FEI-Themenworkshop Ernährungsfragen im Fokus der industriellen Gemeinschaftsforschung

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1 FEI-Themenworkshop Ernährungsfragen im Fokus der industriellen Gemeinschaftsforschung Prozessgestaltung und optimierung für bioaktive Lebensmittelinhaltstoffe am Beispiel Caseinomakropeptid Ulrich Kulozik Lehrstuhl für Lebensmittelverfahrenstechnik und Molkereitechnologie Technische Universität München Center of Life and Food Science Freising-Weihenstephan

2 Funktionelle Eigenschaften von Proteinen und Polysacchariden Technologisch (Bspe.) Schaumstrukturen Löslichkeit (echt/kolloidal gelöst) Temperaturwechselstabilität Serumbindung Viskositätserhöhung Gelbildung/Vernetzung Schaumbildung Emulsionsbildung Grenzflächenaktivität/ Grenzflächenstabilisierung Originär physiologisch Bindungs-/Transport-/Vorrats-/Immunfunktion Gelstrukturen Sekundär physiologisch Sensorisch Bioaktiv: Gesunderhaltend/präventiv, physiologischer Zusatznutzen ( Functional Food ) (Therapeutisch)

3 Die Herausforderung: Gewinnung, Verarbeitung und Nutzen der Stoffe unter Erhalt oder Steigerung der (Bio-)Funktionalität! Beispiel: Natürliches Glykoprotein oder Glykopeptid Inhärente Eigenschaften: - Zusammensetzung -Struktur - Nettoladung - Hydrophobizität Externe Faktoren: Matrix: -Fette -Zucker -Salze - Proteine Chemisch-Physikalische Funktionalität - Temperatur -ph -Salze - Konzentration Physiologische Einflüsse: - Verdauung - Resorption - Transport - Stoffwechsel Theoretische Biologische Funktionalität Tatsächliche Bioaktivität Verarbeitungsverfahren: - Homogenisieren - Erhitzen - Gefrieren - Lagern

4 Vorkommen von Glykoproteinen Glykoproteine Eukaryotische Zellen (Tiere, Pflanzen, Pilze, Protisten) Bakterien Viren Lebensmittel Enzyme Hormone Serumproteine Sekretbestandteil Membranbestandteil Lösliche Blutgruppensubstanzen Hüllproteine Geißelproteine Polysaccharidabbauende Enzyme Hüllproteine Milch Ei Fleisch Fisch Pilze Obst Gemüse

5 Beschriebene humanphysiologische Wirkungen Kardiovaskuläres System Nervensystem ACE-hemmend Antioxidativ Antithrombotisch Cytomodulierend Antibakteriell Anti-inflammatorisch Immunmodulierend Opioid Mineralbindend Immunsystem Gastrointestinales System

6 Vom Protein zum Peptid Vorläuferprotein Freisetzung der Peptidsequenz als Fragment aus dem Gesamtprotein durch möglichst gezielte enzymatische Hydrolyse Verdauungsenzyme im Darm Mikrobielle Fermentation Enzyme (aus best. Mikroorganismen) Downstreaming Peptid

7 Glykoproteine in Milch I Caseinomakropeptid (CMP) Lactoferrin - Erhöhung der Bioverfügbarkeit von Eisen - Immunmodulatorische Wirkung, Prebiotische Wirkung - Antimikrobielle Eigenschaften, Antioxidative Wirkung - Gewinnung mittels Kationenaustauschchromatographie aus Magermilch oder Molke Proteose Pepton 3 (Lactophorin) - Antimikrobielle Wirkung - Präbiotikum, Kalziumhaushalt Osteopontin - Kalziumhaushalt, Osteoporoseprophylaxe - Gewinnung mittels Anionenaustauschchromatographie aus Molke

8 Glykoproteine in Milch II Angiogenin-2 Glycolactin Lactogenin Beta 2 -Microglobulin Prosaposin Metall bindende Proteine - Transferrin (Eisen), Ceruloplasmin (Kupfer) Vitamin bindende Proteine - Folsäure, Vitamin D, Vitamin B12, Riboflavin Glykoproteine der Milchfettkugelmembran - PAS-I, PAS-3, PAS-4, Butyrophilin, BRCA-1, MUC-1, CD-36

9 Bioaktivitätspotenzial von Bestandteilen der Milchfettkugelmembran Es wird berichtet, dass die native Milchfettkugelmembran neben guten Emulgiereigenschaften zahlreiche gesundheitsfördernde Eigenschaften aufweist. Einsatz der MFGM als Nutraceutical

10 Modell zum Aufbau der Caseinmicelle d= nm Submicelles d=10-20 nm κ-casein para- κ-casein Caseinomacropeptide Calcium phosphate

11 Beispiel: Caseinomakropeptid Hydrophiler Teil von κ-casein (genetische Varianten) Glykosilierungsmuster Konzentration: 1,2 2,5 g/l Milch MG: 7-9 kda Ca. 50% glykosyliert (u.a. Sialinsäure)

12 Glycosylation of CMP NeuNAc 1 Met - Thr - Ala - Ile - Ile - Asn - Pro - Thr - 5 Pro - 20 Ile - Lys - NeuNAc Gal Ala - Lys - Ser - Asn - Gly - Gln - Glu - 10 Asp - Gal Lys - GalNAc 25 Pro - Thr - Thr - Ser - Glu - Ile - NeuNAc Thr - Pro - 15 Gal Pro - GalNAc 30 Thr - Thr (Ile) Glu - -Ser- Val - -Glu- Val - Ala - Ile - NeuNAc GalNAc 35 Val - Glu - Ser - Thr - 50 Glu - Ser - Pro - GalNAc Pro - Val - Glu - Ala - Ile - 40 Thr - 55 Asn - Leu - Thr - Glu - GalNAc Asp (Ala) Gal Val - Gln - 45 Pro - 60 Thr - Ser - Thr - Ala - 64 Val. Gal Gal NeuNAc GalNAc Point of saccharide attachment Galactose Sialic acid N-Acetylgalactosamine % of CMP is not glycosylated % of CMP contains glycosidic linked carbohydrate chains = GMP variations in: point of attachment type degree

13 Physiological and biological properties of CMP Activity / Property Absence of Phenylalanine Absence of aromatic amino acids, rich in branched-chain amino acids Inhibition of gastric secretion and motility Growth promotion of Bifidobacteria Reduction of activity of osteoclasts and increase of activity of osteoblasts Inhibition of blood clotting Application Protein source for PKU - patients Dieting aid by liver diseases Dieting aid Inhibition of colonisation of pathogenic microbes Prevention of osteoporosis Prevention of thrombosis Inhibition of adhesion of oral microbes Protection against dental plaques and decay Brody, E.P. (2000); Abd El-Salam, M.H. et al. (1996)

14 Release of CMP during renneting hydration layer Chymosin κ-casein CMP "para-casein micelle" CMP Aggregation of the casein micelles via Ca 2+ -bonds whey/serum Milk: 3,3 4,5 g/l κ-casein (10 15 % of total protein) 1,2 2,5 g/l CMP ( 4 6 % of total protein) Sweet whey: 1,0 2,5 g/l CMP (15-20 % of total protein)

15 Möglichkeiten der Aufreinigung von Glykoproteinen Kristallisation Chromatographie Fällung Membrantrenntechnik Zentrifugation Extraktion Filtration

16 Caseinomakropeptid - Gewinnung Milch Enzymatische Koagulation Membrantrenntechnik Chromatographie Süßmolke Hitzedenaturierung Molkenproteine Enzymatische Quervernetzung ph-einstellung Caseine enzymatische Hydrolyse CMP-reiches Serum CMP Membrantrenntechnik CMP Membrantrenntechnik CMP

17 Glykoproteine: Beispiele für Ansätze im Rahmen von FEI/AiF-Vorhaben Technische Fragestellungen mit Bezug zur Bioaktivität am Beispiel von Glykoproteinen: Prozess- und Milieufaktoren mit Einfluss auf deren Glykosilierung? Mit welchen Methoden sind einzelne Fraktionen abtrennbar und sinnvoll zu gewinnen? Technische Funktionalität, Einflüsse auf/verhalten in unterschiedlichen Matrices (Nutzbarkeit von Eigenschaften über Bioaktivität hinaus)? Wie können bioaktive Substanzen in Lebensmittelsysteme integriert werden und üben sie einen förderlichen bzw. störenden Einfluss auf die Produktmatrix aus? Welche Möglichkeiten zum Schutz und zu kontrollierter Freisetzung gibt es? Scale-up und Strukturerhalt der bioaktiven Wertkomponenten Entwicklung neuer, abgeleiteter Substanzen, z.b. aus Maillard-Reaktion

18 Caseinomakropeptid Technologisch funktionelle Eigenschaften Molekulare Eigenschaften - Keine Sekundärstruktur - Extrem hitzestabil - Hohes Wasserbindevermögen - Leicht amphiphiler Charakter Grenzflächeneigenschaften beim Aufschäumen und Emulgieren 0,0 Sehr gute Schaumbildungseigenschaften - Werden kaum vom Milieu beeinflusst - Synergistische Effekte mit Molkenproteinen 1,2 1,2 1,1 1,0 1,0 0,9 0,8 0,8 0,7 0,6 0,6 0,5 0,4 0,4 0,3 0,2 0,2 0,1 c t /c 0 [-] heating time [min] 120 C whole CMP Glyco-CMP CMP A CMP B Overrun / % Eiweiß C Protein / % CMP WPI Drainage/ % C CMP /C total Pro. / - Hühnereiweiß (Festigkeit) Hühnereiweiß (Drainage) Drainage Schaumfestigkeit Schaumfestigkeit / mn [Thomä, 2006]

19 Caseinomakropeptid Weihenstephaner Verfahren Magermilch MF-Diafiltration Casein- Konzentrat Labfällung Caseinkoagulat (Käsebruch) Permeat CMP-freie Molke CMP-reiche Molke UF Wasser MF Caseinstaub Molkenproteine UF UF-Permeat CMP-Konzentrat Glyco-CMP Aglyco-CMP Ionen- Chromatographie

20 Fragen?

21 Starterkulturen Definition und Einsatzzwecke Starterkulturen sind selektierte, definierte und lebensfähige Mikroorganismen in Rein- oder Mischkultur. Sie werden Lebensmitteln in der Absicht zugesetzt, den Herstellungsprozess gezielter, sicherer, schneller und standardisiert zu gestalten. Gasbildung Aromabildung Starterkultur Texturbildung durch Säuerung Lactobacillus sp. Haltbarmachung durch Säuerung Health Effects (Probiotika)

22 Eigenschaften und Aufgaben von Mikroorganismen in der Lebensmittelindustrie Starter-, Schutzkulturen und Probiotische Keime Technologische und biologische Funktionalität Handelsformen Flüssig Gefroren Hohe Lagerstabilität Getrocknet Kostengünstiger Transport Trocknungsverfahren Sprühtrocknung Vakuumtrocknung Wirbelschichttrocknung Gefriertrocknung Wirksamkeit und Aktivität abhängig von der Vitalität!

23 Einflussfaktoren auf die Vitalität der Mikroorganismen während Herstellung und Einsatz Spezies Physiologischer Zustand der Zellen Wachstumsbedingungen Anfangszellkonzentration Konservierungsprozess Gefriertrocknungsprozess Verhalten im Produkt/Lagerbedingungen Rehydratisierungsbedingungen Trocknungsbedingungen Prozessparameter Zusammensetzung des Trocknungsmediums Schutzstoffe 3

24 Verfahrenstechnik der Konservierung Verfahrenstechnik der Ferm entation - kontinuierlich - batch (mit/ohne Neutralisation) - M ethoden der Zellretention Rehydratationsbedingungen Forschungsgebiet Verfahrenstechnik der Konservierung Maßnahmen zum Auslösen von natürlichen Schutzmechanismen (biologische Schutzmechanismen) - Stressproteine Verfahrenstechnik der Konservierung - Trocknungsmethode - Prozessparameter (Trocknungsrate, Temperatur, Druck, etc.) Lagerungsbedingungen M edienzusammensetzung Anwendung von Schutzstofflösungen (physikalische Schutzmechanismen) Pufferung/pH-Wert Nährstoffe Kohlenhydratkonzentration

25 Ausblick: Mikroverkapselung probiotischer Keime mittels enzymatisch induzierter Gelbildung von Milchproteinen Ausgangssituation und Zielsetzung Bedeutung von LM mit gesundheitlichem Zusatznutzen steigt stetig. Bei probiotischen Keimen ist die Vitalität essentiell für die Wirkung. Umsatz probiotischer Milchfrischerzeugnisse in Deutschland 485 Mio Derzeit jedoch noch je nach Keimart hohe Keimabsterberaten. Die meisten Mikroverkapselungstechniken eignen sich nicht für sensitive Kernmaterialien; Schlüsselfaktor: Verfestigung der Kapselhülle 75 Mio Ziel: Verfahren zum Einschluss in wasserunlösliche Mikrokapseln mit hohem Vitalitätserhalt der Keime während Trocknung, Lagerung, im Produkt und im GI-Trakt: Emulgieren mit anschließender Vernetzung der Proteine. Lösungsansatz: Vernetzung der Milchproteine als Hüllmaterialien Stabilisierender Einfluss von Proteinen auf probiotische Keime ist bekannt. Ideale physiko-chemische Eigenschaften für die Mikroverkapselung. Nach dem Herstellen von Proteintropfen durch einen Emulgierschritt wird durch enzymatisch induzierte Gelbildung eine Mikroverkapselung von probiotischen Keimen ermöglicht.

26 Mikroverkapselung mittels Emulsionstechnik mit nachfolgender enzymatischer Vernetzung Protein Hydrophiles Kernmaterial Enzymzugabe -Chymosin oder - Transglutaminase H 2 O Öl Emulgieren Kapseln Trocknung oder Direkteinsatz Zentrifugation oder Filtration und Ölabtrennen Überführen der Protein-Hüllmatrix in einen unlöslichen Zustand: Auslösen der Gelbildung durch Temperaturführung

27 Mikroverkapselung probiotischer Keime mittels enzymatisch induzierter Gelbildung von Milchproteinen Innovative Konzepte Zwei neuartige Prozesse zur Verkapselung von probiotischen Keimen in Milchproteinkonzentraten und Quervernetzung mittels Chymosin bzw. Transglutaminase in hohem Durchsatz. Herstellung neuartiger, bisher nicht verfügbarer Mikrokapseln mit optimierten Eigenschaften und hohem Anwendungspotential: Steigerung der Überlebensraten verkapselter Keime durch Milchproteinmatrix. Wasserunlöslich, längere Lagerperioden in flüssigen Produkten möglich. Einsatz auch in Trockenprodukten möglich. Natürliches Milchprotein als Hüllmaterial. Methodisches Vorgehen Entwicklung von steuerbaren, reproduzierbaren Verkapselungsprozessen mittels W/Ö-Emulsionstechnologie. Untersuchung relevanter Produkt- und Prozessparameter (Kapselgröße, Einschluss von Präbiotika, Keimart). Analytische Bewertung der Mikrokapseln bezüglich verschiedener, an der Praxis orientierten Stresssituationen.