E L E K T R O P H O R E S E

Transkript

1 E L E K T R O P H O R E S E Makromoleküle (Proteine, DNA, RNA) besitzen Ladungen und können daher in einem elektrischen Feld wandern. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von: (a) Größe der LADUNG (b) GRÖSSE des Moleküls (c) FORM des Moleküls (d) KRAFT des elektrischen Feldes Damit Strom fließen kann, müssen Trägermedium (Gel) und Probenmaterial in Puffer (Elektrolyt) gelöst bzw. damit gesättigt sein. Der Stromfluß wird durch Elektrolyse aufrecht erhalten, die an den Elektroden (in getrennten Pufferreservoirs) stattfindet. Kathode: 2 e H 2 O 2 OH - + H 2 Anode: H 2 O 2 H / 2 O e - Trägermedien: Polyacrylamid-Gele für Proteine, DNA Agarose-Gele für DNA, RNA Papier für andere geladene Moleküle Zur Herstellung von PAA-Gelen benötigt man: Acrylamid N,N'-Methylenbisacrylamid (Vernetzer), BIS Katalysatorsystem, das freie Radikale (SO 4 - ). erzeugt: (a) (NH 4 ) 2 S 2 O 8 (Ammoniumperoxodisulfat, Ammoniumpersulfat, APS) (b) TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) S 2 O 2- TEMED 8 2 (SO -. 4 ) O.Meixner Elektrophorese - Handout 1

2 Polymerisation: APS setzt in Lösung Sulfat-Radikale frei. APS-Lösungen sind daher nicht beständig (nur rund 1/2 Stunde verwendbar!). TEMED bewirkt als Katalysator eine explosionsartige Freisetzung der Radikale. Die Radikale greifen die Doppelbindungen des Acrylamid und des Bisacrylamid an und führen zur Radikalkettenpolymerisation. Die Eigenschaften des PAA-Gels hängen von Polymerisationsgrad und Vernetzungsgrad ab, sie werden definiert durch den T-Wert und C-Wert. T... Total-Acrylamid-Konzentration (%) C... Vernetzungsgrad (%) wobei: a... Masse Acrylamid in g b... Masse Bisacrylamid in g V... Volumen in ml T = (a + b).100 V C = b.100 a + b Disk-PAGE (Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zwei verschieden hoch vernetzte Acrylamidgele mit unterschiedlichen ph-werten werden übereinander geschichtet. (1) Sammelgel: Oben; weitmaschig; dient zur Konzentrierung der Proteine (scharfe Banden, gute Trennung) Sammelgelpuffer: meist TRIS/HCl, ph 6,8 (2) Trenngel: unten; engmaschig; dient zur Probenauftrennung. Trenngelpuffer meist TRIS/HCl, ph 8,8 hat Elektrodenpuffer: entweder den gleichen ph-wert wie der Trenngelpuffer oder einen etwas niedrigeren; er enthält darüberhinaus GLYCIN. O.Meixner Elektrophorese - Handout 2

3 Konzentrierung der Proben im Sammelgel: Glycin ist im Sammelgel ein ungeladenes Zwitterion. Chlorid, Proteine und Glycin wandern in Richtung Anode. Zwischen "Leitionen" (Chlorid) und "Folgeionen" (Glycinat) wird aufgrund ihrer unterschiedlichenbeweglichkeiten (Chlorid-hoch; Glycinat-niedrig) ein Potenzialgradient (Feldstärkegradient zwischen Chlorid und Glycinat) aufgebaut, in welchem sich die Proteine nach ihren Beweglichkeiten gestapelt orientieren. "Stacking effect" Glycinat Proteine Chlorid Der so geordnete Stapel wandert mit konstantergeschwindigkeit (Isotachophorese) bis zum Trenngel. Im Trenngel wird Glycinat geladen (ph-wert höher), überholt die Proteine, weil klein und schnell; der Feldstärkegradient bricht dadurch zusammen; die Proteine werden durch die engen Maschen des Trenngels stark gebremst und langsam voneinander getrennt. O.Meixner Elektrophorese - Handout 3

4 SDS-Elektrophorese Durch Beladung der Proteine mit SDS (Sodium Dodecyl Sulphate; anionisches Detergenz) werden die Eigenladungen effektiv überdeckt; es entstehen anionische Micellen mit konstanter Nettoladung: 1,4g SDS pro g Protein. O - Na + O S-O-(CH 2 ) 11 -CH 3 O Natriumdodecylsulfat Dabei wird SDS vorwiegend an die hydrophoben Regionen der Proteine angelagert. Folge: die Auftrennung erfolgt nur mehr nach Molekülgrösse und nicht mehr nach Ladung. Meistens wird SDS-Elektrophorese mit reduzierenden Agentien kombiniert, um auch noch die Molekülformen auszugleichen: Spaltung von H- und Disulfidbrücken, Auflösung der Tertiärstruktur. (a) Nichtreduzierende SDS-Behandlung z.b. für Serumproteine, um die Proteinkonformation zu erhalten Nach Behandlung mit SDS, aber ohne reduzierendes Agens: O.Meixner Elektrophorese - Handout 4

5 (b) Reduzierende SDS-Behandlung Ist die häufigste Anwendung; es kommt zur Streckung der Polypeptide, zur Bildung von Micellen und zum Ausgleich der Molekülformen. CH 2 -SH CH-OH CH-OH CH 2 -SH CH 2 -SH CH 2 -OH Mercaptoethanol DTT, Dithiothreitol (c) Reduzierende SDS-Behandlung mit Alkylierung Besserer und dauerhafter Schutz der SH-Gruppen durch Alkylierung mit Jodacetamid; die Banden werden schärfer O.Meixner Elektrophorese - Handout 5

6 AUSWERTUNG einer SDS-PAGE PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese die SDS-PAGE (meist als SDS-disk-PAGE) dient zur Trennung von Proteinen zur Reinheitsprüfung von Proteingemischen zur Molmassebestimmung von Proteinen Bestimmung der Molmasse von Proteinen Neben den Probeproteinen wird auf das Gel eine Molmasse-Standardlösung (Gemisch verschiedener Proteine mit bekannten Molmassen) aufgetragen. Kathode Standard 1 Standard P r o b e n Anode L a u f r i c h t u n g Nach Entwicklung des Gels und Färbung der Banden werden die Laufstrecken der Standardproteine abgemessen und gegen die Molmassen (besser: log MW) in eine Eichgerade eingezeichnet. Daraus können die Molmassen der Probenproteine berechnet werden. Die Angabe der Protein-Molmassen erfolgt in D (Dalton) oder kd (Kilo-Dalton) = [g/mol] 6,000 Kalibrationsgerade - Molmasse 5,500 log MM 5,000 4,500 4,000 3, Laufstrecke (mm) John Dalton, , englischer Naturforscher; machte grundlegende Untersuchungen zur Atomtheorie; Ihm zu Ehren wird die Einheit der Atommasse im englischsprachigen Raum mit Dalton benannt. In der Proteinchemie hat sich das D bzw. kd als Einheit der Molmasse durchgesetzt. O.Meixner Elektrophorese - Handout 6

7 Isoelektrische Fokussierung IEF Elektrophoretische Trennung von Proteinen aufgrund unterschiedlicher isoelektrischer Punkte. Im Elektrophoresegel ist dabei ein ph-gradient aufgebaut. Anode + ph 3 ph 10 Kathode - Der ph-gradient wird durch Einbettung von Polyampholyten (aliphatische Polyaminopolycarbonsäuren) in die Gelmatrix (meist Polyacrylamid) erzielt. ph 14 Je mehr Polyampholyte, desto linearer ist der Gradient. viele Polyampholyte 1 Polyampholyt ph 0 Allgemeinformel der Ampholyte: + Anode TRENNSTRECKE - Kathode Beim Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die Ampholyte bis zum Erreichen ihres IEP und bauen dadurch einen stabilen ph-gradienten auf. Erst danach wird die Probe aufgetragen und fokussiert (= wandert zu ihrem IEP). Auswertung Analog zur Auswertung der SDS-PAGE. Standard: "pi-standard" (Mischung von Standard-Proteinen mit bekannten IEP's). Eichgerade (Standard-pI-Werte gegen Laufstrecken) dient zur Ermittlung der IEP's der Probenproteine pi = IEP = ph-wert, bei dem Ladungsneutralität herrscht. O.Meixner Elektrophorese - Handout 7

8 Nachweis von Makromolekülen in Elektrophorese-Gelen (1) Färbung mit Coomassie-Brillantblau oder anderen Proteinfärbemitteln (z.b. Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluorescamin). Quantitative Auswertung mittels Densitometer (Durchlichtscanner) möglich. (2) Silberfärbung von Proteinen hochempfindliche Methode für niedrigste Konzentrationen. (Prinzip wie S/W-Fotografie) (3) Autoradiographie Zum Nachweis radioaktiver Substanzen bzw. radioaktiv markierter Makromoleküle (meist DNA-Nachweis); Einsatz bei Verbrechensaufklärung, in der Gerichtsmedizin etc. (4) Protein-Blotting mit anschließendem Immunstaining ("W-Blot") Transfer von Makromolekül-Banden eines Elektrophoresegels auf die Oberfläche einer immobilisierenden Membran. Anschließend Detektierung spezifischer Banden mit Antikörpern (Immunstaining). O.Meixner Elektrophorese - Handout 8

9 PRINZIP: B L O T T I N G Übertragung von Makromolekülen aus Elektrophoresegelen auf eine Membran ohne Verlust des Originalmusters. Die Moleküle werden auf der Membran adsorbiert (immobilisiert, da nicht mehr beweglich) und können dort entweder VORGANGSWEISE: nachgewiesen oder von dort weiterverarbeitet werden: Zwischenschritt für Proteinsequenzierung bzw. Elutionsmethode für weitergehende Analysen) 1 TRANSFER vom Gel auf die Membran. 2 BLOCKIERUNG der unbesetzten Bindungsstellen auf der Membran. 3 SPEZIFISCHE LIGANDENBINDUNG ("SONDEN") oder spezielle FÄRBETECHNIKEN als Nachweisreaktion. Anwendungen : PROTEIN-BLOTTING: NUCLEINSÄURE-BLOTTING: WESTERN-Blot SOUTHERN-Blot: für DNA NORTHERN-Blot: für RNA Vorteile: (1) Moleküle sitzen an der Oberfläche (und nicht diffus in einem Gel); geringste Mengen sind daher leicht nachweisbar. Elektrophoresegel Konzentrierungseffekt; hohe Empfindlichkeit: pg bis ng-bereich Blotting-Membran (2) Für die vorausgehende Elektrophorese sind nur kleine Mengen von (häufig sehr teuren) Untersuchungslösungen notwendig. (3) Moleküle können leicht mit großmolekularen und leicht detektierbaren Liganden (z.b. Antigene,Antikörper, Lectine, Nucleinsäuren) verbunden werden. (4) Schnelle Analyse (5) Leichte Handhabung und Lagerung der Transfers O.Meixner Elektrophorese - Handout 9

10 TRANSFERMETHODEN Kapillarblotting Diffusionsblotting Vakuumblotting Elektrophoretisches Blotting (Elektroblotting) 1. DIFFUSIONSBLOTTING Blotfolie wird auf das Gel gelegt; Transfer erfolgt nur durch Diffusion; Beschleunigung der Diffusion durch Temperaturerhöhung ("Thermoblotting"); keine quantitativen Transfers möglich. 2. KAPILLARBLOTTING Standardmethode (DNA, RNA und Proteine); Puffer wird durch Kapillarwirkung aus einer Vorratswanne durch das Gel und die Blotfolie in einen Stapel trockener Filterpapierschichten gesaugt; Dauer: ca Stunden. Filterpapier-Stapel Blotting-Membran Elektrophorese-Gel 3. VAKUUMBLOTTING Anstelle des saugenden Papiermaterials wird ein schwaches Vakuum angelegt; Nachteil: Vorteile: Elektrophoresegele können kollabieren Dauer nur 3-4 Stunden quantitativ (kein Rücktransfer) höhere Bandenschärfe kostensparend (weniger Lösungen und Filterpapier) 4. ÜBERDRUCKBLOTTING Wie Vakuumblotting, nur statt Vakuum wird Überdruck angelegt. 4. ELEKTROBLOTTING (Elektrophoretisches Blotting) Fast ausschließlich für Proteine; werden durch Isotachophorese transportiert. Man unterscheidet die Methoden: Tankblotting Semidry-Blotting O.Meixner Elektrophorese - Handout 10

11 TANKBLOTTING: Gel und Blotfolie werden zwischen Filterpapiere und Schwammtücher geklemmt. Dieses "Gelsandwich" wird in einen horizontalen Puffertank (mit Platinelektroden) eingehängt und an ein Power-Supply angeschlossen. Vorteil: Nachteil: Dauer: Quantitativer Transfer möglich. Puffer muß gekühlt werden. Zwischen 1 und 10 Stunden (über Nacht) SEMIDRY-BLOTTING: Gel und Membran befinden sich zwischen horizontal angeordneten Graphitplatten (Elektroden); zwischen Gel/Membran und den Graphitplatten sind Filterpapierblätter und/oder Schwämme (mit Puffer getränkt) angeordnet. Vorteile: Einfacher, billiger, schneller (20 min bis 1 h); Kühlung nicht notwendig O.Meixner Elektrophorese - Handout 11

12 BLOTTING-MEMBRANEN (-Folien): Nitrocellulose ist die meist verwendete Membran. Vorteile: Proteine können reversibel gefärbt werden (danach Entfärbung und spezifischer Nachweis). Präparative Techniken möglich (Proteine später wieder eluierbar). Nachteile: Limitierte Bindekapazität und schlechte mechanische Stabilität. Weitere gebräuchliche Membanen sind: Polyvinylidendifluorid-Membranen, (PVDF), "TEFLON" Diazobenzyloxymethyl- (DBM-) und Diazophenylthioether- (DPT-) Papiere Nylonmembranen Ionenaustauschermembranen BLOCKIEREN - Abdecken der unbesetzten Bindungsstellen auf der Blot-Folie. Protein Blockier-Reagenz Protein Verwendung makromolekularer Substanzen, die an der nachfolgenden Nachweisreaktion nicht beteiligt sein dürfen. für Nukleinsäuren: "Denhardts Puffer" (BSA, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon, EDTA, NaCl, TRIS/HCl ph 7,0; mg/l heterologe DNA) für Proteine: z.b. BSA (2%) oder Magermilchpulver oder Fischgelatine oder Casein oder Hämoglobin DETEKTION - Identifizierung der Banden: (a) Färbemethoden: Zur Begutachtung des gesamten Elektrophorese-Profils VOR dem Blockieren und den spezifischen Nachweisen. Nukleinsäuren: Ethidiumbromid (wird meist schon dem Elektrophorese-Gel vor der Trennung zugegeben; Banden sind dann im UV-Licht sichtbar. Proteine: Reversible Färbung mit Ponceau S O.Meixner Elektrophorese - Handout 12

13 (b) Spezial-Detektion: (Beispiele) Hybridisierung: Komplementäre DNA oder RNA ("Sonden") wird an die DNA oder RNA auf der Folie gebunden. Nachweis durch radioaktiv oder nichtradioaktiv markierte Sonden (z.b. Digoxigenin oder Biotin-Streptavidin). Immunblotting: (im Laborjargon der "W-Blot") Sondierung nach einzelnen Proteinzonen mit spezifischen Antikörpern. Sichtbarmachung: Bindung eines weiteren Antikörpers: enzymgekoppelter Sekundär- Antikörper. Das Immunblotting erfolgt nach dem "ELISA"-Prinzip: Enzyme Linked Immunosorbent Assay = Enzym gebundener Immunnachweis Der "richtige" ELISA-Test wird in Mikrotiterplatten durchgeführt. ELISA-Platte O.Meixner Elektrophorese - Handout 13