Weitere genetische Schalter. Gen-Regulation mit Feedback produziert einen Schalter

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1 Weitere genetische Schalter Gen-Regulation mit Feedback produziert einen Schalter

2 Robuste vs. ultrasensitive Schalter Einfaches Netzwerk mit positiver Rückkopplung Ohne Hysterese: Ultrasensitiver Schalter, rauschinduziertes Schalten Mit Hysterese: Robust gegen Rauschen (Konzentration von A bleibt gering, falls anfängliche Konzentration gering)

3 Robuste Schalter / Bedeutung der Hysterese Einfaches Netzwerk mit positiver Rückkopplung memory-less switch bistable switch Hysterese Ohne Hysterese: Ultrasensitiver Schalter, rauschinduziertes Schalten Mit Hysterese: Robust gegen Rauschen (Konzentration von A bleibt gering, falls anfängliche Konzentration gering)

4 Bistabiles Verhalten positive feedback loops lead to bistable switches from: Kaern et al. Nature Review 2005

5 Bistable genetic Switches Protein A = key regulator active when present as a multimer. multimerization => nonlinear dynamics of the system production of A, f(a p ) described by Hill-type function. deactivation rate, described by a linear-type function, f(a d )

6 Eigenschaften des Lac Netzwerkes Die Induktion der lac synthese ist ein Alles-Oder-Nichts Prozess Die Eigenschaft des genetischen Zustandes kann vererbt werden Novick & Weiner 1957

7 Der Lactose Abbauweg eine hierarchische Betrachtung Molekulare Wechselwirkungen Zelluläres Netzwerk Heterogenität in der Populationsdynamik

8 Zeitliches Verhalten des lac-operon Schalters Niedrige Induktor- Konzentration: Hohe Induktor- Konzentration: [β-galactosidase] [β-galactosidase] time (generations) Verschiedene Farben Verschiedene Zellen => Nicht alle Zellen schalten gleichzeitig! Durchgezogene Linie: Mittel über 2000 Zellen Rote dots: Experiment (Novik, Wiener, PNAS 1957) [β-galactosidase] Vilar, J.M.G et al, J.Cell Biol time (generations)

9 Gen-Regulation mit Feedback: lac-operon IPTG, TMG LacI

10 Modell für lac Netzwerk Glukose Konz. konstant GFP: Reportermolekül, Abbildung durch Fluoreszenz-Mikroskopie => je höher das Fluoreszenz-Signal desto mehr LacZ,Y wird exprimiert

11 Experimenteller Nachweis eines Schalters mit Hysterese Anfang: nicht induziert Nach Induktion 2 Populationen: induzierte Population grün, nicht induzierte Population weiß Bistabiler Bereich (grau) Pfeil zeigt den Anfangs-Zustand Zustand der Bakterien hängt vom Ausgangs-Zustand ab! => Schalter mit Hysterese Ozbudak et al, Nature 2004

12 Modell für lac Netzwerk # y dx # x dt R = R T dy dt = $ 1+ = " y! 1+ steady state: 1+ y = # " R x ( x x ) n 0 R 2 (! y) (! y) 2 0! y x: intracellular TMG concentration y: concentration of LacY (permease) (measured in GFP fluorescence units) R: concentration of active LacI (repressor) R T : total concentration LacI n: Hill coefficient (LacI is tetrameric, but 1 TMG is sufficient to interfere with LacI activity) n! 2 α: maximal activity level (if all repressors were inactive) β: transport rate, TMG uptake rate per LacY! = 1+ R T R 0 : repression factor R 0 : half saturation concentration x 0 : half saturation concentration τ x, τ y : time constants Ozbudak et al, Nature 2004

13 Phasendiagramm große ρ: diskontinuierlicher Übergang vom nicht-induzierten zum induzierten Zustand entspricht Phasenübergang 1. Ordnung, thermisches Rauschen wird durch chemisches Rauschen ersetzt kleine ρ: kontinuierlicher Übergang vom nicht-induzierten zum induzierten Zustand entspricht Phasenübergang 2. Ordnung α: maximal activity level (if all repressors were inactive) β: transport rate, TMG uptake rate per LacY! = 1+ R T R 0 : repression factor in Wild Typ Bakterien wurden nur diskontinuierliche Übergange beobachtet => Konstruktion einer Mutante Ozbudak et al, Nature 2004

14 Phasendiagramm Erniedrige ρ unter Wild Typ Niveau! Mutante mit zusätzlichen Bindungsstellen für LacI Repressor (b:4, c:25) => Reduktion der effektiven LacI (Repressor) Konzentration => Reduktion von ρ [TMG] (Inducer) Fluorescence Intensity, [LacY] Fig c: Kontinuierlicher Übergang vom nicht-induzierten zum induzierten Zustand!, kein Schalter (entspricht einem Phasenübergang 2. Ordnung)

15 Die Dynamik des Schaltverhaltens: Vergleich von Experiment und stochastischer Simulation (rot)

16 Rauschen in Signaltransduktions- Netzwerken ist optimiert

17 Messung der zeitlichen Fluktuationen des chemotaktischen Netzwerks von E.coli Korobkova et al. Nature 2004

18 Das chea-chey Signal-Netzwerk Aus genetischen Untersuchungen sind vier cytoplasmatische Proteine CheA, CheW, CheY und CheZ bekannt, die die chemotaktischen Rezeptoren mit dem Geißelmotor verbinden. CheW: Hilfsfaktor CheA : Proteinkinase CheY : Response Regulator CheZ : Phosphatase-activating Protein CheR : Methyltransferase CheB : Methylesterase Reguliert durch den Rezeptor transferiert unter CheA,eine Phosphorylierung auf das kleine CheY Protein. CheY-p diffundiert zu den Motorproteinen der Flagellen und induziert den Übergang des Motors in die Taumelbewegung. (CHeY-p = Ein/Ausschalter)

19 Variation der Adaption mit der CheR Konzentration Die Adaptionspräzession ist unabhängig von CheR Vollständige Adaption! adaption time tumbling frequency Die interne Proteinkonzentration CheR wird in einem Klon unter die Kontrolle eines Lac Operons gestellt und von aussen eingestellt.

20 Spektrale Analyse einer einfachen chemischen Reaktion (Isomerisation)

21 Experiment Simulation CheY fluctuationen rel. Variabilität des Outputs CheY

22 Quorum Sensing

23 Tintenfisch mit Scheinwerfer Phänomen: Tintenfisch (Euprymna scolopes) emittiert nachts Licht => wird im Mondlicht nicht als Beute erkannt Erklärung: Lichtorgan des Tintenfisches sammelt luminiszente Bakterien (Vibrio fischerei) Frage: Warum sind V. fischerei im Licht-Organ des Tintenfischs luminszent, aber nicht freischwimmend im Meer?

24 Quorum sensing Bakterien teilen sich => exponentielles Wachstum OD: optische Dichte K. Nelson, Cell-Cell Signalling in Bacteria Bakterien detektieren ihre eigene Zelldichte => Regulation der Expression von Luminiszenz-Genen

25 Molekulares Bild von QS Bakterien exportieren Oligopeptide (auch Pheromon, bakterielles Hormon, Autoinduktor) Mit steigender Zellkonzentration akkumuliert Oligopeptid Oligopeptid diffundiert durch Zellmembran, akkumuliert in der Zelle und reguliert Gen- Expression

26 Beobachtung: Zwei unterschiedliche Populationen koexistieren Kompetenz für DNA-Transformation in B. subtilis bei hoher Zelldichte. Kompetente Bakterien sind fluoreszenzmarkiert, d.h. mit Methoden der Gentechnik, wird an ein Kompetenzgen ein fluoreszentes Reporter-Protein (Green Fluorescent Protein, GFP) kloniert. Nur 5-10% der Bakterien sind kompetent. Quorum sensing induziert einen Alles-oder-Nichts Übergang oder legt einen Schalter um ComK-GFP Haijema et al, Mol.Microbiol.2001

27 Kompetenz Kompetenz: lateinisch competere = zusammentreffen, ausreichen, zu etwas fähig sein, zustehen die bei Individuen verfügbaren oder durch sie erlernbaren kognitiven Fähigkeiten und Fertigkeiten, um bestimmte Probleme zu lösen, sowie die damit verbundenen motivational, volitional und sozialen Bereitschaften und Fähigkeiten, um die Problemlösungen in variablen Situationen erfolgreich und verantwortungsvoll nutzen zu können. F. E. Weinert Aus biologischer Sicht: Fähigkeit von Zellen, DNA aufzunehmen und in ihre eigene Erbsubstanz zu integrieren

28 Kompetenz: Fähigkeit von Zellen, DNA aufzunehmen und in ihre eigene Erbsubstanz zu integrieren Freiwillig? Nein: Meistens aber müssen die Zellen vorbereitet, kompetent gemacht werden. => künstliche Kompetenz. Wie? Durch Kombination von Reizen: Hitze, Kälte, Salze (Calziumphosphat), Strom Manchmal! Zellen sporenbildender Bakterien wie Bacillus subtilis können unter bestimmten Umweltbedingungen DNA aufnehmen. => natürliche Kompetenz

29 Warum nehmen Bakterien DNA auf? Für mehr Vielfalt Um einzigartig zu sein Um Fähigkeiten zu erlangen, die die anderen nicht haben Um einen Vorteil zu erlangen Um zu überleben Bakterien können durch DNA Aufnahme z.b. Antibiotikaresistenzen erwerben, oder Informationen um eine neue Zuckerart abzubauen

30 Wann werden Bakterien kompetent? competence unter bestimmten Umweltbedingungen OD 600nm Bacillus subtilis: in einem ganz bestimmtem Lebensabschnitt: der stationären Phase lag exponentiell stationär Time

31 Wie nehmen Bacillen die DNA auf? Molekulares Modell der DNA- Aufnahme über die Zellmembran in Bacillus subtilis Com = Abkürzung für competence Dubnau:Rev Microbiol. 1999;53: Nat Rev Microbiol. 2004;2(3):241-9

32 Wie entscheiden sich Bakterien? Aktiv via quorum sensing Quorum sensing: Die Fähigkeit von Bakterien miteinander über Signal Moleküle (z.b. Pheromone) zu kommunizieren und ihr Verhalten zu koordinieren.

33 Wie wird Kompetenz induziert? ComX- Pheromone ComP Histindinkinase Membrane ComS ComS Proteinaseinhibitor ComX Precursor ComA Transcriptionfactor Pi ComK main Transcriptionfactor After Tortosa and Dubnau, 1999, Curr Opinion in Microbiology, 2: Activation of ~ 100 competence genes