1. Symposium Urologische Forschung der Deutschen Gesellschaft für Urologie

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1 Urologie aktuell Urologe 2010 [jvn]:[afp] [alp] DOI /s Springer Medizin Verlag Symposium Urologische Forschung der Deutschen Gesellschaft für Urologie München, 12. bis 14. November 2009 Abstracts Redaktion Dr. rer. nat. Christoph Becker Forschungskoordination, Deutsche Gesellschaft für Urologie e.v., Düsseldorf Abstract Session 1 Moderation: Susanne Füssel, Bernd Wullich V1. 1 3D-Sonographie und standardisierte Zellinokulation bei der Etablierung eines orthotopen Prostatatumormodells an der Nacktmaus Saar M 1, Jung V 1, Kamradt J 1, Körbel C 2, Stöckle M 1, Menger MD 2, Unteregger G 1 1) Klinik für Urologie und Kinderurologie, Universitätsklinikum des Saarlandes, DE 2) Institut für Klinisch-Experimentelle Chirurgie, Universitätsklinikum des Saarlandes, DE Orthotope Inokulationen von Tumorzellen in Nacktmäuse dienen in der onkologischen Forschung als ideales in-vivo Modell. Für das Prostatakarzinom ist die Technik beschrieben, die Methodik ist jedoch nicht standardisiert. Des Weiteren liegt bisher wenig Erfahrung zur nicht-invasiven Beurteilung des Tumorwachstums vor. Nach Etablierung eines standardisierten Protokolls zur Inokulation von Prostatakarzinomzellen und sonographischem Monitoring des Tumorwachstums haben wir uns mit dem Wachstumsverhalten verschiedener Zelllinien im orthotopen Mausmodell beschäftigt. 30 Crl:CD1-Foxn1nu Mäuse wurden in 4 Gruppen unterteilt. Nach Laparotomie wurden standardisiert 10µl Zellsuspension der Tumorzelllinie DU 145 MN1 inoculiert. Die Gruppen variierten in der Zellzahl (5x105 vs. 5x104), der Anzahl der intraprostatischen Punktionen (1 vs. 3) und durch die Zugabe von MatrigelTM. Komplikationen wie Rückfluss von Zellen über den Punktionskanal oder Perforation der Prostatakapsel wurden dokumentiert. Nach 4, 5 und 6 Wo. wurde das Tumorwachstum mittels 35MHz-Ultraschall dokumentiert. Am gleichen Modell wurde unter Verwendung von Balb/cnu Mäusen und ebenfalls successive reduzierter Zellzahl ein Wachstum von Ln- CaP-Tumoren induziert. 90% der Foxn1nu Mäuse zeigten ein orthotopes Tumorwachstum welches im 3D-Ultraschall über den gesamten Beobachtungszeitraum zuverlässig quantitativ dargestellt werden konnte. Es zeigte sich eine gute Korrelation zwischen Tumorvolumen und Zellzahl mit grösstem Tumorvolumen nach Inoculation von 5x105 Zellen unter die Kapsel eines einzelnen Prostatalappens (260.7mm3 ± 50.4 mm3). Die simultane Injektion von Matrigel bewirkte hier eine Reduktion des Tumorvolumens. Komplikationen wie Rückfluss der Zellsuspension (6,8%) oder Kapselperforation (1,4%) waren selten. Nach Einsetzten der LnCaP-Zellinie zeigt sich mit Reduktion der Zellzahl eine Abnahme der initial 100%igen Take rate sowie des Tumorvolumens. Eine standardisierte Inokulationstechnik erlaubt hohe, reproduzierbare Anwachsraten orthotoper Prostatatumore in der Maus. Hierbei spielen multiple Variablen bei der erfolgreichen Induktion von Tumoren eine Rolle. Die Sonographie erlaubt ein repetitives, nicht invasives Monitoring des Wachstums sowie eine Quantifizierung des Tumorvolumens. Die diesbezüglich gemachten Erfahrungen sollen den Autoren helfen, ein in-vivo Modell unter Nutzung humanen Primärmaterials zu etablieren, um zum einen das Gewebe zu expandieren, zum anderen das biologische Wachstum, die Progression und sowohl das invasive als auch das metastatische Potential der Tumoren zu charakterisieren. V1. 2 Optische Bildgebung zur genaueren Erfassung des klinischen Tumorstadiums beim Prostatakarzinom Eismann T 1, Rinnab L 1, Landfester K 2, Hibst R 3, Kienle A 3, Mailänder V 4, Strauss WSL 3, Hautmann R 1, Kuefer R 1 1) Universitätsklinik für Kinderurologie und Urologie, Universität Ulm, DE 2) Max Planck Institut für Polymerforschung, Mainz, DE 3) Institut für Lasertechnologie in der Medizin und Messtechnik, Universität Ulm, DE 4) Abteilung für Transfusionsmedizin, Universitätsmedizin der Johannes Guthenberg-Universität, Mainz, DE Einleitung: Die Zuverlässigkeit der Bildgebung zur Erfassung eines exakten klinischen T-Stadiums beim lokalisierten Prostatakarzinoms (PCA) ist stark limitiert. Dies ist aber in Anbetracht der unterschiedlichen kurativen Therapieoptionen und sogar unterschiedlicher Operationstechniken von hoher klinischer Relevanz. Die Einschränkungen beruhen nicht nur auf einer nicht ausreichenden Auflösung im Gewebe, sondern auch auf der mangelnden Spezifität. Material und Methoden: Ziel ist die Entwicklung neuartiger Polymerbasierter Sonden, die Peptidsequenzen beinhalten, die von gewebeständigen Prostatakarzinom-spezifischen Enzymen gespalten werden können. Die Spaltung des Polymers führt zu einer Freisetzung von Fluorophoren, die dadurch eine hochauflösende, karzinomspezifische Detektion mittels (Laser)Licht einer definierten Wellenlänge erlauben. Ergebnisse: Es wurde ein neuartiges Konzept der heterophasen Polymerisierung entwickelt (K.L.). Auf diese Weise können Polymer-basierte Sonden mit unterschiedlichen Eigenschaften generiert werden, die - bedingt durch den Herstellungsprozess - eine geringe Größenvariabilität aufweisen und zudem wasserlöslich sind. Es wurden Peptidsequenzen identifiziert (T.E., R.K.), die gezielt synthetisiert und in die Polymersequenz der Polymerkapseln integriert werden können. Diese Peptide werden von Proteasen gespalten, die spezifisch beim Prostatakarzinom hochreguliert sind. Durch diesen Prozess werden Fluorophore aus den Polymerkapseln freigesetzt, die mit (Laser)Licht zur Fluoreszenz angeregt werden können. Der Urologe

2 Schlussfolgerung: Diese am Anfang ihrer Entwicklung stehende Technologie erscheint revolutionär für eine karzinomspezifische, nicht-invasive Bildgebung. V1. 3 PEG-biotinylated magnetoliposomes for cell labeling and MRand optical imaging Hodenius MAJ 1, Schmitz-Rode T 1, Baumann M 1, Ivanova G 1, Wong JE 2, Hieronymus T 3, Schwarz S 3 1) Applied Medical Engineering, Helmholtz Institute, RWTH Aachen University, DE 2) Department of Physical Chemistry, RWTH Aachen University, DE 3) Department of Cell Biology, University Hospital, RWTH Aachen, DE Introduction: Magnetoliposomes (MLs) are superparamagnetic magnetite nanoparticles with a biocompatible liposome coat, which enables their potential in vivo application. In this work, the ML surface was modified with functional PEG-biotin groups. The ML-biotin were evaluated for binding capacity of streptavidin conjugates, MR relaxivities, and intracellular faith using HeLa cancer cells as a model. Materials and Methods: The ML-biotin were were prepared by dialyzing aqueous, oleate stabilized ferrofluid with DMPE-PEG-biotin containing liposomes. The ML-biotin s MR relaxivities r1 and r2 were measured with a 3 T MRI scanner. PEG-biotin was detected by binding streptavidin alkaline phosphatase conjugate (SAP) and quantifying enzyme activity spectrophotometrically. In a similar way, fluorescent streptavidin-fitc was bound and in HeLa cells internalized ML-FITC were visualized with fluorescence microscopy. Lysosomes were stained with LysoTrackerRed. Results: The ML-biotin s iron concentration was 0,47±0,02 mg Fe/mL and a phospholipid concentration of 0,11±0,01 mmol/ml proved the presence of the phospholipid coat. Concentration dependent MR relaxometry revealed r1- and r2 values of 3,1±0,2 mm-1 s-1 and 465,1±8,8 mm-1 s-1 respectively, typical for T2/T2* iron oxide based MRI contrast agents. To check for biotin groups, increasing SAP amounts were added to 1,5 ml portions of ML-biotin. After 2 h, SAP excess was removed and the hydrolysis velocity of colorless p-nitrophenylphosphat to yellow p-nitrophenolate was followed. For each experiment, binding of at least 70 % of the original SAP-amount bound to ML-biotin was calculated. Similarly, streptavidin-fitc was bound to the ML-biotin and HeLa cells were 24 h incubated with the resulting ML-FITC conjugates. After removal of excess ML-FITC, green FITC- and red LysoTrackerRed-fluorescence were visualized separately within the HeLa cells with fluorescence microscopy. Merging of both images gave abundantly yellow stainings showing a colocalization of both ML-FITC and LysoTrackerRed in the lysosomes. Conclusion and perspectives: The potential of ML-biotin for cell labeling and tracking with MR- and optical imaging is shown. The modifiable liposome coat offers the perspective for coupling PSMA antigen specific antibodies or aptamers to the ML-surface. This enables specific ML accumulation in prostata carcinoma cells and their subsequent imaging, either after previous ex vivo cell labeling or in vivo after intravenous application of bare MLs. V1. 4 Sec62 protects prostate cancer cells against thapsigargin treatment Greiner M 1, Kreutzer B 2, Kopsch K 1, Müller A 1, Unteregger G 2, Jung V 2, Wullich B 3, Zimmermann R 1 1) Institute for Medical Biochemistry und Molecular Biology, University of Saarland, Homburg/Saar, DE 2) Department of Urology u. Paediatric Urology, University Hospital of Saarland, Homburg/Saar, DE 3) Department of Urology, University Hospital, Erlangen, DE In our previous studies we showed an amplification of the TLOC1/Sec62 Gene and an over expression of respective mrna in prostate cancer cell lines. We also reported that about half of a patient group we investigated showed a higher Sec62 protein level in the tumor tissue compared to the corresponding normal tissue and that the overall protein level of Sec62 is higher in prostate cancer patients compared to non prostate cancer patients. This indicates, that Sec62 protein overproduction is a wide spread phenomenon in prostate cancer albeit not all patients show this phenotype. Now we investigated the influence of Sec62 over production and Sec62 depletion by sirna treatment on the cellular response to ER-stress inducing drugs like thapsigargin or tunicamycin. In our first experiment we tested whether the thapsigargin induced depletion of AR in LNCaP-cells results in a loss of the stimulating effect by DHT on the growth of these cells in a real time cell monitoring approach. Indeed the DHT stimulation of LNCaP growth was completely disabled after treatment with thapsigargin but not with tunicamycin. Silencing of Sec62 did not lead to a prevention of DHT stimulation, but thapsigargin induced ER-stress lead to a complete growth inhibition in Sec62 silenced cells and LNCaP-cells could not grow in the absence of DHT after Sec62 silencing. This indicates an additive negative effect on cell growth of Sec62 silencing and the deactivation of hormone stimulation either by removing DHT or by depleting the AR. In the hormone independently growing cell lines PC3 and DU145 we compared the induction of apoptosis after tunicamycin or thapsigargin treatment, because DU145 has been shown to overproduce Sec62 protein. These experiments showed, that unhandled ER-stress after thapsigargin treatment lead to an apoptosis induction below 30 % in DU145-cells compared to over 90 % in PC3-cells. Again control experiments with tunicamycin did not show a reduced apoptosis induction of DU145-cells indicating that DU145-cells are somehow protected only against thapsigargin but not tunicamycin induced ER-stress. To also test what happens after Sec62 depletion we treated PC3- cells with Sec62 sirna and thapsigargin or tunicamycin and used a viability assay and again the real time moitoring of cell growth as a read out. In this set of experiments we found an additive negative effect of Sec62 silencing and thapsigargin treatment on cell viability and on cell growth which again could not be seen after tunicamycin treatment after Sec62 silencing. Summarizing our results we found a protective effect of Sec62 in the analyzed cell lines. This is of particular interest for prostate cancer because it may lead to a reduced therapeutic success for prostate cancer patients medicated with thapsigargin or similar acting substances if these patients belong to the group that overproduce Sec62. V1. 5 Einfluss von Sec62-Silencing auf das Invasionsverhalten von Prostatakarzinomzellen Jung V 1, Kreutzer B 1, Greiner M 2, Kamradt J 1, Unteregger G 1, Stöckle M 1, Zimmermann R 2, Wullich B 3 1) Klinik für Urologie, Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg/Saar, DE 2) Institut für Medizinische Biochemie und Molekularbiologie, Universität des Saarlandes, Homburg/Saar, DE 3) Klinik für Urologie, Universitätsklinikum, Erlangen, DE Sec62 ist ein in der Membran des ER lokalisiertes Protein, welches mit dem Sec61-Komplex (verantwortlich für die Proteintranslokation) assoziiert ist. In früheren Studien konnten wir eine Amplifikation und Überexpression von Sec62 in Prostatakarzinomen auf DNA, mrna und Proteinebene nachweisen. Die pathophysiologische Funktion dieser veränderten Sec62 Expression in der Pathogenese des Prostatakarzinoms ist noch völlig unklar. In dieser Arbeit haben wir deshalb das Invasionsverhalten Sec62 depletierter PC3 Zellen untersucht und mit Hilfe von Microarrays differentiell exprimierte Gene nach Sec62 Silencing gesucht. In der Prostatakarzinomzelllinie PC3 wurde RNAi basiert das Sec62 Gen depletiert. Unter Verwendung eines Matrigel Invasions Assays wurde das invasive Wachstumsverhalten von PC3 Zellen nach Silencing von Sec62 mit Kontroll-siRNA tranfizierten Zellen verglichen. In einem Parallelansatz wurde 48h nach Transfektion die mrna aus den sirna transfizierten PC3 Zellen isoliert auf 35K Microarrays hybridisiert. Differentiell exprimierte Gene wurden mit einer GO-Analyse klassifiziert und einzelne Gene mittels qrt-pcr validiert. Im Invasionsassay konnte eine signifikante Hemmung des invasiven Wachstums (96%) durch das Sec62 Silencing in den PC3 Zellen beobachtet werden. Die Mikroarrayuntersuchungen zeigten einige differentiell exprimierte Gene, 2 Der Urologe

3 Urologie aktuell die in der GO-Analyse vermehrt den Gruppen Migration und Zellbewegung zugeordnet wurden. In der qrt-pcr konnten alle sechs untersuchten Gene, die entweder aus den o.g. GO-Gruppen stammen (HMOX1, IGFBP3) oder aber bereits als Karzinogenese assoziiert beschrieben wurden (TOB1, RELN, CA9, REG4), validiert werden. Mit der vorliegende Studie konnten wir zeigen, dass die Hemmung eines ER Membran Proteins das Invasionsverhalten von Prostatakarzinomzellen beeinflusst und ein verändertes Expressionsmuster Karzinogenese-relevanter Gene bewirkt. Ob es sich hierbei um ein Prostatakarzinom spezifisches Phänomen oder um einen allgemeinen tumorassoziierten Mechanismus handelt, ist Gegenstand laufender Untersuchungen. Gefördert durch Deutsche Krebshilfe und Stiftung Europrofession V1. 6 Dickkopf-3 supports proliferation and fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in the diseased prostatic stroma Zenzmaier C, Sampson N, Berger P Institute for Biomedical Aging Research, Austrian Academy of Sciences, Innsbruck, A Dickkopf-3 (Dkk-3), a secreted glycoprotein that unlike the other members of the Dkk family does not modulate Wnt signaling, is expressed in normal prostate epithelium, but expression is lost in benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate carcinoma (PCa). This loss is counterbalanced by upregulation of Dkk-3 expression in the blood vessels of the surrounding stroma. To evaluate applicability of these expression changes as a marker for prostatic diseases in body fluids monoclonal antibodies against Dkk-3 were generated and a highly specific and sensitive indirect IEMA was developed. Subsequently Dkk-3 plasma and seminal plasma (SMP) levels in patients suffering from BPH or PCa and age matched controls were analyzed. Dkk-3 plasma levels were elevated in BPH (2.26 ± 0.08 nmol/l) and PCa (2.26 ± 0.09 nmol/ l) patients compared with control probands (1.88 ± 0.11 nmol/l). Additionally, determining Dkk-3 levels in SMP allowed discrimination of benign and malignant prostatic conditions in patients with elevated serum PSA levels. Patients with biopsy-confirmed PCa had a significantly higher level of Dkk-3 in SMP compared with men with negative biopsies (138 ± 35 pmol/g vs. 51 ± 12 pmol/g). BPH and PCa are associated with stromal remodeling in particular hyperproliferation and fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation, which promotes disease progression via elevated secretion of mitogenic cytokines and growth factors. We investigated the influence of Dkk-3 on the stromal compartment of the prostate in vitro by lentiviral overexpression and shrna mediated downregulation of DKK3 in primary prostate stromal fibroblasts (PrSC). While overexpression did not significantly alter cell proliferation, knockdown of DKK3 led to significantly reduced cellular growth as determined by BrdU incorporation and WST-1 assays. Concomitantly, expression of various CDK inhibitors was increased in DKK3 knockdown cells. Moreover, DKK3 knockdown but not overexpression reduced the efficiency of TGFβ1 to induce fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation. These findings demonstrate that Dkk-3 supports hyperproliferation and transdifferentiation of PrSC, both hallmarks of stromal tissue remodeling in BPH and PCa. V1. 7 Prostate specific deletion of the mismatch repair (MMR) gene Mlh1 in mice cause neoplastic alterations of the prostate Kneitz, Reiß C, Adam P, Ströbel P, Spahn M, Riedmiller H Department of Urology and Paediatric Urology, University Medical School, Würzburg, DE Defects in the mismatch repair system have been identified in prostate cancer. In addition a prognostic role for altered expression in mismatch repair genes has been suggested in colorectal cancer as well as in prostate cancer. To understand the molecular basis of prostate cancer (PCa) development, progression and metastasis caused by MMR defects we generated a mouse model to disrupt Mlh1 by Cre/loxP mediated recombination exclusively in prostate tissue. Pathways mediated by Pten are frequently altered in prostate carcinoma. To test in addition synergistic effects of Pten deficiency and defects of the MMR system in prostate cancer development we inactivated both, Pten and Mlh1, in the prostate epithelium of the mouse. We showed an efficient and specific deletion of MLH1 in prostate epithelium of the Mlh1p-/- mouse. Inactivation of Mlh1 in the Mlh1p-/- mouse leads to prostatic intraepithelial neoplasia after 52 weeks of age. Thus our study demonstrate that loss of MMR activity in the epithilial cells of mouse prostate causes early stages of prostate cancer at late latencies. It was already shown that loss of Pten in mouse prostate epithelium leads to neoplastic transformation in prostate tissue. Inactivation of both Pten and Mlh1 in mice results in rapidly developing prostatic intraepithelial neoplasia. We found initiation stages of prostate cancer with intraephithelial neoplasia, followed by progression into invasive adenocarcinomas with defined kinetics. Using this mouse lines we generated unique models to study PCa development caused by MMR defects. Our results demonstrate that loss of Mlh1 mediated MMR activity causes initiation of hyperproliferative prostate disease followed by neoplastic alterations of the prostate with late latencies. In addition we found a synergy of Mlh1 and Pten deficiency for the development of prostate cancer. This new mouse models should be valuable for providing new genetic and molecular insight in the pathogenesis of MMR defective prostate cancer. Abstract Session 2 Moderation: Roman Nawroth, Gerhard Unteregger V2. 1 Einfluss der Gesamt-RNA-Integrität auf die Quantifizierung von micrornas Schaefer A 1,2,3, Jung M 1, Steiner I 1,2, Lein M 1,2, Erbersdobler A 4, Stephan C 1, Miller K 1, Jung K 1,2 1) Institut für Urologie, Charité.- Universitätsmedizin, Berlin, DE 2) Berliner Institut für Urologische Forschung, Berlin, DE 3) Fachbereich Biologie, Chemie und Pharmazie, Freie Universität, Berlin, DE 4) Institut für Pathologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin, DE Ziel: Bei der Quantifizierung von Genexpressionen auf mrna-ebene stellt die Integrität der Proben-RNA eine wichtige Einflussgröße dar. Trotz der wachsenden Zahl von microrna (mirna) Studien, wurde dieses analytische Problem bei der Quantifizierung von mirnas bisher nicht systematisch bearbeitet. Wir stellten uns deshalb die Frage, ob die Integrität der Gesamt-RNA auch auf die Quantifizierung der micrornas (mirna) einen Einfluss hat. Methoden: Isolierte Gesamt-RNA von LNCaP-Zellen und einem Prostatagewebepool (Normal- und Tumorgewebe) wurde bei 80 C stufenweise bis zu 240 min. degradiert. Der Grad der RNA-Degradation wurde über den RIN-Wert (RNA Integrity Number) am 2100 Bioanalyzer ermittelt. Die Expression von 5 mirnas (hsa-mir-96/-130b/-149/-205/-222) und 4 mrnas (PSA, VEGFA, HIF1α und ALAS) wurde mittels qpcr in den RNA- Proben quantifiziert. Zudem wurde die Expression der HIF1α mrna und ALAS mrna in zwei Gruppen unterschiedlich degradierter RNA-Proben aus nicht-malignen Prostatageweben untersucht. Ergebnisse: Die thermisch degradierten LNCaP-RNA-Proben hatten nach 240 min. Inkubation einen RIN von 2,1 (0 min = 9,7) und die Prostata-RNA einen RIN von 2.0 (0 min. = 7,2). Alle 5 untersuchten mirnas zeigten sowohl in den LNCaP- als auch Prostataproben keine signifikante Änderung ihrer Cp- Werte über den gesamten RIN-Bereich. Dagegen wiesen alle 4 untersuchten mrna-targetgene signifikante Anstiege in der Regressionsgeraden auf. HIF1α mrna und ALAS mrna waren in den degradierten RNA-Gewebeproben (RIN6 n=69) signifikant erniedrigt. Schlussfolgerungen: MiRNAs weisen im Unterschied zur mrna eine hohe Stabilität unter den von uns angewendeten Quantifizierungsmethoden auf. Ihre hohe Stabilität kann auf ihre generelle Nukleotidlänge von nur 20-25b, sowie auf die kurze Amplikonlänge in der qpcr zurückzuführen sein. Damit besteht die Möglichkeit, mirna-signaturen auch in degradierten RNA- Der Urologe

4 Proben (z.b. formalin-fixierten Geweben) zu ermitteln. Dies dürfte in der Praxis eine hohe Bedeutung haben. V2. 2 Stabile Referenzgene zur relativen Quantifizierung von mirna- Expressionen im Prostatakarzinom Schaefer A 1,2,3, Jung M 1, Stephan C 1, Miller K 1, Lein M 1,2, Kristiansen G 4, Erbersdobler A 5, Jung K 1,2 1) Klinik für Urologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin, DE 2) Berliner Institut für Urologische Forschung, Berlin, DE 3) Fachbereich Biologie, Chemie und Pharmazie Freie Universität, Berlin, DE 4) Institut für klinische Pathologie, Universitätsspital, Zürich, CH 5) Institut für Pathologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin, DE Ziel: Real time quantitative PCR (qpcr) ist die Methode der Wahl für mirna-expressionsstudien. Für die relative Quantifizierung der mirna- Expression ist die Auswahl eines passenden Referenzgens von herausragender Bedeutung. Zum jetzigen Zeitpunkt ist kein Referenzgen für mirna qpcr im Prostatakarzinom ausreichend validiert. In dieser Studie wurde die Stabilität der Expression von 4 potenziellen Referenzgenen (has-mir-16, hasmir-130b, RNU6b, Z30) analysiert. Methoden: Die Detektion von vier putativen Referenzgenen mittels qpcr wurde in einem Tumorgewebepool und einem Normalgewebepool aus je 12 RNA Proben überprüft. Die Expression dreier putativer Referenzgene und vier differentiell exprimierter mirnas wurde in 76 Tumorgewebeproben und dem angrenzendem Normalgewebe bestimmt. Ergebnisse: Zwei der in Betracht gezogenen Referenzgene (hsa-mir-130b und RNU6B) zeigten keine signifikant unterschiedliche Expression im Prostatakarzinom-Gewebe im Vergleich zum Normalgewebe, jedoch war nur hsa-mir-130b auch äquivalent in beiden Gewebegruppen exprimiert. Die hsa-mir-16 war signifikant niedriger im Tumorgewebe exprimiert. Die Computerprogramme für Referenzgenbewertungen, GeNorm und Normfinder, identifizierten die hsa-mir-130b und das geometrische Mittel der hsa-mir-130b und RNU6B Expression als die stabilsten Normalisatoren. Die Normalisierung von vier differentiell exprimierten mirnas auf die hier analysierten Referenzgene zeigt, dass Normalisierung auf ungeeignete Referenzgene zu verzerrten Ergebnissen führen kann. Schlussfolgerungen: Die hsa-mir-130b und das geometrische Mittel der hsamir-130b und RNU6B Expression wurden als die stabile Referenzgene im Prostatakarzinom identifiziert. Sie werden zur Normalisierung der relativen Expression von mirnas im Prostatakarzinom für zukünftige Studien empfohlen. V2. 3 Transientes silencing von mirnas: Technische Möglichkeiten und Probleme Wach S, Löprich E, Wullich B Urologische Klinik mit Poliklinik, Universitätsklinikum, Erlangen, DE MikroRNAs (mirnas) haben sich als potenziell wertvolle diagnostische und prognostische Biomarker für eine Reihe von Tumoren etabliert. Die Untersuchung von mirna-expressionsprofilen kann weiterhin Aufschluss über die bei der Tumorenstehung beteiligten Signalwege geben. Da mirnas in der Lage sind, die Expression ihrer spezifischen Zielgene auf einer post-transkriptionellen Ebene negativ zu regulieren, ist es von besonderem Interesse, welche funktionellen Konsequenzen eine differenzielle Expression von mirnas und ihrer spezifischen Zielgene für Tumorzellen hat. Um diese Frage zu beantworten, existieren eine Reihe von kommerziell erhältlichen Systemen, um die Expression einzelner mirnas transient zu modulieren. Wir benutzen anti-mirna Oligonukleotide (antagomirs, Ambion) um die Expression von mirnas, die im Prostatakarzinom als dereguliert identifiziert wurden, zu inhibieren. In permanenten Zelllinien des Prostatakarzinoms konnten wir eine initiale Transfektionseffizienz von bis zu 90% erreichen, die über den betrachteten Zeitraum von 72 Stunden stetig wieder abnahm. Für zellbiologische Untersuchungen erwies es sich als essenziell, die Zielzellen über den gesamten Versuchszeitraum im Transfektionsmedium zu belassen, da die verwendeten Oligonukleotide einem schnellen Abbauprozess unterlagen. Die Überprüfung des spezifischen mirna knock-down mittels real-time PCR basierten Methoden ist in kompletten RNA Präparationen der Zielzellen möglich. Für die Messung der Expression des Zielgens mittels real-time PCR basierten Methoden erwies es sich als vorteilhaft, bei der RNA Präparation eine Auftrennung in kleine (100 nt) durchzuführen. Die spezifische Inhibition erreichte ihr Maximum innerhalb der ersten 24 Stunden nach Transfektion mit den anti-mirna Oligonukleotiden und hielt über einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden an. V2. 4 MicroRNAs als diagnostische und prognostische Indikatoren des Prostatkarzinoms Schaefer A 1,2,3, Jung M 1, Mollenkopf H-J 4, Wagner I 4, Stephan C 1, Jentzmik F 1, Miller K 1, Lein M 1,2, Kristiansen G 5, Jung K 1,2 1) Klinik für Urologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin, DE 2) Berliner Institut für Urologische Forschung, Berlin, DE 3) Fachbereich Biologie, Chemie und Pharmazie, Freie Universität, Berlin, DE 4) Max Planck Institute für Infektionsbiologie, Berlin, DE 5) Institut für klinische Pathologie, Universitätsspital, Zürich, CH Ziel: micrornas sind nicht-kodierende RNAs, welche die Genexpression posttranskriptionell steuern und wichtige Schritte der Kanzerogenese regulieren. Ziel dieser Arbeit war die Identifikation differentiell regulierter mirnas im Prostatakarzinom, die Korrelation der mirna-expression mit klinisch-pathologischen Parametern und die Evaluierung des Potentials der regulierten mirnas als diagnostische und prognostische Marker. Methoden: Tumorgewebe und angrenzendes Normalgewebe wurde von 76 Patienten nach radikaler Prostatektomie gewonnen. Die Expression von 470 humanen mirnas wurde mit einem microrna Microarray in vierundzwanzig Gewebepaaren untersucht. Differentiell exprimierte mirnas wurden mittels TaqMan qpcr validiert. Der prognostische Wert einer mirna wurde an einer unabhängigen Kohorte von 79 Tumorproben validiert. Ergebnisse: Fünfzehn differentiell regulierte mirnas wurden identifiziert. Zehn mirnas waren im Tumorgewebe geringer exprimiert (hsa-mir-16/- 31/-125b/-145/-149/-181b/-184/-205/-221/-222), während 5 mirna signifikant überexprimiert waren (hsa-mir-96/-182/-182*/-183/-375). Die Expression von fünf mirnas korrelierte mit dem Gleason Score oder dem Tumorstadium. Receiver operating characteristics (ROC) Analysen ergaben, dass schon die Kombination zweier mirnas bis zu 84% der malignen und benignen Proben richtig klassifizieren konnte. Die Expression der hsa-mir-96 war in der univariaten Kaplan-Meier-Analyse signifikant mit einem Wiederanstieg des prostataspezifischen Antigens (biochemisches Rezidiv) assoziiert. Ein multivariates Cox Regressionsmodell mit den beiden Kovariaten Gleason Score und hsa-mir-96 wurde als starker Prädiktor eines biochemischen Rezidivs identifiziert. Schlussfolgerungen: Differentiell exprimierte mirnas können als diagnostische und prognostische Marker im Prostatakarzinom dienen. Die vorgestellte Arbeit bietet eine solide Grundlage für weitere funktionelle Untersuchungen der mirna Regulation im Prostatakarzinom. Der Urologe

5 Urologie aktuell V2. 5 Downregulation of mir-221 promotes cancer cell proliferation, is related to the development of aggressive prostate cancer and predicts clinical recurrence Spahn, M 1, Kneitz S 2, Scholz C-J 2, Stenger N 1, Rüdiger T 3, Ströbel P 4, Riedmiller H 1, Kneitz B 1 1) Department of Urology and Paediatric Urology, University Medical School, Würzburg, DE 2) Microarray Core Unit, IZKF (Interdisciplinary Center for Clinical Research), University of Würzburg, DE 3) Institute of Pathology, Community Hospital, Karlsruhe, DE 4) Institute of Pathology, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, DE MicroRNAs (mir) are non-coding, single-stranded RNAs that repress target mrna translation to control various biological processes, including cell differentiation, cell proliferation, apoptosis, stress resistance, and fat metabolism. Emerging evidence suggests that altered mir expression contributes to tumorigenesis. mir expression profiles have been linked to the clinical features of several cancers. We analysed the global expression of mirs in benign, hyperplastic prostate tissue (BPH), primary prostate carcinoma (PCa) of a high risk group of PCa patients, and corresponding metastatic tissues by micro-array analysis. Consistent with the proposal that some micrornas are oncomirs, we found aberrant expression of several mirs, including the down-regulation of mir-221, in prostate carcinoma metastasis. Relative low mir-221 expression was also found in several prostate carcinoma cell lines (e.g. LNCaP) Restoring the expression of mir-221 in prostate carcinoma cell lines induced apoptosis and decreased growth of these cells. We demonstrate that ectopic overexpression of mir-221 results in p27kip1 and c-kit downregulation in LNCaP cells. Down-regulation of mir-221 was negatively correlated with the expression of the proto-oncogen c-kit, but not with p27kip1 in primary carcinoma. To investigate the potential of mir-221 as a biomarker for a high risk of early clinical recurrence, we additionally analysed mir-221 expression a large study cohort of high risk patients. MiR-221 was progressively down-regulated in aggressive forms of prostate carcinoma. Down-regulation of mir-221 was associated with clinicopathological parameters, including the Gleason score and the clinical recurrence during follow up. Kaplan Meier estimates and Cox proportional hazard models showed that mir-221 down-regulation was linked to tumor progression and recurrence in a high risk prostate cancer cohort. Our results showed that progressive mir-221 down-regulation hallmarks metastasis and presents a novel prognostic marker in high risk prostate carcinoma. This suggests that mir-221 has potential as a diagnostic marker and therapeutic target in prostate carcinoma. V2. 6 Down-regulation of micrornas in prostate cancer Erdmann K 1, Thomae C 1, Tomasetti S 1, Krämer K 1, Füssel S 1, Sergon M 2, Wirth MP 1 1) Department of Urology, Technical University, Dresden, DE 2) Institute of Pathology, Technical University, Dresden, DE Introduction: MicroRNAs (mir) are small non-coding RNAs that are involved in a variety of oncogenic pathways, possibly relevant to prostate cancer (PCa). Emerging evidence suggests that the PCa specific up-regulation of certain genes could be associated with a deregulation of mir expression. Therefore, we analyzed the expression levels of candidate mir in PCa and evaluated their influence on the expression of selected genes that are known to be over-expressed in PCa. Materials and methods: Eight different web-based prediction programs were used to search for mir being putative regulators of the PCa-associated genes PSMA, AMACR, TrpM8, PSGR, and EZH2. Four selected mir (hsamir-660, -26a, -374a, -410) were subsequently investigated by qpcr using 50 malignant (PCa) and matched non-malignant tissue samples from prostatectomy explants as well as 30 samples originating from patients with benign prostatic hyperplasia (BPH). Data for the marker gene expression were used from a previous study using the same sample cohort. Results: The expression of hsa-mir-660, -26a, -374a, and -410 in PCa tissue samples compared to BPH samples measured was significantly decreased by 1.91 to 5.35-fold (median). Similar results were found when comparing mir expression in PCa to the corresponding non-malignant samples with a median decrease ranging from 1.66 to not detectable mir expression levels (hsamir-410). No significant associations between these differentially expressed mir and tumor stage or Gleason score were found. Spearman analysis showed that the up-regulation of the selected PCa-associated genes significantly correlated with the down-regulation of their predicted mir regulators with correlation coefficients ranging from to Conclusion: Our findings indicate that specific mir are decreased in PCa and that their expression levels correlate with the up-regulation of their putative target genes that are over-expressed in PCa. This association could be caused either by direct mir-mediated regulation of target genes or by indirect effects on target genes. The data presented provide a solid basis for further functional studies of mir in PCa. V2. 7 Specific metastasis-associated mirna expression patterns in clear cell renal cell carcinoma (ccrcc) Heinzelmann J 1, Henning B 1, Sanjmyatav J 1, Posorski N 1, Steiner T 1, Wunderlich H 1, Junker K 1 1) Laboratory of Molecular Biology, Department of Urology, University Hospitals, Jena, DE 2) Core Unit Chip Applications, University Hospitals, Jena, DE Background: Recent studies have shown that micrornas (mirnas) play important role as regulators of gene expression in tumourgenesis by controlling many biological processes in growth, development, differentiation and apoptosis. But their specific expression levels in several tumour types and the influence on metastasis is almost unknown. It is the intention of this study to identify specific mirnas, which regulate metastasis of clear cell renal cell carcinoma (RCC). Material and Methods: The mirnas were isolated and enriched from primary tumour tissue by using MirVana mirna Isolation kit (Ambion). RNA concentrations were verified by measuring absorbance (A260) on the NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 (Nano-Drop) and total RNA profiles were assessed on the Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies). MiRNA expression analysis was performed using mirxplore- Arrays (Miltenyi Biotec). Microarray images were analysed by using Genepix Pro. To validate the results obtained by mirna microarray and to quantify expression, reverse transcription reaction was performed by using TaqMan MicroRNA reverse transcription (Applied Biosystem) and real-time PCR was carried out by using the TaqMan mirna assay kit (Applied Biosystem). Results: 18 human clear cell RCC including 10 non-metastatic tumours, 4 tumours with metastasis after 5 years and 4 tumours with primary metastasis were analysed. The expression of specific mirnas was significantly altered in metastatic compared to non-metastatic tumours. Furthermore, we found a highly significant difference in mirna expression between very aggressive early-metastatic tumours, which are known to be very agressive and having poor survival prognosis, and late-/non-metastatic tumours. We identified a group of mirnas whose expressions are significantly downregulated in early-metastatic tumours. For example, expression of the let 7 family and mir-30 family as well as mir 125b, mir 126 3P and mir 26a is dramatically decreased in tumour tissues from patients with early metastasis. Biostatistical analysis revealed a well defined specific mirna expression profile in the clinical subtypes of ccrcc with different metastatic potential. Moreover we found significant correlations between the expression levels of mir-26a and let-7c and survival of the patients. Conclusion: Our findings indicate that specific mirnas regulate metastasis and have an impact on the progression of the clear cell RCC. Furthermore, we identified specific mirnas characterising very aggressive tumours with early metastasis. In addition we determined mir-26a and let-7c as possible markers for the survival of the patients. The presented results provide new insights into the biology of metastasis of RCC. Der Urologe

6 V2. 8 Circulating mirnas are correlated with tumor progression in prostate cancer Brase JC 1, Johannes M 1, Schlomm T 2, Fälth M 1, Haese A 2, Steuber T 2, Beissbarth T 1, Kuner R 1, Sültmann H 1 1) Division of Molecular Genome Analysis, German Cancer Research Center, Heidelberg, DE 2) Martini-Clinic, Prostate Cancer Center, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE 3) Department Medical Statistics, University Medicine, Göttingen, DE Circulating mirnas have recently been indicated as practicable and promising biomarkers for non-invasive diagnosis in various tumor entities. However, cell-free mirnas have not been found to correlate with clinico-pathological variables in epithelial carcinomas. In order to learn more about the potential clinical relevance of circulating mirnas in prostate cancer, we screened 667 mirnas in serum samples from patients with metastatic (n=7) and localized prostate cancer (n=14). Various mirnas were highly abundant in the sera of patients with metastatic disease. Five mirnas were further analyzed in an independent patient cohort (n=45). One of these turned out to be the most pronounced serum marker associated with tumor progression, and its level correlated with Gleason scores and lymph-node status of the patients tumors. Analysis of variance (ANOVA) indicated a benefit for the prediction of different clinical parameters when the circulating mirna was combined with prostate specific antigen (PSA) measurements. In addition, the expression level of this mirna was found to be significantly higher in prostate tumor compared to normal tissue samples. Overall, our observations suggest that circulating mirnas are associated with advanced prostate cancer disease. V2. 9 Einfluss von Sorafenib und Sunitinib auf Prozesse der Metastasierung beim Prostatakarzinom Ploog S, Cieślikowski W, Jöckel M, Schneider E, Thüroff JW, Brenner W Klinik für Urologie, Universitätsmedizin, Johannes Gutenberg-Universität, Mainz, DE Auf Grund der hohen Metastasierungsrate des Prostatakarzinoms steht das Ziel, neue Therapieformen zu finden, im Zentrum der Forschung. Sogenannte Target-Therapien mit kleinmolekularen Tyrosin Kinase Inhibitoren (TKI s) stellen eine vielversprechende Alternative für die Behandlung des Prostatakarzinoms dar. Wir haben den Effekt der TKI s Sorafenib und Sunitinib auf Mechanismen der Metastaierung in Prostatakarzinom-Zellen untersucht. In Tumorzellen anderer Entitäten zeigte sich ein synergistischer Effekt zwischen Sorafenib und dem PKC-Inhibitor Rottlerin. Auf Grund dieser Ergebnisse wurde in unseren Analysen neben einer Einzelbehandlung mit Sorafinib und Sunitinib ein möglicher additiver Effekt mit Rottlerin in Prostatakarzinom-Zellen beurteilt. Die Prostatakarzinom-Zelllinien LNCaP und PC-3 wurden mit Sorafenib oder Sunitinib allein in unterschiedlichen Konzentrationen (1-20µM) oder in Kombination mit Rottlerin (10µM) vorbehandelt. Die Zellen wurden daraufhin bezüglich Zelltoxizität (MTT), Proliferation (BrdU-Inkorporation) und chemotaxischer Zellmigration mit Fibronectin (10µM) als Chemotaxin (Boydenkammer) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass in LNCaP-Zellen Sorafenib die geringste Zelltoxozität auslöste, welche jedoch durch die Koapplikation von Rottlerin erhöht wurde. Im Gegensatz dazu wurde die relativ hohe Zelltoxizität von Sorafenib durch die zusätzliche Gabe von Rottlerin nicht beeinflusst. In den PC-3 Zellen konnte kein additiver Effekt auf die Zelltoxizität nachgewiesen werden. Die Proliferationshemmung dieser Zellen durch Sorafenib bzw. Sunitinib wurde durch die zusätzliche Gabe von Rottlerin in keiner Weise beeinflusst. Sorafenib reduzierte die Zellmigration in LNCaP bzw. PC-3 Zellen auf 9% bzw. 12%; Sunitinib zeigte eine Reduktion auf 18% bzw. 46%, bezogen auf die jeweiligen Kontrollen. Die alleinige Gabe von Rottlerin reduzierte die Migration auf 55% bzw. 37% der Kontrolle. Hier konnte in beiden Zelllinien kein additiver Effekt nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Sorafenib den stärksten inhibitorischen Effekt auf die Zellproliferation und migration zeigte. Da sich kein additiver Effekt durch die zusätzliche Gabe von Rottlerin nachweisen ließ, scheint im Prostatakarzinom zur Metastasen-Prävention eine Monotherapie mit Sorafenib sinnvoll. V2. 10 Wachstumshemmung von Prostatakarzinomzellen durch Docetaxel, Ibandronat und Farnesol alleine und in Kombination Epplen R 1, Ohlmann C 2, Pfister D 1, Heidenreich A 1 1) Klinik für Urologie, Universitätsklinikum der RWTH Aachen, DE 2) Klinik für Urologie, Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg/Saar, DE Einleitung: Bisphosphonate stellen neben der Docetaxel-basierten Chemotherapie den Standard in der Therapie des metastasierten Prostatakarzinoms dar. Neben der Wirkung von Bisphosphonaten auf die Osteoblasten und Osteoklasten wurden direkte Wirkungen auf Tumorzellen beschrieben. Die Wachstumshemmung von Inhibitoren der Farnesylierung wie die der Bisphosphonate kann in vitro durch Addition von Farnesol (FOH) aufgehoben werden. Jedoch wurden auch direkt zytotoxische Effekte von FOH bei Tumorzellen beschrieben. Das Ziel unsere Studie war es, die Effekte von Ibandronat, Docetaxel sowie FOH auf das Wachstum von Prostatakarzinomzellen allein und in Kombination zu untersuchen. Material und Methoden: Die PCA Zell-Linien PC3 und LNCaP wurden mit Ibandronat (Iban), Farnesol (FOH) und Docetaxel (Doc) allein oder in Kombination inkubiert. Nach 5 Tagen erfolgte die Bestimmung vitaler Zellen mittels des MTT Assay. Ergebnisse: Iban hemmt dosisabhängig das Wachstum von PC3 und LNCaP Zellen. Die IC50 Werte liegen bei 6.6x10-5 µm bei PC3 und 9.0x10-6 µm bei LNCaP. Die Wachstumshemmung kann dabei vollständig durch gleichzeitige Inkubation mit FOH aufgehoben werden. Doc zeigte keine signifikante Wachstumshemmung bei einer Konzentration von 4 und 6 nm. Im Gegensatz dazu zeigt sich ein additiver Effekt der Wachstumshemmung von Doc (4 nm) in Kombination mit Iban 10-5 M. Hierbei zeigt sich eine Wachstumsreduktion auf 10% (Iban/Doc) bei LNCaP und auf 76% (Iban/ Doc) bei PC3 im Vergleich zur Kontrolle. FOH inhibiert dosisabhängig das Wachstum der Zell-Linien PC3 und LNCaP. Die IC50-Werte liegen bei 64 µm bei PC3 und 108 µm bei LNCaP. In Kombination mit Doc finden sich additive Effekte mit einer Wachstumsreduktion auf 0.4% bei PC3 und 21% bei LNCaP im Vergleich zur Kontrolle. Diskussion: Ibandronat ist ein potenter Wachstumsinhibitor von Prostatakarzinomzellen. Die Blockierung der Farnesylierung von Proteinen scheint für die Wachstumshemmung verantwortlich zu sein. Darüber hinaus zeigen sich additive Effekte von Iban in Kombination mit dem Taxan Doc. FOH stellt ebenfalls einen Wachstumsinhibitor von Prostatakarzinomzellen dar. Die Wachstumshemmung des Iban kann aufgehoben werden, in Kombination mit Doc zeigen sich additive Effekte. Der zugrunde liegende Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Dennoch scheint die Kombination von FOH und Doc vielversprechend für die Therapie von Patienten mit einem hormonrefraktären Prostatakarzinom zu sein. Abstract Session 3 Moderation: Kerstin Junker, Jörn Kamradt V3. 1 The potential role of G2- but not of G0-radiosensitivity for predisposition of prostate cancer Schlomm T 1, Raabe A 2, Dikomey E 2, Borgmann K 2 1) Martini-Klinik, Prostate Cancer Center, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE 2) Laboratory of Radiobiology & Experimental Radiooncology, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE Chromosomal radiosensitivity was compared in 81 prostate cancer patients and 120 healthy controls using both G0 and G2 assay. Prostate cancer patients with a clinical stage of mostly pt2c or pt3a had a median age of 67 Der Urologe

7 Urologie aktuell years. For healthy controls we recruited 60 male monozygotic twin pairs with a median age of 28 years. For G0-radiosensitivity, there was no difference between prostate cancer patients and healthy controls since medians were similar (Hodges-Lehmann estimate: -0.05, 95% CI: , p = ). In contrast, a clear difference in medians was observed for G2-radiosensitvity with prostate cancer patients showing a significantly higher sensitivity when compared to healthy controls (Hodges-Lehmann estimate: -0.41, 95% CI: , p = ). Using the 90% quantile of G2-radiosensitivity in healthy controls as a threshold for discrimination, the fraction of prostate cancer patients with elevated radiosensitivity increased to 49%. In conclusion, in contrast to G0-radiosenstivity, G2-radiosensitvity is a promising marker for predisposition of prostate cancer. V3. 2 Mechanismen und Strategien CpG-DNA basierter Vakzinierung potentielle Anwendung beim Prostatakarzinom Maurer T 1, Thalgott M 1, Horn T 1, Aguilar-Pimentel JA 2, Gschwend JE 1, Nawroth R 1, Kübler H 1 1) Urologische Klinik und Poliklinik, Klinikum r.d. Isar, TU München, DE 2) Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Allergologie, Klinikum r.d. Isar, TU München, DE Bakterielle DNA wie auch synthetisch hergestellte einzelsträngige CpG-DNA Oligonukleotide, die ein unmethyliertes CpG-Motiv besitzen, aktivieren das Immunsystem von Säugetieren. Nach Bindung an Toll-like Rezeptor 9 löst CpG-DNA eine potente Th1-gerichtete Immunantwort aus, die sich durch Generierung von zytotoxischen T Lymphozyten (CTL), bestimmter Zytokine sowie Antikörpersubklassen auszeichnet. CpG-DNA kann daher als potentes Adjuvanz zu Protein- und Peptid-basierten Immunisierungen verwendet werden. Neben Induktion kostimulatorischer Moleküle wie CD40 und CD86 konnten wir eine erhöhte Sekretion proinflammatorischer Th1-Zytokine wie Interleukin-6 und -12 sowie TNFα in murinen, aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen (mbmdc) beobachten. Dabei kommt es zunächst zu einer CpG-unabhängigen Aufnahme der Oligonukleotide bevor eine spezifische Aktivierung über Toll-like Rezeptor 9 erfolgt. Im Mausmodell kann so durch Vakzinierung mit Modelantigenen wie auch mit Peptiden (z.b. PSA-Peptid (HCIRNKSVI) eine spezifische zelluläre T-Zell-Antwort hervorgerufen werden. Neben einer Immunisierung als Mixture erscheint als weitere Immunisierungsstrategie eine kovalente Kopplung von Antigen und CpG-DNA Antigen vielversprechend. Hierdurch werden Antigen effizient in intrazelluläre Kompartimente antigenpräsentierender Zellen dirigiert, was zum einen zur Aktivierung, zum anderen aber auch zu erhöhter Cross-Präsentation von Antigenbruchstücken und daraus resultierend zur gesteigerten Induktion von antigen-spezifischen CTL in vivo führt. Auf diese Weise erfüllt gekoppelte CpG-DNA eine zweifache Aufgabe: Koordination der Antigen- Aufnahme sowie Vermittlung Antigen-spezifischer Aktivierung. Die Forschung bezüglich CpG-DNA im Bereich der Immuntherapie des Prostatakarzinoms steht bisher noch völlig am Anfang. Wir können zeigen, dass CpG-DNA als potentes Adjuvanz in einem PSA-Peptid-basierten Mausvakzinierungsmodell fungieren kann. Aufgrund dieser und anderer ermutigender präklinischer Ergebnisse sollten jedoch weitere Untersuchungen hinsichtlich des Potentials von CpG-DNA in der Immuntherapie des Prostatakarzinoms beim Menschen folgen. V3. 3 Prevalance of the human exogenous gammaretrovirus XMRV in prostate cancer tissue Fischer N 1, Stieler K 1, Schulz C 1, Huland H 2, Aepfelbacher M 1, Schlomm T 2 1) Institute of Microbiology and Virology, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE 2) Martini-Clinic, Prostate Cancer Center and Department of Urology, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE We have recently reported the first bonafide human infection with an exogenous gammaretrovirus, dubbed XMRV due to its sequence homology to xenotropic murine leukemia viruses (X-MLV) (Urisman, Molinaro and Fischer et al., 2006). The XMRV provirus is not endogenous to the human genome and there are no similarities to human endogenous retroviral sequences, suggesting that XMRV is transmitted by exogenous infection. XMRV was preferentially found in patients with familial prostate cancer homozygous for a mutation in RNASE L (R462Q). 40% (n=20) of R462Q mutants were positive for XMRV, only 1% (n=160) of heterozygous or wild type RNASE L showed evidence of XMRV infection. Mapping of integration sites (Dong et al., 2007) and FISH analysis confirmed the presence of XMRV in human prostatic tumor tissue. The virus resides preferentially in stromal fibroblasts; approx. 1% of the cells were found to harbor XMRV. The role of XMRV in prostate cancer tumorigenesis is unclear so far. The present study was initiated to elucidate the question whether XMRV can be also found in sporadic PCA samples. 105 tissue samples from PCA patients in Northern Europe as well as 70 control samples from men without evidence of PCA were analyzed for the presence of XMRV specific sequences by nested RT-PCR. XMRV XMRV was only detected in two samples. The two XMRV positive patients were wild type or heterozygous for the R462Q mutation and thus carried at least one fully functional RNase L allele (Fischer et al., 2008). Interestingly, a recent study describes the expression of XMRV proteins in 23% of prostate cancer samples (54/334), the viral protein being expressed in malignant epithelial cells which suggest a more direct role of XMRV in PCA tumorigenesis. Technical differences between these studies as well as interpretation of the results with regard to the role of XMRV in prostate cancer development will be discussed. V3. 4 Lack of Evidence for Xenotropic Murine Leukemia Virus-related Virus (XMRV) in German Prostate Cancer Patients Krause H, Hohn O, Bannert N Urologische Klinik, Charité - Universitätsmedizin, Robert Koch Institut, Berlin, DE Background: A novel gammaretrovirus named xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV) has been recently identified and found to have a prevalence of 40% in prostate tumor samples from US American patients carrying a homozygous R462Q mutation in the RNaseL gene. This mutation impairs the function of the innate antiviral type I interferon pathway and is a known susceptibility factor for prostate cancer. Here, we attempt to measure the prevalence of XMRV in prostate cancer cases in Germany and determine whether an analogous association with the R462Q polymorphism exists. Results: 589 prostate tumor samples were genotyped by real-time PCR with regard to the RNaseL mutation. Using a highly sensitive nested PCR and RT- PCR approach, DNA and RNA samples from these patients were screened for the presence of XMRV-specific gag sequences. Furthermore, 146 sera samples from prostate tumor patients were tested for XMRV Gag and Env antibodies using a newly developed ELISA assay. In agreement with earlier data, 12.9% (76 samples) were shown to be of the QQ genotype. However, XMRV specific sequences were detected at neither the DNA nor the RNA level. Consistent with this result, none of the sera analysed from prostate cancer patients contained XMRV-specific antibodies. Conclusion: Our results indicate a much lower prevalence (or even complete absence) of XMRV in prostate tumor patients in Germany. One possible Der Urologe

8 reason for this could be a geographically restricted incidence of XMRV infections. V3. 5 Invasiv wachsende Prostatakarzinomzellen zeigen einen überwiegend basalen Phänotyp mit einigen Stammzelleigenschaften Wendel C 1, Jung V 1, Kamradt J 1, Saar M 1, Kreutzer B 1, Grobholz R 2, Stöckle M 1, Unteregger G 1 1) Klinik für Urologie, Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg/Saar, DE 2) Institut für allgemeine Pathologie, Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg/Saar, DE Zum Zeitpunkt der Operation finden sich im Prostatakarzinom unterschiedliche Zellpopulationen. Diese sind bisher hinsichtlich des klinischen Outcomes für den einzelnen Patienten nicht eindeutig identifizierbar. Mit unserem 3D-Invasionsmodell konnten aus Patientenproben invasiv wachsende Zellklone mit überwiegend einheitlichen genetischen Veränderungen (CGH) selektioniert werden. Unklar war bisher, welchen Phänotyp diese Zellpopulation aufzeigt und ob es sich dabei auch um Tumorstammzellen handeln könnte. Die Zelllinien PC3, LNCaP und DU 145 und Gewebeproben von Patienten nach radikaler Prostatektomie wurden im 3D-Invasionsmodell kultiviert. Analysiert wurden dabei die invasiv wachsenden Zellklone sowie die Zellen, welche auf der Oberseite der Invasionsmembran verblieben. Untersucht wurden die Luminalzellmarker CK8, CK18, AR und PSA sowie die Basalzellmarker CK5, p63 und CD44. Antikörper gegen CD44, CD 133 und α2-integrin dienten dem Nachweis von Stammzellen. Die 3 untersuchten Zelllinien waren alle positiv für die Luminalzellmarker und negativ für CD133; keine Unterschiede konnten im gesamten Expressionsmuster zwischen den invasiven und nicht-invasiven Zellklonen beobachtet werden. Bei den Patientenproben konnten wir innerhalb einzelner Spheroide Zellen sowohl mit basalem als auch mit intermediärem Charakter detektieren, luminale Zellen fehlten völlig. Alle Zellen aus diesem Material waren ebenfalls negativ für CD133 und alle positiv für den Stammzellmarker CD44 und p63; die invasiven zeigten zusätzlich eine Anfärbung von α2-integrin. Die Ergebnisse belegen einerseits die Vermutung, dass die Prostatakarzinomzelllinien wenige Gemeinsamkeiten mit den Zellpopulationen aufweisen, die in der 3D-Kultur von Patientenproben auswachsen. Diese Primärkulturen sind zwar phänotypisch heterogen; aber der basale Charakter in Verbindung mit der Expression von Stammzellmarkern lässt darauf schließen, dass mit der von uns entwickelten Technik aus Patientenmaterial nach radikaler Prostatektomie die Zellen aus heraus selektioniert werden können, die aufgrund ihrer Hormonunabhängigkeit und des invasiven Wachstums möglicherweise entscheidend für den individuellen Krankheitsverlauf des Patienten sind. V3. 6 Beteiligung der Stresskinase p38 an der Aktivierung des androgenresponsiven Probasinpromotors durch Interleukin 1β (IL-1β) in humanen Prostatakarzinomzelllinien Streicher W, Erb H, Spindler K-D, Hessenauer A Institut für Allgemeine Zoologie und Endokrinologie, Universität Ulm, DE Einleitung: Entzündliche Prozesse beeinflussen die Entstehung sowie den Verlauf von Tumorerkrankungen. Das Vorkommen von Leukozyten in Tumorgewebe ist seit langem bekannt. Ein wesentlicher Bestandteil dieses Leukozyteninfiltrates sind Macrophagen. So konnte kürzlich im Rattenmodell eine Akkumulation von Macrophagen und damit verbunden eine erhöhte Expression von IL-1β in Prostatakarzinom(PCa)-Gewebe gezeigt werden. Das pro-inflammatorische Zytokin IL-1β kann die Angiogenese- und Invasionseigenschaften von Tumoren modulieren. Für IL-1β konnte in vitro gezeigt werden, dass es die Expression von Matrixmetalloproteinasen in PCa- Zellen fördert und so zur Metastasierung beitragen kann. Während andere Interleukine (IL-4, IL-6, IL-8) in der Lage sind den Androgenrezeptor (AR) ligandenunabhängig zu aktivieren, ist über einen direkten Einfluss von IL-1β auf die androgene Signalkaskade bislang wenig bekannt. Material und Methoden: Die Aktivierung des AR in unterschiedlichen PCa-Zelllinien (LNCaP, 22Rv1, PC3, DU-145) durch IL-1β wurde mit Hilfe eines dualen Luciferase-Reportergenassays untersucht. Um eine Beteiligung der durch IL-1β aktivierbaren Kinasen an der Aktivierung des androgenabhängigen Probasinpromotors zu untersuchen, wurden p38- bzw. Jun-Kinase-Inhibitoren eingesetzt. Die Lokalisation des AR wurde anhand eines grün fluoreszierenden AR-Fusionsproteins (EosFP-AR) bestimmt. Ergebnisse: IL-1β aktiviert den androgenresponsiven Probasinpromotor in hormonsensitiven LNCaP-Zellen. Erste Cotransfektions-Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Aktivierung des Probasinpromotors durch IL-1β in DU- 145-Zellen nur in Gegenwart eines AR stattfinden kann. Interessanterweise wird die Aktivierung des Probasinpromotors nach Behandlung mit IL-1β durch eine Inhibition der p38 MAP-Kinase verringert. Schlussfolgerung: IL-1β aktiviert AR-abhängig den Probasinpromotor in LN- CaP- und DU-145-Zellen. Diese Aktivierung geschieht unter Beteiligung der p38 MAP-Kinase. V3. 7 Changes in proteomic and epigenetic expression patterns in tumour associated fibroblasts (TAF) by interaction with urinary bladder carcinoma cells Enkelmann A 1, Heinzelmann J 1, Escher N 2, Walter M 1, Weidig M 3, Wunderlich H 1, Junker K 1 1) Department of Urology, University Hospitals, Jena, DE 2) Core Unit Chip Application, University Hospitals, Jena, DE 3) Department of Pathology, University Hospitals, Jena, DE Background: Tumour development and progression is strongly affected by interaction of tumour cells and tumour stroma. For different tumour models (e.g. breast cancer) a supportive effect of TAF on the tumour genesis was demonstrated. Purpose of the present work is the isolation and characterisation of TAF from primary urinary bladder tumour specimen. A further part of this study will deal with the influence of urinary bladder carcinoma cell lines on protein expression of TAF. Material and Methods: TAF were isolated from cultured urinary bladder tumour specimen. Therefore, primary tumour material was treated with EDTA followed by differential trypsinisation. Non-tumour fibroblasts were isolated from foreskin and normal urinary bladder tissue. Analyses of protein patterns were carried out on cultivated fibroblasts by SELDI-TOF-MS. TAF and foreskin fibroblasts were co-cultivated with urinary bladder cancer cell lines in separated cell culture compartments followed by SELDI-TOF-MS analyses. Furthermore total RNA was isolated from TAF and non-tumour fibroblasts to analyse the mirna expression profile by mirna Microarray. Results: By optimizing cell culture routines it was possible to isolate and subsequently cultivate TAF from primary tumour material of the urinary bladder. SELDI-TOF-MS measurements reveal differences in the proteomic patterns of TAF and non-tumour fibroblasts. Microarray analyses indicate different expression levels of several mirnas in TAF and non-tumour fibroblasts. Co-cultivation of urinary bladder carcinoma cells and TAF or non-tumour fibroblasts induces modified protein patterns in the different cell types. Conclusion: TAF can be isolated and cultivated separately from primary tumour material. TAF are characterised by the expression of a specific protein pattern and mirna profile in comparison to non-tumour fibroblasts. Cocultivation with tumour cells revealed the induction of a modified expression profile in fibroblasts and vice versa. The present results will provide a more detailed understanding of the function of TAF in the tumour development of urinary bladder carcinoma. Der Urologe

9 Urologie aktuell Abstract Session 4 Moderation: Thorsten Schlomm, Maximilian Burger V4. 1 Der Tumorsuppressor RECK beim Prostatakarzinom Rabien A 1, Ergün B 1, Jung M 1, Stephan C 1, Jung K 1, Kristiansen G 2, Erbersdobler A 3 1) Klinik für Urologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin, DE 2) Institut für klinische Pathologie, UniversitätsSpital, Zürich, CH 3) Institut für Pathologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin, DE Im Rahmen unserer Studien zur Bedeutung von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) beim Prostatakarzinom wurde eine Dysbalance zwischen den Tumor-fördernden MMPs und ihren Inhibitoren in entarteten Prostatazellen entdeckt. Ein MMP-Inhibitor, dessen Rolle erst in jüngerer Zeit bei verschiedenen Tumoren bestimmt wird, ist der Tumorsuppressor RECK (reversioninducing cysteine-rich protein with Kazal motifs). In einer retrospektiven Studie an Prostatakarzinomen von radikalen Prostatektomien konnten wir RECK als geeigneten Biomarker für das Prostatakarzinom klassifizieren (Rabien et al., 2007). Sowohl RECK mrna als auch das Genprodukt wurden im Karzinom verglichen mit umliegendem Normalgewebe vermindert exprimiert, wie quantitative RT-PCR- und immunhistochemische Untersuchungen zeigten. Adenomektomien wiesen sogar ein höheres RECK- Expressionsniveau auf als Karzinom-nahes benignes Gewebe. Die verminderte Expression des RECK im Prostatakarzinom war mit einem höheren Tumorstadium (pt) und Gleason ( 7) assoziiert und konnte für Fälle mit Gleason 7 im Vergleich zu den gängigen Parametern Alter bei Operation, präoperativer PSA-Wert und pt als unabhängiger Faktor für das Risiko eines PSA-Wiederanstiegs identifiziert werden. Zur Zeit wird die RECK-Expression mittels Tissue Microarrays in speziellen Tumorentitäten und arealen des Prostatakarzinoms bestimmt, um die Bedeutung für zufällig entdeckte (inzidente) Fälle und den invasiven Rand des Tumors abzuklären. Im Rahmen funktioneller Untersuchungen zu RECK zeigte sich bei Prostatakarzinomzellen mit stabiler RECK-Überexpression (DU-145/pCMV6-Neo RECK) eine Reduktion der Invasivität um 80% im Vergleich zu Kontroll-transfizierten Zellen, die vermuten lässt, dass RECK für das Prostatakarzinom nicht nur als Tumormarker, sondern auch als Zielstruktur für therapeutische Ansätze dienen kann. Lit.: Rabien A, Burkhardt M, Jung M, Fritzsche F, Ohl F, Ringsdorf M, Schicktanz H, Loening SA, Kristiansen, G, Jung K. Decreased RECK Expression Indicating Proteolytic Imbalance in Prostate Cancer Is Associated With Higher Tumor Agressiveness and Risk of Prostate-Specific Antigen Relapse after Radical Prostatectomy. Eur Urol 2007; 51(5): V4. 2 Lacking rationale for routine assessment of focal neuroendocrine differentiation in prostate cancer Köllermann J 1, Sauter G 1, Simon R 1, Schlomm T 2 1) Institute of Pathology, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE 2) Martini-Clinic, Prostate Cancer Center, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE Focal neuroendocrine differentiation in prostate cancer is supposed to be closely related to an increased malignant phenotype and to tumor progression. However, the clinical significance of focal neuroendocrine differentiation is a matter of an ongoing debate, because results from previous studies are mainly based on small cohorts of patients. In order to learn more on the prevalence and clinical significance of focal neuroendocrine differentiation, a tissue microarray (TMA) containing 3261 primary prostate cancers with sufficient clinical follow up data treated by radical prostatectomy was analyzed by immunohistochemistry for the expression of the neuroendocrine markers chromogranin A and synaptophysin. Detectable expression for chromogranin A was found in 18.3% (407 / 2222) and for synaptophysin in 12.8% (279/2182) evaluable cancers. If both parameters were combined, 508/2237 cancers (22.7%) showed NE marker expression with 49 patients (2.1%) of them displaying a strong positivity for at least one marker. Neuroendocrine differentiation was significantly associated with advanced tumor stage (p < ) and high Gleason grade (p=0.0005). In univariate analysis only a strong positivity for NE differentiation was significantly associated with an increased risk for PSA recurrence (p=0.006). However in multivariate analysis NE differentiation failed to be an independent predictor of prognosis (RR: 1.1 (1.39), p= 0.4 (0.2). It is concluded that if at all only a strong focal neuroendocrine differentiation is of prognostic relevance. Due to the rarity of this finding and the associated lack of predictive accuracy testing there is no convincing rationale to introduce NE staining into routine histological assessment. V4. 3 Low level Her2 overexpression is associated with rapid tumor cell proliferation and poor prognosis in prostate cancer Schlomm T 1, Sauter G 2, Köllermann J 2, Minner S 2 1) Martini-Clinic, Prostate Cancer Center, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE 2) Institute of Pathology, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE Purpose: The HER2-oncogene is involved in the biology of many different tumor types and serves as a prognostic marker and a therapeutic target in breast cancer. In contrast to breast cancer, the significance of Her2 overexpression and gene amplification in prostate cancer remains highly controversial. The purpose of this study was to learn more on the prevalence and clinical significance of HER2 amplification and overexpression in prostate cancer. Experimental design: A tissue-microarray (TMA) containing more than 2000 prostate cancers with follow-up data was used. TMA sections were analyzed on protein and DNA level using two different antibodies (HercepTest, DAKO; Novocastra NCL-CB11) and Fluorescence in situ Hybridization (FISH). Results: Immunohistochemical analyses showed highly similar results for both antibodies. Detectable Her2 immunostaining was observed in 17.2% for the HercepTest and in 22.5% for the Novocastra antibody with the vast majority of cases showing 1+ or 2+ staining. For both antibodies (HercepTest/ Novocastra) significant associations were found between positive staining and high Gleason-grade (p<0.0001, both), advanced pt-stage (p<0.0001/ p=0.0015), rapid tumor cell proliferation (p=0.0004/p=0.0071) and tumor recurrence (p<0.0001, both). HER2 amplification was only found in 1 of 2525 analyzable cases (0.04%). Conclusions: Low level Her2 overexpression occurs at relevant frequency in prostate cancer and in the absence of gene amplification. Increased Her2 expression may potentially lead to an aggressive behaviour of tumor cells through stimulation of tumor cell proliferation since Her2 staining was shown to be significantly associated with Ki67 Labeling Index (LI). These data argue for reconsidering anti Her2 therapy possibly with modified approaches. V4. 4 Chromosome 8p deletions and 8q gains are associated with tumor progression and poor prognosis in prostate cancer Burkardt L 1, El Gammal A 2, Brüchmann M 1, Sauter G 1, Simon R 1, Schlomm T 2 1) Institute of Pathology, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE 2) Martini-Clinic, Prostate Cancer Center, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, DE Purpose: Deletions of 8p and gains of 8q belong to the most frequent cytogenetic alterations in prostate cancer. The target genes of these alterations and their biological significance are unknown. Experimental Design: To determine the relationship between chromosome 8 changes and prostate cancer phenotype and prognosis a set of fully annotated prostate cancers were analyzed in a tissue microarray format by fluorescence in situ hybridization. Results: Both, 8p deletions and 8q gains increased in number during different stages of prostate cancer progression. 8p deletions/8q gains were found in Der Urologe

10 26.1%/4.8% of 1239 pt2-cancers, 38.5%/9.8% of 379 pt3a-cancers, 43.5%/8.9% of 237 pt3b-cancers, 40.7%/14.8% of 27 pt4-cancers, 39.1%/34.8% of 23 nodal metastases, 51.9%/33,3% of 27 bone metastases, and 45.5%/59.9% of 22 hormone-refractory cancers. Conclusions: 8p deletions and 8q gains are relatively rare in early stage prostate cancer but often develop during tumor progression. The prognostic impact does not appear to be strong enough to warrant clinical application. V4. 5 No evidence for mutational activation of FGFR3 in prostate carcinogenesis. Koufou S 1, Lunz J-C 1, Borchardt A 1, Keck B 2, Kneitz B 3, Gaisa N 4, Hafner C 5, Giedl C 6, Rau T 7, Hartmann A 7, Stoehr R 7 1) Department of Urology, University of Regensburg, DE 2) Department of Urology, University Hospital, Erlangen, DE 3) Department of Urology, University of Würzburg, DE 4) Institute of Pathology, RWTH Aachen University, Aachen, DE 5) Department of Dermatology, University of Regensburg, DE 6) Institute of Pathology, University of Regensburg, DE 7) Institute of Pathology, University Hospital, Erlangen, DE Aim: FGF receptors are transmembrane receptor tyrosine kinases which undergo dimerisation and transphosphorylation at the intracellular kinase domain after ligand binding. In human prostate cancer, the FGF system has already been well studied, but the role of FGFR3 is still unknown. Mutational constitutive activation of FGFR3 is known from several malignancies (e.g. urinary bladder and cervix carcinoma). To date, only limited data of FGFR3 mutations in prostate cancer are available. Most recently, activating FGFR3 mutations were described to be associated with low-grade prostate tumors. Therefore the aim of this study was the investigation of the FGFR3 mutation status in a comprehensive series of prostate tumors. Material and Methods: Overall, 102 archival formalin-fixed, paraffinembedded prostate tumors achieved by radical prostatectomy and 29 incidental prostate tumors (low grade tumors (Gleason score 6): n=22) obtained by TUR-P were investigated. After microdissection and DNA isolation, all FGFR3 mutation hotspots known from human malignancies were analyzed using SNaPshot or RFLP assay. Results: All cases could successfully be analyzed by SNaPshot, 80 cases were investigated using RFLP. No mutation in FGFR3 could be detected in any of the analyzed cases. There were also no mutations in patients with concomitant bladder tumors as reported previously. Conclusion: The analysis of our representative cohort of prostate tumors indicates that mutational activation of FGFR3 plays no important role in prostate carcinogenesis, and our data are in accordance with previously published studies. The most recently reported FGFR3 mutations in low-grade prostate tumors could not be verified in our series. V4. 6 Global analysis of CTCF regulated genes in early stages of prostate cancer Küffer S 1, Belharazem D 1, Sauer CG 1, Sticht C 2, Galjart N 3, H. Riedmiller H 4, Michel MS 5, Marx A 1, Ströbel P 1 1) Institute of Pathology, University Medicine Mannheim, University of Heidelberg, DE 2) ZMF, University Medicine Mannheim, DE 3) Department of Cell Biology & Genetics, Erasmus MC, Rotterdam, NL 4) Department of Urology and Paediatric Urology, University Medical School, Würzburg, DE 5) Department of Urology, University Medicine Mannheim, University of Heidelberg, DE Aims: Age is the most important factor in the development of prostate cancer (PCA) and epigenetic silencing of genes is one of the earliest molecular alterations commonly found in prostate neoplasia. It was recently shown that loss of imprinting (LOI) of IGF2 occurs in the normal ageing prostate. The resulting increased IGF2 levels are believed to contribute to prostate carcinogenesis and may also account for the strong association with older age. LOI of IGF2 is due to altered regulation by the enhancer-blocking element CCCTC-binding factor (CTCF). CTCF is a chromatin insulator that is required for repression of the maternal imprinting at the imprint control region (ICR) and influences the activation and inhibition of thousends of genes in the genome. Using IGF2 as an indicator of altered epigenetic CTCF control, we identified potential CTCF target genes by specific CTCF knock down in PCA cell lines. The expression of these genes was further analyzed in non-neoplastic and neoplastic prostate tissues with and without LOI of IGF2. Methods: Gene expression profiles were performed on prostate cancer cells (PC3) with a specific CTCF knock down 48h after transfection. Custom arrays containing potential CTCF target genes were performed on 7 normal morphologically healthy prostate tissues tested for IGF2 LOI and ROI status and on 12 PCA tissues of radical prostatectomy. The most significant genes were tested in 24 normal prostate tissues with LOI and ROI. Results: Microarray analyses of specific knock down of CTCF in the prostate cancer cell line PC3 resulted in ~ 500 significantly regulated genes 48h after sirna transfection. 390 genes were differentially expressed in histologically non-neoplastic prostate tissue with and without LOI (taken from radical prostatectomy specimens resected for PCA). Of these, 111 genes were also significantly regulated in PCA compared to non-neoplastic prostate and 104 were significant when comparing different gleason grades (Gleason 6 vs 8). 50 genes were commonly deregulated in all comparisons. Conclusions: Our data suggest an important role of the insulator and transcription factor CTCF in very early stages of PCA, potentially by global relaxation of the imprinting of a large array of CTCF target genes. In vitro and in vivo analyses using CTCF knock out animals are underway to further define the exact mechanisms of this process. V4. 7 Evidence for an association of a polymorphism in LGALS3 with prostate cancer risk Imkamp F 1, Dubrowinskaja N 1, Dörk T 2, Meyer A 3, Serth J 1, Kuczyk T 1, Merseburger A 1 1) Clinics of Urology and Urologic Oncology, Medical School, Hannover, DE 2) Clinics of Obstetrics and Gynaecology, Medical School, Hannover, DE 3) Department of Radiation Therapy, Medical School, Hannover, DE Background: Galectin-3 is a carbohydrate-binding protein involved in cell-cell and cell-matrix interactions and cancer progression. Modulation of galectin- 3 expression in cancer cells has been reported as a diagnostic/prognostic marker for specific cancer types, such as thyroid, stomach and prostate. A functional polymorphism in the LGALS3 gene (rs4644) substituting proline with histidine (p.p64h) results in susceptibility to matrix metalloproteinase cleavage and acquisition of resistance to apoptosis. Methods: We assessed the frequency of rs4644 in a hospital-based casecontrol study. 482 prostate cancer patients who were treated with brachytherapy at Hannover Medical School, and 488 control individuals matched by ethnicity and gender were genotyped using allele-specific discrimination with fluorescent probe 5 - exonuclease assays (TaqMan). Allele and genotype frequencies were compared by chi-square and Cochran Armitage trend tests. Results: The rare allele of rs4644 was found on 362 chromosomes in the patient series (37.6 %) and 401 chromosomes among controls (41.1 %, allelic OR 0.86, 95% CI 0.72; 1.03). A trend towards a higher incidence of the histidine variant among controls was observed (ptrend= 0.1). In total, carriers of the rare allele were less prevalent among patients than among controls (carrier OR 0.75, 95% CI 0.58; 0.98, p=0.03). Conclusion: The p.p64h variant of galectin-3 may constitute or may be associated with a protective factor in prostate cancer etiology. Larger studies will be required to confirm these observations. 10 Der Urologe

11 Urologie aktuell V4. 8 Quantitative Detektion zirkulierender Tumorzellen (CTC) beim Prostatakarzinom Thalgott MK 1, Nawroth R 1, Rack B 2, Schindlbeck G 2, Maurer T 1, Heck M 1, Kübler H 1, Gschwend JE 1, Retz M 1 1) Urologische Klinik und Poliklinik, Technischen Universität, Klinikum r.d. Isar, München, DE 2) Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Klinikum Innenstadt der Ludwig-Maximilians-Universität, München, DE Einleitung: Das Vorhandensein zirkulierender Tumorzellen (CTC) scheint prognostisch relevant und zur Therapieüberwachung des Prostatakarzinoms geeignet. Ziel des vorliegenden Projektes war die Etablierung des semiautomatisierten CellSearch -Systems. Untersucht wurde die Zahl zirkulierender Tumorzellen im peripheren Blut von Patienten mit einem lokal fortgeschrittenen Prostatakarzinom (PC) oder einem hormonrefraktären metastasierten Prostatakarzinom (HRPC). Material und Methoden: Patienten mit einem PC ( ct3n0m0, Gleason Score 7-9; n=15) oder einem HRPC (n=11) wurde je ca. 20 ml venöses Blut entnommen und mit dem CellSearch -System untersucht. Gesunde Probanden dienten als Kontrollgruppe (n=13). Die quantitative CTC- Bestimmung erfolgte durch immunomagnetische Isolation über einen anti-epcam-antikörper und eine automatisierte immuncytochemische Fluoreszenzfärbung. Die automatisiert selektionierten Tumorzellkandidaten wurden abschließend benutzerdefiniert verifiziert. Die Tumorzellen sind positiv für die Nukleinsäurefärbung DAPI und negativ für CD-45. Ergebnisse: In der Gruppe mit einem PC und einem medianen PSA-Wert von 23,54 ng/ml [6,92-79,64] konnten nur bei zwei Patienten CTC nachgewiesen werden [1-3]. Es fand sich kein Zusammenhang zwischen der CTC-Zahl und den histopathologischen Ergebnissen. Hingegen zeigten HRPC-Patienten bei einem medianen PSA-Wert von 162,45 ng/ml [4,45-318,7] eine mediane CTC- Zahl von 50 [2-6500]. Bei alleiniger lymphogener Metastasierung betrug die mediane CTC-Zahl 3 und lag somit signifikant unter der medianen CTC- Zahl von 86 bei Patienten mit ossärer Metastasierung. In der Kontrollgruppe (n=13) wurden keine CTC detektiert. Schlussfolgerungen: Die höchste CTC-Zahl konnte bei ossär metastasierten HRPC-Patienten nachgewiesen werden. Hingegen zeigte sich bei einem lokal fortgeschrittenen PC, unabhängig von der Histopathologie und dem Gleason- Score, keine CTC-Erhöhung. Das CellSearch -System scheint insbesondere zur Überwachung der Chemotherapie von ossär metastasierten HRPC- Patienten geeignet. Für die klinische Anwendung sollte die CTC-Detektion mit dem CellSearch -System weiter validiert werden. V4. 9 Sarcosine: A key metabolite in non-invasive prostate cancer detection? Jentzmik F 1, Stephan C 1, Miller K 1, Schrader M 1, Lein M 1,2, Jung K 1,2 1) Department of Urology, Charité University Medicine, Berlin, DE 2) Berlin Institute for Urologic Research, Berlin, DE Background: Sarcosine (N-methylglycine) was recently identified as a key metabolite in post digital-rectal-exam (DRE) urine for prostate cancer (PCa) detection. Objektive: To evaluate the potential of sarcosine as a biomarker for early disease detection and aggressivity prediction. Methods: We analyzed sarcosine in archived urine supernatants collected after standardized DRE from 139 Caucasian men with PSA concentrations of 0-20 ng/ml by gas chromatography-mass spectrometry and normalized it to urinary creatinine. One hundred and six had PCa (mean age: 64.3 years) and 33 were NEM patients (66.6 years). All patients underwent prostate biopsy and from 91 patients the prostatectomy specimens were available after radical prostatectomy. Results: The sarcosine to creatinine ratio showed significantly lower values for PCa compared with NEM (median: 806 vs. 929 nmol/mmol; Mann- Whitney test, P=0.0248). Receiver-operating characteristics (ROC) analyses of total PSA, %fpsa, and sarcosine clearly proved that %fpsa performed significantly better than sarcosine in delineating PCa from NEM ([AUC] 0.81 vs. 0.63, P=0.012), while PSA performed equal with sarcosine (AUC: 0.64 vs. 0.63, P=0.933). When the statistical analysis was restricted to patients with the total PSA range of 0-10 ng/ml (n=99; 71 PCa and 28 NEM), %fpsa performed again better than sarcosine and PSA (AUC: 0.79 vs and 0.59), respectively. In addition, no associations of sarcosine to the conventional pathological prognostic indicators tumor stage and Gleason score were evident. The sarcosine ratio did not differ between patients with pt2 and pt3 stage (779 [n=62] vs 838 nmol/mmol [n=30]; P=0.632) as well as in patients with Gleason score <7 and 7 (779 [n=26] vs 803 nmol/mmol [n=65]; P=0.632). Sarcosine was not correlated to age of patients (rs=0.081, P=0.343) and to the PSA concentrations (rs=0.0009, P=0.992). Conclusion: In summary, our data in a well defined cohort demonstrate that measurement of sarcosine in urine after DRE is hardly suitable to improve the diagnostic performance in comparison with the routine markers like %fpsa. Although cancer-related metabolites in urine combined with other markers are expected to become promising tools, the data of sarcosine should be interpreted with caution. Abstract Session 5 Moderation: Edgar Dahl, Patrick J. Bastian V5. 1 ERG rearrangement is specific for prostate cancer and does not occur in any other common epithelial malignancy Scheble V 1, Braun M 1, Ruiz C 2, Petersen K 1, Fend F 1, Bubendorf L 2 und Perner S 1 1) Institute of Pathology, University Hospital, Tübingen, DE 2) Institute of Pathology, University Hospital, Basel, CH The rearrangement of ERG, most commonly resulting in fusion with the androgene-regulated gene TMPRSS2, is the most frequent gene rearrangement in prostate carcinomas. Since its initial discovery in 2005, a lot progress was already made in the understanding of prostate cancer with this alteration. However, until today there is no evidence that the ERG rearrangement specifically occurs in prostate carcinomas but no other common epithelial malignancy. Aim of our study was to assess ERG rearrangement for its specificity for prostate cancers. Materials and methods: We designed a multitumor-tissue-microarray containing representative samples of approx. 150 oropharyngeal, 150 hepatopancreatic, 160 gastrointestinal, 180 urogenital, 100 gynaecological, 120 lung and 180 breast carcinomas. The ERG rearrangement status was assessed by an ERG break-apart FISH assay as earlier described. Results: We could not find an ERG gene rearrangement in any of the multiple epithelial cancer samples but prostate cancer. Conclusion: Since there was no evidence of ERG rearrangement in any other common epithelial cancer, it appears that the ERG rearrangement is a pathognomonic genetic alteration for prostate carcinomas. The detection of this alteration in metastasis of unknown primary would be an evidence of prostate cancer and thus provides a specific marker for prostate cancer. Further research must show whether specific therapeutic approaches can target prostate cancers with ERG rearrangements. Der Urologe

12 V5. 2 ERG rearrangement as a marker to differentiate between small cell lung cancer and small cell prostate cancer Scheble VJ 1 *, Braun M 1 *, Wilbertz T 1, Stiedl A-C 1, Petersen K 1, Schilling D 2, Seitz G 4, Fend F 1, Kristiansen G 3, Perner S 1 * These authors contributed equally to this work 1) Institute of Pathology, Comprehensive Cancer Center, University Hospital, Tuebingen, DE 2) Department of Urology; Comprehensive Cancer Center, University Hospital, Tuebingen, DE 3) Institute of Surgical Pathology; University Hospital, Zurich, CH 4) Department of Pathology; Klinikum of the Sozialstiftung, Bamberg, DE Background: Small cell prostate cancer is a rare but aggressive disease, tending to early metastasis and poor outcome. Still, its histogenetic background is unclear and diagnosis, especially in distinction from metastatic small cell lung cancer is challenging. The aim of our study was to determine whether the ERG rearrangement commonly observed in acinar prostate cancer can distinguish small cell prostate cancer from small cell lung cancer samples. Material and Methods: We assessed 15 small cell prostate cancers and 22 small cell lung cancers for ERG rearrangement using FISH. Commonly used and novel immunohistochemical markers (i.e. AR, CANT1, GOLPH2, PSA, PSMA, CD56, EMA, TTF1, Chromogranin A, Synaptophysin and Ki-67) were further studied. Results: ERG rearrangement occurred in 86% of small cell prostate cancer samples but none of the small cell lung cancer samples. The prostate targeting markers AR, CANT1, PSA, and PSMA were positive in a minority of small cell prostate cancer samples but none of the small cell lung cancer samples whereas GOLPH2 was positive in the majority of both entities. CD56, EMA, and TTF1 were negative in most small cell prostate cancer samples and positive in the majority of small cell lung cancer samples. Discussion: The ERG rearrangement is very common in small cell prostate cancer, supporting the hypothesis that ERG rearrangement occurs in prostate cancer with clinically adverse outcome. Furthermore, the ERG rearrangement is the most significant marker to differentiate between small cell prostate cancer and small cell lung cancer. V5. 3 Global levels of histone H3K27me1 predict prostate cancer recurrence Rogenhofer S 1, Ellinger J 1, Kahl P 2, von der GathenJ 1, Heukamp LC 2, Walter B 3, Hofstädter F 4, Büttner R 2, Müller SC 1, Bastian PJ 5, von Rücker A 2 1) Department of Urology, University Hospital, Bonn, DE 2) Institute of Pathology, University Hospital, Bonn, DE 3) Department of Urology, University Hospital, Erlangen, DE 4) Institute of Pathology, University Hospital, Regensburg, DE 5) Department of Urology, University Hospital, Großhadern, LMU München, DE Objective: Epigenetic alterations such as DNA methylation and histone modifications play important roles in carcinogenesis. It was reported that global histone modification patterns are predictors of cancer recurrence in various tumor entities. Our study was performed to evaluate histone lysine (HxKy) methylation in prostate cancer (PCA). Material and Methods: A tissue microarray with 113 clinically localized PCA and 34 hormone-refractory PCA (HRPC) and 30 metastatic, hormonedependent PCA (HDPC) was stained with antibodies against H3K27me1, H3K27me2, H3K27me3, H4K20me1, H4K20me2 and H4K20me3. Sections were scored according the staining intensity and the proportion of epithelial cells showing nuclear staining. Results: Histone lysine methylation marks were inversely correlated with clinical-pathological parameters [all p 0.05: pt-stage (H3K27me1, H4K20me1), lymph node metastasis (H3K27me1, H4K20me2, H4K20me3), capsular penetration (H3K27me1), seminal vesicle infiltration (H3K27me1), Gleason Score (H3K27me1, H3K27me2, H3K27me3, H4K20me1, H4K20me2, H4K20me3)]. In addition, low levels of H3K27me1 were significantly predicting PSA recurrence following radical prostatectomy (Kaplan Meier estimates, p=0.005). H4k20me1 and H4K20me2 levels were decreased in HDPC and HRPC, whereas H3K27me1 and H3K27me3 levels were increased in HDPC and HRPC (p Conclusion: Global histone modification levels may help to identify patients localized PCA with adverse prognosis. Furthermore, targeting histone modifications may be a potential target for the future therapy of PCA. V5. 4 Untersuchungen zur Gen-Promotormethylierung im Prostatakarzinom und benignem, prostatischen Gewebe Steiner I 1,2, Jung K 1,3, Schatz P 4, Wittschieber D 2, Lein M 3, Dietel M 2, Erbersdobler A 2 1) Berliner Forschungsinstitut für Urologie (BFIU), Berlin, DE 2) Institut für Pathologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin, DE 3) Klinik für Urologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin, DE 4) Epigenomics AG, Berlin, DE Einleitung: Die Detektion des Prostatakarzinoms stellt für den Urologen heutzutage noch immer eine große Herausforderung dar, da abgesehen von einem stanzbioptisch nachgewiesenen Karzinom nach wie vor kein Marker identifiziert ist, der sicher erkennen lässt, ob ein Tumor vorhanden ist. Untersuchungen auf DNA-Ebene haben ergeben, dass Gen-Promotor-Hypermethylierungen häufig bei speziellen Genen in der frühen Krebsentwicklung auftreten. Somit könnte die Messung dieser DNA-Modifikation eine sensitive Methode zum Prostatakrebs-Screening, möglicherweise sogar in histologisch noch tumorfrei erscheinendem Gewebe, darstellen. Wir untersuchten daher die Aussagekraft der Promotorhypermeth ylierung von vier Genen (GSTP1, RARβ2, APC und PITX2) im prostatischen Tumor und benignem Gewebe. Methoden: Das jeweils größte Tumorareal von 25 Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Prostatektomie-Gewebeproben wurde genauestens lokalisiert. Aus Tumor und nicht-neoplastischem Gewebe unterschiedlicher Entfernungen zum Tumor wurden Gewebeproben (1 mm Durchmesser) zur DNA-Isolierung gewonnen. Die Methylierungsraten wurden mittels verschiedener Assay-Technologien ermittelt. Ergebnisse: Erhöhte Methylierung zeigte sich in den Tumorproben beim Vergleich mit Prostatakarzinom-freiem Zystektomie-Kontrollgewebe in allen untersuchten Genpromotoren (GSTP1: 21/25, 84%, RARβ2: 24/25, 96%, APC: 21/25, 84%, PITX2: 20/25, 80%). In prostatischer intraepithelialer Neoplasie (PIN)-Fällen wurden erhöhte Methylierungsraten für GSTP1, APC, PITX2 (jeweils 2/3) und RARβ2 (3/3) gefunden. Einige Proben zeigten auch im Tumor-angrenzenden, benignen Gewebe erhöhte RARβ2- und APC-Methylierung. Des Weiteren assoziierte die GSTP1-, RARβ2- und APC- Methylierung signifikant positiv mit primärem Gleason-Grad. Die GSTP1- Methylierung assoziierte zusätzlich mit dem pt-stadium. Fazit: Erhöhte GSTP1-, RARβ2-, APC- bzw. PITX2-Promotormethylierung stellt ein häufig auftretendes Ereignis im Prostatakarzinom dar, was diese Gene zu sensitiven Werkzeugen für die Detektion von neoplastischen Läsionen in der Prostata macht. RARβ2-Hypermethylierung zeigte sich auch in einigen histologisch tumorfrei-erscheinenden Proben, so dass über die Promotormethylierung dieses Gens hilfreiche Informationen zur frühzeitigen Prostatakrebsidentifizierung gewonnen werden könnten. Die GSTP1-, RARβ2- und APC-Methylierung scheint zusätzlich Potential zur Vorhersage von Tumoraggressivität und ausdehnung zu haben. V5. 5 Epigenetische Regulation des Myopodingens während der Genese des Prostatakarzinoms Dansranjavin T, Wagenlehner F, Bogumil A, Altinkilic B, Weidner W, Steger K, Paradowska A Klinik und Poliklinik für Urologie, Kinderurologie und Andrologie, Justus- Liebig-Universität, Giessen, DE Einleitung: Myopodin ist ein potentielles Tumorsupressorgen, dessen Expressionsverlust mit einer perineuralen Invasion und Metastasierung in 12 Der Urologe

13 Urologie aktuell Prostatakarzinomen (PCa) assoziiert ist. In dieser Studie wurde die Rolle der tumorassoziierten epigenetischen Promotorinaktivierung des Myopodingens in Prostatakarzinomzelllinien und primären Prostatatumoren untersucht. Material und Methoden: Die Zelllinien Du145, LnCaP und 22RV1, sowie PCa-Proben von 37 Patienten (18 T2, 14 T3, 5 T4) und zusätzlich 21 Proben der daran angrenzenden benignen Prostatahyperplasie (BPH), wurden auf die Methylierung des Myopodinpromotors mittels COBRA (Combined Bisulfite- Restriction-Analysis) und Bisulfitsequenzierung untersucht. Zusätzlich wurde der Effekt von 5-Azacytidin (5-AZA) und/ oder Trichostatin A (TSA) einzeln und in Kombination auf die mrna-expression des Myopodingens untersucht. Ergebnisse: Alle untersuchten PCa-Zelllinien zeigten eine partielle Methylierung des Myopodingens, die mit einer schwachen (LnCAP) bzw. fehlenden (DU145, 22RV1) Myopodinexpression assoziiert war. Eine starke Reexpression des Gens wurde mittels TSA-Behandlung erzielt. Dieser Effekt wurde bei DU145 und LnCAP zusätzlich durch die kombinierte 5-AZA/TSA-Behandlung verstärkt. 62% (23/37) der PCa-Proben wiesen eine partielle Methylierung des Myopodingens auf. Die Korrelation der Methylierungsrate mit tumorbiologischen Parametern zeigte bei T3-PCa eine Methylierungsabnahme mit zunehmender Dedifferenzierung (80% in G2 zu 44% in G3). Die vergleichende Analyse der PCa-Proben mit den korrespondierenden BPH-Arealen ergab ein identisches Methylierungsmuster in 20 von 21 Fällen. Schlussfolgerung: Die Reexpressionsexperimente deuten darauf hin, dass Histonacetylierung eine zentrale Rolle bei der Regulation des Myopodingens in PCa spielt. Die DNA-Methylierung hat einen zusätzlichen Effekt auf die Myopodinexpression. Eine Demethylierung des Myopodingens könnte einen Marker für die Dedifferenzierung der PCa in fortgeschrittenen Tumorstadien darstellen. V5. 6 Novel DNA methylation biomarkers for early detection and prediction of progression in bladder cancer Rose M, Gaisa NT, Alkaya S, Antony P, Knüchel R and Dahl E Molecular Oncology Group, Institute of Pathology, RWTH Aachen University, Aachen, DE Background: While the genetics of bladder cancer development has been studied intensively in recent years the knowledge on epigenetic modifications and especially DNA methylation changes in this tumor entity is still limited. Thus, the aim of the current project is the identification and molecular characterization of novel DNA methylation markers potentially useful for early cancer detection or treatment stratification of bladder cancer patients. Methods: cdna array based expression profiling identified 24 candidate genes showing significant downregulation in different types of bladder cancer and harbouring a CpG island in their promoter region. Methylation frequency of these genes in bladder cell lines, cancer tissues and urine samples is being analyzed by methylation-specific PCR (MSP) and pyrosequencing. In order to further proof epigenetic silencing, in vitro demethylation is carried out by azacytidine / trichostatin A treatment. Methylation based multi-marker panels will be optimised using receiver operator characteristics (ROC) curve analysis. Furthermore, selected candidate genes will be functionally analyzed in cell line models. Results: Both MSP and pyrosequencing analysis revealed that eight of the 24 candidate genes exhibited promoter methylation in bladder cancer cell lines (n=5) in clear association with loss of mrna expression, the latter being restored in vitro by demethylation. In bladder cancer, two candidate genes showed frequent methylation in non-invasive (n=30) and invasive bladder carcinomas (n=30) compared with a set of normal urothelial samples (n=15). Interestingly, we characterized one candidate gene specifically exhibiting promoter methylation in progressive disease, i.e. invasive bladder cancer (69% methylation frequency), whereas non-invasive tumours presented an unmethylated promoter, indicating a suppressive function in tumor invasion. Conclusions: This project started just twelve months ago but has already defined several interesting novel genes that are epigenetically silenced in various types of bladder cancer. Subsequent evaluation of these genes as DNA methylation markers as well as their functional analysis in vitro should reveal signalling pathways in bladder cancer affected by aberrant DNA methylation. V5. 7 Epigenetische Veränderungen im Prostatakarzinom und ihre mögliche Beeinflussung durch den Einsatz von Inhibitoren der DNA- Methylierung und Histonmodifikationen Hauptstock V 1, Kuriakose S 1, Ellinger J 2, von Rücker A 1 1) Institut für Pathologie, Universitätsklinikum, Bonn, DE 2) Klinik für Urologie, Universitätsklinikum, Bonn, DE Epigenetische Veränderungen wie DNA- Methylierung und Histonmodifikationen spielen eine wichtige Rolle in der Tumorgenese des Prostatakarzinoms, indem sie Aktivierung und Inaktivierung relevanter Gene steuern. EZH2, eine Komponente des Polycombkomplex 2, ist in Prostatakarzinomzellen überexprimiert und mit GSTP-1 Hypermethylierung assoziiert. EZH2 wirkt als Histon- Lysin- Methyltransferase und führt zur Trimethylierung von H3K27 (Histon3 Lysin27). EZH2 verursacht eine Rekrutierung von DNA- Methyltransferasen, die eine DNA- de novo Methylierung vornehmen, daraus folgt eine Geninkativierung. Dieser Einfluss macht sowohl die DNA- Methylierung als auch die Histonveränderungen zu einem wichtigen Angriffsziel in der Tumortherapie. In dieser Studie untersuchen wir epigenetische Veränderung in verschiedenen Zelllinien (BPH-1, LNCAP und PC-3) unter den Einfluss von 5-aza-2 Deoxycytidine (5-aza-dC), ein DNA- Methyltransferase- Inhibitor, Depsipeptide, ein Histondeacetylase- Inhibitor und 3-Deazaneplanocin A (DZNep), ein S-Adenosylhomocystein- Inhibitor mit hemmender Wirkung auf EZH2. Wir analysieren die epigenetischen Veränderungen am Promotor von GSTP-1, APC und PTGS2, die wie wir in frühere Studien zeigen, durch de novo CpG Inseln Hypermethylierung inaktiviert werden wie auch den Einfluss von genrepremierende Methylierungsmarkierungen wie H3K27me, H3K9me und H4K20me, und die genaktivierende Markierungen H3K4me und H3K18ac auf die drei Promotoren. Der Effekt durch die EZH2- Überexpression im Prostatakarzinom ist noch wenig verstanden. Wir untersuchen den möglichen Einfluss von EZH2 auf die Inaktivierung der Promotoren von GSTP1, APC und PTGS2. Die ersten Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Depsipetide wie auch mit 5-azadC zu einer dosis- und zeitanhängige Reexprimierung von GSTP-1 in LN- CAP und PC-3 Zelllinien führt, dies kann jedoch nicht mit DZNep erreicht werden. Unter Einfluss von Depsipeptide kam es zu einer Abnahme von H3K27tri am APC- Promotor. Die Ergebnisse deuten an, dass die Beeinflussung von epigenetischen Veränderungen in Tumoren ein erfolgsversprechender Ansatz für die Therapie des Prostatakarzinoms ist. V5. 8 Eine qrt- PCR Gensignatur zur Prädiktion des Lymphknotenstatus bei Patienten mit high risk Prostatakarzinom Karl A 1, Davies B 2, Tritschler S 1, Stief C 1, Waldman F 2 1) Urologische Abteilung, Ludwig-Maximilians-Universtiät, München, DE 2) Department of Urology, UCSF, San Francisco, CA, USA Introduction and objective: The ability to predict the lymph node status of high risk prostate cancer patients at the time of diagnosis would be of great clinical utility in determining an appropriate treatment plan. A set of 48 candidate genes previously reported in the literature to be associated with aggressive tumor biology was selected for this investigation. The gene expression of the 48 candidate genes was compared between high risk tumors with and without positive lymph nodes. Methods: All patients with positive lymph nodes determined at the time of radical prostatectomy were included in this investigation (n=19). Node Der Urologe

14 negative patients, who had their surgery during the same time period, were biochemically disease free for at least 2 years and received no other treatment for their disease (n=19). All patients in this analysis received no treatment prior to surgery. The gene expression profile of each tumor using SYBR Green qrt-pcr for the 48 candidate genes was done on RNA extracted from paraffin sections. qrt-pcr was validated by agreement between matched samples in frozen and paraffin prostate tissue. Gene expression was quantitated relative to 3 housekeeping genes. Results: Eight of the 48 genes significantly predicted lymph node status (Mann-Whitney test: p <0.05). Assuming a logistic model and using a forward step-wise approach, ANGPT2, EVI1, and ZNF217 genes from this highly correlated subset of 8 genes were significant independent predictors of lymph node status at the 0.10 level (likelihood ratio test: p = , 0.089, 0.046, respectively). The area under the receiver operating characteristic curve was The model s sensitivity was 95% and the specificity was 80%. Only 4 patients were not classified correctly by our model. Conclusions: It appears that a 3 gene signature (ANGPT2, EVI1, and ZNF217) independently predicts lymph nodes status with a high degree of specificity and sensitivity. Validation studies of these genes are necessary to confirm these findings. Abstract Session 6 Moderation: Lutz Trojan, Michael Seitz V6. 1 DKC1 overexpression is associated with prostate cancer progression and necessary for continued growth of prostate cancer cell lines Sieron P, Schulz WA Department of Urology, University Hospital, Düsseldorf, DE Inherited mutations inactivating the DKC1 gene cause dyskeratosis congenita, a syndrome characterized by hematopoiesis failure, skin defects and cancer development. The product of the gene, Dyskerin (Cbf5), is essential for formation of pseudouridine in various RNAs and of the telomerase RNA subunit htr and has been proposed to protect against apoptosis. Surprisingly, increased expression of DKC1 as well has been linked to the development of various cancers in adults, especially breast cancers. We have studied DKC1 mrna expression in 47 primary M0 prostate cancer tissues compared to 13 benign tissues by quantitative RT-PCR, and its correlation to htr and the proliferation marker MKI67. DKC1 was significantly overexpressed in cancer tissues, especially in highstage and recurrent cases and expression correlated moderately well with htr and MKI67. Enhanced DKC1 expression was not caused by increased copy numbers of the gene at Xq28 measured by quantitative PCR. The function of Dyskerin overexpression was studied by sirna-mediated knockdown in the prostate cancer cell lines Du145 and 22Rv1. Short-term Dyskerin knockdown diminished cell proliferation, but did not promote spontaneous or enhance drug-induced apoptosis. Sustained knockdown prevented proliferation by inducing a diminuitive phenotype and cell detachment, consistent with a failure of RNA biosynthesis, but did not induce senescence. We conclude that DKC1 upregulation is common during progression of prostate cancers. Overexpression of Dyskerin seems to be most crucially required to meet the enhanced requirement for RNA synthesis during tumor growth, but should also support telomerase activation. Our findings confirm the hypothesis that both lack and overexpression of Dyskerin can contribute to cancer development. V6. 2 Bedeutung von Schlüsselenzymen der camp-abhängigen Signaltransduktion in humanem Prostatagewebe Waldkirch E 1, Sigl K 2, Stief CG 3, Kuczyk M 1, Ückert S 1 und Hedlund P 4,5 1) Klinik und Poliklinik für Urologie und Urologische Onkologie, Medizinische Hochschule, Hannover, DE 2) morphosys AG, Martinsried, DE 3) Urologische Klinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Großhadern, LMU München, DE 4) Department of Clinical & Experimental Pharmacology, University Hospital, Lund, SE 5) Department of Clinical Pharmacology, University Hospital, Linköping, SE Einleitung: Die Expression der Phosphodiesterase 4 (PDE4) im Bereich des fibromuskulären Stroma der Prostata sowie die relaxierende Wirkung von Forskolin (Adenylatzyklase-Aktivator) und Rolipram (PDE4-Inhibitor) auf Detrusormuskulatur und Prostata lässt auf eine besondere Bedeutung der camp-abhängigen Signaltransduktion in der Tonusregulation von Blase und Prostata schliessen. Ziel der Studie waren die Darstellung der Expression von Isoformen des Schlüsselenzyms Proteinkinase A (cak) in Relation zu alpha- Actin und zu Isoformen der PDE4, sowie Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung der cak in der Tonusregulation der Prostata. Methoden: Die Darstellung der Expression von alpha-actin, Isoformen der PDE4 und der cak erfolgte mit immunohistochemischen Methoden und der Western Blot Analyse. Im Rahmen der in vitro Organbadversuchen wurde das Prostatagewebe zunächst mit dem cak-inhibitor Rp-8-CPTcAMPS präinkubiert und anschliessend mit Norepinephrin kontrahiert. Es erfolgte die kumulative Gabe von Forskolin, SNP, Rolipram und Tadalafil in Endkonzentrationen von 10-8 bis 10-5 mol/l. Ergebnisse: Immunreaktionen gegen die cak I alpha, II alpha und beta, nicht jedoch gegen die Isoform I beta konnten nachgewiesen werden. Doppelfärbungen zeigten eine Colokalisation von Isoformen der cak und der PDE4 in glattmuskulären und glandulären Anteilen der Prostata. Die Western Blot Analyse bestätigte die Ergebnisse der Immunhistochemie. Die in vitro Organbadexperimente zeigten eine signifikante Abschwächung der relaxierenden Wirkung von Forskolin, SNP, Rolipram und Tadalafil durch den cak-inhibitor Rp-8-CPT-cAMPS. Zusammenfassung: Unsere Ergebnisse zeigen erstmalig die Expression verschiedener Isoformen des Schlüsselenzyms cak in Colokalisation mit der PDE4A und B in der glatten Muskulatur des fibromuskulären Stromas. Darüberhinaus belegen die durchgeführten Organbadversuche eine funktionelle Rolle der cak sowohl in der camp-, aber auch in der cgmpabhängigen Signaltransduktion zur Tonusregulation der glatten Muskulatur der Prostata. In Verbindung mit kürzlich veröffentlichten Daten zur Rolle von PDE4 Inhibitoren in der Tonusregulation der Detrusormuskulatur lässt sich schliessen, dass camp-abhängige Mechanismen eine zentrale Rolle in der Therapie von LUTS/BPH spielen könnten. V6. 3 Berührungsfreie endoskopische Messung der Harnblasenperfusion Firek P, Heidenreich A Klinik für Urologie, Universitätsklinikum, RWTH Aachen, DE Einleitung: Die Pathophysiologie von Funktionsstörungen der Harnblase bei Patienten mit benigner Prostatahyperplasie ist bisher unklar. Interessanterweise berichten nur max. 80% der Männer nach Prostataadenomektomie wegen Prostatahyperplasie über eine Besserung ihrer Symptomatik. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass durch die Blasenauslassobstruktion Sekundärveränderungen im Bereich der Blase verursacht werden, die für die Symptome verantwortlich sind. Nach Ergebnissen tierexperimenteller Untersuchungen finden eine Vielzahl von morphologischen, physiologischen und molekularbiologischen Veränderungen im Detrusor statt, die vermutlich auf eine verminderte Perfusion der Blase mit konsekutiver Hypoxie zurückzuführen sind. Einen direkten Zugriff auf die in der Blasenwand ablaufenden Vorgänge erlauben die in der urologischen Diagnostik eingesetzten Methoden bisher kaum. 14 Der Urologe

15 Urologie aktuell Methoden: Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Verfahrens, mit dessen Hilfe lokal und nichtinvasiv die Sauerstoffsättigung der Harnblasenwand gemessen werden kann. Dazu wurde ein Gerät entwickelt, welches endoskopische Methoden mit faseroptisch basierter berührungsloser Remissionsspektroskopie kombiniert. Ergebnisse: Nach Entwicklung der faseroptisch basierten spektroskopischen Messeinheit wurde diese zunächst in vitro an einem etablierten hämorheologischen Modell validiert. Nach Überprüfung auf Konstanz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse wurde das System an zehn Patienten mit benigner Prostatahyperplasie im Rahmen der TUR-P klinisch erprobt. Es konnte ein Abfall der Sauerstoffsättigung mit zunehmendem Harnblasenvolumen in allen Messpositionen demonstriert werden. Ferner konnte ein deutlicher Perfusionsunterschied zwischen Harnblasenboden und Harnblasendach unabhängig vom Füllvolumen gezeigt werden. Der Blasenboden ist mit einer durchschnittlichen Sauerstoffsättigung von 97% ± 1,56% und einem Abfall von 5,2% so2 bis zu einer Füllmenge von 300 ml der am besten durchblutete Bereich der Harnblase. Schlussfolgerung: Mit der berührungslosen Remissionsspektroskopie wurde eine Methode zur endoskopischen Bestimmung der Sauerstoffsättigung von Hohlorganen entwickelt. Dieses Verfahren kann somit als Grundlage zur Früherkennung von Blasenfunktionsstörungen dienen. Für die Zukunft ist die Korrelation der Messergebnisse mit dem funktionellen Operationsergebnis geplant. V6. 4 Modellierung einer virtuellen Prostata zur Optimierung des magnetischen Pharmakatargetings Röth AA 1, Baumann M 2, Conze J 1, Klinge U 1,2, Schumpelick V 1, Schmitz-Rode T 2 1) Chirurgische Klinik, Universitätsklinikum der RWTH Aachen, DE 2) Lehrstuhl für Angewandte Medizintechnik, Helmholtz-Institut für Biomedizinische Technik, Aachen, DE Einleitung: Magnetische Nanopartikel (MNP) können dazu verwendet werden, die zahlreichen Nebenwirkungen einer systemischen Chemotherapie zu reduzieren, indem die Wirkstoffe lokal im Tumor appliziert werden. Sie werden intravenös verabreicht und dann mit Magnetfeldfallen im Tumor gefangen. Die Anlage eines magnetischen Wechselfeldes bewirkt die Freisetzung des Pharmakons. Anhand eines virtuellen Prostatamodells sollte die Zusammensetzung und der Aufbau der idealen Magnetfeldfalle bestimmt werden. Material und Methoden: Es wurden verschiedene Konfigurationen von magnetischen Spulen in einem virtuellen Prostatamodell designend, gebaut und getestet. Um ein genaues mathematisches Modell der Prostata und ihrer Umgebung zu bilden, wurden pathologische Gutachten ausgewertet, die Prostata histologisch untersucht sowie die magnetischen Eigenschaften des Gewebes bestimmt. Hierauf wurden virtuell Spulenanordnungen in der Urethra und im Rektum platziert, das resultierende Magnetfeld berechnet und entsprechend einer fuzzy-logik optimiert. Ergebnisse: Der Vergleich mit bekannten Magnetfeldern verschiedener Spulenanordnungen zeigte, dass unsere Analyse einen relativen Fehler von 10-3 % aufwies. Die Optimierung zeigte, dass sich eine Anordnung von magnetischen Spulen lediglich in der Urethra und nicht im Rektum am besten für das Pharmakatargeting eignet. Schlussfolgerung: Magnetische Nanopartikel bieten eine hervorragende Möglichkeit, Chemotherapeutika gezielt an einen Tumor zu bringen und dort freizusetzen. Mit Hilfe unseres virtuellen Prostatamodells konnte eine optimierte Spulenanordnung mit einer hohen Targeting-Effektivität gefunden werden. Durch Übertragung ins Tiermodell sollte die Korrektheit des virtuellen Prostatamodells bestätigt werden. V6. 5 Alterations in the gene expression pattern of testicular germ cell tumors after treatment with a novel antiangiogenic compound Nitzsche B 1, Gloesenkamp C 1, Schrader M 2, Lein M 3, Höpfner M 1 1) Department of Physiology (CBF), Charité University Medicine, Berlin, DE 2) Department of Urology (CCM), Charité University Medicine, Berlin, DE 3) Berlin Institute for Urologic Research (CCM), Charité University Medicine, Berlin, DE Testicular germ cell cancer is the most common disease of young men at the age of 20 to 40 years. Because of the generally good response to cisplatin based chemotherapy, new molecular treatment approaches have not been well developed. However, patients with cisplatin-refractory tumors have a very poor prognosis and at present, no standard chemotherapy exists for this particular subgroup of patients. As angiogenesis, driven by several growth factor receptors is known to be essential for tumor growth and metastasis we hypothesized that targeting angiogenic growth factor receptor signaling pathways may be a promising approach for innovative treatment of testicular germ cell tumors. Using a novel tyrosine kinase inhibitor with antiangiogenic and antipoliferative potency identified by in silico screening in a previous study, we performed cdna- Microarrays to further characterize the molecular events induced by the novel inhibitor HP-14. The expression of genes involved in angiogenesis and cancer relevant pathways like transformation and tumorigenesis was analyzed in primary endothelial cells (HUVEC) and in the testicular germ cell tumor cell line Tera-1. In HUVEC cells HP-14 modulated the expression of several important proangiogenic and antiangiogenic genes, such as VEGFR- 2, endostatin, EGF, PDGFB and AKT1. In Tera-1 cells HP-14 also modulated angiogenic genes, but additionally a marked alteration of proteins involved in cell cycle regulation (e.g. CDK2, CDC25A, CDKN1A) was observed, suggesting an arrest of Tera-1 cells in the G1/GO-phase. Taken together our data show that HP-14 is an exciting new inhibitor which merits further evaluation for targeted treatment of testicular germ cell cancer. V6. 6 Zuverlässige Früherkennung von Prostatakarzinomen im Screening durch 3D-FCDS-TRUS Merkle W Deutsche Klinik für Diagnostik (DKD), Wiesbaden, DE Die Früherkennung von Prostatakarzinomen durch bildgebende Systeme ist schwierig. Die vorgestellte Technik hat sich jedoch im Screening bei normalen und erhöhten PSA-Werten über 10 Jahre hin bewährt. Mittels der 3D-FCDS-Transrektalsonographie lassen sich mit einer Sensitivität von 0,82, einer Spezifität von 0,91 sowie einer geringen Falschnegativrate von 1,7% Tumore zuverlässig darstellen und benigne Veränderungen mit einer Sicherheit von 95,6% trotz PSA-Erhöhung sonographisch korrekt vorhersagen, wie in einer histologisch kontrollierten, prospektiven Studie belegt wurde (Merkle W.: UIJ 2009, April, 2(2)). V6. 7 Erhöhte Inzidenz des Prostatakarzinoms nach Nierentransplantation Apel H 1, Walschburger-Zorn K 1 *, Pressmar K 2, Engehausen DG 1, Wullich B 1 1) Urologische Klinik mit Poliklinik, Universitätsklinikum, Erlangen, DE 2) Medizinische Klinik IV, Nephrologie und Hypertensiologie, Universitätsklinikum, Erlangen, DE Einleitung: Die allogene Nierentransplantation ist bei dialysepflichtigen Patienten im Stadium der terminalen Niereninsuffizienz die optimale Nierenersatztherapie. Trotz Verbesserung der Lebensqualität und allgemeinen Lebenserwartung im Vergleich zu Dialysepatienten ist die postoperative Entwicklung von malignen Tumoren hierbei ein bekanntes Problem. Der Urologe

16 Methodik: Retrospektive Analyse anhand des eigenen Patientenkollektivs von 1882 durchgeführten Nierentransplantationen am Transplantationszentrum Erlangen-Nürnberg hinsichtlich Inzidenz und Art von Tumorentwicklung postoperativ im Zeitraum von 1966 bis Ergebnisse: Von 1882 transplantierten Patienten konnte in 221 Fällen (11,7 %) eine Karzinomentstehung nachgewiesen werden. Bei 150 Patienten handelte es sich dabei um Nicht-Hauttumore. Unter diesen waren die urologischen Karzinome mit 32,1 % am häufigsten, wobei das Prostatakarzinom mit 13,5 % hinter dem Nierenzellkarzinom und dem Harnblasenkarzinom bei Männern an dritter Stelle rangiert. Danach folgten mit 31 % Malignome des Gastrointestinaltraktes, mit 14 % gynäkologische Tumore und 10 % Tumore des Respirationstraktes. Schlußfolgerung: Das Risiko einer Tumorentwicklung nach Nierentransplantation ist im Vergleich zur Normalbevölkerung insgesamt 12,5-fach erhöht. Ein erhöhtes Risiko finden wir in Übereinstimmung mit dem United States Renal Data System (USRDS) auch für das Prostatakarzinom. Dieses liegt bei männlichen Transplantierten 4-fach höher als bei der männlichen Gesamtbevölkerung. Damit können immunsupprimierte Patienten als eine Hochrisikogruppe gelten, die einer intensivierten Prostatakarzinomfrüherke nnungsuntersuchung zugeführt werden sollten. V6. 8 Hat die neoadjuvante Hormontherapie einen Einfluss auf die Risikobeurteilung anhand der Prostatastanzen? Micka B, Engehausen D, Krot D, Herzing W, Wullich B, Goebell PJ Urologische Universitätsklinik, FAU Erlangen-Nürnberg, DE Einleitung: Der Wert der neoadjuvanten Hormontherapie vor radikaler Prostatektomie (RRP) wurde in zahlreichen randomisierten Studien untersucht. Sie wird mit dem Ziel eingesetzt, die Frequenz positiver Absetzungsränder zu erniedrigen und ein down-staging des Ausgangsbefundes zu erreichen. Klare Daten, die eine bessere lokale Tumorkontrolle oder eine Senkung der Komplikationsrate belegen, fehlen jedoch. Dass die neoadjuvante Hormontherapie zu einem down-staging des Tumors und damit zu einer Änderung des angenommenen Risikoprofils führt, wird immer wieder diskutiert. Ziel war es, den Einfluss der neoadjuvanten Hormontherapie auf den staging error anhand des Erlanger Patientenkollektivs retrospektiv zu untersuchen. Material und Methode: In die Analyse wurden 412 Patienten nach Prostatektomie (1998 bis 2005) eingeschlossen: 304 Patienten erhielten präoperativ eine Hormontherapie. Das histopathologische Ergebnis der Stanzbiopsie wurde mit der endgültigen Beurteilung nach RRP verglichen. Anhand von PSA, Gleason-Score (GS) und Differenzierungsgrad (DG) wurden die Patienten drei Risikogruppen zugeordnet (low, intermediate, high). Ergebnisse: Eine Änderung des gradings war bei 36,2% (GS) bzw. 31% (DG) in der neoadjuvanten Gruppe zu beobachten; in der Kontrollgruppe war bei eine Änderung bei 17,6% (GS) bzw. 34,3% (DG) dokumentiert. Ein niedrigerer Gleason war bei 6,9% und ein niedrigerer Differenzierungsgrad bei 5% in der neoadjuvanten Gruppe zu beobachten; in der Kontrollgruppe war bei 6,5% ein niedrigerer Gleason und ein niedrigerer Differenzierungsgrad bei 8,3% eine Änderung dokumentiert. Die Zuordnung zu den Risikogruppen jedoch führte in beiden Gruppen (neoadjuvant vs. Kontrolle) gleichermaßen zu einer Erhöhung des prozentualen Anteils der Hochrisiko-Gruppe (27,0 auf 46,4 vs. 15,7 auf 30,6). Schlussfolgerung: Die präoperative Zuordnung in Risikogruppen (risk assessment) allein anhand der Prostatastanze scheint unzureichend und die Einbeziehung weiterer Prognoseparameter für eine robustere Einschätzung notwendig. Die neoadjuvante Hormontherapie hat daher keinen signifikanten Einfluss auf den risk assessment error. 16 Der Urologe