Das Anti-Müller Hormon (AMH) bei Mädchen mit Adrenogenitalem Syndrom bei 21-Hydroxylase Defekt.

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1 1 Aus der Kinder- und Jugendklinik der Friedrich Alexander Universität Erlangen Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. W. Rascher Das Anti-Müller Hormon (AMH) bei Mädchen mit Adrenogenitalem Syndrom bei 21-Hydroxylase Defekt. Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich - Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Vera Mölkner aus Schwabach

2 2 Gedruckt mit Erlaubnis der Friedrich Alexander Universität Erlangen Nürnberg Dekan: Referent: Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler Prof. Dr. med. H.G. Dörr Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Rascher Tag der mündlichen Prüfung:

3 3 Gewidmet meiner Familie

4 4 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Zusammenfassung 6 Summary 8 2. Einleitung Das Anti-Müllersche Hormon Das kongenitale Adrenogenitale Syndrom Einteilung und Klinik Diagnostik und Therapie Pubertät und Fertilität bei AGS-Patientinnen AGS und PCOS Ziele der Arbeit Patienten und Methoden Patienten Kollektiv und Art der Erhebung Gruppe der AGS-Patientinnen Kinder und Jugendliche Erwachsene AGS-Patientinnen Referenzgruppe Methoden Klinische Parameter Laborparameter Messung der AMH-Spiegel Laborparameter zur Evaluation der Qualität der Therapie- Einstellung bei AGS Auswertung und statistische Methoden 41

5 5 4. Ergebnisse AGS-Gruppe AMH und klinische Merkmale AMH in Relation zur AGS-Therapie AMH-Konzentrationen im Längsschnitt Referenzgruppe AGS-Gruppe (Kinder und Jugendliche) im Vergleich zur Referenzgruppe Diskussion Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Danksagung 93

6 6 1. Zusammenfassung Hintergrund: Das Anti-Müllersche Hormon (AMH) wird bei Frauen ab dem Säuglingsalter in den Granulosazellen von präantralen und kleinen antralen Follikeln des Ovars produziert. Es wird als geeigneter Serummarker der ovariellen Reserve bei prämenopausalen Frauen angesehen und zeigt keine zyklusabhängigen Schwankungen. Bei Frauen mit Syndrom der polyzystischen Ovarien (PCOS) liegen deutlich erhöhte Serum-AMH-Werte vor, was mit der erhöhten Anzahl kleiner Follikel korreliert. Bei inadäquat behandelten Frauen mit AGS und 21-Hydroxylasedefekt finden sich häufig aufgrund der Hyperandrogenämie eine Adipositas, ein Hyperinsulinismus und eine erhöhte Prävalenz für das metabolische Syndrom und das PCOS. Über Serum-AMH bei Mädchen und weiblichen Jugendlichen mit Adrenogenitalem Syndrom liegen bisher nur wenige Berichte in der Literatur vor. Patienten und Methoden: Wir untersuchten Serum-AMH bei Mädchen mit AGS und 21-Hydroxylase-Defekt (n=41, Alter 2,4-26,1 Jahre, Altersdurchschnitt 13,7 Jahre). Davon waren neun Mädchen präpuberal und neun im Erwachsenalter. Alle Mädchen waren zum Zeitpunkt der Untersuchung mit Glukokortikoiden (GC) therapiert. Wir verglichen die Werte der Patienten (n=32, Altersdurchschnitt 11,7 Jahre) mit den Werten von gesunden Mädchen (n=45, Alter 2,7-16,3 Jahre, Altersdurchschnitt 11,5 Jahre, davon 17 präpuberal). Dabei wurden mögliche Einflüsse von Alter, Größe, Gewicht, Body-Mass-Index, Pubertätsstadien nach Tanner, Alter bei Menarche, Einnahme von Kontrazeptiva, Höhe der GC-Dosis und der Qualität der Therapieeinstellung auf die Höhe von AMH-Konzentrationen untersucht. Bei 23 AGS-Mädchen wurde eine zweite AMH-Messung im zeitlichen Verlauf durchgeführt (zeitliche Abstände 2 bis 14 Monate). AMH wurde mithilfe des Enzym-Immunoassays der Firma Immunotech Beckman Coulter Company Marseille (France) bestimmt. Ergebnisse: Die mittleren Serum-AMH-Werte bei AGS-Mädchen (33,5 ± 22,4 (SD) pmol/l; Range 2,2-109,0 pmol/l) und der Referenzgruppe (29,3 ± 17,3 pmol/l, Range 4,9-87,2 pmol/l) unterschieden sich nicht signifikant voneinander. In beiden Gruppen konnte kein signifikanter Einfluss von Alter,

7 7 Größe, Gewicht, Body-Mass-Index, Pubertätsstadien nach Tanner, Alter bei Menarche, Einnahme von Kontrazeptiva, Höhe der GC-Dosis oder der Qualität der Therapieeinstellung auf die Höhe von Serum-AMH nachgewiesen werden. In der Gruppe mit zwei AMH-Messungen im Verlauf waren die Werte nicht unterschiedlich. Schlussfolgerung: Bei unserem Kollektiv unterscheiden sich die AMH-Werte der AGS-Mädchen nicht von denen der Referenzgruppe. Man kann daher von einer unbeeinträchtigten ovariellen Reserve ausgehen. Dieses Ergebnis lässt eine normale Fertilität bei den untersuchten Mädchen mit AGS und 21- OH-Defekt vermuten. Die Prävalenz von PCOS scheint bei den AGS- Mädchen dieser Altersgruppe ebenfalls nicht erhöht zu sein.

8 8 Summary Background: In women, Anti-Mullerian-Hormone (AMH) is produced by granulosa cells of preantral and small antral follicles of the ovaries from early infancy until menopause. AMH is esteemed as a serum marker of the ovarian reserve in premenopausal women. It is independent of the classical fluctuations of the ovarian cycle. High levels are found in women with polycystic ovary syndrome (PCOS) which correlates to the increased count of small follicles in these patients. Young adult women with CAH and hyperandrogenemia have an increased risk for obesity, hyperinsulinemia, metabolic syndrome and PCOS. However, there are only a few reports on AMH levels in those CAH girls and women in the literature. Patients and methods: We investigated serum-amh levels in children with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency (n=41, aged 2.4 to 26.1 years, mean age 13.7 years). Nine of them were prepubertal, nine were adults. All CAH-patients received glucocorticoid substitution therapy. We compared serum AMH in CAH children (n=32, mean age 11.7 years) with levels in healthy females (n=45, aged 2.7 to 16.3 years, mean age 11.5 years, n=17 prepubertal). Furthermore we investigated possible influences of following clinical parameters on serum-amh levels: age, height, weight, body-mass-index, pubertal stages (Tanner), age of menarche, oral contraceptives, glucocorticoid doses, quality of therapy. In 23 girls with 21- hydroxylase deficiency, AMH was measured twice (intervals between measurements 2 to 14 months). AMH was measured by Beckman Coulter ELISA. Results: There was no significant difference in serum-amh levels of CAH girls with 21-hydroxylase deficiency (33.5 ± 22.4 pmol/l, range pmol/l) compared to the control group (29.3 ± 17.3 pmol/l, range pmol/l). Influences of age, height, weight, body-mass-index, pubertal stage, age of menarche, oral contraceptives, glucocorticoid dose or quality of therapy could not be found. There was no difference between the levels of the two measurements in the longitudinal investigation of AMH. Conclusions: We could not find any differences of serum AMH levels in girls with CAH and the control group. Therefore, it might be conceivable that the

9 9 prevalence of PCOS is not higher in CAH girls with CAH and 21-hydroxylase deficiency, and the ovarian reserve might be similar compared to healthy girls. Our findings suggest that fertility might be normal in our studied girls with CAH.

10 10 2. Einleitung 2.1. Das Anti-Müllersche Hormon Das Anti-Müllersche Hormon (AMH) ist ein ca. 140 kda großes, dimeres Glykoprotein aus der Transforming Growth Factor β- (TGFβ-) Superfamilie [18,30]. Beim Mann wird es in den Sertolizellen des Hodens von der Fetalzeit bis ins späte Erwachsenenalter produziert. Die höchsten Konzentrationen finden sich mit durchschnittlich über 200 pmol/l bzw. 28 ng/ml (pmol/l : 7,143 = ng/ml) im Fetalalter sowie kurz vor Beginn der Pubertät [78,136,161]. Beim männlichen Geschlecht liegen normalerweise in jedem Alter wesentlich höhere Serum-AMH-Konzentrationen vor als beim weiblichen Geschlecht. Zu Überlappungen kommt es nie [69]. Bei der Frau wird AMH in den Granulosazellen der Ovarien von der 36. Gestationswoche bis zur Menopause sezerniert [135]. Während der ersten drei Lebensmonate lässt sich ein Anstieg von AMH auf durchschnittlich 15 pmol/l (3. bzw. 97. Perzentile 4,5 bzw. 29,5 pmol/l) finden, der innerhalb weniger Monate wieder auf ca. 8 pmol/l (3. bzw. 97. Perzentile 3,0 bzw. 18,9 pmol/l) abfällt (s. Abbildung 1a) [60]. Man vermutet eine frühe postnatale Follikelreifung durch den kurzfristigen Anstieg von FSH, welches nicht mehr durch die plazentaren Hormone gehemmt wird [20,32,58,80]. Vom Säuglingsalter bis zum Kleinkindesalter finden sich niedrige Serumwerte von unter 10 pmol/l. Ab einem Alter von ca. vier Jahren steigt AMH kontinuierlich auf peripuberale Werte von durchschnittlich 20,4 pmol/l (3. bzw. 97. Perzentile 5,5 bzw. 57,1 pmol/l) an. Dann bleiben die AMH-Werte bis zum Alter von ca. 25 Jahren konstant, um über die Jahrzehnte hinweg langsam abzufallen, bis AMH schließlich nach der Menopause im Serum nicht mehr nachweisbar wird [60] (s. Abbildungen 1b und 1c).

11 11 Abb. 1a: Verlauf der AMH-Konzentrationen (pmol/l) bei neugeborenen Mädchen und Säuglingen nach Hagen et al. [60]. Längsschnittwerte sind durch schwarze Linien verbunden. Die roten Linien kennzeichnen Median, 3. und 97. Perzentile. (pmol/l : 7,143 = ng/ml)

12 12 Abb. 1b: Verlauf der AMH-Konzentrationen (pmol/l) bei Mädchen und Frauen zwischen vier und 25 Jahren nach Hagen et al. [60]. Die roten Linien kennzeichnen Median, 3. und 97. Perzentile. (pmol/l : 7,143 = ng/ml)

13 13 Abb. 1c: Verlauf der AMH-Konzentrationen (pmol/l) bei Frauen zwischen 25 und 70 Jahren nach Hagen et al. [60]. Die roten Linien kennzeichnen Median, 3. und 97. Perzentile. (pmol/l : 7,143 = ng/ml) Die wichtigste Aufgabe von AMH ist beim männlichen Fötus die Induktion der Rückbildung des Müller-Gangsystems im Rahmen der Sexualdifferenzierung. Dabei bewirkt es die Regression der Anlage des Uterus, der Eileiter sowie der kranialen Vagina, welche im Rahmen eines geschlechtlich omnipotenten Zustands in der Fötalzeit gleichzeitig mit der männlichen Genitalanlage (Wolff-Gänge) angelegt sind [12,83]. AMH wirkt an AMH-Typ-I- und AMH-Typ-II-Rezeptoren, welche als Serin- und Threoninkinasen reagieren. Eine loss-of-function -Mutation im

14 14 Rezeptor-Gen kann beim männlichen Geschlecht zum Syndrom der persistierenden Müllerschen-Gänge führen [54,83,92]. AMH wird in Granulosazellen v.a. in den sekundären präantralen und kleinen antralen Follikeln mit 4 mm Größe sezerniert und spiegelt somit deren Menge wider [91,173] (siehe Abbildung 2). In Follikeln, die mehr als 8 mm durchmessen (dominante Follikel) sowie in Primordialfollikeln ist keine AMH- Sekretion nachweisbar [173]. Aufgrund der azyklischen Reifung der präantralen und kleinen antralen Follikel unterliegt AMH keinen zyklusabhängigen Schwankungen und scheint unabhängig vom Hypothalamus-Hypophysen-Regelkreis zu sein [65,168]. AMH wird als Negativregulator der frühen Follikelreifung angesehen. In reifenden Follikeln von Mäusen bewirkte AMH eine Hemmung des Primordialfollikelwachstums im Sinne eines negativen parakrinen Feedbacks zu benachbarten Primordialfollikeln [42]. Auch bei humanen Follikeln konnte der Effekt in vitro beobachtet werden [16,42]. AMH setzte im Ovar der Maus die Sensitivität für FSH herab [42,43] und beeinträchtigte in kultivierten Granulosazellen die FSH-induzierte Östradiolsynthese aus Testosteron [56]. In den Ovarien von homozygoten AMH-Knockout-Mäusen wurden mehr präantrale und kleine antrale Follikel gezählt als in Wildtyp-Mäusen und der Bestand an Primordialfollikeln war früher erschöpft [42]. AMH könnte also ein Schutzfaktor vor frühzeitigem Follikelabbau sein und eine wichtige Rolle bei der Selektion dominanter Follikel spielen [57]. Das Fehlen von AMH im dominanten Follikel macht diesen sensibel für FSH, während die restlichen Follikel unterdrückt werden.

15 15 Abb. 2: Rolle von AMH während der Follikelreifung im Ovar [92] Die Regulation von AMH selbst ist noch unklar. Es wurde mehrfach von einem direkt hemmenden Effekt von FSH auf AMH und auf die AMH-Typ II- Rezeptor-Expression in Granulosazellen berichtet [9,125]. Frauen mit PCOS hatten nach einer Ovulationsinduktion mit FSH signifikant niedrigere AMH- Werte [19]. Mäuse-Oozyten von frühen präantralen, späten präantralen und präovulatorischen Follikeln regulieren die mrna-produktion in Granulosazellen in Abhängigkeit vom jeweiligen Entwicklungsstadium der Eizelle hoch [145]. AMH wird als Indikator der Eizellreserve im Ovar und des Grades einer ovariellen Dysfunktion angesehen [64,126,168]. So ist ein mit der Zeit fallender Serum-AMH-Spiegel mit dem Rückgang an wachsenden Follikeln und damit einer bevorstehenden Menopause vergesellschaftet [37,87,138,167]. Bei Frauen mit Syndrom der polyzystischen Ovarien (PCOS) liegen durchschnittlich höhere Serum-AMH-Werte vor, was mit einer vermehrten Anzahl an kleinen Follikeln korreliert [45,92]. In einer Studie von Eldar-Geva und Mitarbeitern (2005) lagen die AMH-Werte bei Frauen mit PCOS und zusätzlicher Hyperandrogenämie noch höher als bei PCOS-Patientinnen ohne erhöhte Serum-Androgene [45]. Auch die Töchter von PCOS-

16 16 Patientinnen hatten höhere Serum-AMH-Konzentrationen als die untersuchte Referenzgruppe [148]. AMH hat sich auch als Marker von Granulosazelltumoren etabliert [93,138], da es in 76 % bis 93 % der Fälle erhöht ist [93,137]. Die Höhe der Werte korreliert mit der Tumorgröße [21], wobei die AMH-Konzentrationen bis auf das 1000-fache des Normalwertes ansteigen können [69,93]. AMH kann bei phänotypisch weiblichen Patienten mit leichter Virilisierung (Prader Grad 1 und 2) zur Differenzierung zwischen ovarieller und adrenaler Ursache der Hyperandrogenämie herangezogen werden [108]. Nach Misra und Mitarbeitern (2003) hatten die Mädchen mit adrenaler Hyperandrogenämie (z.b. AGS) niedrig-normale AMH-Werte (5,7 ± 2,1 pmol/l), während die Werte von Patienten mit Ovotestes, Testes, Gonadendysgenesie und AMH produzierenden Tumoren deutlich erhöht waren (37,1 ± 12,9 pmol/l bei Gonadendysgenesien, 492,7 ± 179,9 pmol/l bei Sertoli-Leydigzell-Tumoren) [108]. Die Bestimmung von Serum-AMH kann auch zur Unterscheidung von Störungen der Sexualdifferenzierung hilfreich sein, da hohe AMH-Werte bei präpuberalen Mädchen auf testikuläres Gewebe hinweisen [95,108] Das kongenitale Adrenogenitale Syndrom Einteilung und Klinik Das Adrenogenitale Syndrom (AGS) bezeichnet eine Gruppe von autosomalrezessiv vererbten Störungen der Kortisolbiosynthese in der Nebennierenrinde, wobei der 21-Hydroxylasedefekt mit ca. 95% aller AGS- Formen am häufigsten ist [104]. Bei eingeschränkter oder fehlender Aktivität eines der an der Steroidbiosynthese beteiligten Enzyme (Abbildung 3) kommt es zu einem Mangel an Kortisol und durch den Feedback-Mechanismus zu einer vermehrten CRH- und ACTH-Ausschüttung. Es resultiert eine

17 17 Hyperplasie der Nebennierenrinde mit Kumulation von Kortisolvorstufen und häufig erhöhter Androgensynthese. Man unterscheidet beim AGS mit 21-OH-Defekt je nach Restaktivität des Enzyms ein klassisches und ein nicht-klassisches AGS. Cholesterin P450SCC 3βHSD2 P450C21 P450Aldo P450Aldo Pregnenolon Progesteron DOC CS Aldosteron P450C17 P450C17 3βHSD2 P450C21 P450C11 17-OH-Preg 17-OH-Prog Desoxycortisol Cortisol P450C17 P450C17 DHEA Androstendion Abb. 3: Steroidbiosynthese der Nebennierenrinde. Steroide: DOC = 11-Desoxycorticosteron, CS = Corticosteron, 17-OH-Preg = 17- Hydroxypregnenolon, 17-OH-Prog = 17-Hydroxyprogesteron, DHEA = Dehydroepiandrosteron. Trivialnamen der Enzyme: P450SCC = 20,22 Desmolase, 3βHSD2 = 3β-Hydroxysteroiddehydrogenase Typ 2, P450C17 = 17- Hydroxylase/17,20-Lyase, P450C21 = 21-Hydroxylase, P450Aldo = Aldosteronsynthase, P450C11 = 11-Hydroxlyase. Das klassische AGS hat weltweit eine Inzidenz von ca. 1: und ist durch den Mangel an Kortisol (einfach virilisierende Form) oder von Kortisol und Aldosteron (Salzverlust-Form) und eine vermehrte Androgenproduktion charakterisiert. Die inadäquate Glukokortikoidproduktion kann Apathie,

18 18 verminderte Stresstoleranz, Hypoglykämien und Addison-ähnliche Krisen zur Folge haben. In etwa zwei Drittel der Fälle liegt zusätzlich ein Mangel an Aldosteron vor, welcher insbesondere zwischen dem 7. und 14. Lebenstag zu einer Salzverlustkrise mit Hyperkaliämie, Hyponatriämie, Dehydratation und Schock führen kann. Der Androgenexzess führt pränatal beim weiblichen Föten zu einer Virilisierung des äußeren Genitales, postnatal imponiert bei beiden Geschlechtern unbehandelt eine Pseudopubertas praecox. Außerdem treten Akne, Hirsutismus und Wachstumsbeschleunigung mit vorzeitigem Epiphysenschluss und resultierendem Minderwuchs auf. Da Glukokortikoide für die adrenomedulläre Organogenese und zur Stimulation der Adrenalinsynthese nötig sind, zeigt sich in schweren Fällen eine beeinträchtigte Funktion des Nebennierenmarks, die für AGS-Patienten v.a. bei Infekten aufgrund von Hypoglykämien von Bedeutung ist [40,67]. Die Hyperandrogenämie ist ein Risikofaktor für einen Hyperinsulinismus bei Jugendlichen [71] und Frauen [53]. Tatsächlich werden bei AGS-Patientinnen Hyperinsulinismus und das metabolische Syndrom häufiger beschrieben und man vermutet einen zusätzlichen Zusammenhang mit der beeinträchtigten Adrenalinsynthese [22]. In zahlreichen Ländern hat sich ein Neugeborenen-Screening für AGS etabliert [120,163]. Dabei wird 17α-Hydroxyprogesteron am 3. Lebenstag im Vollblut mithilfe eines Filterpapier-Tests bestimmt, welches bei klassischem AGS deutlich erhöht ist [164]. Das nicht-klassische AGS ist die mildere Ausprägungsform des 21-OH- Defektes mit ausreichender Kortisol-Synthese (ca. 30% Restaktivität) bei latent erhöhten Androgenen im Serum. Das klinische Bild reicht von völliger Symptomfreiheit bis zu klinischen Zeichen einer Hyperandrogenämie mit prämaturer Pubarche, beschleunigtem Wachstum mit vorzeitigem Epiphysenschluss, Hirsutismus, Oligo- und Amenorrhoe, Klitorishypertrophie, Infertilität, PCO, Akne und Insulinresistenz [153]. Die Symptome entwickeln sich dabei verzögert und beginnen zu sehr unterschiedlichen Zeitpunkten. Zu einem klinisch relevanten Kortisol-Mangel kommt es nicht. Genaue Daten über die Häufigkeit des nicht-klassischen AGS liegen nicht vor, da diese

19 19 Form beim Neugeborenen-Screening nicht erfasst wird. Mit einer geschätzten Inzidenz in der weißen Bevölkerung von 1:1000 nimmt man jedoch an, dass sie wesentlich häufiger ist als die klassische Form. Der Genort für die 21-Hydroxylase liegt auf dem kurzen Arm des 6. Chromosoms [174]. Es existieren 2 dicht beieinander liegende Gene, ein aktives Gen CYP21A2 und ein inaktives Pseudogen CYP21A1. Beide Gene haben eine hohe Homologie, die enge Nachbarschaft des Pseudogens mit dem aktiven Gen hat eine kausale Bedeutung für die Entstehung zahlreicher Gendefekte [152]. Bisher wurden über 100 verschiedene Gendefekte allein beim klassischen 21-Hydroxylase-Defekt beschrieben [31,147], z.b. Mutationen im CYP21A2 Gen oder Gendefekte, die im Pseudo-Gen vorkommen und durch Genkonversion ins aktive Gen gelangen [146,171]. Die Restaktivität der 21-Hydroxylase im in-vitro System bestimmt den Phänotyp. Eine Aktivität von 2-4% reicht aus, um einen Salzverlust zu verhindern [172,177]. Allerdings kann es bei unzureichender Substitution auch bei diesen Patienten zu einer Dekompensation mit Salzverlustkrise kommen. Bei einer homozygoten Mutation mit einer Restaktivität von über 20% entwickelt sich in fast allen Fällen ein nicht-klassisches AGS [172,178]. Bei den meisten Patienten werden Kombinationen verschiedener Mutationen nachgewiesen (compound Heterozygotie) [105], der Phänotyp entspricht dabei dem der Mutation mit der höheren Restaktivität [85,152,172] Diagnostik und Therapie Die Diagnostik erfolgt mittels Bestimmung von 17-Hydroxyprogesteron (17- OHP) im Serum, wobei die Konzentrationen bei klassischem AGS bereits postnatal massiv erhöht sind (>100 nmol/l bei normalen Werten von <8,9 nmol/l [177]). Im Harn findet man mittels Kapillargas-Chromatographie/ Gaschromatographie-Massenspektrometrie ein charakteristisches Steroidprofil, wobei insbesondere Pregnantriol (Abbauprodukt von 17-OHP) deutlich erhöht ist. Neben 17-OHP sind im Serum auch die Konzentrationen von

20 20 Testosteron, 21-Desoxycortisol und Androstendion erhöht. Beim Salzverlust findet man neben den typischen Elektrolytveränderungen eine erhöhte Renin-Konzentration im Serum. Bei Kindern mit nicht-klassischem AGS lassen sich erhöhte 17-OHP-Konzentrationen nach Gabe von ACTH messen. Die Diagnose sollte durch eine Genotypisierung bestätigt werden. Die Therapie des AGS mit 21-Hydroxylase-Defekt besteht aus lebenslanger Substitution mit Glukokortikoiden und bei der Salzverlustform zusätzlich mit Mineralokortikoiden [29]. Mittel der Wahl ist bei Kindern die Substitution mit dem physiologischen Glukokortikoid Hydrokortison (HC) und beim Salzverlustsyndrom zusätzlich mit 9α-Fludrocortison [72]. Die HC-Tagesdosis (ca mg/m 2 KOF) wird üblicherweise in 3 Dosen verabreicht [72,176], wobei in der Regel 50 % der Tagesdosis morgens und jeweils 25 % mittags und abends verabreicht werden sollten [24]. Die Morgendosis wird in der Regel nach dem Aufstehen morgens eingenommen. Fludrokortison wird in einer täglichen Gesamtdosis von 0,05 bis 0,3 mg verabreicht [1,2]. Als primäre Therapieziele werden gegebenenfalls eine adäquate Genitalkorrekturoperation bei Mädchen [141], normales Gedeihen und Längenwachstum, Verhinderung von Übergewicht, normaler Blutdruck, Erreichen einer normalen Erwachsenengröße (im genetischen Zielbereich), normale Pubertätsentwicklung sowie die Verhinderung von Salzverlustkrisen angesehen [86]. Das Therapiemanagement muss immer unter Beachtung des Risikos eines iatrogenen Cushing-Syndroms mit Adipositas, Wachstumsstörung, Osteoporose, Hypertonie und Insulinresistenz erfolgen [105,154,175]. Der Umstand, dass zur Suppression von ACTH und Hyperandrogenämie physiologische Dosen (für Kinder und Jugendliche täglich 6-7 mg/m² KOF [82,97]) nicht ausreichen, stellt dabei ein großes Problem im Therapiemanagement dar [103]. Für die Therapiekontrolle und als Aussagewert über die individuelle Qualität der Einstellung werden das Längenwachstum, Knochenalter und Messung der Hormonspiegel in unterschiedlichen Medien wie Serum, Harn und/oder Speichel herangezogen [15,74,118]. Obwohl sich das Therapiemanagement für AGS in den letzten Jahrzehnten stetig verbessert hat, besteht für

21 21 Patienten mit AGS noch immer eine deutlich erhöhte Mortalitätsrate, insbesondere aufgrund adrenaler Krisen [55] Pubertät und Fertilität bei AGS Patientinnen Bei Mädchen mit einem 21-Hydroxylase-Defekt können Störungen der Pubertätsentwicklung und der Fertilität auftreten. Mädchen mit früher Diagnosestellung können bei guter Therapieeinstellung aber auch eine normale Pubertätsentwicklung erleben [61,70,117]. Die Einstellung ist jedoch v.a. während der Pubertät nicht immer optimal. Während der Pubertät gibt es zusätzliche Faktoren, die die optimale Einstellung oft nicht möglich machen [116,175]. Charmandari et al. beschrieben eine peripuberale Veränderung der Pharmakokinetik von Kortisol im Sinne einer erhöhten Clearance [23]. Außerdem ist das rasche Wachstum während der Pubertät ein erschwerender Faktor für die optimale Therapieeinstellung. Bei unzureichender Suppression von ACTH aufgrund fehlender negativer Rückkopplung durch Kortisol kommt es zu einer erhöhten Androgensekretion mit einer Androgenisierung. Häufig werden bei Mädchen mit 21- Hydroxylasedefekt Ausbleiben [68] oder Verzögerung [66] der Menarche, sowie Zyklusstörungen im Sinne einer Oligomenorrhoe oder Amenorrhoe [176], Verzögerung der Brustentwicklung [127] und Infertilität [105] beobachtet. Als Ursache für die Störungen werden verschiedene Gründe diskutiert. Die erhöhten Androgene können sich durch Störung des hypothalamisch-hypophyär-ovariellen Regelkreises negativ auf den Ovarialzyklus auswirken. Androstendion, das daraus synthetisierte Testosteron, und Östradiol hemmen die Ausschüttung von hypothalamischem GnRH und hypophysären Gonadotropinen [162]. Doch auch bei ausreichender Androgensuppression können Zyklusstörungen auftreten. Als Ursache werden erhöhte Progesteron-Werte adrenalen Ursprungs während der Follikelphase angenommen, die den Eisprung verhindern oder den Aufbau des Endometriums stören [156]. Man vermutet zudem, dass die intrauterine und postnatale Androgenbelastung

22 22 Langzeiteffekte auf die Funktion der hypothalamisch-hypophysär-ovariellen Achse hat [49]. Bei postmenarchalen AGS-Patientinnen ist die Prävalenz polyzystischer Ovarien stark erhöht (bis zu 76% vs. 22% bei der Referenzgruppe [62]), was zum großen Anteil zu Zyklusstörungen und reduzierter Fertilitätsrate beiträgt [7,111,115,151]. Aber auch eine zu hohe Glukortikoiddosis führt über die Hemmung der Gonadotropinfreisetzung an der Hypophyse zur Anovulation [6,79]. Bei der Ratte hemmt ein Kortisolexzess die Follikel-Entwicklung und Steroidogenese [73]. Beim Menschen gibt es Hinweise, dass Glukokortikoide auch auf der Ebene von Hypothalamus und Uterus Zyklusstörungen induzieren [131,134,140,144]. Frauen mit AGS haben niedrigere Fertilitätsraten als die Allgemeinbevölkerung, v.a. diejenigen mit Salzverlust, mehrere Studien beschrieben Fertilitätsraten bei AGS-Frauen zwischen 34% und 60% [98,112,133]. Als Ursachen werden nicht nur die inadäquate Androgen- und Gestagensuppression durch Glukokortikoide angesehen [4,61,112], sondern auch psychosoziale Umstände. In Studien, die nur Patientinnen mit heterosexueller Aktivität mit einschlossen, wurde von gleichen Schwangerschaftsraten bei AGS und Gesamtbevölkerung berichtet, wobei auch keine Unterschiede zwischen Salzverlust-AGS und einfachvirilisierender Form festzustellen waren [17]. So ist anzunehmen, dass AGS- Frauen, v.a. diejenigen mit Salzverlust-Form, weniger (hetero-)sexuell aktiv sind. Es wurde häufig bestätigt, dass besonders unter Frauen mit schweren AGS-Formen psychische Gründe wie Probleme mit der Geschlechtsidentität [106], Übersensibilisierung durch häufige Genitaluntersuchungen [109] und Depressionen [132], sowie strukturelle Ursachen z.b. vaginale Vernarbungen, schmerzhafter Geschlechtsverkehr [8,33,59] oder Klitorektomie [107,113] zu einem großen Teil für niedrigere Schwangerschaftsraten verantwortlich sind. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurden in den letzten Jahren zunehmend höhere Fertilitätsraten sogar bei Salzverlust-Patientinnen (91,3 %) berichtet, was wahrscheinlich durch die verbesserte und früher

23 23 eingesetzte Therapie und die Fortschritte in der Genitalrekonstruktion bedingt ist [121;192]. Casteras et al. beschrieben normale Konzeptionsraten bei klassischem AGS, vor allem auch bei Frauen mit Salzverlust (88,9% vs. 92,9% ohne Salzverlust) [123] AGS und PCOS Das Syndrom der Polyzystischen Ovarien (PCOS) ist ein Komplex an Störungen, der aus nicht-erblichen und polygen vererbten Faktoren resultiert [46,96,169]. PCOS ist zusammengesetzt aus 1. Oligo- und/oder Anovulation, 2. klinischen und/oder biochemischen Zeichen einer Hyperandrogenämie und 3. polyzystischen Ovarien (> 12 Follikel mit je 2-9 mm Durchmesser und/oder Ovarialvolumen > 10ml) in der transvaginalen Sonografie. Nach dem Rotterdam-Konsensus (2003) wird die Diagnose bei Vorliegen von 2 der genannten 3 Kriterien gestellt, gleichzeitig muss jedoch das Vorliegen von AGS, Androgen sezernierenden Tumoren oder ein Cushing Syndrom ausgeschlossen sein [50]. Bei PCOS liegt wahrscheinlich eine Störung der Follikelreifung vor, wobei die Hyperandrogenämie hier ovarieller Genese ist. Die Reifung scheint im Stadium eines antralen Follikels zu stagnieren, da nur diese in ihrer Anzahl extrem erhöht sind, während Tertiärfollikel zahlenmäßig reduziert sind. Der Störung liegen möglicherweise eine Theka-zelluläre Androgen-Überproduktion [114] und eine Granulosazell-Dysfunktion zugrunde [142,148,157]. Die ursächlichen Zusammenhänge der Entwicklung von polyzystischen Ovarien bei AGS sind noch nicht hinreichend geklärt. Man vermutet, dass die erhöhten Serum-Androgene adrenalen Ursprungs einen schädlichen Effekt auf das Ovar haben und die Follikelreifung direkt beeinträchtigen [44,176]. Aber auch Frauen mit supprimierten adrenokortikalen Androgenen entwickeln polyzystische Ovarien [11]. Als Ursache diskutierten die Autoren die prä- und postnatale Androgen- und Progesteron-Exposition, wodurch die Hypothalamus-Hypophysen-Achse irreversibel umprogrammiert wird und zu

24 24 einer überschießenden LH-Sekretion während der Pubertät führt [3,10,13,159]. Eine erhöhte LH-Aktivität ist bei PCOS ein häufiger Befund [99,121,130]. Die hohen LH-Serumkonzentrationen sollen bei AGS zur ovariellen Androgenproduktion führen [102] Ziele der Arbeit Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Untersuchung der Serumkonzentrationen von AMH bei Mädchen und jungen Frauen mit AGS und 21-Hydroxylasedefekt. Dabei sollen mögliche Unterschiede zwischen dem Schweregrad des AGS, dem Pubertätsstatus, der Auxologie und der Qualität der Therapie aufgezeigt werden. In der Annahme, dass Androgen- Produktion und Ovarialfunktion bei AGS-Patientinnen mit guter Therapieeinstellung weitestgehend normal sind, werden diese Patientinnen solchen mit schlechter Therapieeinstellung gegenübergestellt und auf Unterschiede in den AMH-Konzentrationen untersucht. Die gemessenen Werte werden mit einer alters-gematchten Gruppe von gesunden Mädchen verglichen.

25 25 3. Patienten und Methoden 3.1. Patienten Kollektiv und Art der Erhebung Das untersuchte Kollektiv bestand aus insgesamt 86 Mädchen und Frauen, welche sich im Rahmen der endokrinologischen Sprechstunde der Kinderund Jugendklinik in einem Zeitraum von 18 Monaten ambulant vorstellten. Aus diesem Kollektiv stammen sowohl die AGS-Patientinnen als auch die Mädchen, die die Referenzgruppe bilden. Das Alter aller Probandinnen lag im untersuchten Zeitraum zwischen 2,4 und 26,1 Jahren (Altersdurchschnitt 12,5 Jahre). Davon waren 26 präpuberal, bei 60 Mädchen war die Pubertät (Tanner B 2 und mehr) bereits eingetreten. 35 hatten bereits ihre Menarche. Das Kollektiv wurde in drei Gruppen aufgeteilt: Gruppe der AGS-Mädchen, Gruppe der erwachsenen AGS-Frauen und Referenzgruppe. Die Gruppe der AGS-Patientinnen bestand aus 32 Mädchen und neun erwachsenen AGS- Frauen. Bei den Patientinnen wurden routinemäßig folgende klinische Parameter erhoben: Körperhöhe, Gewicht, Berechnung des Body-Mass- Index (BMI), Blutdruck nach Riva Rocci und Reifestadium nach Tanner. Zusätzlich erfolgte bei den AGS-Patientinnen eine Blutentnahme zur Kontrolle der Laborparameter 17-Hydroxy-Progesteron (17-OHP), Kortisol, Renin, eine Gewinnung von Speichel (3 Proben) und eines Sammelharns über 24 Stunden. Mit Einverständnis der Eltern/Patientinnen wurde 0,2 ml Blut mehr für die AMH Bestimmung abgenommen Gruppe der AGS-Patientinnen Insgesamt wurden die Daten von 41 Patientinnen mit AGS erhoben. Bei allen AGS-Patientinnen lag ein molekulargenetisch gesicherter Defekt der 21- Hydroxylase vor. Bei 30 Patientinnen lag ein klassisches AGS ohne Restaktivität der 21-OH vor, sieben Patientinnen hatten ein klassisches AGS

26 26 mit drei Prozent Restaktivität des Enzyms. Drei Patientinnen mit nichtklassischem AGS wurden mit eingeschlossen. Eine Patientin hatte einen noch unbekannten Gendefekt. Die Mädchen waren zum Zeitpunkt der Erhebung zwischen 2,4 und 26,1 Jahren alt, der Altersdurchschnitt lag bei 13,7 Jahren. Alle Mädchen mit AGS wurden im Zeitraum der Erhebung mit einer individuellen Glukokortikoid-Dosis (GC-Dosis) therapiert. 30 Mädchen nahmen Hydrokortison ein, fünf Prednison, zwei Prednisolon und eine Patientin Dexamethason. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden die Dosen von Prednison, Prednisolon und Dexamethason durch Multiplikation mit dem Faktor 4 (Prednison/Prednisolon) bzw. 30 (Dexamethason) in Hydrokortison-Äquivalente umgerechnet (s. auch Kap ). Die durchschnittliche Hydrokortison-Äquivalent-Dosis lag bei 14,8 mg/m² Körperoberfläche (KOF)/d (Min. 6,41 mg/m² KOF, Max. 25,0 mg/m² KOF/d). 38 der 41 Patientinnen nahmen zusätzlich täglich Mineralokortikoide (Fludrokortison) ein; die durchschnittliche Dosis betrug 0,07 mg (Min. 0,025 mg, Max. 0,2 mg). Anhand von Laborwerten aus Serum, Urin und Speichel, sowie des Längenwachstums und Knochenalters wurde die Qualität der Therapieeinstellung evaluiert (siehe Kapitel und ). Bei 18 Patientinnen wurde die laborchemische Einstellung als gut, bei 23 als schlecht (mit insuffizienter Unterdrückung der Androgene bzw. zu hohe 17- OHP-Serumkonzentration) bewertet. Bei 23 Patientinnen lag eine zweite AMH-Messung vor, der Altersdurchschnitt dieser Untergruppe betrug bei Erstmessung 13,4 ± 3,49 Jahre, bei Zweitmessung 14,0 ± 3,55 Jahre (Min. 7,8 Jahre, Max. 20,3 Jahre bei Erstmessung; Min. 8,5 Jahre, Max. 21,3 Jahre bei zweiter Messung). Die ersten und zweiten Messungen waren dabei in zeitlichen Abständen von minimal 2 bis maximal 14 Monaten (durchschnittliches Zeitintervall 7,36 ± 3,44 Monate bzw. 0,66 ± 0,29 Jahre).

27 Kinder und Jugendliche Die Gruppe umfasste insgesamt 32 Mädchen mit einem Altersdurchschnitt von 11,7 Jahren (Min. 2,4 Jahre, Max. 17,7 Jahre; zur Altersverteilung siehe Tabelle 1). Davon waren neun präpuberal (Tanner B 1) und 23 in der Pubertät (zur Verteilung der Pubertätsstadien siehe Tabelle 2). Tab. 1: AGS-Kinder und -Jugendliche: Altersverteilung Altersgruppe Häufigkeit (n) Prozent 2,0 7,9 Jahre 6 18,8 8,0 11,9 Jahre 9 28,1 12,0 14,9 Jahre 10 31,3 15,0 17,9 Jahre 7 21,9 Gesamt

28 28 Tab. 2: AGS-Kinder und -Jugendliche: Verteilung der Tanner-Stadien mit jeweiligem Altersdurchschnitt (AD) [Jahre] Tanner-Stadium Pubesbehaarung Tanner-Stadium Brustdrüse Tanner N % AD N % AD ,0 6, ,1 6, ,0-1 3,1 8, ,8 10,4 3 9,4 11, ,6 12,0 7 21,9 12, ,6 15, ,5 15,2 Gesamt , ,7 Bei 14 Mädchen war die Menarche bereits erfolgt. Drei Jugendliche nahmen orale Kontrazeptiva ein. Die Verteilung der Mädchen nach 21-OH-Restaktivität mit Altersmittelwerten ist in Tabelle 3 ersichtlich, einen Überblick über die Verteilung der Gewichtsgruppen bietet Tabelle 4. In Tabelle 5 sind die wichtigsten auxologischen Daten und Therapiedaten zusammengestellt.

29 29 Tab. 3: AGS-Kinder und -Jugendliche: Verteilung der Restaktivität der 21-Hydroxylase mit jeweiligem Alter (Jahre, Mittelwert ± Standardabweichung) Restaktivität der 21-OH N % Alter (J) 0 % (Klassisches AGS) 22 68,8 11,6 ± 4,4 3 % (Klassisches AGS) 6 18,8 13,2 ± 2, % (nicht-klassisches) 3 9,40 10,7 Tab. 4: AGS-Kinder und -Jugendliche: Verteilung der Gewichtsgruppen Gewichtsgruppe SDS N % Starkes Untergewicht - 2,00 1 2,4 Leichtes bis mäßiges Untergewicht - 1,99 bis -1,00 1 2,4 Normalgewicht - 0,99 bis +0, ,1 Übergewicht +1,00 bis +1, ,0 Adipositas + 2, ,1 Gesamt ,0

30 30 Tab. 5: AGS-Kinder und -Jugendliche: Daten zu Menarche, Auxologie und Therapie Merkmal N Min. Max. MW ± SD Alter [Jahre] bei Messung Alter [Jahre] bei Menarche 32 2,4 17,7 11,7 ± 4, ,3 16,4 13,3 ± 1,590 Körperhöhe [cm] 32 92,0 168,2 145,3 ± 19,5 Körperhöhe [SDS] 32-1,97 +1,35-0,31 ± 0,86 Körpergewicht [kg] 32 13,3 87,5 46,0 ± 18,5 Körpergewicht [SDS] 32-2,25 +2,91 +0,36 ± 1,10 BMI [kg/m²] 32 13,8 35,8 20,7 ± 4,85 BMI [SDS] 32-2,71 +3,05 +0,58 ± 1,10 GC-Dosis [mg/m² KOF] 32 6,41 23,76 14,51 ± 3,73 MC-Dosis [mg] 30 0,025 0,10 0,06 ± 0,02 MW: Mittelwert, SD: Standardabweichung, SDS: Standard-Deviation-Score, BMI: Body-Mass-Index, GC: Glukokortikoide, MC: Mineralokortikoide, KOF: Körperoberfläche 30 der 32 Patientinnen nahmen Fludrokortison ein. 27 Mädchen nahmen die tägliche GC-Dosis in Form von Hydrokortison ein, zwei in Form von Prednison und drei Patientinnen Hydrokortison und Prednison im Wechsel. 13 Patientinnen hatten eine gute Therapieeinstellung, 19 waren zum Zeitpunkt der AMH-Messung nicht adäquat therapiert.

31 Erwachsene AGS-Patientinnen Die Gruppe der erwachsenen Patientinnen mit AGS umfasste neun junge Frauen im Alter zwischen 18,4 und 26,1 Jahren, der Altersdurchschnitt lag bei 20,9 ± 2,46 Jahren. Für diese Gruppe konnten wir keine eigene Referenzgruppe generieren. Acht der neun Patientinnen nahmen Fludrokortison ein. Drei Mädchen nahmen die tägliche GC-Dosis in Form von Hydrokortison ein, drei in Form von Prednison, zwei in Form von Prednisolon und eine Patientin in Form von Dexamethason. Fünf Patientinnen hatten eine gute Therapieeinstellung, vier waren mit einer zu niedrigen GC-Dosis eingestellt. Fünf Frauen führten eine orale Kontrazeption durch. Alle neun erwachsenen Patientinnen hatten ein klassisches AGS. Die Verteilung nach 21-OH-Restaktivität mit Altersmittelwerten ist in Tabelle 6 ersichtlich. Die auxologischen und wichtigsten klinischen Daten sind in Tabelle 7 dargestellt. Tab. 6: Erwachsene AGS-Patientinnen: Verteilung der Restaktivität der 21-Hydroxylase (21-OH) mit jeweiligem Alter (Jahre, Mittelwert ± Standardabweichung) Restaktivität der 21-OH N % Alter 0 % (Klassisches AGS) 8 88,9 21,8 ± 2,49 3 % (Klassisches AGS) 1 11,1 18,8

32 32 Tab. 7: Erwachsene AGS-Patientinnen: Daten zu Menarche, Auxologie und Therapie Merkmal N Min. Max. MW ± SD Alter [Jahre] bei Messung Alter [Jahre] bei Menarche 9 18,4 26,1 20,9 ± 2, ,8 15,5 12,8 ± 1,32 Körpergröße [cm] 9 149,5 164,4 160,5 ± 4,86 Körpergewicht [kg] 9 50,4 96,0 72,2 ± 17,3 BMI [kg/m²] 9 20,9 40,0 28,1 ± 6,83 GC-Dosis [mg/m² KOF] MC-Dosis [mg/d] 9 8,35 20,0 15,9 ± 5,78 8 0,025 0,20 0,11 ± 0,06 MW: Mittelwert, SD: Standardabweichung, BMI: Body-Mass-Index, GC: Glukokortikoide, MC: Mineralokortikoide, KOF: Körperoberfläche Referenzgruppe Als Referenzgruppe wurde eine Gruppe von Mädchen herangezogen, die sich aus verschiedenen medizinischen Gründen (z.b. Kleinwuchs, Abklärung der Schilddrüsenfunktion) ebenfalls in der endokrinologischen Sprechstunde vorstellte (siehe Tabelle 8) und bei denen sich aufgrund der Anamnese, Klinik und Laborparameter kein Hinweis auf eine Störung der Gonadenfunktion fand. Ausgeschlossen wurden Mädchen mit z.b. Hyperandrogenämie, Hyperprolaktinämie, Hypogonadismus, Pubertas praecox vera, Pseudopubertas praecox, Pubertas tarda und Ullrich-Turner-Syndrom.

33 33 Tab. 8: Diagnosen der Mädchen in der Referenzgruppe und jeweiliges Alter (Mittelwert ± Standardabweichung) Diagnose N Alter Adipositas 7 12,3 ± 1,26 Hochwuchs 6 11,1 ± 2,57 Kleinwuchs 15 10,7 ± 4,09 Idiopathischer Wachstumshormon (GH)- Mangel mit GH-Therapie 13 11,6 ± 2,50 Hyperthyreose 4 13,7 ± 2,73 Insgesamt 45 11,5 ± 3,06 Die Gruppe umfasste insgesamt 45 Mädchen mit einem Altersdurchschnitt von 11,5 Jahren (Min. 2,7 Jahre, Max. 16,3 Jahre, Altersverteilung siehe Tabelle 9). Davon waren 17 präpuberal (Tanner B 1) und 28 in der Pubertät (Verteilung der Tannerstadien siehe Tabelle 10). Zwölf Mädchen hatten bereits ihre Menarche. Ein Mädchen führte eine orale Kontrazeption durch. Einen Überblick über die Verteilung der Gewichtsgruppen bietet Tabelle 11. Wichtige auxologische und klinische Daten sind in Tabelle 12 dargestellt. Tab. 9: Referenzgruppe: Altersverteilung Altersgruppe Häufigkeit Prozent 2,0 7,9 Jahre 6 13,3 8,0 11,9 Jahre 19 42,2 12,0 14,9 Jahre 15 33,3 15,0 17,9 Jahre 5 11,1 Gesamt

34 34 Tab. 10: Referenzgruppe: Verteilung der Tanner-Stadien mit jeweiligem Altersdurchschnitt (AD) [Jahre] Tanner-Stadium der Pubesbehaarung Tanner-Stadium der Brustdrüse Tanner N % AD N % AD ,0 9, ,8 9, ,6 11,3 5 11,1 11, ,9 12,0 5 11,1 11, ,9 13, ,2 13, ,7 14,3 8 17,8 14,3 Gesamt , ,5 Tab. 11: Referenzgruppe: Verteilung der Gewichtsgruppen Gewichtsgruppe SDS N % Starkes Untergewicht - 2,00 3 6,7 Leichtes bis mäßiges Untergewicht - 1,99 bis -1, ,6 Normalgewicht - 0,99 bis +0, ,0 Übergewicht +1,00 bis +1, ,0 Adipositas + 2, ,8 SDS: Standard-Deviation-Score

35 35 Tab. 12: Referenzgruppe: Auxologische und klinische Daten Merkmal N Min. Max. MW ± SD Alter bei AMH Messung Alter bei Menarche Körpergröße [cm] Körpergröße [SDS] Körpergewicht [kg] Körpergewicht [SDS] 45 2,7 16,3 11,5 ± 3, ,2 14,2 12,2 ± 1, ,5 178,7 144,9 ± 21,8 45-3,95 +4,75-0,46 ± 2, ,8 117,6 45,7 ± 23,9 45-4,23 +3,81-0,15 ± 2,08 BMI [kg/m²] 45 12,6 42,0 20,4 ±6,63 BMI [SDS] 45-3,92 +3,54 +0,19 ± 1,73 MW: Mittelwert, SD: Standardabweichung, SDS: Standard-Deviation-Score, BMI: Body-Mass-Index 3.2. Methoden Klinische Parameter Grundlage der in dieser Studie verwendeten Daten sind die in der endokrinologischen Sprechstunde am jeweiligen Vorstellungstag erhobenen klinischen Parameter. Neben einer klinischen Untersuchung wurden Körperhöhe, Körpergewicht und Reifestadien nach Tanner erhoben. Weiterhin wurden das Eintreten der Regelblutung bzw. das Alter bei Menarche und die Einnahme von Kontrazeptiva erfragt. Der Beginn der Pubertät wurde bei dem Tanner-Stadium B2 festgelegt.

36 36 Aus Körpergröße und Körpergewicht wurde jeweils der Körpermassenindex (Body-Mass-Index, BMI) berechnet. Für die Berechnung der SDS-Werte von Größe, Gewicht und BMI bei Mädchen unter 18 Jahren wurden als Referenzen die Werte von Kromeyer-Hauschild und Mitarbeitern verwendet [84]. Die Mädchen wurden nach SDS-Wert in Gewichtsgruppen eingeteilt (siehe Tabelle 13, rechte Spalte). Für Mädchen ab 18 Jahre gelten die Werte der World Health Organisation (WHO), wobei leichtes und mäßiges Untergewicht sowie Adipositas Grad I-III zu jeweils einer Klasse zusammengefasst wurden (s. Tabelle 13, mittlere Spalte). Tab. 13: Einteilung der verschiedenen Gewichtsklassen modifiziert nach WHO Gewichtsklasse Body-Mass-Index [kg/m²] bei 18 Jahre Body-Mass-Index [SDS] bei < 18 Jahre Starkes Untergewicht < 16,00-2,00 Leichtes bis mäßiges Untergewicht 16,00 bis 18,49-1,99 bis -1,00 Normalgewicht 18,05 bis 24,99-0,99 bis +0,99 Übergewicht 25,00 bis 29,99 +1,00 bis +1,99 Adipositas 30,00 + 2,00 Die meisten AGS-Patientinnen wurden mit Hydrokortison behandelt. Sofern die Patientinnen ihre tägliche Glukokortikoid-Dosis in Form von Prednison, Prednisolon oder Dexamethason einnahmen, wurde die entsprechende Dosis zur besseren Vergleichbarkeit in Hydrokortison-Äquivalente umgerechnet. Als Umrechnungsfaktoren wurden die relativen glukokortikoiden Potenzen [81] verwendet:

37 37 Tab. 14: Umrechnungsfaktoren der verschiedenen Substanzen in Hydrokortison-Äquivalente nach Karow [81]: Substanz Relative glukokortikoide Potenz Umrechnung zu Hydrokortison- Äquivalenten Hydrokortison 1 x 1 Prednison/Prednisolon 4 x 4 Dexamethason 30 x 30 Aus Tagesdosis, Körpergröße und Gewicht wurde für jede AGS-Patientin die Glukokortikoiddosis pro Körperoberfläche berechnet. Zur Beurteilung der Qualität der Therapieeinstellung wurde wie folgt vorgegangen: Bei zunehmender Androgenisierung, zu hoher Wachstumsgeschwindigkeit (mehr als 2,0 SDS), einem in Relation zum chronologischen Alter fortgeschrittenen Knochenalter oder einem zu langen Zeitraum zwischen den Kontrollterminen (über 6 Monate für unter 12-jährige bzw. über 12 Monate für puberale Mädchen) wurde die Einstellung als nicht adäquat beurteilt. Zusätzlich gingen Laborparameter in die Beurteilung der Therapieeinstellung ein (s. Kapitel ).

38 Laborparameter Messung der AMH-Spiegel AMH wurde im hauseigenen Labor mittels Enzym-Immunoassay der Firma Immunotech Beckman Coulter Company Marseille bestimmt. Das Patientenblut wurde mittels Serum-Röhrchen abgenommen und bei -20 C bis zur Messung von AMH (bis zu zwei Monate) tiefgefroren. Das Auftauen erfolgte bei Raumtemperatur. Der AMH-Enzym-Immunoassay wurde zur quantitativen Bestimmung von Anti-Müllerschem Hormon in Serum, Plasma oder Überstand von Zellkulturen entwickelt. Er wird in Sandwich-Technik durchgeführt und benötigt somit zwei immunologische Schritte. Im ersten Schritt wird AMH mittels monoklonaler Anti-AMH-Antikörper, die an die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte fest anhaften, fixiert. Dazu wird jeweils eine Probe von 25 µl in eine Vertiefung pipettiert. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei Raumtemperatur (18-25 C) im Mikrotiterplatten-Shaker bei 350rpm werden die Banden mit 300 µl Waschlösung gewaschen. Im zweiten Schritt werden in jede Vertiefung jeweils 50 µl biotinylierter monoklonaler Anti-AMH-Antikörper und anschließend je 50 µl Streptavidin- Meerrettichperoxydase (HRP2)-Konjugat gegeben. Der biotinylierte Anti- AMH-Antikörper bindet sowohl an die solide Phase der Antigen-Antikörper- Komplexe als auch an das Streptavidin-HRP2-Konjugat. Nach einer weiteren 15-minütigen Inkubation bei 350 rpm im Shaker erfolgt ein weiterer Waschvorgang. Dann wird die Streptavidin-Peroxidase-Bindung durch Zufügen von 100µl des farbgebenden TMB (Tetramethylbenzidin Peroxidase-Substrat) detektiert. Es wird ein letztes Mal bei denselben Bedingungen und zusätzlicher Abdunkelung für Minuten inkubiert. Die Reaktion wird mittels 50 µl saurem Stop-Reagenz beendet. Der Grad der enzymatischen Umsetzung des Substrats wird durch eine Doppelwellenlängen-Absorptionsmessung bei 450 nm bestimmt (s. Abbildung 4). Die gemessene Absorption im Photospektrometer ist direkt proportional zu der AMH-Konzentration der Probe.

39 39 Mit jedem Kit wurde eine Standard-Verdünnungsreihe gemessen und damit eine Kalibrierkurve erstellt, welche die Grundlage für die Berechnung der gemessenen Patienten-AMH-Proben war. Eine Pipette unverdünnten Standards beinhaltete 7 pmol rekombinantes humanes AMH. Zur Kontrolle wurden jeweils zwei Messungen derselben Probe durchgeführt. Zur Messung geringster AMH-Konzentrationen wird der hochsensible Vorgang gewählt. Dabei werden gesonderte Verdünnungsserien vorgenommen. Die Sensitivität des Enzym-Immunoassays der Firma Immunotech Beckman Coulter beträgt 1,75 pmol in der standardmäßigen Anwendung bzw. 0,7 pmol in der höchsten Empfindlichkeitsstufe. Die Spezifität beträgt nahezu 1, da es keine Kreuzreaktion mit anderen Proteinen der TGFβ-Superfamilie gibt. Die Intra-Assay-Präzision beträgt bei einem Mittelwert von 36 pg/ml bzw pg/ml 5,3 bzw. 4,9 %. Die Inter-Assay-Präzision liegt bei einem Mittelwert von 31 pmol bzw pmol bei 8,7 bzw. 7,8 % [75]. Alle hier verwendeten Daten aus der Literatur sowie die eigenen Messungen wurden mit dem Enzym-Immunoessay der Firma Immunotech-Beckman Coulter erhoben. Meist wird AMH in der SI-Einheit als ng/ml oder µg/l angegeben. Sofern die Einheit pmol/l verwendet wird, lassen sich die Werte durch Division mit dem Faktor 7,14 in ng/ml umrechnen.

40 40 (1) (2) (3) (4) (5) Abb. 4: Prinzip des Enzymimmunoassays in Sandwich-Technik (1) Mit Antikörpern beschichtete Mikrotiterplatte (2) Zugabe des Patientenserums und Inkubation (3) Zugabe des biotinylierten monoklonalen Anti-AMH-Antikörpers (4) Zugabe und Komplexbildung des Streptavidin-HRP2-Konjugats (5) Detektion durch Zugabe des farbgebenden Peroxidase-Substrats (TMB) Laborparameter zur Evaluation der Qualität der Therapieeinstellung bei AGS Bei allen AGS-Patientinnen wurden zur Beurteilung der Qualität der Therapieeinstellung ergänzend zu klinischen Parametern folgende Laborwerte untersucht: Es wurden im Serum Kortisol, DHEAS, 17- Hydroxyprogesteron, Renin und IGF-1, im Speichel ein 17- Hydroxyprogesteron-Tagesprofil bestimmt. Im 24h-Sammelurin wurde ein Steroidprofil mit Pregnantriol, Pregnantriolon und Tetrahydrocortison erstellt. Diese Laborparameter gingen in dieser Studie jedoch in keine Berechnungen ein. Sie dienten lediglich zusammen mit klinischen Parametern zur Beurteilung, ob die Therapieeinstellung im Zeitraum der Patientenvorstellung suffizient oder zu niedrig war.

41 Auswertung und statistische Methoden Für die statistische Auswertung der Daten wurde das Statistik-Programm SPSS/PASW Statistics 18 verwendet. Als Signifikanzniveau wurde p 0,05 festgelegt. Nicht signifikante Ergebnisse (p > 0,05) wurden mit n.s. gekennzeichnet. In der deskriptiven Statistik wurden Mittelwert, Standardabweichung, Minimum und Maximum berechnet. Normalverteilungen wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test berechnet. Zur Erfassung von Zusammenhängen zwischen kategorialen Variablen wurde der Chi-Quadrat-Test herangezogen. Zum Vergleich von Mittelwerten wurden der T-Test für unabhängige Stichproben und die univariate Varianzanalyse verwendet. Zur Untersuchung auf Homogenität der Varianzen wurde der Levene-Test durchgeführt. Bei Varianzheterogenität zum Vergleich der Mittelwerte zweier Stichproben wurde der U-Test nach Mann-Whitney gewählt. Mehrfachvergleiche erfolgten mittels Post-Hoc-Tests nach Tamhane-T2 bei Varianzheterogenität bzw. LSD bei homogenen Varianzen. Zur Untersuchung der AMH-Werte bei mehreren Messungen im Verlauf wurde der Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben verwendet. Die bivariaten Korrelationen wurden mit dem Korrelationskoeffizienten nach Pearson berechnet. Es wurde mit zweiseitigen Signifikanztests gerechnet. Zur graphischen Darstellung wurden Punkte-, Boxplot- und Balkendiagramme mithilfe der Programme Microsoft Excel und SPSS erstellt. Alle Untersuchungen erfolgten nach Aufklärung mit Zustimmung der Eltern und Patientinnen. Das lokale ethische Komitee hatte keine Einwände zur Durchführung der Analysen.

42 42 4. Ergebnisse Die AMH-Werte wurden für die AGS- und Referenzgruppe zunächst getrennt dargestellt. Bei allen Berechnungen wurde, sofern nicht anders vermerkt, der erste AMH-Messwert verwendet. Die Werte wurden stets in pmol/l angegeben AGS-Gruppe Es bestanden keine AMH-Unterschiede zwischen den beiden AGS- Untergruppen, deshalb wurden für die Analyse der Daten der Kinder, Jugendlichen und Erwachsenen mit 21-Hydroxylase-Defekt zusammengefasst. Die AMH-Werte der AGS-Gruppe und ihrer Untergruppen (Kinder und Jugendliche / Erwachsene, Dosis-Gruppen, Mehrfachmessungen, etc.) waren normal verteilt AMH und klinische Merkmale Die AMH-Werte wurden auf Unterschiede bei verschiedenen Variablen geprüft. Die Variablen waren chronologisches Alter, Restaktivität der 21- Hydroxylase, Body-Mass-Index (BMI), Reifestadium nach Tanner, Eintritt von Menarche und Einnahme von Kontrazeptiva. Die Untersuchung ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede. Zur Übersicht über AMH-Mittelwerte und Standardabweichungen bei den verschiedenen Alters-, Enzym- und Gewichtsgruppen siehe Tabellen 15, 16 und 17. Es konnte kein Unterschied zwischen den AMH-Mittelwerten von adipösen (N=7, AMH 29,8 ± 11,1 pmol/l) und nicht-adipösen (N=34, AMH 35,6 ± 23,8 pmol/l) AGS-Patientinnen festgestellt werden (p = 0,53). Im Vergleich

43 43 zwischen präpuberalen und postmenarchalen AGS-Patientinnen ließen sich keine AMH-Unterschiede erheben. Tab. 15: AGS-Gruppe: AMH-Konzentrationen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) in den verschiedenen Altersgruppen Altersgruppe N % AMH Range 2,0 7,9 Jahre 6 14,6 31,8 ± 16,0 12,0 54,4 8,0 11,9 Jahre 9 22,0 33,2 ± 22,9 8,9 73,6 12,0 14,9 Jahre 10 24,4 40,6 ± 29,4 12,7 109,0 15,0 17,9 Jahre 7 17,1 25,1 ± 14,9 2,2 51,1 18,0 26,9 Jahre 9 22,0 38,5 ± 22,1 12,8 86,8 Gesamt ,6 ± 22,2 2,2 109,0 Differenz der Mittelwerte: n.s. Tab. 16: AMH-Konzentrationen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) nach Restaktivität der 21-Hydroxylase Restaktivität der 21-OH N AMH Range 0 % 30 34,6 ± 20,4 2,2 86,8 3 % 7 28,2 ± 10,8 17,5 51, % 3 56,9 ± 47,9 14,7 109,0 Differenz der Mittelwerte: n.s.

44 44 Tab. 17: AGS-Gruppe: AMH-Konzentrationen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) in Relation zum Körpergewicht Gewichtsgruppe N % AMH Range Starkes Untergewicht 1 2,4 25,6 25,6 Leichtes bis mäßiges Untergewicht 1 2,4 23,7 23,7 Normalgewicht 23 56,1 34,6 ± 21,9 2,2 86,8 Übergewicht 9 22,0 40,5 ± 31,2 12,7 109,0 Adipositas 7 17,1 29,8 ± 11,1 18,4 51,0 Gesamt ,0 34,6 ± 22,2 2,2 109,0 Differenz der Mittelwerte: n.s. Die Korrelation der AMH-Werte mit dem chronologischen Alter, Alter bei Menarche, Körpergröße, Körpergewicht und Body-Mass-Index ergab keine signifikanten Ergebnisse. Die Untersuchung der AMH-Werte in Relation zum Zeitraum seit Menarche erbrachte keine Korrelation AMH in Relation zur AGS-Therapie In Relation zur Höhe der Therapie konnten keine Dosis-bezogenen AMH- Unterschiede gefunden werden. Die jeweiligen Dosisgruppen sind in den Tabellen 18 und 19 dargestellt. 38 AGS-Patientinnen nahmen Mineralokortikoide (MC) in Form von Fludrokortison ein, drei Patientinnen hatten keine MC-Medikation. Die AMH-Werte beider Gruppen unterschieden sich nicht signifikant voneinander.

45 45 Tab. 18: AMH-Konzentrationen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) in Relation zu den Glukokortikoid- Äquivalenz-Dosen GC-Dosis [mg/m²] N % AMH Range 6,0-9,9 6 14,6 28,3 ± 13,1 12,0 47,0 10,0-14, ,0 39,7 ± 27,7 8,9 109,0 15,0-17, ,3 27,8 ± 15,7 2,2 55,5 18,0-25,9 7 17,1 40,0 ± 22,2 12,8 73,6 Gesamt ,6 ± 22,2 2,2 109,0 Differenz der Mittelwerte: n.s. Tab. 19: AMH-Konzentrationen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) in Relation zu den Mineralokortikoid- Dosen MC-Dosis [mg/d] N % AMH Range 0, ,5 46,2 ± 18,8 30,9 73,6 0, ,1 29,3 ± 16,1 8,9 61,5 0,06-0, ,9 36,1 ± 26,1 2,2 86,8 0,1-0,2 7 18,4 26,5 ± 11,1 12,8 39,0 Gesamt ,5 ± 19,3 2,2 86,8 Differenz der Mittelwerte: n.s.

46 46 In der AGS-Gruppe konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen AMH-Mittelwerten bei gut oder schlecht eingestellter Therapie nachgewiesen werden (siehe Tabelle 20). Bei Mädchen mit schlechter Therapieeinstellung waren keine altersgruppen-spezifischen AMH-Unterschiede zu finden (siehe Tabelle 21). Zwischen postmenarchalen AGS-Patientinnen mit guter und schlechter Therapie-Einstellung gab es keine signifikanten AMH-Unterschiede. In der Gruppe von Patientinnen mit schlechter Therapieeinstellung fanden sich bei den Patientinnen mit (N=6, AMH 24,7 ± 7,98 pmol/l) bzw. ohne (N=17, AMH 35,9 ± 26,6 pmol/l) Einnahme oraler Kontrazeptiva keine signifikanten AMH- Unterschiede (p = 0,33). Tab. 20: AMH-Konzentrationen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) bei guter und schlechter Therapieeinstellung in der AGS-Gruppe Qualität der Therapieeinstellung AMH Range gut 23 56,1 36,6 ± 23,6 2,2 109,0 schlecht 18 43,9 33,0 ± 20,8 12,0 86,8 gesamt ,0 34,6 ± 22,2 2,2 109,0 Differenz der Mittelwerte: n.s.

47 47 Tab. 21: AGS-Patientinnen mit schlechter Therapieeinstellung: AMH- Konzentrationen in den verschiedenen Altersgruppen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) Altersbereich N AMH Range 2,0 7,9 Jahre 3 33,9 ± 11,9 23,7 47,0 8,0 11,9 Jahre 3 35,8 ± 33,7 8,9 73,6 12,0 14,9 Jahre 9 39,7 ± 31,1 12,7 109,0 15,0 17,9 Jahre 4 20,1 ± 13,3 2,2 34,5 18,0 26 Jahre 4 27,9 ± 7,53 18,4 36,5 Differenz der Mittelwerte: n.s AMH-Konzentrationen im Längsschnitt Bei den Patientinnen mit zwei AMH-Messungen im zeitlichen Verlauf wurden die Mittelwerte der ersten und zweiten Messungen auf mögliche Unterschiede getestet. Die Konzentrationen stiegen im Durchschnitt an, eine statistische Signifikanz war jedoch nicht nachweisbar (siehe Tabelle 22). Die durchschnittlichen AMH-Konzentrationen bei erster und zweiter AMH- Messung sortiert nach einzelnen Altersgruppen sind in Tabelle 23 und Abbildung 5 dargestellt. In der Gruppe der 15- bis 18-Jährigen stieg AMH zwischen der ersten und zweiten Messung signifikant an. Tab. 22: AGS-Gruppe: AMH-Konzentrationen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) bei erster und zweiter Messung N Alter AMH p AMH ,3 28,0 ± 18,5 AMH ,0 31,7 ± 20,9 P=0,057

48 AMH-Mittelwerte [pmol/l] 48 Tab. 23: AMH-Konzentrationen (pmol/l; Mittelwert ± Standardabweichung) bei erster (AMH 1) und zweiter Messung (AMH 2) sortiert nach Altersgruppen Altersgruppen N AMH 1 AMH 2 P 2,0 7,9 Jahre 1 12,0 20,4-8,0 11,9 Jahre 9 33,2 ± 22,9 39,0 ± 28,8 n.s. 12,0 14,9 Jahre 5 32,0 ± 19,8 28,5 ± 18,5 n.s. 15,0 17,9 Jahre 5 18,1 ± 8,95 26,6 ± 9,02 P=0,013 18,0 26,9 Jahre 3 27,9 ± 14,2 26,9 ± 13,4 n.s AMH-Messung 2. AMH-Messung ,0 7,9 Jahre 8,0 11,9 Jahre 12,0 14,9 Jahre 15,0 17,9 Jahre 18,0 26,9 Jahre Alter (Jahre) Abb. 5: AMH-Mittelwerte (pmol/l) bei erster und zweiter AMH-Messung sortiert nach Altersgruppen

49 Referenzgruppe Es konnten keine signifikanten AMH-Unterschiede zwischen den verschiedenen Diagnose-, Alters- und BMI-Untergruppen und den verschiedenen Tanner-Stadien gefunden werden (Diagnose-, Alters- und BMI-Untergruppen mit jeweiligen Mittelwerten und Standardabweichungen siehe Tabellen 24, 25 und 26). Eintritt von Menarche und Pubertät sowie die Einnahme von Kontrazeptiva hatten keine signifikanten Auswirkungen auf die Höhe von AMH. Die Untersuchung der AMH-Mittelwerte zwischen adipösen (N=7, AMH 21,8 ± 14,4 pmol/l) und nicht-adipösen (N=38, AMH 30,6 ± 17,6 pmol/l) Mädchen ergab keine signifikanten Unterschiede (p = 0,21). Die Korrelation der AMH-Werte mit dem chronologischen Alter, Alter bei Menarche, Zeitintervall zwischen Menarche und AMH-Messung, Körpergröße, Körpergewicht und Body-Mass-Index ergab keine signifikanten Ergebnisse. Bei Selektion präpuberaler bzw. puberaler Mädchen ließen sich ebenfalls keine Korrelationen zwischen Alter und AMH feststellen. Tab. 24: Referenzgruppe: AMH-Konzentrationen (pmol/l, Mittelwert ± Standardabweichung) in Relation zu den verschiedenen Diagnose-Untergruppen Diagnose N % AMH Range Adipositas 7 15,6 23,2 ± 14,9 4,9 48,0 Hochwuchs 6 13,3 20,0 ± 8,39 12,5 32,1 Kleinwuchs 15 33,3 34,6 ± 15,5 6,4 61,7 Hyperthyreose 4 8,90 23,6 ± 5,76 17,2 28,6 Kleinwuchs mit GH- Therapie 13 28,9 32,3 ± 23,4 10,8 87,2 Differenz der Mittelwerte: n.s.

50 50 Tab. 25: Referenzgruppe: AMH-Konzentrationen (pmol/l, Mittelwert ± Standardabweichung) in Relation zum Alter Alter N % AMH Range 2,0 7,9 Jahre 6 13,3 30,7 ± 16,7 6,4 59,0 8,0 11,9 Jahre 19 42,2 27,5 ± 13,9 10,3 61,7 12,0 14,9 Jahre 15 33,3 32,2 ± 23,7 4,9 87,2 15,0 17,9 Jahre 5 11,1 25,5 ± 6,92 16,7 33,7 Gesamt ,3 ± 17,3 4,9 87,2 Differenz der Mittelwerte: n.s. Tab. 26: Referenzgruppe: Verteilung der Gewichtskategorien und zugehörige AMH-Konzentrationen (pmol/l, Mittelwert ± Standardabweichung) Gewichtsgruppe N % AMH-MW Range Starkes Untergewicht 3 6,7 28,4 ± 28,8 10,7 61,7 Leichtes bis mäßiges Untergewicht 7 15,6 24,6 ± 18,6 6,4 59,0 Normalgewicht 20 40,0 35,7 ± 17,9 12,6 87,2 Übergewicht 8 20,0 24,1 ± 8,61 12,5 36,9 Adipositas 7 17,8 21,8 ± 14,4 4,9 48,0 Gesamt ,0 29,3 ± 17,3 4,9 87,2 Differenz der Mittelwerte: n.s.

51 AGS-Gruppe (Kinder und Jugendliche) im Vergleich zur Referenzgruppe Tab. 27: AMH-Konzentrationen (pmol/l, Mittelwerte ± Standardabweichungen), Minima und Maxima von AGS- und Referenzgruppe Zwischen der AGS- und der Referenzgruppe konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede in den AMH-Konzentrationen gefunden werden (s. Tabelle 27). Bei der AGS-Gruppe lag eine stärkere Streuung der Werte vor (s. Abbildungen 6 und 7). Bei selektiver Betrachtung der AGS-Mädchen mit schlecht eingestellter Therapie (N=19) ergab sich kein AMH-Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Präpuberale AGS-Patientinnen unterschieden sich in ihren AMH- Werten nicht von präbuberalen Mädchen in der Referenzgruppe, ebenso wenig unterschieden sich puberale Mädchen beider Gruppen voneinander. Auch die Selektion nach Eintritt der Menarche ergab keine AMH-Differenzen. N AMH Minimum Maximum AGS 32 33,5 ± 22,4 2,20 109,0 Kontrollgruppe 45 29,3 ± 17,3 4,90 87,2 Differenz der Mittelwerte n.s.

52 52 Abb. 6: Punktediagramm der Werteverteilung von AMH (pmol/l) abhängig vom Alter (Jahre) bei AGS- und Kontrollgruppe