Results After correction for multiple testing no result of an association test remained signicant. The comparison of the genetic models did not show any clear dierences concerning the quality of the models. 3

8 ABSTRACT 4 Conclusions In this study, the extension of the models by additional genetic variables showed no improvement of the informative value of these models. But this result cannot be generalized and is not readily transferable to other data sets. The exploration and development of methods for the analysis of genome wide data sets is still continuing. In the next few years, it will surely generate further interesting approaches.

9 Kapitel 1 Einleitung 1.1 Überblick In den letzten drei Jahrzehnten hat eine rasante Entwicklung der Technologien stattgefunden, mit denen genetische Merkmale untersucht werden können. Eine immer gröÿere Anzahl an Markern kann zu immer niedrigeren Kosten untersucht werden. Parallel dazu hat die Entwicklung statistischer Methoden, mit denen diese immer gröÿer werdenden Datensätze analysiert werden können, ebenso stark zugenommen. Das HapMap Project ([72], [73]) hat eine Entwicklung von experimentellen Designs, analytischen Methoden und Tools vorangetrieben, um die Probleme mit hochdimensionalen Datensätzen und multiplem Testen zu verbessern [21]. Zu diesen Methoden gehören auch Werkzeuge für die Analyse der Linkage Disequilibrium (LD)- und Haplotyen-Daten, die vom HapMap Project bereit gestellt werden. Darunter sind Tools für die Verknüpfung von assoziierten Single Nucleotid Polymorphisms (SNP, sprich:"snip") mit SNPs in hohem LD, um das tatsächlich für eine Krankheit ursächliche Allel zu nden, zur Identizierung von optimalen Sets von tagsnps für Haplotypen oder auch Tools für die Betrachtung von LD und Haplotypen in einer bestimmten Region [3]. Diese Entwicklungen haben auch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) ermöglicht, die eine groÿe Anzahl von SNPs quer über das gesamte Genom genotypisieren, um die Variationen auf einen Zusammenhang mit einer Krankheit zu untersuchen [38]. Elston und Spence [21] haben bereits 2006 festgestellt, dass dies ein Gebiet ist, auf dem die Forschung zu statistischem Design und Analysemethoden unvermindert weitergehen wird, weil es nicht klar ist, welches die besten statistischen Methoden für solche Studien sind. Auch wenn seither viel Entwicklung stattgefunden hat, ist diese Feststellung immer noch aktuell. Beispielsweise gibt es, soweit uns bekannt, bis heute keinen eindeutigen Konsens über den Vorteil von Ansätzen, die jeden SNP einzeln testen. Ein häug auftretender Vorwurf gegen diese Ansätze ist, dass sie Zusammenhänge zwischen mehreren SNPs ignorieren und solche SNPs übersehen die nur einen Eekt in der Interaktion mit anderen zeigen [62]. Doch auch die Ansicht, dass die (rekonstruierten) Zusammenhänge zwischen SNPs (Haplotypen) grundsätzlich mehr Informationsgehalt als einzelne SNPs haben, [68] ist umstritten [12]. 1.2 Fragestellung Diese Arbeit beschäftigt sich mit einem Teil der oben angesprochenen Methoden zur Assoziation von genetischen Einüssen auf ein Krankheitsrisiko. Die dafür analysierten Daten wurden im Rahmen der GeparQuinto-Studie, einer neoadjuvanten Chemotherapiestudie bei Mammakarzinompatientinnen erhoben. Während in der untersuchten, neoadjuvanten Studie die Heilungsrate 5

10 KAPITEL 1. EINLEITUNG 6 (pathologische Komplettremission) als primäres Studienziel untersucht wurde, soll in der vorliegenden Arbeit ein Zusammenhang zwischen dem Behandlungsrisiko der Chemotherapie in Bezug auf die Nebenwirkungen und individuellen Genotypen untersucht werden. Dabei stehen zwei Fragestellungen im Vordergrund: 1. Lässt sich das Auftreten oder Ausbleiben von Nebenwirkungen während der ersten vier Zyklen neoadjuvanter Chemotherapie durch genetische Unterschiede zwischen den Patientinnen erklären? 2. Lässt sich durch bestimmte Veränderungen des genetischen Datenmodells die Aussagekraft der Ergebnisse verbessern? Dafür wurden genomweite Genotypendaten mit univariaten Modellen untersucht. Zusätzlich wurde als weitere Fragestellung untersucht, ob sich durch die Hinzunahme von weiteren SNPs in das Modell oder durch die Rekonstruktion von Haplotypen die Aussagekraft der Modelle verbessern lässt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf den statistischen Aspekten, die sich aus diesen Fragestellungen ergeben. Die statistischen Methoden und deren Umsetzung in Funktionen der Statistiksoftware R werden daher in einem gesonderten Kapitel ausführlicher betrachtet. 1.3 Aufbau der Arbeit Die Darstellung dieser Arbeit gliedert sich in vier Kapitel. Kapitel 2 Material und Methoden stellt die betrachtete Studie kurz vor (Abschnitt 2.1) und beschreibt den daraus gewonnenen Datensatz (Abschnitt 2.2 und 2.3). Danach werden die angewandten Methoden zur Qualitätskontrolle (Abschnitt 2.4) und die Schritte der statistischen Auswertung (Abschnitt 2.5) erläutert. Der erste Teil des Kapitels 3 Hintergrund erläutert die wichtigsten Begrie und Prozesse der Genetik, die zum Verständis von Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) notwendig sind (Abschnitt 3.1). Dazu werden vor der Einführung des Begris Single Nucleotide Polymorphismen in Abschnitt einige Grundlagen der Genetik skizziert (siehe Abschnitt bis 3.1.3). Danach (Abschnitt 3.2) wird der Weg von der Blut- oder Gewebeprobe bis zum digitalen Datensatz aufgezeigt und die verwendeten Methoden kurz beschrieben. Im zweiten Teil wird beschrieben mit welchen Methoden der Statistik SNP-Daten analysiert werden können. Dabei wird mit statistischen Methoden der Qualitätskontrolle (Abschnitt 3.3.1) begonnen. Darauf folgen deskriptive Methoden, die die Verteilung der Ausprägungen der SNPs (Alleldistribution, Abschnitt und Hardy-Weinberg-Gleichgewicht, Abschnitt 3.3.5) beschreiben, sowie die Beziehungen der SNPs untereinander betrachten (Linkage Disequlibrium, Abschnitt 3.3.6). Anschlieÿend wird aufgezeigt, wie mehrere SNPs zu Haplotypen zusammengeführt werden können (Abschnitt 3.3.7), um sie in dieser Form in die Analysen einieÿen zu lassen. Schlieÿlich werden in Abschnitt 3.4 statistische Testmethoden und Modellkriterien vorgestellt, mit denen Assoziationstests durchgeführt und beurteilt werden können. Im dritten Teil des Kapitels werden verschiedene R-Pakete und die darin enthaltenen Funktionen beschrieben, mit denen die in Abschnitt 3.3 vorgestellten Analysen durchgeführt werden können. Dazu wird in Abschnitt 3.5 die Software R kurz beschrieben. Anschlieÿend werden nach einem kurzen Ausblick auf die erweiternde Software Bioconductor (3.5.1) in Abschnitt die ausgewählten Pakete vorgestellt. In Kapitel 4 Ergebnisse werden die Ergebnisse der Qualitätskontrolle (Abschnitt 4.1 und 4.2) und der statistischen Auswertung erläutert. Dabei teilt sich die statistische Auswertung in

11 KAPITEL 1. EINLEITUNG 7 drei Teile. Im ersten Teil (Abschnitt 4.3) werden die Ergebnisse der genomweiten univariaten Assoziationstests der SNPs mit der Zielvariablen vorgestellt. Im zweiten Teil (Abschnitt 4.4 und 4.5) wird die Auswahl der Top-SNPs und die Ergebnisse der Berechnung der LD-Blöcke und der Rekonstruktion der Haplotypen dargestellt. Im letzten Teil (Abschnitt 4.6) schlieÿlich werden die Ergebnisse der Modellvergleiche aufgezeigt. Kapitel 5 Diskussion schlieÿlich betrachtet zunächst die Ergebnisse der genomweiten univariaten Assoziationstests der SNPs mit der Zielvariable (Abschnitt 5.1). Danach werden die Ergebnisse der Modellvergleiche und die Vor- und Nachteile unterschiedlicher Analyseansätze diskutiert (Abschnitt 5.2). Im Anhang ab Seite 67 bendet sich das R-Skript, mit dem die Auswertungen durchgeführt wurden. Anmerkung zum Sprachgebrauch Bei der Einführung neuer Begrie wird, sofern vorhanden, auch immer die deutsche Bezeichnung genannt, aber dort wo sich auch im deutschen Sprachgebrauch die englische Bezeichnung bzw. Abkürzung durchgesetzt hat, wird diese im weiteren Verlauf verwendet werden.

12 Kapitel 2 Material und Methoden In diesem Kapitel wird die genutze neoadjuvante Chemotherapiestudie kurz vorgestellt (Abschnitt 2.1) und der daraus gewonnene Datensatz beschrieben (Abschnitt 2.2 und 2.3). Dann werden die angewandten Methoden zur Qualitätskontrolle (Abschnitt 2.4) und die Schritte der statistischen Auswertung (Abschnitt 2.1) erläutert. 2.1 Die Studie Die GeparQuinto-Studie ist eine neoadjuvante Chemotherapiestudie, bei der Patientinnen mit vier Zyklen Epirubicin und Cyclophosphamid, gefolgt von vier Zyklen Docetaxel behandelt worden sind. Je nach molekularem Subtyp wurden die Patientinnen noch zusätzlich mit einer antiangiogentischen Substanz (Bevacizumab) oder einer anti-her2-therapie behandelt (Lapatinib oder Trastuzumab). Sie ist eine Gemeinschaftsstudie der Arbeitsgemeinschaft Gynäkologische Onkologie (AGO)-Breast Study-Group und der German Breast Group (GBG), gefördert von der GBG Forschungs GmbH, Neu Isenburg. [26] Das primäre Ziel der Studie ist der Vergleich der Rate pathologischer Komplettremission (pcr). Pathologische Komplettremission heiÿt, dass in einer pathologischen Untersuchung keine vitalen Tumorzellen mehr nachweisbar sind. Dafür werden die Teilnehmerinnen entsprechend ihres HER2-Status und des Ansprechens nach vier Zyklen neoadjuvanter Therapie mit Epirubicin/Cyclophosphamid randomisiert drei verschiedenen Szenarien zugeteilt, die eine weitere Behandlung mit Bevacizumab, Everolimus oder Lapatinib beinhalten. Sekundäres Studienziel ist unter anderem die Bestimmung der Toxizitäten in jedem Behandlungsarm. Mit Toxizitäten ist hierbei das Auftreten einer starken (Grad 3 oder 4) Leukopenie, einem Mangel an weiÿen Blutkörperchen (Leukozyten) gemeint. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich ein Zusammenhang zwischen dem Behandlungsrisiko der Chemotherapie in Bezug auf die Nebenwirkungen und individuellen genetischen Gegebenheiten aufzeigen lässt. Dazu wurde die Fragestellung analysiert, ob sich das Auftreten oder Ausbleiben von Toxizitäten während der ersten vier Zyklen neoadjuvanter Chemotherapie, also vor der Aufteilung in die drei unterschiedlichen Behandlungsarme, durch genetische Unterschiede zwischen den Patientinnen erklären lässt. 8

13 KAPITEL 2. MATERIAL UND METHODEN Das Patientinnenkollektiv An der Studie nahmen im Zeitraum von November 2007 bis Juli 2010 insgesamt Frauen teil, die an über 100 Studienzentren in ganz Deutschland rekrutiert wurden. Für die Studie kamen Frauen mit einem primären Mammakarzinom ohne Metastasen mit einer palpablen Gröÿe von mindestens zwei Zentimetern bzw. einer sonographischen Gröÿe von mindestens einem Zentimeter in Frage, die aufgrund des Tumorstadiums für eine neoadjuvante Chemotherapie in Betracht kamen. Die Teilnehmerinnen der Studie mussten mindestens 18 Jahre alt sein, noch keine Chemotherapie oder Strahlentherapie der Brust bekommen haben und abgesehen von dem Brustkrebs einen guten allgemeinen Gesundheitszustand vorweisen. 2.3 DNA Extraktion und Genotypisierung Für die Untersuchung der genetisch bedingten Einüsse auf die Untersuchungsergebnisse wurde für jede Patientin ein genomweiter Genotypdatensatz mit SNPs erstellt. Insgesamt 2011 Blutproben wurden zur DNA-Extraktion verwendet. Davon konnten 2064 Proben aufgrund ausreichender DNA-Qualität zur Genotypisierung weitergeleitet werden. Daraus resultierten insgesamt Genotypdatensätze. Die DNA-Extraktion fand im Humangenetischen Institut des Universitätsklinikums Erlangen statt. Dafür wurde das Chemagic Magnetic Separation Module I von Chemagen verwendet. Die Normalisierung der Proben wurde mit dem Biomek FK von Beckman Coulter durchgeführt. Die Genotypisierung der Proben wurde vom Genetic Resources Core Facility (GRCF) SNP Center der Johns Hopkins University durchgeführt. Die Daten wurden mit dem HumanOmniExpress- 12v1 Array von Illumina (San Diego, California, U.S.) analysiert. Die Genotypisierung wurde mit Illumnias GenomeStudio (Version ), Genotyping Module (Version 1.9.4) und GenTrain (Version 1.0) durchgeführt. 2.4 Qualitätskontrolle Die Qualitätskontrollen innerhalb des Genotypisierungsprozesses wurden vom GRCF SNP Center durchgeführt und umfassen unter anderem die Verizierung der Daten mit Duplikaten und HapMap-Kontrollsamples. Im Rahmen dieser Auswertung wurden einige statistische Methoden verwendet, die zur weiteren Qualitätsverbesserung nach dem Genotypisierungsprozess beitragen. So wurden SNPs mit nur einer Ausprägung sowie SNPs mit einem Anteil des selteneren Allels (engl: minor allele frequency, MAF) unter einem Prozent aus dem Datensatz entfernt. SNPs, die das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht nicht erfüllen, wurden nicht grundsätzlich ausgeschlossen. Jedoch wurde für die 20 besten SNPs (Top-SNPs, siehe Abschnitt 2.5) der Test auf das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht durchgeführt, um auszuschlieÿen, dass die Ergebnisse durch nicht-genetische Eekte beeinusst wurden. In Anlehnung an Laurie et al (2010) [47] wurde hierbei ein Grenzwert von 10 4 festgelegt. Aus dem selben Grund wurden für diese SNPs Cluster-Plots erzeugt. Für alle Proben wurde der Anteil der fehlenden Genotypwerte (engl: missing call rate, MCR) berechnet. Proben mit MCR über fünf Prozent wurden ausgeschlossen. Zusätzlich wurden für jede statistische Analyse die einieÿenden Variablen einschlieÿlich der Zielvariable Toxizität auf

14 KAPITEL 2. MATERIAL UND METHODEN 10 Vollständigkeit hin überprüft und der Datensatz entsprechend angepasst. 2.5 Statistik Als Zielvariable wurde die binäre Variable Toxizität mit den Ausprägungen 0 (keine Toxizitäten aufgetreten) und 1 (Toxizitäten aufgetreten) gewählt. Mit Toxizitäten ist hierbei das Auftreten einer starken (Grad 3 oder 4) Leukopenie, einem Mangel an weiÿen Blutkörperchen (Leukozyten) gemeint (siehe Abschnitt 2.1). Die SNPs wurden als kategoriale Variable mit den Ausprägungen 0, 1 und 2 entsprechend der Anzahl des selteneren Allels kodiert. Für die Rekonstruktion von Haplotypen wurden zunächst mit der Methode von Gabriel et al [24] die SNPs ermittelt, welche in einem gemeinsamen Bereich liegen in dem wenig historische Rekombination stattgefunden hat (LD-Block). Die Rekonstruktion der Haplotypen innerhalb dieser LD-Blöcke wurde mit einem Expectation- Maximization(EM)-Algorithmus [22] ausgeführt (siehe Abschnitt ). Für jeden Haplotyp wurde eine kategoriale Variable mit der Anzahl des Haplotpyen pro Patient (0, 1 oder 2) generiert. Für die univariate Analyse wurde jeder SNP einzeln in einem additiven Modell mit einer logistischen Regression auf einen Zusammenhang mit der Zielvariable getestet. Da das Interesse auf den genetischen Ursachen für das Auftreten von Toxizitäten liegt, wurde für die Variablen Alter, Humaner Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2)-Status, Östogenrezeptor (ER)-Status und Körperoberäche adjustiert. Bei diesen Variablen handelt es sich um bekannte Prädiktoren, deren Einuss durch die Adjustierung heraus genommen wurde. Für die Korrektur des Fehlers aufgrund von multiplem Testen wurde die Methode von Bonferroni-Holm [7] verwendet. Aus den Ergebnissen wurden die 20 SNPs mit den kleinsten p-werten (Top-SNPs) ausgewählt. Für diese Top-SNPs wurde jeweils der LD-Block ermittelt, in dem sie sich benden. Sowohl die SNPs innerhalb dieses LD-Blocks (SNP1,...,SNPn) als auch die rekonstruierten Haplotypen (HAPLO1,...,HAPLOm) wurden jeweils als multivariates Modell in einer logistischen Regression mit der Toxizität als abhängiger Variable, den SNPs bzw. den Haplotypen als unabhängigen Variablen und Alter, HER2-Status, ER-Status und Körperoberäche als Adjustierungsvariablen getestet. Damit ergeben sich für jeden Top-SNP drei Regressionsmodelle: 1. SNP-Modell: Toxizität Top-SNP + Adjustierungsvariablen 2. BLOCK-Modell: Toxizität SNP SNPn + Adjustierungsvariablen 3. HAPLOTYP-Modell: Toxizität HAPLO HAPLOm + Adjustierungsvariablen Die Güte der drei Regressionsmodelle wurde mithilfe des Aikaike-Informationskriteriums (AIC), des Likelihood-Ratio-Tests, der Area under the Curve (AUC) und dem Brier-Score bewertet und verglichen (siehe Abschnitt 3.4.3). In Abschnitt 3.3 werden die verwendeten statistischen Methoden im Einzelnen beschrieben. Die statistischen Analysen wurden mit dem Statistikprogramm R, Version [60] durchgeführt. Eine detaillierte Beschreibung der verwendeten R-Pakete ndet sich in Abschnitt 3.5.

15 Kapitel 3 Grundlagen der Genetik, Statistische Methoden und R Pakete Im ersten Teil dieses Kapitels (Abschnitt 3.1) werden die wichtigsten Begrie und Prozesse der Genetik erläutert, die zum Verständis von Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) notwendig sind. Dazu werden vor der Einführung des Begris Single Nucleotide Polymorphismen in Abschnitt einige Grundlagen der Genetik skizziert (siehe Abschnitt bis 3.1.3). Danach (Abschnitt 3.2) wird der Weg von der Blut- oder Gewebeprobe bis zum digitalen Datensatz aufgezeigt und die verwendeten Methoden beschrieben. Im zweiten Teil wird beschrieben mit welchen Methoden der Statistik SNP-Daten analysiert werden können. Dabei wird mit statistischen Methoden der Qualitätskontrolle (Abschnitt 3.3.1) begonnen. Darauf folgen deskriptive Methoden, die die Verteilung der Ausprägungen der SNPs (Alleldistribution, Abschnitt und Hardy-Weinberg-Gleichgewicht, Abschnitt 3.3.5) beschreiben, sowie die Beziehungen der SNPs untereinander betrachten (Linkage Disequlibrium, Abschnitt 3.3.6). Anschlieÿend wird aufgezeigt, wie mehrere SNPs zu Haplotypen zusammengeführt werden können (Abschnitt 3.3.7), um sie in dieser Form in die Analysen einieÿen zu lassen. Schlieÿlich werden in Abschnitt 3.4 statistische Testmethoden und Modellkriterien vorgestellt, mit denen Assoziationstests durchgeführt und beurteilt werden können. Im dritten Teil dieses Kapitels werden verschiedene R-Pakete und die darin enthaltenen Funktionen beschrieben, mit denen die in Abschnitt 3.3 vorgestellten Analysen durchgeführt werden können. Dazu wird in Abschnitt 3.5 die Software R kurz beschrieben. Anschlieÿend werden nach einem kurzen Ausblick auf die erweiternde Software Bioconductor (3.5.1) in Abschnitt die ausgewählten Pakete vorgestellt. 3.1 Grundlagen der Genetik DNA Die Desoxyribonukleionsäure, kurz DNS oder DNA von englisch: deoxyribonucleic acid, ist die Trägerin der Erbinformation. Sie enthält die Gene, die die Informationen zur Herstellung der Proteine tragen. Die chemischen Bausteine der DNA sind die Nukleotide, die aus einem Phosphat-Rest, dem Zucker Desoxyribose und einer von vier organischen Basen, Adenin (A), Cytosin (C ), Guanin (G) oder Thymin (T) bestehen. Im Normalfall kommt die DNA als 11

16 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN 12 Doppelhelix vor, bei der zwei Einzelstränge in entgegengesetzter Richtung aneinandergelagert sind. In der Mitte der Doppelhelix sind immer zwei Basen gepaart, und zwar paaren sich immer Adenin und Thymin sowie Cytosin und Guanin. Die DNA ist in Chromosomen organisiert, von denen jeder Mensch 23 (bis auf das Geschlechtschromosom identische, d.h. homologe) Paare hat. Jedes Chromosom besteht aus einem langen DNA-Strang, der zur Komprimierung eng um sogenannte Chromatinproteine gewickelt ist. Neben den kodierenden Bereichen, den Genen, besteht die DNA zu etwa 95% ([57]) aus nichtkodierender DNA. Ein Gen wiederum besteht aus unterschiedlichen Bereichen. Der Promotor liegt am Beginn des Gens vor dem RNA-kodierenden Bereich. Er bindet Proteine, sogenannte Transkriptionsfaktoren, die die Transkription (siehe Abschnitt 3.1.3) starten. Der RNA-kodierende Bereich baut sich aus den Exons und den Introns auf. Exons bleiben nach dem Spleiÿen (d.h. Herausschneiden der Introns, siehe Transkription im Abschnitt 3.1.3) enthalten, während die Introns herausgeschnitten werden. Der Terminator schlieÿlich bezeichnet eine Sequenz die zur Beendigung der Transkription führt, also das Ende des Gens markiert [44] RNA Ribonukleinsäure, abgekürzt RNS oder RNA von englisch: ribonucleic acid, ist das Ergebnis der DNA-Transkription (siehe Transkription im Abschnitt 3.1.3). Sie enthält im Unterschied zur DNA den Zucker Ribose anstelle von Desoxyribose und die Base Uracil (U ) anstelle von Thymin. Zudem ist sie in der Regel einzelsträngig. Es gibt verschiedene RNA-Moleküle, die unterschiedliche Funktionen ausüben. Die Messenger-RNA (mrna) trägt die kopierte Gen- Information zum auÿerhalb des Zellkerns liegenden Ribosom, wo die Translation (siehe Abschnitt 3.1.3) stattndet. Die Präkursor-mRNA (prä-mrna) oder heterogeneous nuclear RNA (hnrna) ist die Vorstufe der reifen RNA. Sie ist ein Zwischenprodukt in der Transkriptionsphase. Die Transfer-RNA (trna) ist für den Transport der Aminosäuren zum Ribosom zuständig, während die ribosomale RNA (rrna) am Aufbau des Ribosom beteiligt ist [44]. MicroRNAs (mirnas) sind kurze Nukleotidketten, bestehend aus etwa 22 Nukleotiden. Es wird davon ausgegangen, dass mirnas auf verschiedene Arten Gene abschalten können. Dazu zählen die Beschleunigung des Proteinabbaus, die Blockade der Translation (siehe Abschnitt 3.1.3) oder der gezielte Abbau von mrna. Aktuelle Forschungen beschäftigen sich mit der Frage, auf welche Weise mirnas an der Entstehung von Krankheiten wie Krebs oder Stowechselstörungen beteiligt sind. [43] Genexpression Genexpression bezeichnet die Umsetzung der genetischen Information auf der DNA in Proteine. Sie gliedert sich in zwei Phasen: die Transkription und die Translation, deren Einzelschritte durch übergeordnete Strukturen, sogenannten Signal-Strukturen gesteuert werden. Darüber hinaus können zelleigene oder umweltbedingte Signale das An- oder Abschalten von Genaktivitäten bewirken [45] Transkription Bei der Transkription wird die DNA in mrna übersetzt. Dazu setzt sich ein Enzym, die sogenannte (DNA-abhängige) RNA-Polymerase an der Promotor-Region der DNA an. Diese wird auf einem kurzen Stück entspiralisiert. Dort lagern sich komplementäre Ribonucleotide an. Am Terminator wird die Transkription beendet und die RNA löst sich ab. Dann wird das

17 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN 13 als prä-mrna bezeichnete Transkript durch Tailing (Anhängen von Adenin-Nukleotiden) und Spleiÿen (engl. Splicing, Herausschneiden der Introns) weiterverarbeitet, bevor es den Zellkern verlässt [44] Translation Die Translation bezeichnet den Vorgang, bei dem die Informationen auf der mrna in Aminosäuren übersetzt werden, die wiederum Proteine bilden. Dabei wird im Ribosom an die mrna jeweils an einem Basentriplet die entsprechende trna angedockt, die die zu diesen drei Nucleotiden passende Aminosäure angelagert hat. Beginnend mit dem Start-Codon (AUG) wird jede neu hinzukommende Aminosäure mit der vorherigen verbunden, bevor sich die trna wieder ablöst. Am Stop-Codon (UAG, UAA und UGA) kann sich kein trna-molekül andocken, die Aminosäurenkette löst sich ab und faltet sich zur Sekundär- (Kleeblatt-Form) und Tertiärstruktur (L-Form) [44] Single Nucleotide Polymorphismen Einzelnukleotid-Polymorphismen (engl. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) sind Unterschiede zwischen Individuen einer Population in einem einzelnen Basenpaar der DNA. Etwa 90% aller genetischen Variationen im menschlichen Genom sind SNPs [72]. Zwei Drittel von ihnen entstehen durch den Austausch von Cytosin durch Thymin [77]. Man kann SNPs nach ihren Auswirkungen in verschiedene Klassen einteilen: coding SNPs, regulatory SNPs und structural RNA-SNPs. Coding SNPs (csnp) sind SNPs die in einer kodierenden Region eines Gens liegen. Codiert das Triplet durch den Basenaustausch eine andere Aminosäure kann das Auswirkungen auf die Proteinfunktion haben. Ist dies der Fall, spricht man von einem nicht-synonymen SNP im Unterschied zum synonymen SNP, der trotzt Basenaustausch immer noch dieselbe Aminosäure codiert. Regulatory SNPs (rsnp) stören die Genregulation. Sie liegen häug in nicht-kodierenden Regionen und beeinussen die Transkription. Structural RNA-SNPs (srsnp) stören die RNA-Prozessierung, zum Beispiel durch eine Basenänderung an der Splicestelle, wodurch das Intron nur unvollständig abgetrennt wird [11]. Durch die Doppelhelix-Struktur der DNA hat jedes Chromosom an jeder Stelle (Locus) zwei Basen. Da diese komplementär sind, reicht es aus nur eine der beiden Basen zu betrachten. (Eindeutigkeit erhält man hierbei durch die Konvention einer Leserichtung des DNA-Stranges.) Daher gibt es, da die Chromosomen paarweise vorliegen, für jeden SNP zwei Ausprägungen. Man bezeichnet das als die beiden Allele des SNPs. Sind diese gleich, spricht man von einer homozygoten Ausprägung. Sind sie verschieden, ist die Ausprägung heterozygot [46]. Das häuger vorkommende Allele eines SNPs wird als "major" Allel bezeichnet, das seltenere Allel als "minor" Allel. Für jede Person gibt es also drei mögliche Ausprägungen eines SNP: homozygot bezüglich des major Allels, heterozygot oder homozygot bezüglich des minor Allels [18]. SNPs gewinnen immer mehr an Bedeutung für genetische Studien. Sie sind in hinreichender Dichte vorhanden, um Zusammenhänge mehrerer benachbarter Polymorphismen (Haplotypen) zu untersuchen. Weiterhin ist ihre Ausprägung binär und daher gut geeignet für automatisierte Hochdurchsatzverfahren der Genotypisierung. Und schlieÿlich haben sie im Gegensatz zu anderen Markern eine niedrigere Rate an vorkommenden Mutationen, was sie zu stabilen Indikatoren für historische Veränderungen macht [74]. In der Erforschung von Krankheitsrisiken dienen SNPs als Marker für die vermutlichen Loci von Krankheiten und damit für die dafür verantwortlichen

18 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN 14 Gene. Dafür werden beispielsweise in Familienstudien Zusammenhänge untersucht oder auch Assoziationsanalysen zwischen Patienten und gesunden Kontrollen durchgeführt [80] Genotypen und Haplotypen Die Begrie Genotyp und Haplotyp werden in der Literatur teilweise unterschiedlich gebraucht. In dieser Arbeit werden die folgenden Denitionen verwendet: Genotyp bezeichnet die Ausprägungen der Allele eines Individuums. Für einen SNP kann eine Person einen von drei möglichen Genotypen haben: homozygot bezüglich des major Allels, heterozygot oder homozygot bezüglich des minor Allels (siehe Abschnitt 3.1.4). Als Haplotypen bezeichnet man die Kombination der Allele mehrerer SNPs auf einem Chromosom. Im Unterschied zu den Genotypen von SNPs wird bei Haplotypen zwischen den Chromosomen unterschieden. Jedes Individuum hat demnach zwei Haplotpyen für eine Kombination von SNPs, je einen vom mütterlichen und einen vom väterlichen Chromosom. [18]. Aktuelle Genotypisierungmethoden geben keine Informationen über Haplotypen. Haplotypen können zwar experimentell oder durch Genotypisierung von Familienmitgliedern erhoben werden, da dies jedoch sehr zeit- und kostenintensiv ist, werden sie in der Regel mit statistischen Methoden aus den Genotypen rekonstruiert (siehe Abschnitt 3.3.7) [69]. 3.2 Methoden der Biotechnologie Um die SNPs einer Stichprobe auf Zusammenhänge mit Krankheitsmerkmalen untersuchen zu können, sollten diese nach Möglichkeit in digitaler Form vorliegen. Dazu wird die DNA der Individuen benötigt. DNA kann aus beinahe jeder menschlichen Körperzelle gewonnen (extrahiert) werden, zum Beispiel aus Blut oder Gewebe (siehe Abschnitt 3.2.1). Die interessierenden DNA-Abschnitte werden anschlieÿend auf Microarrys aufgetragen (hybridisiert) und mit speziellen Scannern eingelesen (siehe Abschnitt 3.2.2) DNA Extraktion Moderne Methoden der DNA-Extraktion verwenden magnetische Partikel, sogenannte Magnetic Beads. Dazu wird der Probe, nachdem ein lysierendes Agens die Zellen geönet und die DNA freigesetzt hat, eine Lösung mit Magnetic Beads beigefügt, die die DNA an sich binden. Dann wird die DNA mit Hilfe magnetischer Stäbe, die in die Lösung getaucht werden, isoliert, in verschiedene Waschlösungen getaucht und schlieÿlich ausgewaschen, so dass die Probe am Ende reine DNA enthält. Gegenüber Methoden, die aus mehreren Wasch- und Zentrifugierprozessen bestehen, bedeuted eine magnetische Extraktionsmethode einen deutlich geringeren Zeit- und Arbeitsaufwand. Die DNA oder RNA kann direkt aus dem Probenmaterial (Blut, Gewebe etc.) extrahiert werden. Zudem kann der gesamte Extraktionsprozess automatisiert und damit ein hoher Durchsatz erreicht werden. [4] Microarrays Moderne Microarrays bestehen aus aus vielen tausend Oligonukleidketten (kurze Ketten aus 10 bis 100 Basenpaaren) die komplementär zu den zu untersuchenden DNA-Abschnitten sind. Die

19 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN 15 aus Zellen oder Gewebe extrahierten und mit uoreszierendem Farbsto versehenen Transkripte werden auf die Microarrays aufgetragen (hybridisiert), nicht gebundene Stücke abgewaschen und mit speziellen Laserscannern eingelesen [53]. Die verwendeten HumanOmniExpress-12v1 Arrays von Illumina beinhalten mehr als häuge SNP-Variationen, die vom Internationalen HapMap Project erfasst wurden. [42]

20 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN Statistische Methoden Qualitätskontrolle Für statistische Analysen ist die Qualität der Daten einer der entscheidenden Faktoren für das Aunden von echten, d.h. nicht durch Störgröÿen beeinussten Ursachen für Gruppenunterschiede. Neben einigen Kriterien wie der Auswahl der Probanden oder der Erhebung der Daten, die in allen epidemiologischen Studien von Relevanz sind, kommt in genetischen Studien die Qualität der Genotypisierung als ein sehr wichtiger Aspekt hinzu [46]. Im Genotypisierungsprozess selbst sind einige Kontrollschritte enthalten wie die Überprüfung der Qualität der DNA, die Korrektur von plattformspezischen oder technisch bedingten Fehlern, oder der Ausgleich von Schwankungen zwischen den einzelnen Chargen. Diese Methoden zur Qualitätskontrolle wurden im Rahmen des MicroArray Quality Control (MAQC) Projekts der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zusammengestellt und validiert [78]. Darüber hinaus gibt es zusätzlich einige statistische Methoden der Qualitätskontrolle, die nach dem Genotypisierungsprozess angewendet werden. Im Folgenden sollen einige dieser Methoden, die auch in dieser Auswertung verwendet wurden, erläutert werden Missing call rate (MCR) Die fehlende Antwort-Rate (engl: missing call rate, MCR) wird als das Verhältnis der fehlenden Werte entweder pro SNP über die gesamten Proben oder pro Probe über alle SNPs deniert. Die hier verwendete missing call rate über eine Probe ist ein Indikator für die Qualität dieser Probe. Üblicherweise gelten Proben als nicht genotypisiert, wenn die missing call rate fünf Prozent übersteigt [47] Allelverteilung und Minor Allele Frequency (MAF) Für eine erste Betrachtung der Ausprägungen einzelner SNPs ist eine Auistung der SNPs mit den beiden Allelen, die an diesem Locus vorkommen, der Häugkeiten der beiden Allele sowie der Häugkeit der Genotypen hilfreich. Dabei unterscheidet man bei den beiden Allelen zwischen dem häugeren (major) Allel, das auch als "Wildtyp" bezeichnet wird, und dem selteneren (minor) Allel. Analog gibt es die Unterscheidung zwischen den häug vorkommenden homozygoten Genotypen, den heterozygoten und den seltenen homozygoten Genotypen (siehe auch Abschnitt 3.1.4). Ein Beispiel für eine tabellarische Übersicht über die Allele- und Genotypenverteilung der 20 SNPs mit der stärksten Assoziation im Sinne unserer Analyse ndet sich in Tabelle 4.4. Die Qualität der Genotypisierung hängt meist auch von der Häugkeit des selteneren Allels (minor allele frequency, MAF) ab, da beim Einlesen der Daten die Intensitäten in drei Cluster eingeteilt werden, die den drei möglichen Genotypen entsprechen. Für sehr kleine MAF wird die Identizierung des selteneren homozygoten Genotypes schwieriger und damit fehleranfälliger [46]. Daher ist es üblich, SNPs mit einer MAF unter einem bestimmten Grenzwert auszuschlieÿen. Dieser Grenzwert hängt von der gewünschten Aussagekraft (Power) der Assoziationstests ab [47]. In Orientierung an den Qualitätskriterien von Laurie et al (2010) [47] wurde in dieser Analyse ein Grenzwert von einem Prozent als Ausschlusskriterium gewählt.

21 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN Genotyp-Clusterplot Eine graphische Übersicht über die Qualität der Genotypisierung bietet der sogenannte Clusterplot. Dabei werden entweder die beiden (normalisierten) Intensitäten der Allele oder die Parameter R und Θ gegeneinander aufgetragen. [47]. Dabei ist R der normalisierte Intensitätswert und Θ das Verhältnis der Intensitätswerte der Allele. Diese beiden Parameter entstehen durch eine Polarkoordinaten-Transformation der Intensitäten der beiden Allele [58]. Wenn die drei Cluster sich visuell deutlich voneinander abgrenzen, ist die Qualität der Genotypisierung gut. Überlappen dagegen die Cluster stark, so können die Genotypen für eine groÿe Anzahl von Proben nicht klar identiziert werden [46]. Abbildung 4.3 zeigt Clusterplots der R und Θ-Werte für die 20 Top-SNPs Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) Das von dem Mathematiker G.H.Hardy [34] und dem Mediziner Dr. med. W.Weinberg [82] beschriebene Prinzip des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts (engl: Hardy-Weinberg equilibirum, HWE) besagt, dass in einer idealen Population, d.h. in einer recht groÿen Population mit zufälliger Paarung und Gleichverteilung der Geschlechter [34] die Verteilung der Genotypen über die Generationen hinweg dieselbe bleibt [71]. Betrachten wir einen Locus mit den beiden Alleleausprägungen A und a. Mit p bezeichnen wir die relative Häugkeit des Allels A (d.h. den Anteil der Allele mit der Ausprägung A an allen Allelen) und mit q die relative Häugkeit des zu A komplementären Allels a. Damit gilt p + q = 1 Die relativen Häugkeiten h für die drei möglichen Genotypen AA, Aa und aa ergeben sich aus dem Produkt der beiden entsprechenden Allelhäugkeiten: h(aa) = p 2, (3.1) h(aa) = 2pq, h(aa) = q 2. Das Prinzip des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts besagt nun, dass die relativen Häugkeiten der Allele und der Genotypen über Generationen hinweg konstant bleiben. Die Formeln des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts beschreiben, dass die Allelhäukeiten und damit auch die Genotyphäugkeiten zueinander komplementär sind, sich also zu eins summieren: h(aa) + h(aa) + h(aa) = p 2 + 2pq + q 2 = (p + q) 2 = 1. (3.2) Für einen SNP kann man berechnen ob er "im" Hardy-Weinberg-Gleichgewicht ist, indem man die Nullhypothese testet, dass die beobachteten Genotypfrequenzen sich nicht signikant von den erwarteten Genotypfrequenzen (berechnet aus den Allelfrequenzen) unterscheiden. Dafür kann man zum Beispiel den Pearsons χ 2 -Test verwenden. Wigginton et al (2005) [86] kritisieren jedoch den häug verwendeten einfachen χ 2 -Test zur Güte der Anpassung (goodness-of-t), da er selbst in relativ groÿen Datensätzen eine überhöhte Anzahl falsch-positiver Ergebnisse haben kann. Um diesen Nachteil zu kompensieren schlagen sie exakte Tests vor, die die Rate

22 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN 18 falsch-positiver Ergebnisse in kleinen wie in groÿen Datensätzen kontrollieren. Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht können Indikator für unterschiedliche Phänomene sein. So etwa für enge verwandschaftliche Beziehungen oder eine recht homogene Schicht innerhalb der Population, aber sie können auch auf Probleme bei der Genotypisierung hindeuten [40]. Auch kann die Abweichung vom HWE in Stichproben mit betroenen Individuen einen Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen dem SNP und der Zielvariablen geben [86]. Das HWE wird bei der Analyse von SNPs also auch als Qualitätskontrolle eingesetzt, um Probleme in der Genotypisierung zu entdecken [40], [86]. Laurie et al (2010) [47] empfehlen einen Qualitätslter basierend auf dem p-wert des Tests auf HWE. Die Interpretation dieser p-werte ist allerdings nicht ganz einfach, da die Wahl des Signikanzlevels von der Stichprobengröÿe abhängt. Durch die Betrachtung von Clusterplots (s ) lassen sich geeignete Grenzwerte für das Signikanzniveau nden und Artefakte der Genotypisierung von wahren Abweichungen der Genotypenfrequenzen von HWE unterscheiden [47] Linkage Disequilibrium (LD) Mit Linkage Disequilibrium (LD), auch Gametic Disequlibrium, wird das Maÿ des nichtzufälligen Zusammenhangs von Allelen an verschiedenen Loci bezeichnet [36]. Ausgehend von zwei Loci A und B mit je zwei Allelen a 1, a 2 und b 1, b 2 ergeben sich vier mögliche Haplotypen a 1 b 1, a 1 b 2, a 2 b 1 und a 2 b 2 mit den jeweiligen beobachteten Häugkeiten p 11, p 12, p 21 und p 22. Damit lassen sich die erwarteten Häugkeiten der Allele als Summe der beobachteten Haplotyphäugkeiten berechnen, die dieses Allel enthalten: a 1 : π 1+ = p 11 + p 12 (3.3) a 2 : π 2+ = p 21 + p 22 b 1 : π +1 = p 11 + p 21 b 2 : π +2 = p 12 + p 22 Umgekehrt kann man die erwarteten Haplotyphäugkeiten als Produkt der entsprechenden erwarteten Allelhäugkeiten berechnen: a 1 b 1 : π 11 = π 1+ π +1 (3.4) a 1 b 2 : π 12 = π 1+ π +2 a 2 b 1 : π 21 = π 2+ π +1 a 2 b 2 : π 22 = π 2+ π +2 Als Linkage Disequlibrium wird nun die Dierenz D zwischen der beobachteten und der erwarteten Häugkeit der jeweiligen Haplotypen bezeichnet. Damit ergibt sich aus Gleichung

23 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN und Gleichung 3.4: D = p 11 π 11 (3.5) = p 22 π 22 = (p 12 π 12 ) = (p 21 π 21 ) Aus den Gleichungen in 3.5 ergibt sich die allgemein verwendete Formel für Linkage Disequilibrium. D = π 11 π 22 π 12 π 21 (3.6) Ist D 0, sind also bestimmte Allele häuger gemeinsam zu beobachten als erwartet, so sagt man, dass die zwei Loci "in" Linkage Disequlibrium sind. Bei D = 0 spricht man von Linkage Equlibrium, die Loci sind unabhängig voneinander [59]. Da der Wert von D abhängig von der Allelfrequenz der beiden Loci ist, muss D normalisiert werden, damit die LD-Werte zwischen verschiedenen Paaren von Loci vergleichbar sind [55]. Verschiedene Koezienten wurden zur Normalisierung vorgeschlagen. Hier sollen die zwei am häugsten verwendeten Maÿe und D vorgestellt werden Korrelationskoezient Ein sehr häug verwendetes Maÿ für Linkage Disequlibrium ist der Korrelationskoezient der Genfrequenzen, häug in der Literatur auch mit r bezeichnet. = π 11π 22 π 12 π 21 π1+ π 2+ π +1 π +2 (3.7) Häug wird quadriert, um die Vorzeichenunterschiede auszugleichen, die durch die willkürliche Festlegung der Allelbezeichnungen entstehen [37], [20]. Für biallelische Marker ist 2 die konventionelle χ 2 -Teststatistik dividiert durch die Anzahl der Chromosomen in der Stichprobe [83], [59] D von Lewontin Lewontins D [48] teilt den Koezienten D durch den maximalen Wert, der mit den Allelfrequenzen erreicht werden kann [55]. D = D D max = π 11 π 12 π 12 π 21 min(π 1+ π 2+,π +1 π +2 ) falls D > 0 π 11 π 12 π 12 π 21 min(π 1+ π +1,π +2 π +2 ) falls D < 0 (3.8)

24 KAPITEL 3. GRUNDLAGEN 20 Als Signikanz-Tests für D eignen sich der χ 2 -Test, der Likelihood-Ratio-Test oder Fishers exakter Test [55]. Welches LD-Maÿ in welchem Kontext am geeignetsten ist, ist bisher vielfach diskutiert worden. Müller (2004) [55] empehlt die Verwendung von D für die Analyse von historischer Rekombination, während er 2 für geeigneter in Assoziationsstudien hält. Auch Barnes (2006) [3] hat die beiden Maÿe D und 2 verglichen. Er sieht D als ein gutes Maÿ innerhalb einer Studie, aber nicht studienübergeifend beim Vergleich von verschiedenen Populationen, da der relative Wert von D nicht als Maÿ für die Stärke des LD interpretierbar ist und in sehr kleinen Stichproben stark überhöht sein kann. In Assoziationstudien ist laut Barnes die Korrelation 2 zwischen den Allelen zweier Loci die angemessenere Maÿzahl, da sie relativ robust gegen unterschiedliche Allelfrequenzen zwischen den Markern ist, die Werte von 2 als Stärke des LD interpretierbar sind und auch in kleinen Stichproben die Tendenz zu überhöhten Werten nicht so stark ist. Linkage Disequlibrium spielt eine wichtige Rolle in der Kartierung (engl. mapping) von Genen [55]. Die Höhe des LD zwischen einem mit der Krankheit assoziierten Alleles und stark verbundenen genetischen Markern kann wertvolle Informationen über den Ort des für die Krankheit verantwortlichen Genes enthalten. Dadurch lässt sich die Menge der DNA, die nach einem mit einer Krankheit in Zusammenhang stehenden Genes durchsucht werden muss, deutlich einschränken [20]. Dabei führt LD häug zu der Entdeckung von Zusammenhängen mit Allelen, die um den Locus eines Merkmal herum liegen, aber ihrereseits keinen Einuss haben [1] Haplotypenrekonstruktion Aktuelle Genotypisierungmethoden geben keine Informationen über Haplotypen. Zwar können Haplotypen experimentell oder durch Genotypisierung von Familienmitgliedern erhoben werden, das ist jedoch mit erheblichen Kosten verbunden. Daher sind statistische Methoden attraktiv, mit denen Haplotypen rekonstruiert werden können [69]. Es gibt verschiedene Ansätze für die Rekonstruktion von Haplotypen. Hier sollen einige häug verwendete und weiter modizierte Methoden vorgestellt werden Parsimony Methode Clark (1990) [14] hat einen Ansatz für die Rekonstruktion der Haplotypen entwickelt, der die Anzahl der Haplotypen in einer Stichprobe minimiert, daher die Bezeichnung parsimony Methode [69]. Der Algorithmus geht folgendermaÿen vor: Zunächst werden die eindeutigen Haplotypen aufgestellt, d.h. die von komplett homozygoten oder nur an einem Locus heterozygoten Individuen. Danach werden die verbleibenden Sequenzen dahingehend betrachtet, ob sie aus den bereits aufgestellten Haplotypen gebildet werden können. Die komplementären Haplotypen, die dadurch neu hinzu kommen, werden der Liste beigefügt. Das Verfahren endet, wenn entweder allen Individuen zwei Haplotypen zugeordnet wurden oder sie als unlösbar identiziert wurden [14]. Dieser Algorithmus hat einige gewichtige Einschränkungen. So ist er nur anwendbar wenn es homozygote Individuen in der Gruppe gibt, da der Algorithmus sonst nicht starten kann. Weitere Kritikpunkte an dem Ansatz sind die Tatsachen, dass unlösbare Sequenzen übrig bleiben können.