Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie Ruhr-Universität Bochum

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1 Inhaltsverzeichnis 1. Anschrift und Telefonnummern 2 2. Verzeichnis der untersuchten Erreger (in alphabetischer Reihenfolge) 3 3. Untersuchungsmaterial, Probennahme und transport, Probenannahmekriterien Untersuchungsmaterial und Probenahme Anforderungsformular Probentransport Kriterien der Probenannahme 8 4. Untersuchungshäufigkeit, Notfalluntersuchungen, Probenarchivierung, Wiederholungsmessungen, Unteraufträge Untersuchungshäufigkeit Notfalluntersuchungen Probenarchivierung und Nachforderungen Medizinische Validierung, Wiederholungsmessungen, 11 Befundübermittlung und Meldepflicht 4.5 Vergabe von Unteraufträgen Verdacht auf Pocken, haemorrhagisches Fieber und 12 andere in den Tropen vorkommende Erkrankungen 5. Untersuchungsprogramm Erreger, alphabetisch geordnet Erreger, nach Methoden geordnet Testprinzipien, Vor- und Nachteile 27 der durchgeführten Methoden 6. Abkürzungen Literatur 33 1

2 1. Anschrift und Telefonnummern Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie Geb. MA 6/134 Universitätsstr Bochum Direktor: Prof. Dr. med. K. Überla Homepage: Telefon Fax Sekretariat: Diagnostiklabor/ Probenannahme: Rufbereitschaft: Normale Dienstzeiten: Montag Freitag: Montag + Dienstag: Mittwoch Freitag : Uhr (Diensthabender) Uhr (Labor) Uhr (Labor) Rufbereitschaft: Montag Freitag: Samstag, Sonntag: Uhr Uhr Besondere Regelungen, die sich im Zusammenhang mit aktuellen virologisch diagnostischen Erfordernissen (z.b. H1N1-PCR) ergeben, entnehmen Sie bitte unserer homepage Diagnostik Formulare und Informationen Diagnostik aktuell 2

3 2. Verzeichnis der untersuchten Viren (in alphabetischer Reihenfolge) Adenoviren Coxsackieviren ECHO-Viren Epstein-Barr-Virus (EBV) Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME) Hepatitis-A-Virus (HAV) Hepatitis-B-Virus (HBV) Hepatitis-C-Virus (HCV) Herpes-simplex-Virus Typ 1 und 2 (HSV 1/2) Humanes Herpes-Virus Typ 6 (HHV-6) Humanes Immundefizienz-Virus 1 und 2 (HIV 1/2) Influenzavirus Typ A und B Lymphozytäres Choriomeningitisvirus (LCMV) Masernvirus Mumpsvirus Papillomaviren Parainfluenzavirus Typ 1, 2 und 3 Parvovirus B19 Poliovirus Typ 1, 2 und 3 Polyomaviren (BK und JC) Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) Rötelnvirus Rotavirus Varicella-Zoster-Virus (VZV) Zytomegalie-Virus (CMV) 3

4 3. Untersuchungsmaterial, Probenahme und -transport sowie Probenannahmekriterien 3.1 Untersuchungsmaterial und Probenahme Probenmaterial Entnahmetechnik Volumen und Transportgefäß Transport Abstrich von Haut, Schleimhaut, Rachen, Auge (bitte Lokalisation angeben!) mit sterilem Tupfer (evtl. mit steriler physiol. Kochsalzlösung angefeuchtet) Abstrich entnehmen; darauf achten, dass Material möglichst zellreich ist sterilen Tupfer in Röhrchen mit 1 ml steriler physiolog. Kochsalzlösung geben, keine bakteriologischen Transportmedien (Agar) verwenden! möglichst rasch dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank Cervixabstrich Cytobrush Cytobrush-Transportgefäß möglichst rasch dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank Biopsie, Probeexcision (PE) (bitte Organ angeben!) in steriles Röhrchen geben, mit geringer Menge steriler physiolog. NaCl vor dem Eintrocknen schützen (kein Formalin!, kein Alkohol) Einfrierröhrchen (1,8 ml) möglichst rasch dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank Bläscheninhalt mit einer Tuberkulinspritze Bläschen punktieren und Flüssigkeit abziehen (Mengen können sehr gering sein) geringe Menge sterile physiolog. Kochsalzlösung aufziehen und in steriles Röhrchen geben, zur Not auch Spritze direkt einsenden möglichst rasch dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank Blut für Antikörpertests Venenpunktion röhrchen (z. B. Monovette o. ä., pro Test ca. 0,5 ml Vollblut rechnen) keine Kühlung notwendig, bei längerem Transport (> 24 Std.) möglichst bereits abzentrifugiertes einsenden Blut für Nukleinsäurediagnostik aus (HBV, HCV-Virus load) Venenpunktion mind. 3 ml, für HBV-DNA oder HCV-RNA (monovette) keine Kühlung notwendig, Transport möglichst rasch, maximal 24 Std. Transportzeit Blut für Nukleinsäurediagnostik aus Plasma (HIV-Virus load, Resistenztestung) Venenpunktion EDTA-Röhrchen (z. B. Monovette, mind. 3 ml), auf richtiges Mischungsverhältnis von Blut und EDTA achten, d.h. Monovetten vollständig füllen keine Kühlung notwendig, Transport möglichst rasch, maximal 24 Std. Transportzeit Blut für Leukozytenseparation (z. B. CMV-DNA, CMVpp65-Antigen, EBV- DNA, HHV-6-DNA) Venenpunktion EDTA-Röhrchen (z. B. Monovette, mind. 3 ml), auf richtiges Mischungsverhältnis von Blut und EDTA achten, d.h. Monovetten vollständig füllen keine Kühlung notwendig, Transport möglichst rasch, maximal 24 Std. Transportzeit, pp65 maximal 4 Std. 4

5 Probenmaterial Entnahmetechnik Volumen und Transportgefäß Transport Bronchoalveoläre Lavage (BAL) Teil der gewonnenen Flüssigkeit in steriles Röhrchen überführen 1-10 ml in sterilem Röhrchen möglichst rasch, dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank fetales Blut ultraschallgesteuerte Punktion EDTA-Blut-Röhrchen, mind. 0,5 ml möglichst rasch, bitte telefonisch ankündigen Fruchtwasser ultraschallgesteuerte Punktion mind. 2 ml in sterilem Röhrchen Glaskörperpunktat Gelenkpunktat Knochenmarkaspirat Liquor Punktate (Pleura- Perikard-, Aszites) Rachenspül- oder Gurgelwasser Stuhl Trachealsekret Urin in steriles Röhrchen überführen in steriles Röhrchen überführen in EDTA-Blutröhrchen, kein Heparin als Antikoagulans (!) nach Lumbalpunktion in steriles Röhrchen überführen in steriles Röhrchen überführen mit 3 10 ml physiolog. steriler NaCl gurgeln lassen, in Röhrchen überführen bohnengroße Mengen in Stuhlröhrchen überführen, bei flüssigem Stuhl ca. 2-3 ml mit entsprechendem Absauger gewinnen Urin (Spontanurin, Katheter- oder Beutelurin) in steriles Gefäß überführen steriles Gefäß mit Schraubverschluss steriles Gefäß mit Schraubverschluss mind. 3 ml in EDTA-Röhrchen möglichst 1 ml in sterilem Gefäß mind. 3 ml in sterilem Gefäß 3 10 ml (steriles) Röhrchen spezielle Stuhlröhrchen benutzen 1 3 ml in sterilem Röhrchen 3 10 ml in sterilem Röhrchen möglichst rasch, bitte telefonisch ankündigen möglichst rasch, dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank möglichst rasch, dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank möglichst rasch, dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank keine Kühlung notwendig, Transport möglichst rasch, maximal 24 Std. Transportzeit möglichst rasch, dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank möglichst rasch, dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank ungekühlt, Postversand möglich möglichst rasch, dann ist Kühlung unwichtig, kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank Urin für Virusisolierung umgehend, nicht kühlen, ansonsten kurzfristige Lagerung (einige Stunden) im Kühlschrank möglich 5

6 3.2 Anforderungsformular Die Anforderung von diagnostischen Untersuchungen erfolgt durch unser Anforderungsformular (s. Anhang). Anforderungsformulare können auch von unserer Homepage ( als PDF-Datei heruntergeladen werden Bitte unbedingt Entnahmezeitpunkt und Erkrankungsdatum, Materialart und gewünschte Untersuchung angeben! Bitte Einsendestempel, Name des verantwortlichen Arztes und Unterschrift, sowie eine Telefon-/ oder Piepernummer für Rückfragen nicht vergessen. Nicht eindeutig ausgefüllte Anforderungsscheine können nicht bearbeitet werden! Klinische Angaben zum Patienten sind in jedem Fall auch für die Befundinterpretation hilfreich. Notfall/Eilanforderungen können nur nach telefonischer Ankündigung im Diagnostiklabor ( ) bzw. außer den normalen Dienstzeiten nach Rücksprache mit dem diensthabenden Arzt durchgeführt werden! 3.3 Probentransport allgemeine Hinweise Grundsätzlich sollte für den schnellstmöglichen Transport des Untersuchungsmaterials gesorgt werden (Transportbedingungen siehe Tabelle). Die, an unser Labor einzusendenden Proben gehören nach Gefahrgutrecht i.d.r. zur Kategorie B (WHO). Die offizielle Beförderungsbezeichnung lautet ab : Biologischer Stoff, Kategorie B (vormals: Diagnostische Probe). Sie sind der UN-Nr.: 3373 zuzuordnen. Die Verpackungen für medizinische Untersuchungsmaterialien müssen grundsätzlich so beschaffen sein, dass sie allen üblicherweise beim Transport auftretenden Belastungen 6

7 standhalten und jegliches Freisetzen des Inhalts verhindert wird. Sie sollten aus drei Bestandteilen bestehen: a) ein wasserdichtes Primärgefäß (Monovette) b) eine wasserdichte Sekundärverpackung c) eine ausreichend feste Außenverpackung die Sekundär- oder die Außenverpackung sollte starr sein.(s. Verantwortlich für die gewissenhafte Einhaltung aller gefahrgutrechtlichen Bestimmungen beim Versand medizinischer Untersuchungsmaterialien ist grundsätzlich der Absender. Die Anforderungsscheine sind von den Proben getrennt, d.h. außerhalb der Proben- Umverpackung zu versenden, um eine Kontamination des Scheines durch Probenmaterial zu verhindern! Außerdem sollten die Anforderungsscheine so verpackt sein, dass eine Einsichtnahme in Patientendaten durch den Botendienst nicht möglich ist. (Datenschutz). Es wird darauf hingewiesen, dass nicht richtig verpackte Proben nicht bearbeitet werden können! Bei Abnahme der Proben am späten Nachmittag oder abends, sowie vor dem Wochenende oder am Feiertag sollten diese beim Einsender bei 4 C gelagert und erst am darauf folgenden Werktag versendet werden, wobei und Plasma innerhalb von 6 Stunden vom Blutkuchen getrennt werden sollten. (Bei instabilem Material - z.b. Granulozyten für CMV-pp65-Bestimmung - ist eine Untersuchung allerdings bereits nach 1 Tag nicht mehr sinnvoll.) Untersuchungsverfahren Materialien Transport Antigennachweis : -Direktnachweis von Virusproteinen mittels IFT -oder Immunperoxidase (pp65) -Antigen ELISA Abstriche, BAL, Rachenspülwasser, Sputum, Trachealsekret EDTA-Blut (Leukozyten) Schnellstmöglicher Transport; wenn möglich, gekühlt! Untersuchung sollte innerhalb 24 h nach Abnahme erfolgen können! Antikörpernachweis : IgG/IgM (ELISA), KBR, EDTA -Blut, Liquor Schnellstmöglicher Transport; wenn möglich, gekühlt! 7

8 Nukleinsäurenachweis Virusisolierung Abstriche, Aszites, BAL, Biopsie, Bläscheninhalt, EDTA-Blut, Erbrochenes, Fruchtwasser, Gelenkflüssigkeit, Knochenmark, Liquor, Plasma, Rachenspülwasser,, Sputum, Stuhl, Trachealsekret, Urin Abstriche, (Aszites), BAL, (Biopsie), Bläscheninhalt, (EDTA-Blut, Fruchtwasser), Rachenspülwasser, Sputum, Stuhl, Trachealsekret, Urin, etc. Schnellstmöglicher Transport (max. 6 Stunden!), wenn möglich gekühlt! Ausnahme: Myocardbiopsie bitte vorher ankündigen! Nach Entnahme auf Flüssig-N2 oder Trockeneis zum Versand bringen! Schnellstmöglicher Transport! Material darf nicht eingefroren werden! 3.4 Kriterien der Probenannahme Proben können im Regelfall nur in den normalen Dienstzeiten angenommen werden: Montag Freitag 7:30 16:00 Uhr. Notfälle, die noch am selben Tag bearbeitet werden sollen, müssen telefonisch angekündigt werden ( ) und das Labor bis spätestens 13:00 Uhr erreichen! (EDTA-Blut für CMV-pp65 muss bis spätestens 14:00 Uhr eingehen!). Das Labor ist nach 16:00 Uhr sowie an Wochenenden und Feiertagen regulär nicht besetzt. In dringenden Fällen außerhalb der normalen Dienstzeit bitte zunächst die Rufbereitschaft benachrichtigen ( ) und den Versand der Probe besprechen. Ein Untersuchungsauftrag wird abgelehnt, wenn das Material: nicht eindeutig zugeordnet werden kann (eindeutige Probenkennzeichnung!), für die jeweilige Untersuchung unbrauchbar ist (z.b. falsches Material), für die jeweilige Untersuchung nicht ausreicht, fehlerhaft transportiert wurde (z.b. nicht genügend gekühlt oder im bakteriologischen Gelröhrchen versandt wurde), zu alt ist, nicht richtig verpackt wurde. 8

9 Ein Untersuchungsauftrag kann ebenfalls abgelehnt werden, wenn der Anforderungsschein nicht richtig ausgefüllt worden ist. Gekennzeichnete Proben ohne Auftrag werden, soweit stabil, max. 5 Tage kühl gelagert (Liquor wird eingefroren), um eine nachträgliche Auftragsbearbeitung zu ermöglichen. Die Abteilung für Virologie behält sich zudem vor, einzelne Tests aus bestimmten Proben u. U. nicht durchzuführen, wenn kein valides Ergebnis zu erwarten ist. So führt z.b. stark hämolytisches, ikterisches oder lipämisches zu falschen Ergebnissen in ELISA-Testsystemen Blut im Liquor zu einem verfälschten -Liquor Quotienten von Antikörpern langer, unsachgemäßer Transport zu einer Degradation von RNA/ DNA und damit zu einem falsch negativen Ergebnis des Nukleinsäurenachweisverfahren Einfrieren der Proben zerstört intakte Virionen, so dass eine Anzucht nicht mehr gelingt. 4. Untersuchungshäufigkeit, Notfalluntersuchungen, Probenarchivierung, Wiederholungsmessungen, Unteraufträge 4.1 Untersuchungshäufigkeit In dringenden Fällen bitte telefonische Rücksprache mit dem Labor (Tel.: ), bzw. dem diensthabenden Arzt ( ) 9

10 Serologische Untersuchungen Alle Serologischen Untersuchungen wie ELISA, IFT (Immunfluoreszenztest) und KBR werden in der Regel zweimal wöchentlich (MO + MI) durchgeführt. Die Untersuchungen auf Enteroviren (Coxsackie B1 B5, A9; Echo 3, 6, 7, 11, 30 und Polio 1, 2, 3) im Neutralisationstest werden immer freitags angesetzt, die Auswertung erfolgt am Dienstag der darauffolgenden Woche. Alle Proben, die bis ca. 9:00Uhr des Ansatztages im Labor angenommen werden, gehen noch in den Testansatz des gleichen Tages ein. Virusdirektnachweis/ Antigennachweis/ Virusisolierung Der Nachweis von Virusantigenen in Nasen-/Rachenabstrichen, BAL, Rachenspülwasser, etc. mittels indirekter Immunfluoreszenz erfolgt täglich (Montag Freitag). Der Nachweis von CMV pp65 Antigen in Leukozyten (EDTA-Blut) erfolgt ebenfalls arbeitstäglich. Nukleinsäurenachweis Der Nachweis von Nukleinsäuren erfolgt nach Bedarf, Einzeluntersuchungen werden spätestens innerhalb von 5 Arbeitstagen angesetzt. HSV-Nachweise aus Liquores werden werktags innerhalb von 24 Stunden durchgeführt. Sollten aufgrund außergewöhnlicher Anforderungen, z.b. H1N1-Nachweise besondere Regelungen hinsichtlich der Bearbeitungszeiten getroffen werden, finden Sie diese auf unserer hompage Diagnostik Formulare und Informationen Diagnostik aktuell 4.2 Notfalluntersuchungen Dringende Untersuchungen während der Dienstzeiten werden bevorzugt durchgeführt und, wenn möglich, noch am selben Tag bearbeitet. 10

11 Voraussetzung ist jedoch die telefonische Absprache mit dem Labor (Tel.: ) sowie die schnellstmögliche Anlieferung des Untersuchungsmaterials! Das Untersuchungsmaterial sollte, wenn möglich bis spätestens Uhr das Labor erreichen! (EDTA-Blut für CMV-pp65 muss bis spätestens Uhr im Labor eingehen!) Auf dem Anforderungsschein ist die Eilprobe als Notfall zu kennzeichnen. Die Befundübermittlung erfolgt nach analytischer und medizinischer Beurteilung und anschließender Freigabe vorab telefonisch oder per FAX unter der Voraussetzung, dass ausreichender Datenschutz gewährleistet ist. Die Abteilung hält eine Rufbereitschaft außerhalb der regulären Dienstzeiten vor. Diese Rufbereitschaft (Tel.: ) existiert nur für genuine Notfälle, z.b. Verdacht auf HSV-Enzephalitis, lebensbedrohliche Pneumonien oder bei begründetem Verdacht auf eine (ggf. meldepflichtige) Viruserkrankung, bei der eine Diagnostik so schnell wie möglich erfolgen muss. In Absprache mit der Rufbereitschaft werden die außerhalb der Dienstzeiten durchführbaren Untersuchungen vereinbart. 4.3 Probenarchivierung und Nachforderungen Nach Abschluss der Untersuchungen werden die Proben in Abhängigkeit von ihrer Stabilität aufbewahrt., Plasma und Liquor werden zunächst (max. 2 Wochen) bei 4 C zwischengelagert. In dieser Zeit können weitere Untersuchungen sowie Kontrolluntersuchungen nachgefordert werden. Die Stabilität des gelagerten Materials bezüglich der jeweils nachgeforderten Untersuchung (z.b. IgM-Nachweis oder Nukleinsäurenachweis) ist zu prüfen. Danach werden diese Proben bei -20 C für mindestens 3 Monate eingefroren. 11

12 DNA- und RNA-Präparationen werden direkt nach der Bearbeitung bei -20 C bzw. -80 C (RNA) eingefroren und für mindestens 3 Monate archiviert. EDTA-Blut (2 Tage bei 4 C) und Anzuchtmaterial (tiefgefroren) wird nur bis zum endgültigen Befund für eventuelle Nachuntersuchungen aufbewahrt. In Ausnahmefällen können gewisse Untersuchungen auch aus bereits archivierten Proben telefonisch oder schriftlich nachgefordert werden. 4.4 Medizinische Validierung, Wiederholungsmessungen, Befundübermittlung und Meldepflicht Im Rahmen der medizinischen Validierung erfolgt sowohl eine Plausibilitätskontrolle der Einzel-Ergebnisse als auch die Beurteilung der Ergebnisse eines Auftrages in ihrer Gesamtheit im Zusammenhang mit klinischen Angaben über den Patienten. Bei Auftreten eines analytischen Fehlers sowie bei auffälligen Messwerten, werden zur Kontrolle des Ergebnisses Wiederholungsbestimmungen durchgeführt. In der Regel wird das Ergebnis zunächst im selben Testsystem noch einmal überprüft. Falls nötig, wird zur Kontrolle bzw. Bestätigung des Ergebnisses ein 2. Testsystem oder auch eine andere Untersuchungsmethode herangezogen. Auffällige Ergebnisse (z.b. HCV-ELISA wiederholt positiv) sowie Befunde mit offensichtlich therapeutischer Konsequenz werden vorab per Telefon mitgeteilt. Meldepflichtige Befunde werden an das zuständige Gesundheitsamt, HIV positive Immunoblot-Ergebnisse anonym auf dem entsprechenden Meldebogen ans Robert-Koch-Institut in Berlin gemeldet. Der Nachweis krankenhaushygienisch relevanter Erreger wird dem Einsender umgehend telefonisch oder per Fax mitgeteilt. 12

13 4.5 Vergabe von Unteraufträgen Untersuchungsaufträge, die in der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie nicht durchgeführt werden können, werden an ein entsprechendes Referenz- oder Konsiliarlabor weitergeleitet. Diese Untersuchungen sind im Leistungsverzeichnis gekennzeichnet. 4.6 Verdacht auf Pocken, Haemorrhagisches Fieber und andere in den Tropen vorkommende Erkrankungen Proben von Patienten, bei denen der Verdacht auf eine Infektion mit einem humanpathogenen Erreger der Risikogruppe 4 (siehe untenstehende Liste) besteht, werden in unserem Labor nicht angenommen. Die Untersuchung dieser Proben darf nur in einem Institut mit S4-Labor erfolgen, Wir bitten daher unsere Einsender, direkt Kontakt mit einem der nachfolgend aufgeführten Institute und deren Ansprechpartner aufzunehmen, die Probe dort anzumelden und die Möglichkeiten des Transports zu klären. Kontakt: Prof. Dr. med. Bernhard Fleischer Bernhard-Nocht-Str Hamburg Tel.: 040/ (24-stündige Rufbereitschaft) Prof. Dr. S. Becker/ Dr. Markus Eickmann Hans-Meerwein-Str Marburg Tel.: 06421/ oder Mobiltelefon: 0172/ /

14 Liste der humanpathogenen Viren der Risikogruppe 4 gemäß Biostoffverordnung: Ebolavirus (hämorrhagisches Fieber) Guanaritovirus (Venezuelsnisches Fieber) Juninvirus (Argentinisches hämorrhagisches Fieber) Krim-Kongo-Fieber Virus (hämorrhagisches Fieber) Lassavirus (hämorrhagisches Fieber) Machupovirus (Bolivianisches hämorrhagisches Fieber) Marburgvirus (hämorrhagisches Fieber) Morbillivirus des Pferdes (Paramyxo-ähnliches Pferdevirus) Pockenviren (Variola-Major- und Variola-Minor-Virus) Sabiavirus (Brasilianisches hämorrhagisches Fieber 14

15 5. Untersuchungsprogramm 5.1 Erreger, alphabetisch geordnet Adenoviren Antigennachweis: -direkter IFT Infektionen des Auges, der Atemwege Augen-, Rachenabstrich Nachweis beweisend für ursächl. Beteiligung von Adenoviren. Auge: häufig Serotypen 3, 4, 8, 19, 37. Bei positivem Befund bitte Meldepflicht beachten! Atemtrakt: häufig Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 7 Nukleinsäure-Nachweis DNA qualitativ Infektion der Atemwege, des Auges, des Gastrointestinaltraktes und Urogenitaltraktes disseminierte Infektionen bei immunsupprimierten Patienten; V. a. Infektion des ZNS Abstriche, BAL, Gurgelwasser, (Biopsiematerial, Stuhl, Urin) (EDTA-Blut, ) (Liquor) Nachweis von Adenovirus ätiologisch signifikant Systemischer Nachweis diagnostisch wegweisend Pos. Nachweis im Liquor ätiologisch signifikant KBR Verdacht auf Adenovirusinfektion Erhöhte Titer ab 1: 32 häufig bei akuter Infektion. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. Coxsackieviren s. Enteroviren ECHO-Viren s. Enteroviren 15

16 Enteroviren (Coxsackieviren Typ A und B, ECHO-Viren) Nukleinsäurenachweis RNA qualitativ Sommergrippe ; Myalgien; Myocarditis; Meningitis; Exantheme; Hand-Mund-Fuß- Erkrankung; haemorrhagische Konjunktivitis Liquor (Stuhl, Abstriche Bläscheninhalt, Augenabstrich, Bläscheninhalt, Endomyokardbiopsien) z.b. haemorrhag. Konjunktivitis: Coxsackie A Typ 24 Enterovirus Typ 70 Hand-Mund-Fuß-Erkrankung: Coxsackie A Typ 16 Enterovirus Typ 71 Meningitis: Coxsackie A Typ 7, Coxsackie B ECHO Viren (z.b. Typ 30) Enteroviren Typ Antikörpernachweis NT s.o. Erhöhte Titer ab 1: 256 kompatibel mit Infektion. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. Epstein-Barr-Virus Antikörpernachweis, 2 : VCA IgG/IgM, EBNA-IgG Early-Ag-IgG Bestätigung/Ausschluss einer Mononukleose; EBV Status vor Transplantation; V.a. EBV-Reaktivierung bei immunsupprimierten Patienten Frische Infektion: VCA IgM u. IgG positiv bei negativem EBNA-IgG und positivem Early-Ag-IgG Abgelaufene Infektion: VCA IgM negativ VCA IgG + EBNA IgG positiv Reaktivierung: VCA IgM +IgG positiv EBNA IgG positiv Nukleinsäurenachweis DNA quantitativ 1 V. a. ZNS-Infektion Liquor Positiver Nachweis im Liquor ätiologisch signifikant. V. a. EBV-Lymphom / Lymphoproliferation bei immunsupprimierten Patienten (PTLD); Lymphome bei Immunsuppression; (auch ZNS Lymphome) 16 EDTA-Blut, (BAL, Biopsie, Knochenmark, Trachealabstrich/ -sekret) Bei V.a. PTLD bitte EDTA-Blut (Lymphozyten) einsenden - Werte müssen hier im Verlauf interpretiert werden. Interpretation oft schwierig und nur im Zusammenhang mit Pathologie aussagekräftig. EBV im Liquor deutet auf pathologischen Prozess hin.

17 Frühsommer-Meningoencephalitis-Virus IgG/IgM, KBR V. a. Infektion; Impfstatus Bei negativem Befund nach Zeckenbiss-Anamnese Kontrollserum in 2 Wochen untersuchen. Kreuzreaktion mit anderen Flaviviren möglich, z.b. Gelbfieber- Impfung! Hepatitis-A-Virus (HAV) IgG/IgM Bestätigung/ Ausschluss akuter HAV-Infektion; Überprüfung des Impfstatus IgG + IgM positiv: Akute Infektion Bei Verdacht auf akute Infektion bitte Meldepflicht beachten! IgG positiv/ IgM negativ: - Zustand nach Impfung - abgelaufene Infektion mit Immunität -Leihtiter 17

18 Hepatitis-B-Virus (HBV) Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie Antigennachweis (ELISA): HBsAg Bestätigung/ Ausschluss einer akuten/ chronischen HBV-Infektion bzw. der Infektiosität positiv während der akuten Infektion. Persistiert bei chronischer Infektion HBeAg ² Nachweis hoher Virämie/Infektiosität Nachweis hoher Infektiosität, positiv während akuter/chron. Infektion bei hoher Viruslast anti-hbc IgG Bestätigung/ Ausschluss einer abgelaufenen Infektion Marker für erfolgte HBV- Infektion (sowohl ausgeheilt wie chron. Infektion), falsch positive Ergebnisse möglich anti-hbc IgM ² Unterscheidung akuter/ chronischer Infektion Marker der akuten bzw. reaktivierten Infektion (selten) Bei Verdacht auf akute Infektion bitte Meldepflicht beachten! anti-hbs Nachweis der Immunität (Impfkontrolle); Nachweis abgelaufener, ausgeheilter Infektion Nachweis der Immunität/ Rekonvaleszenz Immunität besteht bei einem Titer > 10 U/l anti-hbe ² Verlauf der Infektion Anti-HDV ² Bestätigung/Ausschluss einer Koinfektion mit HDV Hinweis auf reduzierte Infektiosität und günstigen Verlauf Bestätigung/Ausschluss einer Koinfektion mit HDV Nukleinsäurenachweis DNA quantitativ 1 Genotypischer Resistenztest Überwachung der Therapie; Überwachung der Infektiosität ; Bestätigung einer HBV- Infektion bei unklarer Serologie Therapieversagen; Therapiewechsel (EDTA-Blut) (EDTA-Blut) Berücksichtigung der Medikamentenhistorie und der Virusbeladung 18

19 Hepatitis-C-Virus (HCV) IgG Bestätigung/Ausschluss einer HCV-Infektion positiver anti HCV screening Test ohne HCV -RNA- Nachweis deutet auf inaktive ' Infektion Nukleinsäurenachweis RNA quantitativ 1, ² Nachweis der Virämie, Infektiosität, Überwachung der Therapie (EDTA-Blut) Positiver Nachweis deutet auf aktive Infektion hin! Bei Verdacht auf aktive Infektion bitte Meldepflicht beachten! Herpes-simplex-Virus Typ 1, 2 (HSV 1/2) IgG/IgM ² V. a. HSV-Infektion oder -Reaktivierung bei Primärinfektion und Reaktivierung meist IgG und IgM positiv KBR Antigennachweis: direkter IFT V. a. HSV-Infektion oder -Reaktivierung V.a. HSV-Infektion oder Reaktivierung; HSV-verdächtige Bläschen; Gingivostomatitis; V.a. disseminierte Infektion bei immunsupprimierten Patienten Augenabstrich, Rachenspülwasser, Schleimhautabstrich, BAL, Trachealsekret erhöhte KBR Titer ab 1:64 kompatibel mit Primär-Infektion oder Reaktivierung. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion oder Reaktivierung geben. Achtung: Kreuzreaktion mit VZV möglich. direkter Erregernachweis: Nachweis HSV-infizierter Zellen Nukleinsäurenachweis DNA qualitativ HSV-verdächtige Bläschen V.a.Meningoencephalitis V.a. disseminierte Infektion bei immunsupprimierten Patienten Abstriche, (BAL, Bläscheninhalt, Trachealsekret) Liquor (EDTA-Blut) Positiver Nachweis deutet auf aktive Infektion hin. Positiver Nachweis im Liquor ätiologisch signifikant. 19

20 Humanes Herpes-Virus 6 (HHV-6) IgG/IgM Nukleinsäurenachweis DNA qualitativ Verdacht auf HHV6-Infektion/ Reaktivierung; Exanthema subitum Immunsupprimierte Patienten mit Fieber, Panzytopenie; Differentialdiagnose zu CMVbedingten Erkrankungen bei Immunsupprimierten EDTA-Blut IgM-Nachweis oft unsicher erhöhte HHV 6-Last bei Imunsupprimierten als Ursache für Symptome, wie sie auch bei einer CMV-Erkrankung auftreten V. a. ZNS-Infektion (Liquor) Positiver Nachweis ätiologisch signifikant Humanes Herpes-Virus 8 (HHV-8) IgG Verdacht auf Kaposi-Sarkom Humanes Immundefizienz-Virus Typ 1 und 2 (HIV-1/2) Antikörpernachweis IgG ² V. a. HIV-Infektion Screening Test, positives Ergebnis allein nicht beweisend für HIV-Infektion! Bestätigungstest (Immunoblot) erforderlich. Nukleinsäurenachweis RNA quantitativ 1 Bestimmung der Viruslast Therapieüberwachung; EDTA-Blut Genotypischer Resistenztest Therapieversagen, Erstmaliger Beginn der Therapie EDTA-Blut Berücksichtigung der Medikamentenhistorie und der Virusbeladung 20

21 Influenzavirus Typ A und B KBR V. a. Influenza-Infektion Erhöhte KBR Titer ab 1: 32 kompatibel mit frischer Infektion. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. Nukleinsäurenachweis RNA qualitativ V. a. Influenza-Infektion BAL, Gurgelwasser, Abstrich Influenza-RNA-Nachweis bei passender Symptomatik ätiologisch signifikant Lymphozytäre Choriomeningitisvirus (LCMV) KBR² Verdacht auf LCMV-Infektion Erhöhte KBR Titer ab 1: 32 kompatibel mit frischer Infektion. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. Masernvirus IgG/IgM ² V. a. Maserninfektion; Immunstatus; Bei Verdacht auf Masern- Infektion bitte Meldepflicht beachten! Pos. IgM oder signifikanter Anstieg des IgG- Titers spricht für akute Infektion. Subakute sklerosierende Panencephalitis (SSPE) Extrem hohe IgG-Spiegel bei SSPE. 21

22 Mumpsvirus IgG/IgM V. a. Mumpsinfektion, - Parotitis - Orchitis - Pankreatitis - Meningitis; Impfstatus IgG/IgM Titeranstieg bei akuter Infektion KBR V.a. Mumpsinfektion Erhöhte KBR Titer ab 1: 32 kompatibel mit frischer Infektion. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. Papillomaviren Nukleinsäurenachweis DNA qualitativ V. a. Zervix-CA, Papillomatöse Haut- und Schleimhautläsionen unklarer Genese Abstrich, (Biopsie) Typisierung V. a. Zervix-CA s. o. Nachweis der häufigsten highrisk Typen, 16, 18, 31, 33, 45 und low-risk Typen 6 und 11. Parainfluenzavirus Typ 1, 2, und 3 Antikörpernachweis KBR Respiratorischer Infekt bei Säuglingen, Kleinkindern Erhöhte KBR Titer ab 1: 32 kompatibel mit frischer Infektion. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. 22

23 Nukleinsäurenachweis: RNA qualitativ Respiratorischer Infekt bei Säuglingen, Kleinkindern BAL, Gurgelwasser, Abstrich Nachweis bei passender Symptomatik beweisend. Parvovirus B19 IgG/IgM V. a. Ringelröteln; Infektion in Schwangerschaft IgM manchmal unspezifisch Nukleinsäurenachweis DNA qualitativ V. a. Primärinfektion in Schwangerschaft; chron. Infektion bei Immundefizienz EDTA-Blut, (Fruchtwasser, Knochenmark, Biopsiematerial) Virusgenomnachweis bei Aborten und Totgeburten; Persistenz des Virus bei Immunsupprimierten Poliovirus Typ 1, 2 und 3 Antikörpernachweis Neutralisationstest Nukleinsäurenachweis Enterovirus-RNA (qualitativ); mit anschließender Sequenzierung Impfstatus Respiratory-Syncytial-Virus V. a. Poliomyelitis Liquor (Stuhl, Abstriche Bläscheninhalt, Augenabstrich, Bläscheninhalt, Endomyokardbiopsien) Identifizierung des Serotyps Bereits der Verdacht einer Polio-Infektion ist meldepflichtig! IgG Respiratorischer Infekt bei Säuglingen, Kleinkindern Titeranstieg um drei Titerstufen in gepaarten Seren bes. aussagekräftig Antikörpernachweis KBR Respiratorischer Infekt bei Säuglingen, Kleinkindern Erhöhte KBR Titer ab 1: 32 kompatibel mit Infektion. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. 23

24 Antigennachweis: Direkter IFT Respiratorischer Infekt bei Säuglingen, Kleinkindern Nasen-/ Rachen - Abstrich, BAL Antigennachweis beweisend für RSV-Infektion bei passender Symptomatik Nukleinsäurenachweis RNA qualitativ Respiratorischer Infekt bei Säuglingen, Kleinkindern BAL,Gurgelwasser, Abstrich RNA-Nachweis beweisend für RSV-Infektion Rötelnvirus IgM ² V. a. Infektion Falsch positives IgM-Ergebnis durch Parvovirus B19- oder EBV- Infektion möglich Hämagglutinationshemmtest ² Immunstatus, Überprüfung des Impferfolges Titer ab 1:32 bedeutet Immunität (bis 1:32 Bestätigung durch andere Tests notwendig); Test ist in den Schwangerschaftsrichtlinien vorgeschrieben! Rotavirus Antigennachweis Gastroenteritis, besonders bei Säuglingen/ Kleinkindern Stuhl Effiziente Übertragung in Kinderhorten, Stationen etc. Bei positivem Befund bitte Meldepflicht beachten! Varicella-Zoster-Virus IgG/IgM V. a. VZV-Infektion oder Reaktivierung; Impfstatus Signifikanter Titeranstieg oder positives IgM spricht für akute Infektion oder Reaktivierung Nukleinsäurenachweis DNA quantitativ 1 Vesikuläres Exanthem; V.a. ZNS -Beteiligung V.a. VZV-Infektion ohne typische Symptomatik bei schwerer Immunsuppression Abstrich Liquor (EDTA-Blut) beweisend für VZV Positiver Nachweis im Liquor ätiologisch signifikant. Positiver Nachweis beweisend für disseminierte VZV-Infektion. 24

25 Zytomegalie-Virus Antigen Nachweis: pp65 Early Antigen² Nukleinsäurenachweis DNA quantitativ 1 Verdacht auf Infektion, Reaktivierung bei Immunsupprimierten; kongenitale Infektion Nachweis von Virus in Biopsiematerial; Virusausscheidung im Urin Therapieüberwachung bei Immunsupprimierten Patienten; EDTA-Blut V. a. Infektion des ZNS Liquor Abstrich, BAL, Sekret BAL, Urin (Biopsie, Knochenmark, Trachealabstrich/ -sekret) EDTA-Blut Nachweis von pp65 positiven Zellen impliziert aktive Virusreplikation Nachweis von Early-Antigen positiven Zellen impliziert aktive Virusreplikation Interpretation im Zusammenhang mit Viruslast in Blutleukozyten oder plasma Interpretation in Kenntnis klinischer Daten z.b. Therapie. Positiver Nachweis im Liquor ätiologisch signifikant IgG/IgM Antikörpernachweis KBR Bestimmung des Infektionsstatus; V.a. Primärinfektion oder Reaktivierung V.a. Primärinfektion oder Reaktivierung Pos. IgG zeigt vorherige Infektion an. Pos. IgM kompatibel mit Primärinfektion/Reaktivierung Zur kurzzeitigen Überwachung von CMV-Infektionen ist die Serologie ungeeignet. Erhöhter KBR Titer ab1:64 kompatibel mit Primärinfektion oder Reaktivierung; kann aber auch über Jahre persistieren. Daher kann nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. Virusisolierung Zellkultur + Nur noch in Ausnahmefällen. Urin, Stuhl, BAL, Abstrich Bitte vorab telefonische Absprache 1 Die Angaben zur Messunsicherheit dieser Verfahren sind auf Anfrage im Labor erhältlich ² Untersuchung wird an Unterauftragnehmer weitergeleitet 25

26 5.2 Erreger nach Methoden geordnet Nachweis von Antikörpern ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen: Epstein-Barr-Virus (EBV) (IgG, IgM) FSME-Virus (IgG, IgM) Hepatitis-A-Virus (HAV) (IgG) Hepatitis-B-Virus (HBV) (anti-hbs, anti-hbc, anti- HBc-IgM, anti- HBe, anti-hdv) Hepatitis-C-Virus (HCV) (anti-hcv) Herpes-simplex-Virus (HSV) (IgG, IgM) Humanes Herpes-Virus 6 (HHV6) (IgG, IgM) Humanes Immundefizienzvirus Typ 1 und 2 (anti HIV -1/2) Influenzavirus A und B (IgG) Masernvirus (IgG, IgM) Mumpsvirus (IgG, IgM) Parainfluenzavirus Typ 1, 2 und 3 (IgG) Parvovirus B19 (IgG, IgM) Respirator-Syncytial-Virus (RSV) (IgG) Rötelnvirus (IgG, IgM) Varicella-Zoster-Virus (VZV) (IgG, IgM) Zytomegalie-Virus (CMV) (IgG, IgM) 26

27 Komplementbindungsreaktion zum Nachweis von Antikörpern gegen: Adenoviren Herpes-simplex-Virus Typ 1 und 2 Influenzavirus A und B Masernvirus Mumpsvirus Parainfluenzavirus Typ 1, 2 und 3 Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) Varicella-Zoster-Virus (VZV) Zytomegalie-Virus Indirekter Immunfluoreszenztest: Humanes Herpes-Virus 8 (HHV8) (anti-lana-igg) Hämagglutinationshemmtest (HAH): Rötelnvirus Neutralisationstest zum Nachweis von Antikörpern gegen: ECHO-Viren Typ 3,6,7,11,30 Coxsackieviren Typ B1 B5, A9 Poliovirus Nachweis von Virusantigenen im Patientenmaterial: Adenoviren (IFT) Hepatitis-B-Virus (HBV) (HBsAg-, HBeAg-ELISA) Herpes-simplex-Virus Typ 1 und 2 (HSV 1/2) (IFT) Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) (IFT) Zytomegalie-Virus (CMV) (pp65, Early-Antigen) 27

28 5.2.3 Nukleinsäurenachweis Adenoviren Enteroviren Epstein-Barr-Virus Hepatitis-B-Virus Hepatitis-C-Virus Herpes-simplex-Virus Typ 1 und 2 Humanes Herpes-Virus Typ 6 Humanes Immundefizienz-Virus Typ 1 Influenzavirus Typ A und B Papillomaviren Parainfluenza Respiratorisches Syncytial-Virus Varicella-Zoster-Virus Zytomegalie-Virus qualitativ qualitativ quantitativ quantitativ quantitativ qualitativ qualitativ quantitativ qualitativ qualitativ qualitativ qualitativ qualitativ quantitativ 5.3 Test-Prinzipien, Vor- und Nachteile der durchgeführten Methoden Enzymbindungsassays (ELISA, EIA, ELA, MEIA etc.) Was wird nachgewiesen? Prinzip in der Regel Antikörper, bei einigen wenigen Testen: Virusantigene Das Prinzip von Liganden-Bindungsassays ist die Bindung des nachzuweisenden Analyten an komplementäre Festphasen-gebundene Antigene bzw. Antikörper mit anschließendem Nachweis der gebundenen Komponente mit Hilfe eines enzymmarkierten Zweitantikörpers. Die enzymvermittelte Farbreaktion ist proportional zur Konzentration des Analyten im Untersuchungsmaterial. Vorteile Antikörperklassen (z. B. IgM/IgG) können differenziert werden. Zügige Diagnostik möglich (bei ausgewählten Tests) sensitive Methode zum Antikörpernachweis Einige IgG-Teste geben quantitative Ergebnisse Nachteile Wie bei allen Verfahren zum Bei akuten Infektionen Antikörper frühestens 1 Woche nach Infektion nachweisbar Untersuchungsmaterial oder EDTA-Blut (Plasma) 28

29 Hämagglutinations-Hemmtest (HAH, Röteln-Serologie) Was wird nachgewiesen? Prinzip Antikörper gegen Röteln-Virus Hämagglutinin Einige Virusarten, z.b. das Rötelnvirus, enthalten auf ihrer Oberfläche Moleküle, die die Fähigkeit besitzen, sich an Rezeptoren auf der Erythrozytenmembran zu binden und die Erythrozyten zu agglutinieren. Beim HAH werden abgestufte Verdünnungen eines Patientenserums mit Virussuspension vermischt und anschließend mit Erythrozyten inkubiert. Sind im Patientenserum keine Anti-Röteln- Antikörper vorhanden, kann das Virus die Erythrozyten agglutinieren. Sind im Patientenserum Antikörper gegen Rötelnagglutinine vorhanden, wird die Agglutination gehemmt. Die Erythrozyten sedimentieren. Als Titer wird die höchste Verdünnungsstufe angegeben, bei der noch keine Agglutination stattgefunden hat. Vorteile Referenzmethode zur Bestimmung der Röteln-Immunität Nachteile Eine frische Infektion ist nur durch zusätzliche IgM-Bestimmung (ELISA) und Titervergleich in einem paar (Abstand 2 Wochen) erfassbar. Besonderheiten Aufwendig In der Schwangeren-Vorsorge vorgeschrieben! Interpretation Untersuchungsmaterial Ein Titer = 1:32 weist Röteln-Immunität nach. Immunoblot (Western Blot) Was wird nachgewiesen? Prinzip Antikörper In diesem Verfahren werden Virusantigene nach Größe und Ladung in einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Bei bekannter Antigenzusammensetzung kann man nach Reaktion mit eventuell in der Patientenprobe vorhandenen Antikörpern und Detektion mit entsprechenden Zweitantikörpern nicht nur feststellen, ob virusspezifische Antikörper in der Probe vorhanden, sondern auch gegen welche Proteine diese Antikörper gerichtet sind. Durch diese Differenzierung ist eine sichere Diagnose möglich. Vorteile hohe Spezifität Nachteile zeitaufwendig, teuer Besonderheiten Bestätigungstest bei positivem HIV - bzw. HCV-Screening-Test Normwerte je nach Test Untersuchungsmaterial 29

30 Immunfluoreszenztest, direkt (IFT) Was wird nachgewiesen? Prinzip Virusantigene in infizierten Zellen (z.b. in Abstrichen enthalten) Zum Nachweis der Antigene werden Zellausstriche mit virusspezifischen monoklonalen Fluochrom-markierten Antikörpern, (meist Fluoreszein- Isothiocyanat) überschichtet. Überschüssiges Antikörperkonjugat wird abgewaschen und die Fluoreszenz der Zellstruktur im Immunfluoreszenzmikroskop beurteilt. Vorteile Schnell Interpretation Infizierte Zellen zeigen eine typische Fluoreszenz. Der Nachweis einer positiven Zelle gilt als positiv. Verwendbare Materialien Patientenmaterial mit ausreichend hoher Zellzahl: Abstriche aller Art, Spülflüssigkeiten (BAL, Rachenspülwasser), Sputum, Trachealsekret Infizierte Zellkulturen mit positivem CPE Besonderheiten Normwerte Da infizierte Zellen nachgewiesen werden, bitte keine bakteriologischen Gelröhrchen für Einsendung verwenden! Bitte Transporthinweise beachten! Der Nachweis einer eindeutig positiven Zelle gilt als positiv. Immunfluoreszenztest, indirekt (IFT) Was wird nachgewiesen? Prinzip Antikörper Das Untersuchungsmaterial wird auf Objektträger aufgetropft, die zuvor mit Virus infizierten Zellen beschichtet wurden. Im Untersuchungsmaterial enthaltene virusspezifische Antikörper binden sich an das Antigen und werden mit Hilfe von fluorochrom-markierten Anti-human-Antikörpern im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen. Vorteile hohe Spezifität IgM-/IgG- Differenzierung möglich Nachteile zeitaufwendig Verwendbare Materialien oder EDTA-Blut (Plasma) 30

31 Komplementbindungsreaktion (KBR) Was wird nachgewiesen? Prinzip Komplement bindende Antikörper. Bei der Komplementbindungsreaktion macht man sich die Eigenschaft zu nutze, dass Antigen-Antikörper-Komplexe Komplement aktivieren und damit verbrauchen. Dazu wird dem inaktivierten (das bedeutet Komplement-freien) Patientenserum das entsprechende Antigen und eine definierte Menge Komplement zugesetzt. Sind im Patientenserum die gesuchten Antikörper vorhanden, bindet Komplement an die sich bildenden Immunkomplexe und wird ganz oder teilweise verbraucht. Ein nachfolgend zugefügtes Indikatorsystem (meist Immunkomplexe aus Hammelerythrozyten und Anti-Hammelerythrozyten-Antikörpern) kann nicht mehr hämolysiert werden. Die Erythrozyten sedimentieren. Wenn das die gesuchten Antikörper nicht enthält, läuft die Komplement-vermittelte Hämolyse der Erythrozyten ab. Als Titer gibt man nun die höchste Verdünnungsstufe an, bei der noch keine Hämolyse beobachtet wird. Vorteile Die KBR ist besonders gut geeignet, Titerverlaufsdiagnostik durchzuführen (deutliche Titeranstiege bei frischen Infektionen und schneller Rückgang der KBR-Titer nach Ausheilung). Nachteile Im Vergleich zu ELISA-Methoden unempfindlich Da sowohl Antikörper der Klasse M als auch der Klasse G in der Lage sind, Komplement zu binden bzw. zu aktivieren, kann eine Differenzierung zwischen beiden Klassen nicht erfolgen. zeitaufwendig Normwerte Ein erhöhter Titer, eine Serokonversion oder ein signifikanter Titeranstieg innerhalb von zwei Wochen zeigen eine frische Infektion/ Reaktivierung an. Ein erhöhter Titer kann aber auch eine rezente (kurze Zeit zurückliegende) Infektion anzeigen. Einzeltiter sind daher wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion oder Reaktivierung geben. Untersuchungsmaterial paar in Abstand von 2 4 Wochen abgenommen Nachweis des CMV pp65-antigens in Leukozyten Was wird nachgewiesen? Prinzip CMV-pp65-Protein in Leukozyten Das sog. pp65-antigen ist ein Matrixprotein des Cytomegalievirus, das während einer vermehrten Replikation des Virus in Granulozyten nachweisbar ist. Man weist es immunzytochemisch mit der APAAP- Methode (alkaline phosphatase + Mouse anti-alkaline phosphatase) in einem Cytospinpräparat der peripheren Leukozyten nach. Vorteile schnell Nachteile Verfahren bei extremer Leukopenie nicht möglich Besonderheiten Beachte Transporthinweise! Normwerte Eine eindeutig positive gefundene Zelle in untersuchten Granulozyten zeigt eine Virusreplikation (CMV-Reaktivierung oder Verwendbare Materialien frische CMV-Infektion) an. EDTA-Blut 31

32 Neutralisationstest Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie Was wird nachgewiesen? Prinzip Vorteile Nachteile Normwerte Verwendbare Materialien Neutralisierende Antikörper gegen Polio-, Coxsackie- oder Echoviren Neutralisierende Antikörper blockieren die Infektiosität eines Virus. Zum quantitativen Nachweis mischt man eine Verdünnungsreihe des Patientenserums mit einer bekannten Virusmenge und lässt das Gemisch (nach Reaktion des Virus mit Ak) auf eine für das Virus empfängliche Zellkultur einwirken. Wenn genügend neutralisierende Antikörper vorhanden sind, kann das Virus die Zellen nicht infizieren. Die höchste -Verdünnungsstufe, bei der noch kein cytopathogener Effekt (CPE) zu erkennen ist, wird als Titer angegeben. Nachweis von Immunität (Referenzmethode für Polioviren) hohe Spezifität zeitaufwendig Erhöhte Titer ab 1: 256 kompatibel mit Infektion. Einzeltiter sind jedoch wenig aussagekräftig. Nur der Titerverlauf in einem paar (Abstand 2-4 Wochen) kann Auskunft über das Vorliegen einer akuten Infektion geben. Ein Titeranstieg um 3 Stufen innerhalb von drei Wochen zeigt eine akute Infektion an. Virusnachweis im Stuhl und Rachen durch Nukleinsäurenachweis ist aber anzustreben und zu bevorzugen! Patientenserum oder plasma Nukleinsäurenachweis Was wird nachgewiesen? Virusgenom (DNA oder RNA) Prinzip Das Prinzip des Nukleinsäurenachweis beruht auf einer exponentiellen enzymatischen Vermehrung eines oder mehrerer genau definierter DNA-Abschnitte in vitro. Das Virusgenom von RNA-Viren wird zunächst durch reverse Transkription zu DNA transkribiert. Dieses Verfahren ermöglicht den spezifischen Nachweis geringster Mengen von Nukleinsäuren. Vorteile sehr sensitiv früher Nachweis von Infektionen möglich Nachteile teuer klinisch nicht relevante positive Ergebnisse durch Viruslatenz möglich (z.b. EBV) zeitaufwendiger, und damit langsamer als direkter IFT Besonderheiten Normwerte Verwendbare Materialien Beachte Transporthinweise! Virusnachweis aus Proben des Respirationstraktes, sowie aus Liquor meist nur in der frühen Akutphase möglich. Für die meisten Viren und Untersuchungsmaterialien negativ. Ausnahme: persistierende Viren. Für diese daher quantitative Bestimmung sinnvoll. je nach nachzuweisendem Virus und Erkrankung (siehe nächste Seite) 32

33 Folgende Viren können mittels Nukleinsäurenachweisverfahren aus dem jeweiligen Material nachgewiesen werden: EDTA-Blut Augenabstrich Nasen-Rachenabstrich Bronchioalveolarlavage Rachenspülwasser Liquor Stuhl Urin Abstrich/Bläscheninhalt Genitalabstrich HBV, HCV CMV, EBV, HHV-6, Parvo B19, HIV, (HBV, HCV) Adeno, Entero, HSV Adeno, Influenza A/B, Parainfluenza, RSV Adeno, CMV, EBV, HSV, Influenza A/B, Parainfluenza, RSV Adeno, Influenza A/B, Parainfluenza, RSV CMV, Entero, EBV, HSV, Polyoma, VZV (Adeno, HHV-6) (Adeno, Entero) CMV, Polyoma Entero, HSV, VZV Papillomaviren Knochenmark (CMV, EBV, HHV6, Parvo B19) Biopsien (Adeno, CMV, EBV, Entero, Parvo B19) Sequenzierung Was wird nachgewiesen? Ein Teil der Erbinfomation des Virus wird analysiert Prinzip Voraussetzung ist die Amplifikation von Virusnukleinsäure. Die so gewonnene DNA wird dann aufgereinigt und sequenziert. Dies wird mit dem Verfahren nach Sanger (Kettentermination bei DNA -Synthese durch Dideoxynukleotide) automatisiert durchgeführt. Im Anschluß daran erfolgt die Auswertung der Sequenz im Datenbank-Abgleich. Vorteile Nachweis Resistenz-vermittelnder Mutationen Aufklärung von Infektketten Typisierung von Viren zum Teil möglich. Nachteile teures Verfahren als Ergänzung zur PCR, nur in bestimmten Sonderfällen gerechtfertigt Besonderheiten Normwerte Verwendbare Materialien Die Sequenzierung setzt einen positiven Nukleinsäurenachweis voraus siehe Nukleinsäurenachweis 33

34 6. Abkürzungen Ak ACV BAL CPE CMV EBV EMB FSME HAH HAV HBV HCV Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie Antikörper Acyclovir Bronchioalveoläre Lavage cytopathogener Effekt Zytomegalie-Virus Epstein- Barr-Virus Endomyokardbiopsie Frühsommer-Meningoenzephalitis Hämagglutinationshemmtest Hepatitis-A-Virus Hepatitis-B-Virus Hepatitis-C-Virus HHV-6 Humanes Herpes-Virus 6 HHV-8 Humanes Herpes-Virus 8 HIV HSV HTLV IFT KBR KSHV MCS PEL PTLD RSV SSPE VZV Humanes Immundefizienz-Virus Herpes-simplex-Virus Humanes T-Zell-Leukämie-Virus Immunfluoreszenztest Komplementbindungsreaktion Kaposi s Sarcoma associated Herpesvirus Multicentric Castleman s disease Primary Efffusion Lymphom post transplantation lymphoproliferative syndrome Respiratory-Syncytial-Virus subakute sklerosierende Panenzephalitis Varicella -Zoster-Virus 34

35 7. Literatur A. Zuckerman, J. Banatvala, J. Pattison: Principles and Practice of Clinical Virology, 4th edition, 2000, Verlag Wiley + Sons Th. Mertens, O. Haller, Th. H.-D. Klenk: Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten (Leitlinien der Gesellschaft für Virologie) Verlag Urban und Fischer, 2. Auflage 2004 D. Falke: Virologie am Krankenbett, Springer Verlag, 1. Auflage 1988 S. Specter, R. Hodinka, s. Young: Clinical Virology Manual, ASM Press, 3rd edition, Fassung geprüft und freigegeben am von Prof. Dr. K. Überla 35