Genregulation. Physik der Transkriptionskontrolle und Expressionsanalyse. Vorlesung System-Biophysik 11. Dez. 2007

Transkript

1 Genregulation Physik der Transkriptionskontrolle und Expressionsanalyse Vorlesung System-Biophysik 11. Dez Literatur - Alberts/Lehninger - Kim Sneppen & G. Zocchi: Physics in Molecular Biology - E. Klipp et al. : Systems Biology in Practice

2 Vom genetischen zum systemischen Ansatz DNA Mutationen / Evolution Genregulation mrna Regulation Proteinfunktionen Signaltransduktion Raumzeitliche Strukturbildung Morphogenese => Themen der Systembiophysik

3 Biologische Musterbildung und Morphogenese Reaktions-Diffusions-Modell von Morphogenen 30. Okt 07 Biochemische Netzwerke Enzymatische Reaktionen Michaelis-Menton-Kinetik Inhibierung, Regelung E + S k " 1 # $ # k "1 $ " ES k " 2 # E + P

4 Modell-System E.coli Genregulation erlaubt Anpassung an Umweltveränderungen Steuerung des Metabolischen Netzwerks (Stoffwechsel) E.coli besitzt ein einziges DNA Molekül mit Basenpaaren. Es kodiert für 4226 Proteine und einige RNA Moleküle. Der Informationsgehalt des Genoms übersteigt die Strukturinformation der exprimierten Proteine. -> regulatorische Mechanismen sind auf dem Genom kodiert.

5 Inhalt Grundlagen: Monod Modell, Lac Operon Statistische Physik DNA-bindender Proteine Modellierung genregulatorischer Netzwerke (ODE & Boolsche Netze) Dynamik der Protein-DNA Bindung DNA looping Analyse von Genexpressionsdaten Synthetische Netzwerke (Seminar)

6 Das Operon-Modell Francois Jacob und Jaques Monod, 1961 operon Operon: Genetische Funktionseinheit, die aus regulierten Genen mit verwandter Funktion besteht und enthält: - Promotor: Bindungsstelle für RNA-Polymerase - Operator: kontrolliert Zugang der RNA-Polymerase zu Strukturgen - Strukturgene: Polypeptide codierende Gene

7 Der Trp Operator als Schalter: Innerhalb des Promoters liegt eine kurz Region regulatorischer DNA, die als Bindungsstelle eines Repressors arbeitet. Bindet der Repressor, so ist das Ankoppeln der RNA Pol sterisch unterdrückt.

8 Die Aussenseite von DNA kann von Proteinen erkannt werden: Die verschiedenen Basenpaare werden anhand ihrer Ränder erkannt => DNA-Bindungsmotive

9 Durch Bindung des Tryptophan an das Tryptophan- Repressorprotein wir die Konformation des Repressors verändert

10 Identifizierung von Promoter Sequenzen

11 Transkriptions-Aktivatorproteine schalten Gene ein

12 Gen-Regulation mit Feedback: lac-operon IPTG, TMG LacI

13 Non-metabolizable inducer are used to induce gene expression IPTG (Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside)this compound is used as a molecular mimic of allolactose, a lactose metabolite that triggers transcription of the lac operon. Unlike allolactose, the sulfur (S) atom creates a chemical bond which is non-hydrolyzable by the cell, preventing the cell from "eating up" or degrading the inductant. IPTG induces activity of betagalactosidase, an enzyme that promotes lactose utilization, by binding and inhibiting the lac repressor. In cloning experiments, the lacz gene is replaced with the gene of interest and IPTG is then used to induce gene expression. A cis-regulatory element or cis-element is a region of DNA or RNA that regulates the expression of genes located on that same strand. This term is constructed from the Latin word cis, which means "on the same side as". These cis-regulatory elements are often binding sites of one or more trans-acting factors. Campbell, N.A., Biology

14 Variation der Protein-Konzentration mit IPTG Northern Blot: Bestimme die Konzentration von messenger RNA (mrna) 60 [mrna] Long, C et al, J.Bacteriol [IPTG Induktor] 0.10 Externe und interne Induktor-Konzentration gleich, sobald System im Gleichgewicht Die Konzentration von mrna nimmt bis 60% monoton mit der Induktor-Konzentration zu, bei höheren Konzentrationen Sättigung Operon ermöglicht Variation der Protein-Konzentration. Was fehlt noch zum Schalter?

15 Transkription und Translation in E.coli Typische Zeiten und Raten 1 Molekül / Zelle = 1nM Gesamtmasse Da TRANSKRIPTION Initierungsrate 1/s - 1/18s Transkriptionsrate: 30bps-90bps TRANSLATION Ribosome Translationsrate 6-22 codons/s (40 Proteine/mRNA)

16 The arabinose system1 pbad24 2 ~55 copies/cell Reporter Break down Regulator Uptake [1] R. Schleif. Trends in Genetics, 16(12): , 2000 [2] L. M. Guzman, D. Belin, M. J. Carson, and J. Beckwith. J.Bacteriol., 177(14): , 1995 [3] D. A. Siegele and J. C. Hu. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(15): , 1997

17 Time-lapse Fluorescence Microscopy and Quantitative Image Processing DIC t n automated data aquisition define ROIs t n t 1 Fluorescence t 0 DIC t 0 measure total intensity N background correction calibration and conversion into molecular units

18 Judith Leierseder Diplomarbeit

19 Total Fluorescence [a.u.] 8x % arabinose Single cell expression Fluorescence kinetics measurement Saturating induction Cell outlines are determined using bright field images The signal is integrated within the outline in each fluorescence image 5min 15min 25min 35min 45min Time [min] Subsaturating induction Total Fluorescence [a.u.] 8x % arabinose 30min 40min 50min 60min 70min Image series correspond to blue curves Time [min]

20 Gene expression model Reporter module Deterministic rate model Uptake module with time delay d Induction: t=0min 8x10 5 Z(! ) [a.u.] ! [min]

21 Curve Fitting Fit expression function Saturating induction Fixed Parameters Literature Total Fluorescence [a.u.] 8x % arabinose Measured Time [min] Subsaturating induction Fit Parameters Time delay Protein synthesis rate Total Fluorescence [a.u.] 8x % arabinose Time [min]

22 Zeitskala der Suche nach der Bindungsstelle D = kt 6"#R Stokes Einstein Gleichung (z.b. D GFP =3-7µm 2 /s) P(r,t) = 1 4"tD $ r2 ' exp &# ) % 4Dt ( Wahrscheinlichkeitsverteilung 1µm t diffusion = d 2 2D Typische Zeitskala dass ein Protein einen beliebigen Punkt in E.coli findet : t D 0.1s

23 Diffusion zu einer absorbierenden Scheibe J = "D4#r 2 dc dr dc dt = 1 r D d # dc& % 2 dr $ 4"r2 ( dr ' C(r) = J D4"r + C(#) C(") = N V C(") = 0 J = 4"#D N V " on = V 4#D$N % 20s N

24 Verweildauer der Transkriptionsfaktoren 1 = 1 V # exp ( $G kt) = 4%D& [ M] # exp ( $G kt) " off " on für spezifische Bindungsstellen (Operator) mit 1M -1 =1.6nm 3 and ΔG spez =-12.6kcal/mol, ε=1 folgt " off # 20s (mit τ on =20s/N folgt, dass 1Molekül in 1µm 3 einen Operator gerade halb besetzt) für unspezifische Bindungsstellen mit ΔG uspez =-10-4 kcal/mol, " off #10 $4 s

25 Die Suche auf dem DNA Strang Unspezifische Bindung von TFs and DNA ist ein Problem, da die Suche auf nach der Bindungsstelle auf dem Strang länger dauert. Wenn die Verweildauer unendlich wäre, würde ein ein-dimensionaler random walk " = L2 2D 1 # s # 2Tage dauern (L=1.5mm und D 1 D)

26 Die Suche auf der DNA wird durch Sprünge auf benachbarte DNA Stränge beschleunigt $ " # & l2 % D 1 ' )* L ( l # Ll D 1 Mit L=1.5mm, l=150nm folgt " # 50s

27 Kombinatorische Genregulation: Genetische Netze Genregulatorisches Protein translation transcription

28 Ein Transkriptions-Aktivator und ein Transkriptions-Repressor kontrollieren das lac-operon

29 Thermodynamisches Modell einer kombinatorischen Transkriptions Logik Genregulation folgt den Prinzipien von Boltzmann-Maschinen ΔP : Bindungswahrscheinlichkeit Gerland et al. PNAS, 2005

30 Statistische Physik der Protein - DNA Bindung CI + O " CIO [ ][ O] [ ] K = k + = CI k " CIO Bindungsisotherme: [ ] [ ] = [ CI] K + [ CI] " = CIO O total

31 Kooperativität durch Dimer-Bildung CI ( ) M + CI ( ) M " CI " ( ) D ( CI) D + O " CIO K D = ( CI ) M CI [ ] 2 [ ] ( ) D Kooperative Bindung [ ] ( [ ] = CI) M " = CIO O total K # K D + [ ] 2 [( CI) ] 2 M

32 Das statistische Gewicht des on Zustands P on = Z(on) Z P on P off = Z(on) Z(off ) = " c [ ( ) = CI ] exp #$ G % kt K Die freie Energiedifferenz DG ist auf eine freie Konzentration von 1M festgelegt. Die wahre Änderung der freien Energie der Bindung hängt von der Konzentration des Transkriptionsfaktors in Lösung ab: ( ( ) # ln( Z(off ))) = "G # kt ln [ CI] "G * = kt ln Z(on) ( )

33 Modell für lac Netzwerk Glukose Konz. konstant GFP: Reportermolekül, Abbildung durch Fluoreszenz-Mikroskopie => je höher das Fluoreszenz-Signal desto mehr LacZ,Y wird exprimiert

34 Experimenteller Nachweis eines Schalters Anfang: nicht induziert Nach Induktion 2 Populationen: induzierte Population grün, nicht induzierte Population weiß Bistabiler Bereich (grau) Pfeil zeigt den Anfangs-Zustand Zustand der Bakterien hängt vom Ausgangs-Zustand ab! => Schalter mit Hysterese Ozbudak et al, Nature 2004

35 Modellierung genregulatorischer Netzwerke ein Beispiel:

36 Modellierung auf der Ebene der mrna

37 Verlauf der mrna Konzentrationen stationärer Zustand Problem: Die kinetischen Bindungskonstanten sind in der Regel nicht bekannt

38 Vereinfachung kombinatorischer Netzwerke Genregulatorisches Protein translation transcription

39 Abstraktion genetischer Netze + Gen Y Gen X - Gen Z

40 Boolesche Netze (Kauffman 1989)

41 Boolsche Netzwerkmodelle N Gene (Knoten) mit 2 N unterschiedlichen Zuständen 2 2K durch mögliche Regeln verküpft wobei K die Anzahl inputs pro Knoten ist

42 Boolsche Regeln für N=2 und K=2

43 Zurück zum Beispiel Beobachtung: wenn a=0, dann wird 0101 stationär wenn a=1, dann oszillatorisches Verhalten 1000->1001->1111->1010 ->1000