Entwicklung eines Aptamer-basierten Multisensorsystems zum Nachweis von Pathogenen in WässernW

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1 Internationale WasserforschungsAllianz Sachsen Entwicklung eines Aptamer-basierten Multisensorsystems zum Nachweis von Pathogenen in WässernW Regina Stoltenburg,, Sören S Linkorn, Elke Boschke, Frank Sonntag, Beate Strehlitz 2. - Statuskolloquium KUBUS Leipzig, 15. April 2011 Gefördert vom 1

2 Hintergrund: Schutz der menschlichen Gesundheit Mikroorganismen sind ein integraler Bestandteil des Lebens auf der Erde einige Mikroorganismen verursachen jedoch Krankheiten mit milden bis schweren Symptomen, bis hin zu lebensbedrohlichen Komplikationen Nahrung Bioterrorismus Krankenhaus Wasser / Umwelt Infektionsquellen ein schneller, sensitiver and spezifischer Nachweis pathogener Mikroorganismen ist für den Schutz der menschlichen Gesundheit von besonderer Bedeutung neue Methoden und Instrumente (einfach handhabbar, schnell und zuverlässig, portabel, kosteneffektiv)

3 Aptamer-basiertes Multisensorsystem Schwerpunkte UBZ Regina Stoltenburg, Sören Linkorn, Beate Strehlitz Bereitstellung pathogenspezifischer Aptamere Konzipierung eines SPR-basierten Sensorsystems AG Mikrobearbeiten Frank Sonntag Integration Ziel: Aptamer-basiertes Multisensorsystem Biomagnetische Separation Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Elke Boschke 3

4 Aptamere hoch affine Nukleinsäuremoleküle erstmalig 1990 beschrieben (Tuerk, C and Gold, L (1990) Science 249, ; Ellington, AD and Szostak, JW (1990) Nature 346, ; Robertson, DL and Joyce, GF (1990) Nature 344, ) Aptamere (abgeleitet vom lateinischen Wort aptus = passend) SELEX (Methode zur Gewinnung von Aptameren aus kombinatorischen Oligonukleotid-Bibliotheken) können ihre vorgegebenen Zielmoleküle spezifisch erkennen und binden (Schlüssel-Schloß-Prinzip) können für verschiedene Klassen von Zielmolekülen entwickelt werden 4

5 Aptamere als funktionale Nukleinsäuren uren einzelsträngige Oligonukleotide (<100nt) RNA oder DNA Primärstruktur z.b. anti-fmn-aptamer* 5 -GGCGUG..CACGCC-3 Faltung in eine komplexe räumliche Struktur Sekundärstruktur -Stems - Loops -Hairpins - interne Loops -Bulges Tertiärstruktur - Pseudoknots - Triplicates - Kissing Loops - G-Quartets Bindungsmechanismen zwischen Aptamer und Target strukturelle Komplementarität hydrophobe Wechselwirkungen, Stapelkräfte elektrostatische Interaktionen Wasserstoffbrückenbindungen target: FMN (* Fan, P. et al. (1996) J. Mol. Biol. 258, ) 5

6 Aptamere für verschiedene Klassen von Zielmolekülen len vornehmlich für Nicht-Nukleinsäuremoleküle kleine organische Moleküle Peptide und Proteine komplexe Strukturen Aminosäuren, Nukleotide und ihre Derivate, Co-Faktoren, Antibiotika, Zucker Enzyme, Wachstumsfaktoren, Membranproteine, Zytokine, Rezeptoren, Strukturproteine Targetgemische, Organellen, Säugerzellen, Parasiten, Mikroorganismen, 6

7 SELEX-Technologie SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment in vitro Selektions- und Amplifikationsmethode evolutionärer Prozess im Eppendorfgefäß sich wiederholender Kreislauf, bestehend aus Selektion, enzymatischer Amplifikation und Aufreinigung SELEX-Runden randomisierte Oligonukleotid-Bibliothek (~10 15 verschiedene Sequenzen) Aptamer-Pool SELEX-Runden 7

8 SELEX-Technologie zur Selektion von DNA-Aptameren FluMag-SELEX Magnetic Beads Targetmolekül Fluorescein funktionalisierte MB 8

9 Aptamere / SELEX Vorteile und Grenzen Vorteile SELEX universeller Prozess in vitro Selektionsmethode (unabhängig von Tierversuchen oder Zellkulturen) anwendbar unter nichtphysiologischen Bedingungen und für toxische Targets Aptamere hohe Affinität und Spezifität zum Target Produktion durch chemische Synthese sehr gut modifizierbar Aptamer-Target-Bindung ist regenerierbar Bedingungen können entsprechend den Erfordernissen angepasst werden prinzipiell automatisierbar Grenzen SELEX keine Routinemethode kein Standardprotokoll Aptamere Stabilität nicht alle Targets sind gleichermaßen geeignet Koselektion unspezifischer Oligonukleotide zeitaufwendig (manuell) 9

10 Anwendung von Aptameren Grundlagenforschung pharmazeutische Forschung Wirkstoffsuche Validierung krankheitsassoziierter Zielmoleküle analytische Anwendungen Medizin klinische Diagnostik Therapie Aptamere als biologische Erkennungselemente in verschieden konzipierten Nachweisassays und Sensoren ELONA fluoreszenzbasierte Assays kolorimetrische Assays Biosensoren mit massesensitiven, optischen oder elektrochemischen Nachweisprinzipien 10

11 Aptamere für mikrobielle Pathogene Selektion von Aptameren für pathogene Mikroorganismen mikrobielle Toxine (Choleratoxin, Botulinum-Neurotoxin, Staphylokokken Enterotoxin B, Shigatoxin) virale Pathogene (RSV, HCV, HIV, Influenza A Virus, SCV) bakterielle Pathogene einzellige Parasiten (Trypanosoma bruzei, Trypanosoma cruzi) Auswahl des Selektionstargets komplexe Targets gereinigte Targetmoleküle intakte Bakterienzellen Strukturkomponenten der: Zellwand Kapsel / Schleimschicht Fimbrien / Pili Flagellen Vielzahl potentieller Targets (unbekannter Art) heterogener Aptamer-Pool bekanntes, spezifisches Targetmolekül Evaluierung der Aptamer-Target-Bindung im Zellkontext post-selex Identifizierung der Aptamertargets sehr praxisnaher Ansatz 11

12 Aptamere für f r bakterielle Pathogene relevante bakterielle Pathogene: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes Auswahl des Selektionstargets definierte Zelloberflächenmoleküle Flagellen (Geißeln) Flagellin von S. typhimurium (Strukturprotein der Flagellen) Protein A von St. aureus (Zellwandprotein) O-spezifische Seitenketten der Lipopolysaccharide von E.coli und S. typhimurium (Strukturkomponente der gramnegativen Zellwand) Zellwand Kapsel / Schleimschicht (Glykokalyx) FluMag-SELEX: MB intakte Bakterienzellen E. coli, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes Zell-SELEX: 12

13 Aptamere für f r Protein A FluMag-SELEX Aptamer-Pool 96 Aptamer-Klone heterogener Aptamer-Pool Screening nach besten Bindern 13

14 Aptamere für f r Protein A Aptamer Sequenz (5 3 ) Länge PA#2/8 ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 76nt PA#2/8 - Fragmente PA#2/8KR40 AGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCT 40nt PA#2/8KR23 GATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCG 23nt PA#2/8[S1-58] ATACCAGCTTATTCAATTAGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCT 58nt PA#2/8[S19-76] AGCAACATGAGGGGGATAGAGGGGGTGGGTTCTCTCGGCTACAATCGTAATCAGTTAG 58nt 7,0 Bindungsversuche zwischen Aptamer und Target modifizierten Magnetic Beads Target gebundene ssdna (pmol) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 PA#2/8 0,0 BANK BANK PA#2/8 PA#2/8 PA#2/8KR40 PA#2/8KR23 PA Aptamere PA#2/8[S1 58] PA#2/8[S19 76] 14

15 Aptamere für f r Bakterienzellen Aptamere für E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium Zell-SELEX drei Aptamer-Pools für alle drei Bakterienarten 15

16 gerätetechnische Entwicklung des Sensorsystems Konzipierung eines SPR-basierten Sensorsystems (Fraunhofer IWS) als kompaktes, portables, bench-top Multisensorsystem SPR-Funktionsprinzip (SPR = Surface Plasmon Resonance) Gerätekonzept erstes Labormessgerät (Messgerät mit Lab-on-Chip-System, Sensorchip mit Goldfilm, On-Chip-Mikrofluidik, 4- bzw. 17-Kanal- Flusssystem) 16

17 gerätetechnische Entwicklung des Sensorsystems SPR-basiertes Multisensorsystem erste Messungen mit einem Modellaptamer (Fraunhofer IWS, TU Dresden) (Immobilisierung, Blockierung, Bindung, Regeneration, Stabilität ) anti-thrombin-aptamer als Modellaptamer Sensorchip Thrombin Aptamere für P. expansum Änderung des SPR-Signals in Abhängikeit der Targetkonzentration parallele Testung verschiedener Aptamere Target: Proteine des Sporenextraktes von P. expansum 17

18 Zusammenfassung, künftige Aufgaben Aptamer-Pools für bakterielle Targets selektiert (Protein A, Bakterienzellen EC, LM, ST) Klonierung und Screening der Aptamer-Pools Auswahl der besten Binder Charakterisierung der Bindungseigenschaften der Aptamere (Affinität, Spezifität) (fluoreszenzbasierte Assays, ELONA, Biacore...) Optimierung der Aptamersequenzen und Modifizierungen Adaptierung der Aptamere an das SPR-basierte Multisensorsystem und Durchführung von Messreihen Prototyp des SPR-basierten Multisensorsystems entwickelt, Testmessungen mit Modell-Aptameren Integrierung eines automatischen Probenhandlingsystems Softwareentwicklung Optimierung der Funktionalisierung der Chipoberflächen Biomagnetische Separation in der Entwicklung Parameteroptimierung: magnetische Partikel (Oberflächenfunktionalisierung, Größe, Menge), Separation (Volumen, Zeit, Durchmischung, Probenmatrix) Entwicklung eines Magnetmixers mit Elektromagneten Einsatz selektierter Aptamere zur Abtrennung von Bakterien 18

19 Perspektiven Einsatz von Aptameren als spezifische Erkennungselemente im Multisensorsystem bedarfsgerechte Entwicklung pathogenspezifischer Aptamere prinzipiell möglich durch Anwendung der SELEX- Technologie hohe Flexibilität und Erweiterbarkeit des Multisensorsystems darüber hinaus: Einsatz von Aptameren für andere Analyte Multisensorsystem als kompakter, portabler Messplatz mit automatisiertem Probenhandlingsystem prinzipiell in verschiedenen Regionen/Standorten oder unterschiedlichen Bereichen der Wasserwirtschaft einsetzbar, überall dort, wo eine mikrobielle Beurteilung der Qualität von Wässern gefragt ist darüber hinaus: Einsatz des Multisensorsystems in anderen Bereichen (z. B. Lebensmittelanalytik) Verwendung verschiedener Erkennungselemente (z. B. Aptamere, Antikörper, Peptide, DNA) Vielen Dank für r Ihre Aufmerksamkeit 19