I) Einführung in die Bedienung eines Gaschromatographen und des zugehörigen Datenverarbeitungssystems [Seminare an den Geräten]

Transkript

1 Prof. Dr. R. G. Berger/ PD Dr. Ulrich Krings Callinstr Hannover krings@lci.uni-hannover.de Praktikum Bioanalytik im Studiengang Life Science zur Vorlesung Bioanalytik Das Praktikum findet im Raum 317 statt. Erarbeitung analytischer Grundbegriffe anhand einer praktischen Einführung in die Gaschromatographie Praktikumsleiter: PD Dr. U. Krings Betreuer: Daniel Sandner, Miriam Meyer, Sanaz Khaligi, Mareike Siebert Inhalt: I) Einführung in die Bedienung eines Gaschromatographen und des zugehörigen Datenverarbeitungssystems [Seminare an den Geräten] II) GC-Injektionstechniken und GC-Detektoren (s. Vorlesung) [Kolloquien während der Versuche] III) Messprinzip In der Gaschromatographie werden verschiedene Gase als Trägergase eingesetzt. Neben hohen Reinheitsanforderungen stellen insbesondere niedrige Viskosität, chemische Inertheit und vernachlässigbare Wechselwirkung mit Analyten und stationärer Phase wichtige Anforderungen an ein Trägergas dar. Aus den genannten, sowie aus Kostengründen, finden daher hauptsächlich He, N und H in der Gaschromatographie Verwendung. Helium eignet sich aufgrund seines hohen Ionisierungspotenzials insbesondere als Trägergas bei der Kopplung der Gaschromatographie mit einem massenselektiven Detektor (GC-MS). Der Einfluss des verwendeten Trägergases auf die Trennleistung bei unterschiedlichen Trägergasgeschwindigkeiten wird anhand der zugehörigen Van-Deemter-Kurven deutlich. Seite 1 von 13

2 Abb.: Van-Deemter-Kurven für verschiedene Gase Aufgabe: Die Trägergasgeschwindigkeit ist nicht nur vom Säulenvordruck und der Säulendimensionierung, sondern auch von der Temperatur abhängig, nämlich wie? a) Parameter des Gaschromatographen Retentionszeit Die Zeit, die nicht retardierte Substanzen bis zur Detektion benötigen (z. B. Methan) bezeichnet man als Totzeit (chromatographisch tote Zeit). Um die Totzeit zu messen, injiziert man eine Substanz, die von der Säule nicht zurückgehalten wird. Aus der gemessenen Totzeit und der Länge des chromatographischen Systems kann die mittlere Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases oder des Eluenten ermittelt werden. v [m s -1 ] L t T Die Gesamtzeit, die von der Injektion bis zur Detektion vergeht, nennt man Bruttoretentionszeit. Die Differenz zwischen Bruttoretentionszeit und Totzeit bezeichnet man als Nettoretentionszeit. Seite von 13

3 b) Trennleistung: Trennzahl, Theoretische Böden, Auflösung, Retentionsinde Eine wichtige Kenngröße zweier benachbarter Peaks ist die Auflösung (Resolution, R). R beschreibt, in wie weit zwei Peaks überlappen. Von zwei benachbarten Peaks wird jeweils die Peakbreite auf halber Peakhöhe gemessen ( Halbwertsbreite ). Nach Ermittlung der Nettoretentionszeiten von Peak 1 und Peak kann die Auflösung R wie folgt berechnet werden: 1,176t R b b 1 () N 1 (1) Für eine Auflösung von R = 1 überlappen zwei Peaks um 3 %. Etwa mit dem Wert R = 1,3 sind zwei Peaks bis zur Grundlinie voneinander getrennt ( basisliniengetrennt ). Zur Beurteilung der Qualität eines Trennsystems dienen die Trennstufenzahl N th und die Bodenhöhe HETP (high equivalent to a theoretical plate). Diese Größen sind der Theorie der fraktionierten Destillation entnommen. Man kann sich vorstellen, dass die Säule in kleine Zonen eingeteilt ist, in denen Austausch passiert und die Substanz von Zone zu Zone weiter transportiert wird. Eine solche Zone nennt man theoretischen Boden. Die Anzahl der Böden ergibt die theoretische Bodenzahl (Trennstufenzahl). Da die Trennung ein dynamischer Prozess ist, gibt die Trennstufenzahl letztendlich die Zahl der Gleichgewichtseinstellungen in der Säule wieder. Die Trennstufenzahl ist unter anderem abhängig von den Abmessungen der Säule der Art der stationären Phase den äußeren Bedingungen (z.b. Fluss der mobilen Phase) den Prüfsubstanzen Je mehr theoretische Böden in einer Säule vorhanden sind, umso öfter können Sorptions- und Desorptionsprozesse erfolgen. Daher wird die Trennstufenzahl als Maß für die Leistungsfähigkeit eines Systems verwendet. Zur Bestimmung der Trennstufenzahl wird eine Substanz bei konstanter Ofentemperatur injiziert. Der Peak sollte mit k > 5 im Chromatogramm aufgezeichnet werden. k errechnet sich nach: t k t N T t B t t T T Seite 3 von 13

4 Aus der Halbwertsbreite und der Bruttoretentionszeit kann die Bodenzahl ermittelt werden: N th t 5,54 b B 1 Um die Länge einer Säule mit in die Bewertung einzubeziehen, kann man die Höhe eines theoretischen Bodens berechnen. Dieser Parameter Bodenhöhe H oder HETP errechnet sich nach: H L N th Je kleiner die Bodenhöhe H ist, umso besser die theoretische Trennleistung einer Säule. Eine weitere Größe zur Charakterisierung einer Säule ist die Trennzahl TZ. Sie gibt an, wie viele Substanzen maimal zwischen zwei aufeinander folgenden n-alkanen (in diesem Fall zwischen zwei Carbonsäuremethylestern) mit einer Auflösung von R = 1 eluieren können. TZ t b 0,5 R (1) t R b 1 0,5 ( ) 1 t = Nettoretentionszeit, b0,5 = Peakbreite in halber Höhe Um geräteunabhängige vergleichbare Retentionsdaten für eine gegebene Trennphase zu erhalten, wurden Retentionsindices eingeführt. Ein solches System wurde von Kováts (Kováts-Inde) eingeführt. Der Kováts-Inde I gibt die relative Lage eines Substanzpeaks zu zwei aufeinanderfolgenden homologen n-alkanen in einem Chromatogramm an. I lgt 100 z 100 lgt R' R' z1 lgt lgt R' z R' z z = Anzahl der C-Atome des vorher eluierenden Alkans, tr = Nettoretentionszeit der Substanz, tr z = Nettoretentionszeit des vorher eluierenden Alkans, tr z+1 = Nettoretentionszeit des nachher eluierenden Alkans Seite 4 von 13

5 c) Reproduzierbarkeit von manuellen Injektionen: Varianz, Standardabweichung relative Standardabweichung Die häufigste Streuungsgröße in Verteilungen ist die Varianz var () bzw. ( s ) und die Standardabweichung s der Einzelwerte. Zur Berechnung der Varianz var werden die Abweichungen jedes Wertes i einer Datenreihe vom Mittelwert [( i - )] quadriert [( i - )] und aufsummiert [ ( i - ) ]. Jede quadrierte Abweichung ist ein Maß für die Abweichung des Messwertes vom Mittelwert. Die Summe der Abweichungsquadrate wird durch den Freiheitsgrad f dividiert. var( ) ( i - ) f Der Freiheitsgrad f ist in Datenreihen die Anzahl N der Daten, vermindert um 1. Vereinfacht gibt der Freiheitsgrad f die Anzahl der Wiederholungsmessungen an. Beträgt die Gesamtzahl der Messungen z.b. N = 5, wird eine Messung als Grundmessung betrachtet, die anderen 4 Messungen dienen zur Wiederholung. Die Varianz var gibt die Streuung der Messwerte um ihren Mittelwert an. Dabei geht man vom Quadrat der charakterisierten Größe aus. Um das Ergebnis auf die ursprüngliche Einheit zurückzuführen, zieht man aus der Varianz die Quadratwurzel var ( ). Als Ergebnis erhält man die Standardabweichung s() der Einzelmessung vom Mittelwert. Die Standardabweichung kann also mit Hilfe der folgenden Gleichungen berechnet werden: s var () s ( ) i N -1 Vorsicht ist beim Berechnen dieser Kennzahlen mit dem Taschenrechner bzw. mit Tabellenkalkulationsprogrammen angebracht. Oftmals wird zur Berechnung der Standardabweichung nicht die Stichprobenstandardabweichung eingesetzt sondern die Formel: s ( ) i N Seite 5 von 13

6 Beim Vergleich von Datenreihen mit verschiedenen Größenordnungen ist die Standardabweichung als Maß für die Präzision (Streuung) alleine noch nicht sehr aussagekräftig. Daher wird die Standardabweichung auf den Mittelwert bezogen. Diese Größe wird als Variationskoeffizient V oder relative Standardabweichung (CV coefficient of variation) bezeichnet (angegeben meistens in %). V s 100% Beim Ausreißertest nach Nalimov müssen mindestens drei Daten (N>) vorliegen. Die Kontrolle erfolgt auf den kleinsten und den größten Wert. Anschließend wird eine Prüfgröße nach Nalimov berechnet und mit einem Tabellenwert verglichen. Die Prüfgröße nach Nalimov berechnet sich nach PG * s - N N -1 mit: s * N = ausreißerverdächtiger Wert = Mittelwert = Standardabweichung = Anzahl der Stichproben Prüfgrößen zum Ausreißertest nach Nalimov (Ausschnitt): Freiheitsgrad f Statistische Sicherheit 95 % 99% 99,9% 1 1,409 1,414 1,414 1,645 1,715 1, ,757 1,918 1,98 Seite 6 von 13

7 d) Detektor: Linearität und Empfindlichkeit (Kalibration, Blindwert, NWG) Beim Einsatz einer Analysenmethode ist es wichtig zu wissen, bis zu welcher unteren Grenze die Methode verwertbare Werte liefert. Das kann zum einen derart geschehen, dass Proben immer geringerer Konzentration gemessen werden, bis kein Signal mehr erkannt werden kann. Abgeschätzt kann die Nachweisgrenze aus dem Vergleich des Messsignals des Analyten im Vergleich zum Rauschen. Dabei muss das Messsignal mindestens das Dreifache des Rauschens betragen (95% Sicherheit zum Substanznachweis). Der statistisch sichere Weg geht über die Kalibrierfunktion und den Prognosebereich. Es eistieren verschiedene Vorschläge zur Ermittlung von Nachweis- und Bestimmungsgrenzen (z.b. nach DIN (Schnellschätzung) oder DFG). Allgemein gilt die Nachweisgrenze als die geringste Analytmenge in einer Messprobe, die detektiert, aber nicht quantifiziert werden kann. Die Nachweisgrenze NG nach DIN ist eine Entscheidungsgrenze. Die Bestimmungsgrenze ist die geringste Analytmenge, die mit der geforderten Präzision und Richtigkeit quantifiziert wird. Für die Ermittlung der Grenzwerte kann eine Blindprobe (Leerprobe) notwendig sein. Sie ist eine Probe, die den Analyten nicht enthält, ansonsten aber mit der Probe identisch ist. Mehrere unabhängig hergestellte Blindproben werden vermessen, der Mittelwert ist als Blindwert anzusehen. Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung des Blindwertes ist die Berechnung des Ordinatenabschnitts b in einer linearen Kalibrierfunktion mit Hilfe der linearen Regression ("Kalibrationkurvenverfahren"). Der Ordinatenabschnitt b ist die Größe des Signals y bei der Konzentration 0, was definitionsgemäß mit dem Blindwert identisch ist. Voraussetzung für die Anwendbarkeit des Kalibrationskurvenverfahrens: Alle Kalibrationsproben müssen voneinander unabhängig sein, d.h. entweder aus unabhängigen Einwaagen oder zumindest aus unabhängigen Verdünnungen aus ein und derselben Stammlösung stammen, die Kalibrierfunktion muss linear sein, die Varianzen müssen im interessierenden Arbeitsbereich konstant sein, die Konzentrationen der Kalibrierlösungen müssen genau bekannt sein und "richtig" sein, der gewählte Arbeitsbereich schließt die Bestimmungsgrenze mit ein. Seite 7 von 13

8 Ermittlung der Nachweisgrenze aus Kalibrierkenndaten - Graphische Bestimmung der Nachweisgrenze nach DIN 3645: Mathematische Bestimmung der Nachweisgrenze nach DIN 3645: (t = 1,86, einseitige Fragestellung, f = N, P = 95%) Seite 8 von 13

9 IV) Praktischer Teil Alle zur Verfügung stehende Gaschromatographen sind mit Kapillarsäulen ausgestattet, die als stationäre Phase WAX oder HP-5 besitzen (was bedeutet das?). Die Temperatur für den S/SL-Injektor wird auf 75 C und die für den Detektor wird auf 35 C gesetzt. Die weiteren Parameter sind der folgenden Tabelle zu entnehmen: GC TRACE (S/SL-GC- FID) HP 6890 (Alekto) (KAS-GC-FID) Agilent 7890A (OC- GC-FID/O) Agilent 7890A (Diva) (OC-GC-FID) Agilent 7890B (Xena) (OC-GC-FID) Säulenparameter Phase Länge Innendurchmesser Filmdicke CP-WAX 5 CB 30 m 0,3 mm 0,5 µm VF-5MS 30 m 0,5 mm 0,5 µm HP-5 30 m 0,3 mm 0,5 µm CP-WAX 5 CB 30 m 0,3 mm 0,5 µm HP-5 30 m 0,3 mm 0,5 µm 1.) Bestimmung der mittleren Strömungsgeschwindigkeit, der Totzeit und des Splitverhältnisses Mittlere Trägergasströmungsgeschwindigkeit/Splitverhältnis: Als Trägergas wird Wasserstoff verwendet. Zunächst wird der Durchfluss des geöffneten Splits (Gesamtfluss) mit einem Blasenzähler für kleine Volumina am Splitausgang bestimmt (Wiederholung mind. 3) Aufgabe: Die mittlere Trägergasströmungsgeschwindigkeit soll bei 100 C und geöffnetem Split auf 40 cm sec -1 eingestellt sein: Berechnen Sie hierzu den Trägergasfluss in ml min -1 aus der Säulendimensionierung für die angestrebte Trägergasströmungsgeschwindigkeit. Berechnen sie nun unter Berücksichtigung der berechneten Trägergasströmungsgeschwindigkeit und des gemessenen Gesamtflusses das aktuell bestehende Splitverhältnis. Seite 9 von 13

10 Anschließend wird das Splitverhältnis auf 10:1/0:1/50:1 gestellt und wiederum der Gasfluss mit dem Blasenzähler (für große Volumina) bestimmt (Wiederholung 3). Überprüfen sie nun unter Berücksichtigung der berechneten Trägergasströmungsgeschwindigkeit und des gemessenen Gesamtflusses das aktuell bestehende Splitverhältnis von 10:1/0:1/50:1. Totzeit: Die Temperatur des Säulenofens wird auf 100 C gesetzt. Ein 4-mL-Probenfläschchen mit Schraubverschluss wird mit Erdgas gefüllt und verschlossen. Mit Hilfe einer Injektionsspritze werden bei geöffnetem Split ca. 10 µl Gas in den Split/Splitless-Injektor injiziert und gleichzeitig die computergestützte Aufzeichnung gestartet. Die Ofentemperatur bleibt isotherm bei 100 C. Da diese Alkane bei 100 C von der stationären Phase nicht retardiert werden, ist die ermittelte Retentionszeit die Totzeit des chromatographischen Systems unter diesen Bedingungen. Die Messung ist mindestens dreimal durchzuführen..) Trennleistung: Trennzahl, theoretische Böden, Auflösung; Retentionsinde Die ausgegebene Testmischung enthält folgende Substanzen: -Octanon, n-tetradecan, 1-Octanol, Decansäuremethylester, Undecansäuremethylester, Naphthalen, 1-Decanol, Dodecansäuremethylester,,6-Dimethylanilin,,6-Dimethylphenol in n-hean. Zur Bestimmung der Trennleistung des vorliegenden GC-Systems (Auflösung, Bodenzahl, Trennstufenhöhe, Trennzahl) wird 1 µl der Testmischung bei geöffnetem Split zuerst isotherm bei 150 C und anschließend mit nachstehend aufgeführtem Ofentemperaturprogramm injiziert. Zum Vergleich der Split-Injektion mit einer Splitless-Injektion wird die Testmischung nochmals bei geschlossenem Split injiziert und mit dem Gradientenprogramm aufgetrennt. Die erforderlichen Messdaten zu Berechnung der Trennleistung sind dem Datenverarbeitungssystem zu entnehmen. Die Trennzahl wird aus den Elutionsdaten für Decan- und Undecansäuremethylester bestimmt. Zur Berechnung der Kováts-Indices der im Säulentest vorhandenen Substanzen wird je 1µL einer Alkanreihe (C10 bis C 5, c = 100 ng/µl bzw. C8-C0, c = 40 ng/µl) isotherm und mit dem Gradientenprogramm injiziert. Seite 10 von 13

11 Nach der Berechnung der einzelnen Parameter ist eine Diskussion/Interpretation der erhaltenen Werte anzuschließen und das bevorzugte Programm mit der besten Trennleistung zu benennen. Ofentemperaturprogramm: 60 C (3 min)//6 C min -1 /0 C (10 min) 3.) Reproduzierbarkeit von manuellen Einspritzungen: Varianz, Standardabweichung, relative Standardabweichung Möglichst genau 1 µl der obigen Testmischung ist mindestens dreimal manuell zu injizieren. Die Einspritzung erfolgt isotherm bei 150 C und geöffneten Split. Es werden der Mittelwert mit Varianz und Standardabweichung sowie der Median für alle Substanzen berechnet. Die Peakflächenberechnungen werden dann erneut unter der Annahme, dass Decansäuremethylester als Normierungsstandard zugesetzt wurde, berechnet. Danach sind erneut die Mittelwerte mit Varianz und Standardabweichungen sowie der Median für alle Substanzen zu berechnen. In beiden Messreihen ist für die Substanzen mit der größten relativen Standardabweichung ein Ausreißertest nach Nalimov durchzuführen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in einer Diskussion/Interpretation zusammenzufassen. 4.) FID: Linearität und Empfindlichkeit (Kalibration, Blindwert, NWG) Es wird je eine Stammlösung der Testsubstanzen 1-Octanol und des "internen Standards" Dodecansäuremethylester hergestellt. Von der 1-Octanol-Lösung sind folgende Verdünnungen herzustellen: 10 µg µl -1, 1 µg µl -1, sowie 100, 50, 10, 8, 6, 4,, 1 ng µl -1 ; diese sind so mit Dodecansäuremethylester zu versetzen, dass dessen Konzentration in jeder Kalibrierlösung 00 ng µl -1 beträgt. Beginnend mit der geringsten Konzentration sind jeweils 1 µl dieser Lösungen einzuspritzen. Die Ofentemperatur bleibt isotherm bei 150 C. Für 1- Octanol wird nach Korrektur der Peakflächen eine Kalibrationsgerade gezeichnet und die zugehörige Kalibrierfunktion mit Hilfe der linearen Regression berechnet. Mit Hilfe der Kalibrationsgeraden ist der Blindwert abzuschätzen. Eine statistische Auswertung der Kalibriergerade ermöglicht die mathematische Bestimmung der Nachweisgrenze. Seite 11 von 13

12 Literatur Cammann K (001) Instrumentelle analytische Chemie : Verfahren, Anwendungen und Qualitätssicherung. Spektrum Akad. Verl., Heidelberg u.a. Gey MH (008) Instrumentelle Analytik und Bioanalytik : Biosubstanzen, Trennmethoden, Strukturanalytik, Applikationen, Ed. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg Kolb B (006) Gaschromatographie in Bildern : eine Einführung, Ed. Wiley-VCH, Weinheim Lohninger H (003) Teach/Me - instrumentelle Analytik. In Springer-electronic-Media, Ed Elektronische Ressource. Springer, Berlin u.a., pp 1 CD-ROM Lottspeich F, Engels JW (006) Bioanalytik. Elsevier (Spektrum Akademischer Verlag), Heidelberg Rücker G, Neugebauer M, Willems GG (008) Instrumentelle Analytik für Pharmazeuten. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart Schwedt G, Schreiber J (007) Taschenatlas der Analytik, Ed 3., überarb. und erw. Aufl. WILEY- VCH, Weinheim Schwedt G (1995) Analytische Chemie: Grundlagen, Methoden und Prais. Thieme, Stuttgart u.a. Skoog DA, Leary JJ (1996) Instrumentelle Analytik. Springer, Berlin, Heidelberg Seite 1 von 13

13 Allgemeine Angaben zu Versuchsprotokollen Institut für Lebensmittelchemie Prinzip In -3 Sätzen darstellen, worum es bei dem Versuch geht und was das Versuchsziel ist Durchführung Die Durchführung des Versuches ist bereits im Skript angegeben. Stellen Sie hier nur wesentliche Abweichungen dar. Die Abweichungen sollten nachvollziehbar sein und begründet werden. Rohdaten Hier sind sämtliche eperimentellen Daten wie Einwaagen, Verbrauch an Maßlösung, Verdünnungen, Chromatogramme, Spektren etc. anzugeben bzw. darauf zu verweisen (Chromatogramme können auch in einen Anhang gegeben werden) Auswertung und Berechnung Hier muss schlüssig aus den Rohdaten das Ergebnis abgeleitet werden (ggf. mit Strukturformeln und Reaktionsgleichungen). Insbesondere sind sämtliche Berechnungen, die zum Ergebnis geführt haben, nachvollziehbar darzustellen! Ergebnis/Schlussfolgerung/Diskussion Was ist das Versuchsergebnis und wie ist diese zu bewerten? Fallen beim Vergleich mit literaturbekannten Werten Unterschiede auf? Wie kommen die Unterschiede zustande? Literatur Angabe der verwendeten Literatur. Bitte verwenden Sie nur vertrauenswürdige Quellen; ausschließliches Googlen bzw. Kopieren von Wikipedia-Artikeln oder von Seiten, die Wikipedia spiegeln, wird nicht akzeptiert! Verwenden Sie die im Praktikumsskript angegebene Literatur bzw. Literatur aus der TIB! Anhang Hier kommen evtl. Chromatogramme, Spektren, eportierte Gerätedaten wie Peakflächentabellen o. Ä. rein. Anmerkung Quellen müssen korrekt zitiert werden! Achten Sie beim Protokoll auf eine kurze und prägnante Darstellung von Sachverhalten (keine Ich -form, keine seitenlangen Diskussionen) Seite 13 von 13