Proteine III. SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese

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1 Proteine III SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese

2 Serumproteine ca. 100 verschiedenen Proteine im Blutplasma; stammen aus Leber und Lymphknoten; Gesunder Organismus: dynamisches Gleichgewicht zwischen Biosynthese und Abbau von Plasmaproteinen Hypoproteinämie zu niedriger Plasmaproteinspiegel Ursachen: - verringerte Biosynthese (vermindertes Aminosäureangebot oder Leberparenchymschäden) - vermehrte Ausscheidung - Nierenschädigung Hyperproteinämie zu hoher Plasmaproteinspiegel durch vermehrte Biosynthese; meist klonale Expansion von g- Globulin produzierenden Plasmazellen

3 Fraktionen der Serumproteine I Bestimmung der gesamten Proteinkonzentration besitzt nur beschränkte Aussagekraft Auftrennen der Plasmaproteine in Einzelfraktionen diagnostische Hinweise Grundsätzlich kann man Plasmaproteine in 5 Fraktionen trennen: 1) Albumine 2) a 1 -Globuline 3) a 2 -Globuline 4) b-globuline 5) g-globuline

4 Analyse der Serumproteinfraktionen I Die Trägerelektrophorese wird meist routinemäßig (,screening method ) bei Verdacht auf bestimmte Krebstypen durchgeführt. Nach der elektrophoretischen Auftrennung kann man 5 gefärbte Banden (Albumin und Globuline) erkennen.

5 Analyse der Serumproteinfraktionen II Zur genaueren Analyse können die Banden eingescannt und mittels Bildanalyseprogrammen berechnet werden (Abb.1). Abb.1 Am wichtigsten ist die Erkennung abnormer Eiweißstoffe, sog. Paraproteine (Abb.2). Paraproteine können Indikatoren für Blutkrebs sein. Abb.2

6 Albumin hohe Fähigkeit zur Wasserbindung wichtiger Regulator des kolloidosmotischen Drucks Transportvehikel für Pharmaka, Vitamine, Magnesium, Calcium, nichtveresterte Fettsäuren, Spurenelemente, Abbau- und toxische Produkte im Blut in der Leber synthetisiert und anschließend in den Extrazellulärraum sezerniert; 40% befinden sich im Plasma, 60% im Extrazellulärraum des Hautgewebes Stark erniedrigte Albuminwerte deuten auf schwere Leberleiden, Leberzirrhose oder Nephrose hin.

7 a 1 -Globuline Saures a 1 -Glycoprotein: kohlenhydratreichstes Serumprotein; als Akute-Phase-Protein an der Immunmodulation beteiligt; liegt besonders bei akuten und chronischen Entzündungen, bei Carcinomen und während der Schwangerschaft in hohen Konzentrationen vor. a 1 -Fetoprotein: im fetalen Plasma, beim gesunden Erwachsenen nur in Spuren vorhanden; bindet Östrogen, könnte den Fetus vor einem Überschuss an mütterlichem Östrogen schützen. Bei Patienten mit Leberzellkarzinomen oder Hodentumoren findet die Biosynthese von a 1 -Fetoprotein in den Tumorzellen statt und wird von denen ins Plasma abgegeben. Weiters gehören zur α 1 Fraktion: Proteaseinhibitoren, Hormon-bindende Proteine, α1 Lipoprotein (HDL), und Prothrombin.

8 a 2 -Globuline / b-globuline a 2 - Gobuline sind,carrier-moleküle - binden und transportieren bestimmte Stoffe (Haptoglobin bindet Hämoglobin, Coeruloplasmin ist das Transportmolekül für Kupfer). Weiters findet man unter den a 2 - Gobulinen Thrombin-Inhibitoren, Plasmin-Inhibitoren und das Proenzym Plasminogen. Zu den b-globulinen zählt man Transferin (bindet und transportiert Eisenmoleküle) Fibrinogen (Fibrinvorstufe dient der Blutgerinnung) CRP (C-reaktives Protein): fördert die Phagozytose, indem es Makrophagen und das Komplementsystem aktiviert. CRP steigt bei Entzündungen fach an und wird zu den Akute-Phase- Proteinen gezählt. b-lipoprotein (low densitiy lipoprotein-ldl), für den Lipidtransport Faktoren des Komplementsystems

9 g-globuline Bei den g-globulinen (Immunglobulinen) handelt es sich um Antikörper; man unterscheidet fünf Immunglobulinklassen: IgG, IgA, IgM, IgD und IgE g-globuline werden von zu Plasmazellen ausgereiften B-Zellen produziert. Sie zirkulieren im Blut, befinden sich aber auch an der Oberfläche von allen B- Lymphozyten, wo sie als Membranrezeptoren für Antigene wirken. g-globulin-erhöhung bei: Längerdauernden entzündlichen Prozessen (Infektionen; Autoimmunerkrankungen: z.b. Rheuma; maligne Tumoren) Lebererkrankungen, besonders Leberzirrhose Erhöhte Produktion von g-globulinen durch Blutkrebserkrankungen

10 Akute-Phase-Reaktion Gewebsverletzung Unspezifische Entzündungsreaktion Erhöhte Plasmakonzentration von Akute-Phase-Proteinen (meist in Hepatocyten gebildet) Regulation der Synthese durch Cytokine, die von Entzündungszellen gebildet werden Bei Stress: Corticosteroide; wirken als Cofaktoren

11 Elektrophorese Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Zur Erzeugung des elektrischen Feldes wird das ganze Elektrophorese-System in einen Puffer getaucht und Spannung angelegt. Über die im Puffer enthaltenen Ionen fließt Strom. Dabei wandern positiv geladene Teilchen (Kationen) zur Kathode (-) und negativ geladene Teilchen (Anionen) zur Anode (+). Die Mobilität dieser Teilchen wird von mehreren Faktoren beeinflußt: - Form und Größe - Nettoladung - Porengröße des Trägers - Stärke des elektrischen Feldes - Reibung

12 Wanderungsgeschwindigkeit I Die Wanderungsgeschwindigkeit nimmt für größere Moleküle ab, da z.b Reibungskräfte im Gel zunehmen. Moleküle ähnlicher Größe, aber unterschiedlicher Form, können unterschiedliche Wanderungseigenschaften aufweisen, da Reibungskräfte und elektrostatische Kräfte unterschiedlich angreifen.

13 Wanderungsgeschwindigkeit II Ohmsches Gesetz: I = U R I = Stromstärke (in Ampere A) U = Spannung (in Volt V) R = Widerstand (in Ohm W)

14 Wanderungsgeschwindigkeit III v = E z f v = Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens E= elektrische Feldstärke z = Nettoladung des Teilchens f = Reibungskoeffizient

15 SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamidgel-Elektrophorese häufige Methode um Proteingemische zu trennen und die Größe von Proteinen abzuschätzen Detergens (SDS) bindet im Überschuss an die Proteine im Proteingemisch (etwa 1,4g SDS / 1g Protein). Alle Proteine tragen daher eine beständig negative Ladung und wandern zum positiven Pol, der Anode. Infolge der Molekularsiebeigenschaften des Polyacrylamidgels bewegen sich die Proteine unterschiedlich schnell. Je grösser ein Protein, desto langsamer wird es durch die Maschen des Polyacrylamidgels gezogen. Läßt man Eichproteine mit bekanntem Molekulargewicht mitlaufen, so kann man das Molekulargewicht der unbekannten Proteine bestimmen. -200kD -116kD -97kD -66kD -45kD -31kD -21.5kD -14.4kD

16 Polyacrylamidgele als Trägermedien Die Wanderung von Proteinen aufgrund des elektrischen Feldes wird durch das Gel größenabhängig abgebremst. Moleküle, die im Verhältnis zu den Gelporen klein sind, wandern schnell, Moleküle, die größer sind als die Poren, sind nahezu unbeweglich. Polyacrylamid wird in der Elektrophorese gerne als Trägersubstanz verwendet, da : - es chemisch inert ist - es sich leicht herstellen läßt - die Porengröße leicht zu variieren ist

17 Polyacrylamidgele Polyacrylamidgele sollten kurz vor Gebrauch hergestellt werden. Das Monomer Acrylamid wird mit einem quervernetzenden Agens -meist N,N`- Methylenbisacrylamid (Kurzform:,Bis ) mit Hilfe eines Radikalbildners (Ammoniumpersulfat) und eines Katalysators (TEMED) polymerisiert. Die Porengröße wird durch das Verhältnis der Konzentration des Acrylamid-Monomers zu der des Quervernetzungsagens Bis bestimmt.

18 SDS Dient dazu, die Proteine zu denaturieren, da es fast alle nicht-kovalenten Wechselwirkungen in nativen Proteinen zerstört. Erhitzen auf 95 C löst alle Tertiär und Sekundärstrukturen auf. Die SDS-Anionen binden sich an die Hauptketten der denaturierten Proteine, sodaß Komplexe mit einer stark negativen Ladung entstehen. Um noch vorhandene Disulfidbrücken zu reduzieren, gibt man 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT) zu.

19 Probenvorbereitung Die Proben enthalten neben SDS und 2-Mercaptoethanol noch Glycerin oder Saccharose, um die Dichte zu erhöhen, und Bromphenolblau als Markierungsfarbstoff. Vor dem Laden der Gele werden die Proben für 10 min. aufgekocht, damit alle Proteine vollständig denaturiert werden und auch hydrophobe Proteine in Lösung gehen.

20 Diskontinuierliches Puffersystem I Die Diskontinuierliche (Disk -) Elektrophorese wurde von U.K.Laemmli eingeführt Bei der Disk -Elektrophorese wird die Gelmatrix in 2 Bereiche geteilt: 1) weitporiges Sammelgel 2) engmaschiges Trenngel Die Disk - Elektrophorese hat 2 Vorteile: 1) Aggregation von Proteinen bei Eintritt in das Gel wird verhindert 2) Schärfung der Banden

21 Diskontinuierliches Puffersystem II

22 Diskontinuierliches Puffersystem II Probe Sammelgel Trenngel

23 Diskontinuierliches Puffersystem II

24 Andere Proteingel-Typen Gradienten Gele: Eignen sich, wenn man auf einem Gel Proteine mit sehr unterschiedlichen Grössen auftrennen will Porenweite verringert sich mit der Gellänge Trennschärfe in jedem Bereich sehr gut Native Proteingele SDS-frei Sekundär- und Tertiärstruktur bleibt erhalten Wanderung der Proteine durch ihre Eigenladung Nicht reduzierende Proteingele Ohne DTT oder 2-Mercaptoethanol Disulfidbrücken und somit Quartärstruktur bleiben erhalten Nachteile von nativen und nicht reduzierenden Gelen Neigung zur Aggregatbildung Schlechte Auflösung Schlechte Reproduzierbarkeit

25 Praktisches

26 Glasplatte mit Spacer Spacer (1mm) Deckplatte Glasplatten mit Leitungswasser putzen und mit Haushaltspapier gründlich trockenwischen

27 Halterung für Glasplatten Festklemmen der Glasplatten

28 Kontrolle Glasplatten müssen plan aufliegen?

29 Gießständer vorbereiten Einspannen Moosgummiunterlage Moosgummiunterlage mit Leitungswasser reinigen und trockenwischen

30 Gießen des Trenngels Gießen bis ca. 3mm unter dem grünen Balken Überschichten mit Butanol Polymerisation

31 Gießen des Sammelgels Gießen bis zur Oberkante Einführen des Kamms Polymerisation

32 Glasplatten mit polymerisiertem Gel

33 Einsetzen der Glasplatten in die Gelapparatur Einspannen

34 Füllen des Kathodenraums mit Elektrodenpuffer Gel Glasplatten Kathodenpuffer

35 Kochen (Erhitzen) der Probe

36 Füllen der Slots (unterschichten) mit Probe Gel Kathodenpuffer

37 Einsetzen in die Pufferkammer

38 Befüllen des Anodenraumes mit Elektrodenpuffer

39 Gel - Seitliche Ansicht Elektrodenpuffer +

40 Elektrophorese

41 Entfernen der Glasplatten

42 Färben und Entfärben des Gels

43 Nachweismethoden Elektrophoretisch aufgetrennte Proteine können mit Hilfe von Färbemethoden sichtbar gemacht werden. Coomassie-Brilliant-Blue Das Gel wird dabei in eine Lösung aus Coomassie-Brilliant- Blue und 10% Essigsäure eingelegt. Die Proteine werden gefärbt und gleichzeitig durch die Essigsäure fixiert. Nachweisgrenze: 0,5-1mg stöchiometrische Färbung Silverstain Ag+Ionen werden durch schwefelhältige und basische Aminosäuren zu metallischem Silber reduziert. Die Färbung ergibt rotbraune bis schwarze Spots. Empfindlichere Methode mit einer Nachweisgrenze von ca.10ng nicht-stöchiometrische Färbung

44 Wissenswertes

45 Wenn der Strom keine mechanische oder chemische Arbeit leistet, wird die von der Stromquelle aufgenommene Energie als Wärme abgegeben U = I x R

46 Mobilität Beschleunigende Kraft auf ein Teilchen: F (beschleunigend) = q (Ladung) x E (Feldstärke) Bremsende Kraft auf ein Teilchen: F (bremsend) = f (Reibungskoeffizient) x v (Geschwindigkeit)

47 P P P P P=Proteine P P Elektro-Osmotisches Feld (EOF): Ist eine durch (Gegen) Ladungen bedingte (Puffer) Gegenströmung

48 Praktische Probleme Hohe Ionenstärke bedeutet geringen spezifischen Widerstand Hohe Ionenstärke bedeutet hohe spezifische Leitfähigkeit Hohe Ionenstärke bedeutet hohe Stromstärke Hohe Stromstärke bedeutet hohe Wärmeentwicklung Wärme Dissoz. mehr Ionen mehr Strom mehr Wärme...

49 Wärme E(Feldstärke) = Fc(Coulomb-Kraft)/Q(Ladung)

50 Feldstärke Die elektrische Feldstärke ist eine vektorielle Größe (Coulomb.), die jedem Punkt des Raumes eindeutig einen bestimmten Betrag und eine bestimmte Richtung des elektrischen Feldes zuordnet. Sie beschreibt die Fähigkeit des elektrischen Feldes, Kraft auf Ladungen auszuüben, und ist in einem gegebenen Punkt definiert durch q steht für eine kleine Probeladung, die sich am gegebenen Punkt befindet. ist die auf diese Probeladung wirkende Kraft. Diese Definition ist wegen der Proportionalität von Kraft und Ladung sinnvoll. Der Grenzwert beschreibt die reale physikalische Existenz der elektrischen Feldstärke, auch wenn die Probeladung entfernt wird bzw. gegen Null geht.

51 Konstante elektrische Parameter Folgende Parameter können konstant gehalten werden: Stromstärke (A) Spannung (U) Leistung (P)

52 Im elektrischen Feld wandern Probe-Ionen und Puffer-Ionen Verwendung von Puffertanks an beiden Elektroden als Pufferreservoirs Puffer darf sich nicht erschöpfen Anteil der Probe-Ionen soll möglichst hoch sein (Optimierung der Wanderungsgeschwindigkeit der Probeionen) Gering konzentrierter Elektrophoresepuffer (aber noch puffernd)