Research Group. Manipulation von Leukozyten
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- Uwe Waltz
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1 Research Group Rezeptor-Ligand-Interaktionen Interaktionen Design und Test kleiner Moleküle für die Manipulation von Leukozyten Dr. Katja Schmitz, KIT The cooperation of Forschungszentrum Karlsruhe GmbH and Universität Karlsruhe (TH)
2 Chemokine und Chemokinrezeptoren Chemotaktische Cytokine Kleine, lösliche Proteine ( AS) ca. 50 menschliche Chemokine 20 verschiedene Rezeptoren CCL2 Chemokin (MCP-1) CXCL8 Chemokin (IL-8)
3 Chemokine steuern die Migration von Leukozyten Sekretion z.b. in entzündetem Gewebe Bindung an Glykosaminoglykan (Zelloberfläche) Bildung eines Gradienten Erkennung durch Rezeptoren auf Leukozyten Migration der Leukozyten entlang des Gradienten SEITE 3
4 Nebenwirkungen von Chemokinen Chronische h Entzündungen Autoimmunerkrankungen Allergien Wanderung von Metastasen HIV-Infektion (via Chemokinrezeptor)
5 Ansätze zur Modulation der Chemokinfunktion Antikörper gegen g Chemokinrezeptoren Kleine Moleküle als Inhibitoren der Chemokinrezeptoren Chemokine mit Deletion des N-Terminus Chemokine mit Mutationen in der GAG-Bindungsstelle
6 Alternativer Ansatz Kleine Moleküle, die an Chemokine binden, und damit deren Wechselwirkung mit dem Rezeptor verändern Inhibierung der Rezeptorbindung
7 Design, Test und Synthese von Liganden Ligandensynthese Molecular Modeling Proteinexpression Bindungsstudien Zellisolierung Bioassays
8 Bindungsassays zur Validierung von g y g Computermodellen
9 Bindungsexperimente im Arrayformat Microarrays: < kleine Moleküle Miniarrays < 400 Peptide Bindungsassay mit Chemokinen und Antikörpern < 0,5 µg Protein/Versuch Detektion über Fluoreszenz oder Chemiluminsezenz
10 Fluoreszenzpolarisation (FP) Fluoreszierende Moleküle, die mit polarisiertem Licht angeregt werden, emittieren polarisiertes Licht. Kleine bewegliche Fluorophore: große Depolarisation An große, weniger bewegliche Proteine gebundene Fluorophore: geringere g Depolarisation Die gemessene Polarisation spiegelt das Verhältnis von gebundenen zu ungebundenen Liganden wieder. Tina Schröder
11 Vorteile der Fluoreszenzpolarisation Gebundene und ungebundene Spezies müssen nicht getrennt werden. Nur ein Bindungspartner muss fluoreszent markiert werden. Chemokine können aufgrund ihrer Größe in FP-Assays sowohl als Rezeptoren als auch als Liganden fungieren.
12 Leitstruktur für Interleukin-8 Liganden Energy Diff ference WT TRP2 PHE4 ASP6 MET8 PRO10 ASP12 ASP14 SER16 Proteinstruktur aus Datenbank Computational Alanine Scan Synthese von Peptidanaloga Bindungsexperimente zur Überprüfung SEITE 12
13 Chemokin funktionalisierte Magnetpartikel zur Isolierung von Leukozyten KIT The cooperation of Forschungszentrum Karlsruhe GmbH and Universität Karlsruhe (TH)
14 Immobilisierte Chemokine zur Isolierung von Leukozyten Magnetische Mikropartikel mit immobilisierten Chemokinen Bindung von Leukozyten z.b. aus Blutprobe Magnetische Abtrennung der Mikropartikel
15 Rekombinante Expression von Chemokinen Transformation des Expressionsvektors in E. coli BL21 Fermentation (Proteinexpression) Proteinreinigung über Affinitäts- ität chromatographie
16 Bindung von Chemokinen an Mikropartikel Ziel: stabile Bindung der Chemokine an die Partikel, so dass die Rezeptorbindungsseite präsentiert wird Adsorption an nichtfunktionalisierte Partikel: nicht-kovalente Bindung Orientierung entsprechend Ladungen der Partikeloberfläche Kovalente Bindung an funktionalisierte Partikel: kovalente Bindung Orientierung entsprechend Partikelfunktionalisierung KIT The cooperation of Forschungszentrum Karlsruhe GmbH and Universität Karlsruhe (TH)
17 Reaktive Gruppen zur Proteinimmobilisierung Primäre Amine: N-Terminus, Lysin unspezifisch Thiole: Cystein In strukturgebenden Disulfidbrücken Guanidin: Arginin In GAG- Bindungsstelle KIT The cooperation of Forschungszentrum Karlsruhe GmbH and Universität Karlsruhe (TH)
18 Aktivitätsassays zur Bestätigung g der biologischen Aktivität der Liganden KIT The cooperation of Forschungszentrum Karlsruhe GmbH and Universität Karlsruhe (TH)
19 Migrationsassays Boyden-Kammer: Filter Dunn-Kammer: Kanal
20 Leukozytenbindungsassay Chemokine an magnetischen Mikropartikeln immobilisiert Inkubation mit Liganden Magnetische Abtrennung der Mikropartikel Auszählung freigesetzter t Leukozyten Evaluierung der Reaktion der Leukozyten auf blockierte Chemokine
21 Aktivitätstests und Anwendungen Abhängigkeit der Leukozytenreaktion von der Oberflächenbeladung Chemokin funktionalisierte Oberflächen für Migrationsassays
22 Wo finde ich die RG Schmitz??? FZK Institut für funktionelle Grenzflächen UKA Institut für organische Chemie KIT The cooperation of Forschungszentrum Karlsruhe GmbH and Universität Karlsruhe (TH)
23 Vorankündigung Chemische Biologie II im Sommersemester 2009 Vorlesung: Dienstag Seminar: Donnerstag
24 Vorankündigung Chemische Biologie II Design und Synthese biofunktionaler Moleküle Molecular Modelling Ribozyme und Aptamere Enzymatische Antikörper Teilnahme auch ohne Kenntnisse aus Biologisch aktive Peptide Chemische Biologie I Künstliche Rezeptoren möglich! Chemische Sensoren Drug Delivery Glykokonjugate
25 Dank Dana Wiese Irene Meliciani Ebru Diler Dr. Tina Schröder Dr. Daniel Maisch Marion Döbele Alisha Oster Am IFG, FZK: Prof. Sonja Berensmeier PD Matthias Franzreb Dr. Thomas Schwartz Am IOC, UKA: Prof. Stefan Bräse Am INT, FZK: PD Wolfgang g Wenzel Am IBG, FZK: Dr. Kai Hilpert
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