Versuch SDS-PAGE und Western Blot

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1 Versuch SDS-PAGE und Western Blot Kurzer Überblick über den Versuch In diesem Versuchsteil soll das rekombinant in E. coli exprimierte Modellprotein EGFP über eine Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Dies geschieht durch eine Ni-IMAC mit Hilfe des His-Tags des EGFPs. Bei dieser Aufreinigung soll zum einen der Einfluss der Anfangs-Imidazolkonzentration im Aufschluss- und Waschpuffer auf das Reinigungsergebnis untersucht werden. Zum anderen soll durch eine weitere Aufreinigung getestet werden, ob (und wenn ja welche und in welcher Menge) E. coli Proteine an die Säule binden. Die dabei gewonnenen Proteinproben werden per SDS-PAGE und Gelfärbung bzw. Western Blot mit anschließender Immunodetektion analysiert. Dabei wird der Einfluss der Acrylamidkonzentration auf das Ergebnis der SDS-PAGE untersucht. Weiterhin werden zwei verschiedene Gel-Färbemethoden und zwei verschiedene Western-Blot- Entwicklungsmethoden gegenüber gestellt. Das Skript ist im Folgenden nach Themen gegliedert: Die Reinigung eines Proteins, die elektrophoretische Trennung und Färbung eines Proteins, und schließlich der elektrophoretische Transfer und die immunologische Detektion eines Proteins. Nach der Theorie zu den einzelnen Teilen sind die dazugehörigen Protokolle angeordnet. Teil: Reinigung eines Proteins (Tag 1) 1. Worum geht es bei diesem Versuch? Bestimmte Wirtsorganismen kann man durch Transformation mit geeigneten Konstrukten (z.b. Expressionsplasmide, Integration von Sequenzen in das Wirtsgenom) dazu bringen rekombinante Proteine in größeren Mengen zu produzieren. Die Motivation solche rekombinanten Proteine zu exprimieren und zu reinigen kann darin liegen ein bestimmtes Protein anschließend enzymkinetisch/strukturell zu charakterisieren oder das Protein im medizinischen oder biotechnologischen Bereich einzusetzen (z.b. Insulin oder das Labferment). Die Auswahl des Wirtes hängt sowohl von technischen/ökonomischen Aspekten ab (wie einfach ist es den Wirt zu kultivieren, was kostet es, gibt es sicherheitstechnische Bedenken) als auch von der Kapazität des Wirtes das Protein entsprechend den Ansprüchen des Experimentators korrekt zu exprimieren (richtige Faltung des Proteins, post-translationale Modifikationen des Proteins). Da selbst bei einer starken Expression des rekombinanten Proteins die wirtseigenen Proteine mengenmäßig überwiegen, muss das rekombinante Protein mit geeigneten Proteinchromatographischen Verfahren gereinigt werden. In den allermeisten Fällen sind Reinigungen nach nicht-selektiven physiko-chemischen Parametern wie z.b. Größe eines Proteins (chromatographisches Verfahren: Gelfiltration) oder Ladung eines Proteins (chromatographische Verfahren: Ionentauschchromatographie, Chromatofokussierung) nicht ausreichend. Daher wird eine andere Kategorie der Chromatographie bevorzugt: die Affinitätschromatographie. Hierbei wird sich eine besonders hohe Bindungsaffinität zwischen einem Teil des zu reinigenden Proteins (z.b. dem aktiven Zentrum oder einem Tag s.u.) und einem immobilisierten Bindungspartner in einer Säulenmatrix zu Nutze gemacht. Bei einem Tag handelt es sich um eine Aminosäure-Sequenz, die bei der Klonierung des rekombinanten Proteins an den offenen Leserahmen angefügt wird. In der Regel liegt der Tag, wenn das Protein exprimiert wird, entweder am N- oder C-terminalen Ende des Proteins (im Gegensatz zu internen Tag-Sequenzen). Dieser Tag ist also eine nicht-natürliche Erweiterung der Aminosäuresequenz des Proteins, von der man hofft, dass diese Tag- Sequenz die Tertiärstruktur und damit die Eigenschaften des Proteins nicht beeinträchtigt. Eine Verfeinerung dieser Proteingewinnungs- und Reinigungsstrategie ist es, in die Tag- 1

2 Sequenz eine spezifische Protease-Sequenz zu integrieren, so dass im Anschluss an die Affinitätschromatographie der Tag abgespalten werden kann und dadurch ein natürlicheres Protein gewonnen wird. His-getaggtes EGFP (= enhanced green fluorescent protein) als Modellprotein: Ein His-Tag besteht aus einer Sequenz von mehreren Histidinen (i.d.r. 6-8 je nach Expressionsvektor bzw. individueller Klonierungsplanung). Histidin ist eine Aminosäure, die als Rest einen Heterozyklus mit einem Stickstoff-Atom (dem sog. Imidazol-Ring) besitzt. Im Alkalischen besitzt dieser Stickstoff ein freies Elektronenpaar, das Koordinationsverbindungen mit positiv geladenen Metallionen eingehen kann. Wird jetzt ein i.d.r. zweiwertiges Metallion (wie z.b. Ni 2+, Cu 2+, Co 2+, Zn 2+ ) durch einen kovalent an einer Matrix gebundenen Komplexbildner an einer Säule immobilisiert und der Komplexbildner lässt noch Koordinationsstellen am Metallion frei, kann das Metallion mit dem Elektronenpaar des Stickstoff des Imidazolring (der Histidine) in Wechselwirkung treten. Säulen mit solchen immobilisierten Metallionen werden also in der Tendenz His-getaggte Proteine binden während nicht His-getaggte Proteine durch die Säule durchgespült werden. Diese Art der Affinitätschromatographie nennt man IMAC (= immobilized metal ion affinity chromatography). Antikörper gegen His-Tags gehören zum Standardwerkzeug der Biochemiker und erlauben eine immunologische Detektion. Im Laboralltag werden aber häufig nicht nur His-getaggte, rekombinante Proteine an die Säule binden sondern auch solche Proteine des Expressionswirtes, die in ihrer Primär- oder sogar nur Tertiärstruktur in räumlicher Nähe mehrere Histidine aufweisen oder die aufgrund ihrer physiologischen Funktion als Metalltransport- oder bindeproteine die Tendenz haben an Metallionen zu binden. Um diese Kontaminationen zu analysieren werden zwei Praktikumsuntergruppen sogenannte Mock-Kontrollen durchführen. Darunter versteht man, dass E. coli-expressionszellen ohne das Expressionskonstrukt (stattdessen: Leervektor) identisch behandelt werden (Expression & Aufreinigung), wie die Zellen mit dem EGFP- Expressionskonstrukt. Durch die Mock-Kontrolle ist auch eine Unterscheidung zwischen kontaminierenden Proteinen die direkt an die Säule gebunden haben und solchen, die an das Zielprotein gebunden haben, möglich. Homogenisation von Bakterienzellen: Will man ein rekombinantes Protein aus einem Expressionswirt gewinnen müssen in einem ersten Schritt die Zellen des Wirtes zerstört werden. Man erzeugt ein sogenanntes Homogenat. Die Art des Vorgehens wird von der Art des Wirtes und der späteren weiteren Schritte bestimmt. Dabei können mechanische und enzymatische Aufschlußverfahren zur Anwendung kommen. Bei den hier verwendeten E. coli Zellen, die bereits am Lehrstuhl hochgezogen, in einer Induktionsphase das His-getaggte EGFP gebildet haben, durch Zentrifugation geerntet und dann eingefroren wurden, ist zu beachten, dass diese Zellen von einer relativ robusten Zellwand umgeben sind. Deshalb wird in einem ersten Schritt die Zellwand mit Hilfe des hydrolytischen Enzyms Lysozym abgebaut. Im Generellen soll der dabei verwendete Puffer für die spätere Affinitätschromatographie einen geeigneten ph-wert garantieren und eventuell noch Stoffe enthalten, die das zu reinigende Protein stabilisieren (Protease-Inhibitoren, Osmotika). Weiterhin wird häufig in der Kälte gearbeitet um den proteolytischen Abbau des rekombinanten Proteins durch Proteasen des Wirtes zu unterdrücken. In unserem Fall sollen zwei Bakterienpellets mit exprimierten EGFP und zwei Bakterienpellets ohne das Expressionskonstrukt (sog. Mock-Kontrolle) aufgeschlossen werden. Die beiden Bakterienpellets mit EGFP-Expression und die beiden Mock-Kontrollen sollen in Puffern mit verschiedenen Konzentrationen von Imidazol aufgeschlossen werden: ein Aufschlußpuffer enthält 0 mm Imidazol, der andere 20 mm Imidazol. Theoretische Überlegungen sagen vorher, dass durch das Imidazol die Bindungen von weniger affinen Bindungspartnern an die IMAC-Säule unterdrückt wird. Die Mock-Kontrollen ermöglichen einen Einblick welche E.coli Proteine unerwünscht an die Säule binden. 2

3 Im Anschluß an die Inkubation mit Lysozym werden die Zellen mit Ultraschall aufgebrochen und dabei gleichzeitig die DNA der Zellen zerstückelt. Dadurch wird das Homogenat weniger viskos (langkettige DNA in größerer Konzentration hat eine Schleim-artige Konsistenz). Durch eine Zentrifugation und Filtration durch einen Filter werden unlösliche Zellbestandteile abgetrennt (rekombinante Proteine können wenn sie falsch gefaltet werden auch als sog. Inclusion bodies unlöslich vorliegen). Die lösliche Fraktion wird für die folgende Affinitätschromatographie verwendet. Ni-IMAC zur Reinigung des His-getaggten EGFP: Bei einer Protein-Chromatographie gibt es einige Schritte, die in unterschiedlichen Varianten ausgeführt werden können. Wir wollen eine Säulenchromatographie (im Gegensatz zur Batchchromatographie (vgl. Lehrbücher)) durchführen. Der Puffer kann bei einer Säulenchromatographie durch reine Schwerkraft durch eine Säule fließen oder durch eine Druckerhöhung mit technischen Hilfsmitteln kann die Flußrate (stark) erhöht werden. So ein technisches Hilfsmittel kann im einfachsten Fall eine manuell betriebene Spritze oder aber eine mehr oder weniger aufwendige Pumpe sein. Die Ladefraktion läuft durch die Säule und die aus der Säule auslaufende Fraktion wird Flowthrough genannt. Dieser Flowthrough entspricht von der Proteinzusammensetzung der Ladefraktion minus dessen was an die Säule gebunden hat. An das Laden der Probe schließt sich ein Waschschritt an, bei dem nur schwach gebundene Proteine aus der Säule ausgewaschen werden. Im letzten Schritt folgt die Elution des Zielproteins von der Säule. Dies kann durch eine Veränderung einer Konzentration eines kritischen Stoffs geschehen - entweder als eine Ein- Schritt-Elution oder in mehreren diskreten Stufen oder als kontinuierlicher Gradient. Hierbei wird dem Elutionspuffer ein Stoff (in unserem Fall Imidazol) zugegeben, der mit dem Tag um die Bindestelle am Bindungspartner (hier das Nickelion) konkurriert und bei einer bestimmten Konzentration das getaggte Protein vollständig von der Säule verdrängt. Der aus der Säule austretende Puffer mit der über die Zeit unterschiedlichen Proteinzusammensetzung wird gesammelt. Dies geschieht entweder manuell oder mechanisiert (Fraktionssammler). Fraktioniert werden kann über bestimmte Tropfenzahlen, Zeit oder Fraktionsschritte (Laden, Waschen, Eluieren). Zur einfacheren Identifikation der interessierenden Fraktionen kann der aus der Säule austretende Puffer durch eine Photometerzelle geleitet werden und damit grob der Proteingehalt (z.b. bei 280 nm) abgeschätzt werden kann. Wir machen uns zu Nutze, dass das EGFP eine starke Eigenfarbe besitzt und dadurch in nativen Zustand rein visuell ohne Hilfsmittel erkannt werden kann. Wie ist der Versuch aufgebaut? Die Praktikumsgruppe wird in vier Teilgruppen aufgeteilt und jede Teilgruppe führt mit dem Überstand aus einem Bakterienpellet eine Ni-IMAC durch. Zeitplan für den 1. Tag: Die Bakterienpellets werden aufgetaut, die Puffer (Aufschluß- u. Elutionspuffer) werden hergestellt und die Bakterien im Aufschlußpuffer mit Lysozym lysiert. Das Lysat wird einer Ultraschallbehandlung unterworfen. Die Proben werden zentrifugiert und filtriert. Es wird eine Ni-IMAC mit den jeweiligen Proben durchgeführt. Für den zweiten Tag werden die Gele gegossen und eine Färbelösung angesetzt (Arbeitsanweisung s. Tag 2). 3

4 2. Arbeitsanweisung und Protokolle - Die Pellets werden auf Eis aufgetaut. - Währenddessen müssen die Puffer hergestellt werden: Insgesamt werden 3 Puffer benötigt: Puffer A mit 0 mm Imidazol, Puffer A mit 20 mm Imidazol und Puffer B mit 400 mm Imidazol. Praktikumsteilgruppe 1 Praktikumsteilgruppe 2 Praktikumsteilgruppe 3 Puffer A 20 mm Na-Phosphat-Puffer 200 mm NaCl 0 mm Imidazol ph 7,5 Puffer A 20 mm Na-Phosphat-Puffer 200 mm NaCl 20 mm Imidazol ph 7,5 Herstellung Puffer B 20 mm Na-Phosphat-Puffer 200 mm NaCl 400 mm Imidazol ph 7,5 200 ml 200 ml 200 ml ml 0,2 M NaH 2 PO 4 ml 2 M NaCl ml 1 M Imidazol ml 0,2 M NaH 2 PO 4 ml 2 M NaCl ml 1 M Imidazol ml 0,2 M NaH 2 PO 4 ml 2 M NaCl ml 1 M Imidazol mit dd Wasser fast auf das gewünschte Endvolumen auffüllen, ph Wert einstellen, Volumenschritt im Messzylinder auf gewünschtes Endvolumen Aufteilen: 100 ml für Gruppe ml für Gruppe 3 Aufteilen: 100 ml für Gruppe ml für Gruppe 4 Aufteilen: 50 ml für Gruppe 1 50 ml für Gruppe 2 50 ml für Gruppe 3 50 ml für Gruppe 4 [Für die meisten Proteine würden diese Puffer noch filtriert und an der Vakuumpumpe entgast und schließlich vorgekühlt werden. Da es sich bei EGFP um ein sehr stabiles Protein handelt, können wir auf den Entgasungs- und Vorkühlschritt verzichten und auch im weiteren Verlauf bei Raumtemperatur arbeiten. Aus Zeitgründen wird auch auf den Filtrationsschritt verzichtet, der die Säulen schonen soll.] Praktikumsteilgruppe 4 stellt eine ausreichende Menge an Lysozymstocklösung 10 mg/ml her. Bitte überlegen Sie, (s.u.) wie viel Sie brauchen, wie viel Sie herstellen wollen, und wie viel Lysozym Sie daher einwiegen müssen, und in welchem Puffer wie das Lysozym lösen wollen. Das Lysozym wird in ein Eppi eingewogen und mit dem Puffer dann vorsichtig resuspendiert ohne dabei den Inhalt aus dem Eppi zum Überlaufen zu bringen. - Die E. coli Expressionspellets (von 150 ml Kultur) werden in je 15 ml Puffer resuspendiert. Die dafür verwendeten Pasteurpipetten kommen in den Autoklaviermüll. Teilgruppe 1 Teilgruppe 2 Teilgruppe 3 Teilgruppe 4 EGFP-Pellet Puffer A EGFP-Pellet Puffer A Mock-Pellet Puffer A Mock-Pellet Puffer A - In der Zellsuspension wird eine Lysozym-Endkonzentration von 0,1 mg/ml eingestellt. Teilgruppe 4 hat eine Lysozymstocklösung von 10 mg/ml hergestellt. Benötigtes Volumen (ohne Berücksichtigung der Volumenzunahme durch diese Zugabe) µl 4

5 - Inkubation der Zellsuspension für 15 min bei Raumtemperatur. Probe von Zeit zu Zeit vorsichtig mischen. [Für viele andere Proteine erfolgt auch dieser Schritt auf Eis, z.t. auf dem Taumelschüttler] - Nach der Inkubation mit Lysozym werden die Zellen mit Ultraschall aufgebrochen und dabei auch die DNA zerstückelt um so die Viskosität der Probe zu erniedrigen: 6 Zyklen à 10 sec, 50 %, Power: 53 %; dazwischen je 1 min auf Eis. - Während der Lysozym-Inkubation kann die Säulenvorbereitung beginnen. Es werden HisTrap FF crude 1 ml Säulen von GE Healthcare verwendet (die Ni 2+ -Ionen sind bereits am Chelator des Säulenmaterials gebunden). o o o o o o Die Säule wird mit der Spritze immer nach dem Tropfen auf Tropfen- Verfahren verbunden (Betreuer). Es sollte nie Luft auf die Säule gepresst werden. Daher nie alles Volumen der Spritze durch die Säule pressen. Am besten ist eine Flussrate von etwa 1 ml/min. Die Säule ist in 20% Ethanol konserviert. Daher wird die Säule zunächst mit etwa 10 ml ddwasser gewaschen, um den Ethanol auszuwaschen. Dann wird die Säule mit etwa 10 ml Puffer B gewaschen. Jetzt kommen z.b. Proteine von der letzten Gruppe oder überschüssige Nickelionen von der Säule. Diese sind dann später nicht in unserer Elutionsfraktion. Dann wird die Säule mit 10 ml Puffer equilibriert Teilgruppe 1 Teilgruppe 2 Teilgruppe 3 Teilgruppe 4 Puffer A Puffer A Puffer A Puffer A Somit sind die gleichen Puffer-Bedingungen auf der Säule eingestellt, wie sie auch in der Proteinprobe sind - Bitte bereiten Sie Gefäße für die folgenden Proben vor: o Falcons: Ladefraktion und Flowthrough o Eppis: Ladefraktion, Flowthrough, Elution 1 bis 4 - Das Zell-Lysat wird zentrifugiert: 6000 g 20 min 4 C - Der Überstand wird durch einen Einmal-Spritzenfilter GF/PET-Membran (0,45 µm Porengröße) filtriert. Das Filtrat stellt die Ladefraktion dar (200 µl der Ladefraktion in Eppi abfüllen). - Laden: Ladefraktion mit der Spritze aufziehen und vorsichtig über die Säule drücken. Flowthrough auffangen (200 µl des Gesamtflowthroughs in Eppi abfüllen) - Waschen: ca. 10 ml: Teilgruppe 1 Teilgruppe 2 Teilgruppe 3 Teilgruppe 4 Puffer A Puffer A Puffer A Puffer A - - Eluieren: Spritze mit etwa 5 ml Puffer B befüllen und etwa vier 1ml-Fraktionen (Eppibeschriftung) auffangen. Gruppen 1 und 2 können anhand der grünen Fluoreszenz die Probe mit dem höchsten EGFP-Gehalt bestimmen. Diese Proben sollen im weiteren Praktikumsverlauf analysiert werden. Da analysiert werden soll, welche E. coli Proteine direkt an die Säule binden können, wird von Gruppen 3 und 4 die entsprechende Elutions-Probe aufgehoben und analysiert. - Konservierung der Säule: Die Säule wird wieder mit etwa 5 ml ddwasser und im Anschluss daran mit etwa 5 ml 20% Ethanol gespült, zugeschraubt und bei 4 C gelagert. 5

6 Teil: Elektrophoretische Trennung und Färbung eines Proteins (Tag 2) 1. Worum geht es bei diesem Versuch? Bei der Protein-Elektrophorese ist man bestrebt Protein-Gemische nach bestimmten Eigenschaften (Größe, Ladung oder ein Kombination von beiden) voneinander zu trennen. Motivation Proteine zu trennen kann in dem Interesse an einem einzelnen Protein begründet sein. Dann kann man untersuchen wie sauber ein Protein nach einer Reinigung ist oder wie groß ein bestimmtes Protein ungefähr ist. Alternativ kann man untersuchen welche Proteine in welcher Menge in einer Zelle/Gewebe/ Organismus unter bestimmten Bedingungen (Entwicklungszustand, äußere Bedingungen wie Hitze/Kälte/Licht etc. oder Einwirkung von Xenobiotika; z.b. Pestizide, Pharmazeutika) vorhanden sind. Die Gesamtheit aller Proteine in einem Organismus/Gewebe/Zelle/Zellkompartiment unter definierten Bedingungen wird Proteom genannt. Die Technik/Wissenschaft, die das Proteom beschreibt, wird Proteomik (engl. proteomics) genannt. Die Proteomik gewinnt in der Post-Genomik Ära zunehmend an Bedeutung, da das Genom eines Organismus quasi unveränderlich ist während das Proteom hoch variabel ist (Lehrbuch-Beispiel Frosch/Kaulquappe: gleiches Genom stark unterschiedliches Proteom). Proteine sind Makromoleküle, die in Abhängigkeit vom ph-wert des umgebenen Mediums eine Ladung tragen. Proteine werden also in einem elektrischen Feld anfangen zu wandern (Elektrophorese). Dies kann man sich zu nutze machen um Proteine zu trennen. Allerdings können im Gegensatz zu Nukleinsäuren, die immer negativ geladen sind, Proteine unterschiedliche Ladungszustände einnehmen. Dies ergibt sich aus der Tatsache, dass die möglichen Ladungsträger eines Proteins in Abhängigkeit des ph-wertes des Medium geladen oder nicht-geladen vorliegen können. Ladungsträger sind dabei vor allem die sauren (Glutaminsäure, Asparaginsäure) und basischen (Arginin, Histidin, Lysin) Aminosäuren. Der Ladungszustand deren Seitenketten hängt vom ph-wert des Mediums ab (s.o.). Proteine können also drei generelle Arten von Ladungsverhalten zeigen: mehr negative als positive Ladungsträger ph Lösungsmittel > pi-wert Protein Protein verhält sich als Anion; mehr positive als negative Ladungsträger ph Lösungsmittel < pi-wert Protein Protein verhält sich als Kation; Anzahl positive Ladungsträger = Anzahl negative Ladungsträger ph Lösungsmittel = pi Protein Protein verhält sich elektrisch neutral). Proteine unterschiedlicher Aminosäurezusammensetzung können also in einem elektrischen Feld in unterschiedliche Richtungen wandern. Durch den Einsatz des Detergenz Sodium Dodecyl Sulfate (=SDS) kann dies verhindert werden. SDS besteht aus einer polaren, negativ geladenen Sulfonsäure-Gruppe (mit Natrium als Gegenion im Feststoff) und einem 12 C-Atome langen, hydrophoben Kohlenwasserstoffrest. Der hydrophobe Dodecyl-Rest schiebt sich dabei in die hydrophoben Bereiche des Proteins und faltet es dabei auf. SDS wirkt dadurch denaturierend auf das Protein. Da sich SDS in hoher Menge an die Proteine anlagert (ca. 1 SDS-Molekül pro 3 Aminosäuren) wird die relativ schwache Eigenladung des Proteins durch das SDS überdeckt. In einem (idealisierten) widerstandsfreien Medium (in erster Näherung z.b. Wasser) würden jetzt alle Proteine in einem elektrischen Feld in die gleiche Richtung, allerdings mit der der gleichen Geschwindigkeit wandern, weil das SDS für ein konstantes Ladung-zu-Masse Verhältnis sorgt (große Proteine binden proportional mehr SDS als kleine Proteine). Unterschiedlich große Proteine würden also in einem elektrischen Feld gleich weit wandern (man würde keine Trennung erreichen). Deshalb muss wenn man eine Trennung von Proteinen nach der Größe erreichen will, anstelle eines widerstandsfreien Mediums ein Medium einsetzen, das großen Proteinen mehr Widerstand entgegensetzt als kleinen Proteinen. So ein Medium (oder auch Matrix) nennt man ein restriktives Medium. 6

7 SDS-PAGE als Methode zur Größentrennung von Proteinen Damit man ein restriktives Medium erhält braucht man eine Polymer-Matrix, die Poren definierter Größe besitzt. Dabei sollen die Poren so groß sein, dass die Proteine noch hindurchpassen, aber andererseits so klein sein, dass große Proteine durch Kollisionen mit dem Polymermaterial stärker abgebremst werden als kleine Proteine. Als Polymer wird in den allermeisten Fällen Polyacrylamid (Polyacrylamidgelelektrophorese = PAGE) verwendet. Das Polymer besteht aus zwei Komponenten: Acrylamid und Methylenbis-Acrylamid (Vorsicht: beide Monomere sind starke Neurotoxine). Acrylamid besitzt eine Doppelbindung und kann durch radikalische Polymerisation lange lineare Ketten bilden (aber keine Poren). Als Radikalstater wird Ammoniumpersulfat (APS) und zum Stabilisieren der Radikale Tetramethylethylendiamin (TEMED) verwendet. Durch die Verwendung der zweiten Komponente (Methylenbis-Acrylamid besitzt zwei Doppelbindungen) können jetzt zwei wachsende Acrylamidketten miteinander verknüpft (engl. crosslinking) werden, so dass jetzt Poren entstehen. Polyacrylamidgele werden durch zwei Kennziffern charakterisiert: der Massenanteil von Acrylamid und Bisacrylamid an der Gesamtmasse des Gels wird mit T% gekennzeichnet (T = total acrylamide), der Anteil von Methylenbisacrylamid an der Gesamtacrylamidmenge wird mit C% (C = crosslinking) charakterisiert. Die Porengröße eines Gels wird i.d.r. durch Variation von T eingestellt. Je kleiner T ist desto größer werden die Poren. Polyacrylamidgele werden häufig dadurch hergestellt, dass zwei Glasplatten getrennt durch zwei Abstandshalter (engl. Spacer) an den Seiten zu einer Kassette zusammengebaut werden. Nach unten wird die Kassette z.b. durch flexible Gummimatten abgedichtet. Die Komponenten der Gellösung werden in einem Behälter gemischt und die Polymerisation durch APS gestartet. Das Gemisch wird zügig in die vertikal stehende Gelkassette überführt. Am Schluß wird von oben ein sogenannter Kamm eingeführt. Dort wo sich die Zinken des Kamms befinden sind später Aussparungen (sog. Taschen) im Gel, in die später die Proteinproben geladen werden können. Wie bereits erwähnt befindet sich in den Proben und in den Elektrophoresepuffern SDS, das denaturierend wirkt. Die denaturierende Wirkung wird durch die Probenbehandlung verstärkt, bei der die Proteine hohen Temperaturen (95 C) und starken Reduktionsmitteln (Mercaptoethanol/ Mercaptopropandiol/Dithiothreitol =DTT), die eine Spaltung/Reduktion von Disulfidbrücken bewirken, ausgesetzt werden. SDS-PAGE ist also i.d.r. eine denaturierende Art der Proteingelelektrophorese (im Gegensatz zu nativen Gelelektrophorese-Methoden). Dies hat zur Folge, dass man keine Enzymaktivität in diesen SDS-PAGE Gelen mehr messen kann und dass Enzyme, die aus mehreren Untereinheiten bestehen in ihre Monomere zerfallen. So besteht die Ribulosebisphosphatcarboxylase/oxygenase (Rubisco) aus 8 kleinen und 8 großen Untereinheiten. In einer SDS- PAGE würde also die Rubisco zwei Banden ergeben und man könnte nur aus diesen Daten noch keine Aussagen über die Quartärstruktur der Rubisco treffen. Diskontinuierliche Gelsysteme als Verfeinerung der SDS-PAGE Würden SDS-PAGE Gele nur aus einer Sorte Gel bestehen, so würde sich die Höhe der Proteinprobe in der Geltasche auf die spätere Höhe der Proteinbande im Gel auswirken. Da man aber an möglichst scharfen (schmalen) Proteinbanden interessiert ist, werden in der SDS-PAGE häufig diskontinuierliche Gelsysteme verwendet. Darunter versteht man, dass es mindestens zwei aufeinanderstoßende Gele gibt, die sich in T% und/oder den Gelpuffern unterscheiden. Man spricht von einem Sammelgel (großporig, mit niedriger Geschwindigkeit des sog. Folgeions) und einem Trenngel (engporig, hohe Geschwindigkeit des Folgeions). An der Grenze zwischen Trenn- und Sammelgel wird die Proteinprobe zusammengeschoben (fokussiert) und beginnt sich dann im Trenngel gemäß der Größe zu trennen. Dies geschieht einerseits durch den Unterschied in der Porengröße und andererseits dadurch, dass das Folgeion (bei uns Glycin) durch den ph-sprung zwischen Sammel-und Trenngel seine Mobilität verändert und die Proteine überholt. Dies führt zu einer Feldstärkeveränderung im Gel. Die Kombination von SDS und diskontinuierlichem Puffersystem wurde von Lämmli 1970 beschrieben und ist heutzutage das häufigste Proteinelektrophorese-Rezept weltweit. 7

8 Die Prozentigkeit T des Trenngels hat über die Porengröße der Matrix einen Einfluß auf das Trennergebnis (s.o.): in niedrig-prozentigen Trenngelen können hochmolekulare Proteine in das Trenngel einwandern und werden dort der Größe nach aufgetrennt, dafür erfahren aber verschiedene kleinere Proteine nicht genügend Widerstand und wandern quasi ungebremst (und dadurch ungetrennt) durch das Trenngel. Umgekehrt werden kleinere Proteine in hochprozentigen Trenngelen zwar sehr gut getrennt, aber größere Proteine können in die zu kleinen Gelporen nicht einwandern und bleiben im Extremfall an der Grenze zwischen Sammel-und Trenngel liegen. Man kann also mit einer T% immer nur einen bestimmten Molekulargewichtsbereich von Proteinen trennen. Um diesen Trennbereich zu vergrößern besteht die Möglichkeit sogenannte Gradientengele zu gießen: dabei wird im Trenngel ein Gradient von T% erzeugt. In der Nähe des Sammelgels ist T% gering, je weiter die Entfernung von der Grenze Trenn-/Sammegel desto mehr nimmt T% zu. Technisch kann man solche Gradientengele mit einem Gradientmischer erzeugen, der zwei Kammern mit Trenngellösungen unterschiedlicher T% besitzt. Strömt am Anfang eine Lösung mit der schweren, hochprozentigen T%-Lösung in die Gelkammer, so wird im weiteren Verlauf des Gelgießens in die Kammer mit der hochprozentigen T%-Lösung immer mehr niedrigprozentige T%-Lösung nachströmen und dort mit der hochprozentigeren Lösung mittels eines Magnetrührfisch vermischt werden. Dies hat zur Folge, dass in der Gelkasette die anfängliche hochprozentige T%-Lösung mit immer weiter abnehmenden T%-Lösung überschichtet wird (es entsteht ein Gradient der T%). Gradientengele decken zwar einen größeren Molekulargewichtsbereich der zu analysierenden Proteine ab, sind aber aufwendiger herzustellen und schwieriger zu reproduzieren. Detektion der Proteine in SDS-PAGE Gelen Da Proteine im Allgemeinen nicht im sichtbaren Bereich des Spektrums absorbieren, müssen die Proteine nach der Trennung in einem SDS-PAGE Gel durch eine Färbung sichtbar gemacht werden. Dabei will man einerseits die Position des interessierenden Proteins im Gel z.b. in Relation zu Proteinen bekannter Größe in einer anderen Spur (sogenannte Molekulargewichtsmarker) bestimmen und andererseits die Menge des Proteins ermitteln können. Eine Färbemethode sollte verschiedene Bedingungen erfüllen: hohe Empfindlichkeit (d.h. geringe Proteinmengen sollen noch zuverlässig detektierbar sein) schnelle, einfache Arbeitsschritte geringe Kosten des Farbstoffs und geringer apparativer Aufwand bei der Detektion ein großer linearer dynamischer Bereich der Färbung, d.h. über einen möglichst großen Konzentrationsbereich sollte die Signalstärke proportional zur Proteinmenge der Bande sein keine Störung nachfolgender Analysenmethoden wie z.b. Massenspektrometrie gleiche Mengen verschiedener Proteine sollten gleiche Signalintensitäten geben Zurzeit gibt es keine Färbemethode, die alle Anforderungen optimal erfüllt. Deshalb werden manchmal verschiedene Färbemethoden in einem Labor verwendet. Sehr gebräuchlich sind verschiedene Protokolle, bei denen der Coomassie-Farbstoff Verwendung findet. Empfindlicher als Coomassie-Farbstoffe sind Methoden bei denen die Proteine mit Silber angefärbt werden. Mittlerweile dazugekommen sind noch Methoden bei denen Fluoreszenzfarbstoffe Verwendung finden (diese sind allerdings teuer und die Scanner zur Detektion der Fluoreszenzfarbstoffe sind komplexer/teuerer als konventionelle Scanner). 8

9 Wie ist der Versuch aufgebaut? Zeitplan Tag 2: Jede Teilgruppe bereitet ihre Proben vor und lädt sie aufs Gel. Während das Gel läuft wird der Western Blot vorbereitet (Membranen und Blotpapiere zuschneiden). Beim Ende des Gellaufs werden die Gele zerschnitten, ein Teil in die Färbelösungen transferiert und jeder Teilnehmer baut mit einem Gelstück einen Blotstapel auf. Nach Ende des Western Blot werden die Blot-Stapel auseinander gebaut und die Membranen über Nacht getrocknet. 9

10 2. Arbeitsanweisung und Protokolle Herstellung der SDS-PAGE Gele - die Glasplatten werden mit Alkohol fettfrei gemacht und die Gelkasetten gemäß den Anweisungen des Betreuers zusammengebaut. Mit Aqua dest. werden die Kassetten auf Dichtigkeit überprüft - es wird das jeweilige Trenngel in die Kassette eingegossen und mit Wasser überschichtet - wenn das Trenngel auspolymerisiert ist, wird das überstehende Wasser abgeschüttet und die Sammelgel-Lösung aufpipettiert und der Kamm gesteckt - die Gele werden bis zum Gebrauch in einer Feuchte-Kammer gelagert jede der vier Teilgruppen gießt zwei Gele und zwar ein 12% und ein 18% Gel, dabei werden zwei Teilgruppen jeweils ein Gelgieß- und Laufsystem der Firma PeqLab verwenden während die anderen zwei Teilgruppen ein System der Firma BioRad verwendet Trenngel (Volumenangaben für 1 Gel): 12% 18% ddh 2 O 1,65 ml 0,65 ml Trenngelpuffer 1,25 ml 10% SDS-Lsg. 50 µl 30% Acrylamid/ 2 ml 3 ml Bisacrylamid-Lösung (37,5:1) Alles mischen, sobald APS zugegeben wird beginnt die Polymerisation, d.h. ab jetzt zügig arbeiten TEMED 3 µl 10% APS 30 µl ddh 2 O = doppelt destilliertes Wasser (Äquivalent heutzutage: Wasser aus Reinstwasseranlage) APS = 10% Ammoniumpersulfat-Lsg. in Wasser Trenngelpuffer: 1,5 M Tris/HCl ph 8,8 Sammelgel (5% Acrylamid); unabhängig vom Trenngel. Volumenangaben pro Gel für 1 Gel für Gele ddh 2 O 1,1 ml Sammelgelpuffer 0,5 ml 10% SDS-Lsg. 20 µl 0,5% Bromphenolblau-Lsg. 10 µl 30% Acrylamid/ 0,26 ml Bisacrylamid-Lösung (37,5:1) Alles mischen, sobald APS zugegeben wird beginnt die Polymerisation, d.h. ab jetzt zügig arbeiten TEMED 2 µl 10% APS 10 µl Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris/HCl, ph 6,8 10

11 Zusammenbau der Gelapparatur - Messen Sie die Dimensionen der Gelabschnitte aus, die später geblottet werden sollen (s. Ladeschema) - Die Gelkassetten werden nach Anweisung des Betreuers in Haltevorrichtung der Gelkammer eingebaut - Anode und Kathode werden mit Laufpuffer befüllt, dazu muss 10fach Laufpuffer zu 1x Laufpuffer verdünnt werden (pro Kasettenpaar 500 ml 1x Laufpuffer). 10fach Laufpuffer: 30,3g Tris (Base) und 144g Glycin in 1l Wasser lösen (ph ca. 8,3, nicht mit HCl nachstellen) Probenvorbereitung - die gesammelten Fraktionen der Ni-IMAC Trennung werden im Verhältnis 1 Volumen zu 1 Volumen mit zweifach Probenpuffer versetzt und 5 min bei 95 C erhitzt, wir wollen pro Tasche und Fraktion 20 µl laden, setzen aber 30 µl an - die Proben werden gemäß Ladeschema auf der nächsten Seite geladen (mit Ladehilfe und ausgezogenen Pipettenspitzen) 2x Probenpuffer: 125 mm Tris, 2 % SDS, 10 % Glycerin, 0,01 % Bromphenolblau, (10 % Thioglycerin), ph 6,8 Am Tag der Probenvorbereitung, d.h. also frisch, versetzt jede Praktikumsuntergruppe 450 µl dieser Lösung mit 50 µl Mercaptoglycerin (= Thioglycerin= Mercaptopropandiol) Gellauf - die Ladehilfe wird entfernt, die Deckel auf die Kammern gesteckt und die Kabel in das Netzgerät gesteckt (jeweils auf richtige Polung achten) - der Gellauf findet bei konstanten 200 V statt (Dauer ca. 1 h) - Auseinanderbauen der Gelkassette und Zerschneiden des Gels 11

12 Ladeschemata (jedes Gel hat 10 Taschen) Ladevolumen vorbereiteter Proteinproben: 20 µl Marker (siehe letzte Seite) M1: µl M2: µl Teil-Gruppe 1 Proben von EGFP-Reinigung mit 0 mm Imidazol 12% Trenngel M1 Lade Flow Elution M2 M2 Lade Flow Elution für Klassische Coomassie Färbung Western Blot (Kurzfärbung) 18% Trenngel M1 Lade Flow Elution M2 M2 Lade Flow Elution für Kolloidale Coomassie-Färbung Western Blot (Langfärbung) für für Teil-Gruppe 2 Proben von mit EGFP-Reinigung mit 20 mm Imidazol 12% Trenngel M1 Lade Flow Elution M2 M2 Lade Flow Elution Kolloidale Coomassie-Färbung 18% Trenngel Western Blot (Kurzfärbung) M1 Lade Flow Elution M2 M2 Lade Flow Elution Klassische Coomassie Färbung Western Blot (Langfärbung) für Teil-Gruppe 3 Proben von mit Reinigung mit Mock (0 mm Imidazol) 12% Trenngel M1 Lade Flow Elution M2 M2 Lade Flow Elution Klassische Coomassie Färbung Western Blot (Kurzfärbung) 18% Trenngel M1 Lade Flow Elution M2 M2 Lade Flow Elution für Kolloidale Coomassie-Färbung Western Blot (Langfärbung) für für Teil-Gruppe 4 Proben von mit Reinigung mit Mock (20 mm Imidazol) 12% Trenngel M1 Lade Flow Elution M2 M2 Lade Flow Elution Kolloidale Coomassie-Färbung Western Blot (Kurzfärbung) 18% Trenngel M1 Lade Flow Elution M2 M2 Lade Flow Elution Klassische Coomassie Färbung Western Blot (Langfärbung) Lade = Ladefraktion, Flow = Flowthrough, Elution = Elutionsfraktion, M1 & M2 = Marker siehe letzte Seite 12

13 Färbung der Gele Kolloidale Coomassie-Färbung - Am Tag vor der Färbung werden pro Gruppe 78,4 ml Lösung A und 1,6 ml Lösung B miteinander gemischt und über Nacht auf einem Magnetrührer gerührt - Kurz vor der Färbung werden zu 80 ml des Gemisches von Lösung A+B 20 ml Brennspiritus gegeben - Die Gele werden über Nacht in dieser Färbelösung inkubiert, am nächsten Tag wird die Färbelösung in den entsprechenden Abfallsammelbehälter geschüttet und die Gele solange mit Wasser entfärbt bis der Hintergrund einigermaßen farblos ist Lösung A: 2% (w/v) ortho-phosphorsäure (85% H 3 PO 4 ) = 20g (zähflüssig) H 2 O 800ml 10% (w/v) Ammoniumsulfat (NH 4 ) 2 SO 4 100g H 2 O ad 980ml Lösung B: 5% (w/v) SERVA Blue G 1g H 2 O ad 20ml Klassische Coomassie Färbung - Gel für mindestens zwei Stunden in Färbelösung inkubieren - Färbelösung in Flasche zurückschütten (kann 2x wiederverwendet werden) - Entfärber zugeben, sobald Entfärber die Farbe des Gels angenommen hat, Entfärber wechseln (Küchenpapier in Entfärberschale bindet Coomassiefarbstoff und beschleunigt Entfärbung, viele Schritte mit wenig Volumen bringen bessere Ergebnisse als wenige Schritte mit viel Volumen Färbelösung: 0,25% Serva Blue G 2,5 g 45% Brennspritus 450 ml 9,2% Essigsäure 9,2 ml mit Wasser auf 1l Entfärber: 35% Brennspiritus 350 ml 7,5% Essigsäure 75 ml mit Wasser auf 1l 13

14 Teil: Elektrophoretischer Transfer und immunologische Detektion eines Proteins (Tag 2+3) 1. Worum geht es bei diesem Versuch? Wenn man Proteingemische unbekannter Zusammensetzung mittels einer SDS-PAGE getrennt hat, möchte man bei bestimmten Anwendungen die Einzelproteine identifizieren. Dies kann z.b. über Massenspektrometrie geschehen, was apparativ aufwendig ist aber theoretisch die Identifikation aller Banden in einem Gel erlaubt (sofern nicht verschiedene Proteine in einer Bande übereinanderliegen). Alternativ können bestimmte Proteine durch Antikörper identifiziert werden. Dies setzt logischerweise aber den Besitz der entsprechenden Antikörper in dem jeweiligen Labor voraus. Solche Antikörper können entweder von Firmen gekauft werden, weil diese Antikörper gegen Epitope gerichtet sind, die sehr häufig nachgewiesen werden sollen (z.b. Tags oder für die Humandiagnostik wichtige Proteine), oder man stellt das Protein (s. Tag 1) selber her und beauftragt eine Firma dann ein Tier (z.b. Kaninchen, Meerschweinchen, Huhn) gegen dieses Protein zu immunisieren, in dem diesem Tier in bestimmten Mengen und zeitlichen Abständen dieses fremde Protein gespritzt wird. Das Tier wird darauf gegen dieses Protein Antikörper bilden und das entsprechende Antiserum (oder bei Vögeln auch das Eigelb) oder eine gereinigte Fraktion daraus kann für die Immunodetektion verwendet werden. Transfer der Proteine von einem Gel auf eine Membran Für die Immunodetektion muß man sich klar machen, dass sich unsere Proteine in einem restriktiven Gel befinden und dass die Antikörper selber auch Proteine sind. Die Detektion der Proteine im Gel würde also aufgrund der langen Inkubations- und Waschzeiten sehr lange dauern. Auch wenn in der Literatur ein Verfahren beschrieben ist, wie man doch im Gel die Immunodetektion durchführen kann, wird in den meisten Laboren ein anderer Weg beschritten. Dabei werden die Proteine aus einem dreidimensionalen Raum (dem Gel) auf eine (idealisiert) zweidimensionale Fläche (die Membran) transferiert. In der Biologie können verschiedene Makromoleküle von einem Gel auf eine Membran transferiert werden. Als erstes wurde der Transfer von DNA-Fragmenten von einem Wissenschaftler namens Southern beschrieben. In Analogie (und als Indiz für Humor in der Wissenschaft) wurde der Transfer von Proteinen Western und der Transfer von RNA Northern Blot genannt. Dabei findet der Transfer von Proteinen dadurch statt, dass im Winkel von 90 zur Laufrichtung der SDS-PAGE in einer entsprechenden Apparatur eine Spannung angelegt wird bei der die SDS-Proteinkomplexe elektrophoretisch aus dem Gel auf die Membran wandern. Im Gegensatz dazu findet beim Southern Blot i.d.r. der Transfer durch einen Massenstrom von Puffer durch das Gel auf eine Membran statt (durch einen Stapel Filterpapier wird aufgrund von Kapillarkräften der Puffer durch das Gel gesogen und über eine Papierbrücke strömt Puffer aus einem Reservoir nach. Beim Western Blot wird zwischen einem Semi-Dry Blot und einem Tankblotting unterschieden: beim Semi-Dry Blot befinden sich zwischen Elektroden nur wenige, angefeuchtete Papierschichten und Gel und Membran befinden sich in der Mitte zwischen diesen Papieren. Beim Tankblotting befindet sich der Blotstapel (Gel, Membran und außen Papier und Trägermaterial) in einer Kammer die je nach Bauart mit mehreren Litern Transferpuffer gefüllt ist und an deren Wänden die Elektroden befestigt sind. Wir wollen im Praktikum das Semi-Dry Verfahren verwenden. Nachdem die Proteine aus dem Gel auf die Membran (bei uns eine PVDF-Membran, alternativ werden auch Nitrocellulose-Membranen verwendet) transferiert worden sind, müssen sie jetzt noch detektiert werden. Dies kann unspezifisch durch Farbstoffe geschehen oder spezifisch durch Antikörper (Immunodetektion) Immunodetektion von Proteinen auf Membranen Nach dem erfolgreichen Transfer möchte man erreichen, dass die Antikörper spezifisch nur die Antigene binden und dann die Antikörper/Antigenbindung auf der Membran sichtbar 14

15 machen. Dabei gibt es verschiedene Protokolle, die sich u.a. durch die Art der verwendeten Membran unterscheiden. Nach dem Western Blot soll die Membran mit dem Antikörper inkubiert werden. Bei einer Nitrocellulose-Membran bestände die Gefahr, dass der Antikörper (als Protein) unspezifisch an die Membran und nicht nur an das Antigen bindet. Deswegen werden solche Membanen längere Zeiten mit einer Protein-haltigen (Magermilchpulver, BSA) Lösung inkubiert, um alle Bindestellen für Proteine auf der Membran abzusättigen. Dies nennt man den Blockierungsschritt. Wir machen uns zu Nutze, dass unsere PVDF-Membran im trockenen Zustand sehr hydrophob ist und deshalb bei der Inkubation in der Antikörperlösung der Antikörper nicht an die Membran selber binden kann sondern nur dort wo durch den vorangegangenen Western Blot schon Proteine liegen. Dies ermöglicht uns ein sogenanntes Schnellfärbeprotokoll zu verwenden. Nach der Inkubation mit dem Antikörper (dem sogenannten Primärantikörper) erfolgen Waschschritte bei denen locker oder gar nicht gebundene Antikörper von der Membran entfernt werden. Im Detektionsschritt wird dann die Antigen/Antikörperbindung durch ein Enzym (Signalamplifikation) sichtbar gemacht. Dies kann dadurch bewerkstelligt werden, dass schon der Primärantikörper mit einem solchen Reporterenzym kovalent gekoppelt ist oder die Membran wird mit einem weiteren Zyklus von Inkubations- und Waschschritten mit einem Sekundärantikörper (aus einer anderen Tierart) versetzt, der an den Primär-Antikörper bindet. Dann ist der Sekundärantikörper mit dem Reporterenzym verknüpt. Als Reporterenzyme werden häufig alkalische Phosphatase (AP) oder Meerrettich-Peroxydase (HRP) eingesetzt, die bestimmte Stoffe entweder zu einem Farbstoff (chromogene Reaktion) umsetzen oder eine Lichtemission (Chemolumineszenz-Reaktion) hervorrufen. Wie ist der Versuch aufgebaut? Die Membranen von Tag 2 werden nach zwei verschiedenen Protokollen immunologisch auf das Vorhandensein des His-Tags untersucht. Während die einzelnen immunologischen Schritte durchgeführt werden, werden die Gele aus den Färbelösungen genommen und entfärbt. Gemeinsam mit den Betreuern findet eine Auswertung und Diskussion der Ergebnisse statt. 15

16 2. Arbeitsanweisung und Protokolle Western Blot - die Papiere und die PVDF-Membranen werden für den Western Blot zurecht geschnitten. Weder Papier noch Membran dürfen mit der Haut in Kontakt kommen (Handschuhe tragen) - Gel 10 min Kathodenpuffer equilibrieren - PVDF-Membranen sind hydrophob, um diese mit Puffer benetzen zu können müssen diese in vergälltem Ethanol (15s) vorinkubiert werden, dann 2 min in Wasser, 5 min in Anodenpuffer 2 - Blotstapel aufbauen, dabei Luftblasen beim Zusammenbau des Stapels vermeiden. Gel wenn möglich nicht wieder von der Membran abziehen (Transfer des Proteins beginnt auch schon ohne Strom) - Stromstärke einstellen (Membranfläche in cm 2 aller Gelabschnitte auf dem Blotter x 0,8 = ma), Western Blot starten, Transferzeit 1,5 h Schema des Blotstapels Kathode (Deckel des Elektroblotters) 3 x Papiere in Kathodenpuffer Gel PVDF-Membran 1 x Papier in Anodenpuffer 2 2 x Papiere in Anodenpuffer 1 Anode (Geräteunterteil) Kathodenpuffer: 25 mm Tris, 40 mm Aminocaproat, ph 9,4, Anodenpuffer 2: 25 mm Tris 10% Brennspiritus, ph 9,4 Anodenpuffer 1: 0,3 M Tris, 10% Brennspiritus, ph 9,4 16

17 Immunodetektion Langfärbeprotokoll: - Membran für 15s in Brennspiritus inkubieren (Membran muss komplett benetzt sein) - Mit dd Wasser die Membran spülen - 3x 2 min mit 40 ml TBS waschen - 30 min mit 20 ml TBS+ 0,5% Tween 20 (= 0,1 ml) + 3% BSA (= 0,6 g) blockieren - 3x 2 min mit 40 ml TBS-T (1) waschen - 10 ml Primärantikörper in TBS-T (1) zugeben, 30 min inkubieren - Antikörperlösung aufbewahren, 3x 2 min mit 40 ml TBS-T (1) waschen - 10 ml Sekundärantikörperlösung in TBS-T (1) zugeben, 30 min inkubieren - Sekundärantikörperlösung aufbewahren, 2x 1min mit 20 ml TBS-T (1) waschen - 2 x 1 min mit 20 ml TBS waschen - Färben im Dunkeln mit 10 ml AP-Puffer+ 5 µl NBT + 30 µl BCIP - Stoppen durch mehrmaliges Spülen mit dd Wasser Kurzfärbprotokoll: - trockene Membran 30 min mit Primärantikörper in Blocking-Lösung inkubieren: 1% BSA in TBS-T (2) - 2 x für 10 s in TBS waschen - 30 min mit Sekundärantikörper in Blocking-Lösung inkubieren. 1% BSA in TBS-T (2) - 2 x 10 s in TBS waschen - Färbereaktion durchführen (s. Langfärbeprotokoll) Puffer und Lösungen: TBS = Tris buffered saline: 10 mm Tris/HCl ph 7,4, 150 mm NaCl TBS-T (1) = TBS mit 0,1% Tween 20 TBS-T (2) = TBS mit 0,05% Tween 20 AP-Puffer 100 mm Tris/HCl ph 8,8 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 NBT 75 mg/ml in 70% DMF; BCIP 50 mg/ml in 100% DMF 17

18 Proteinmarker M1 (ungefärbt) M2 (angefärbt) Die berechnete Größe von His-EGFP beträgt 28,27 kda. LEITFRAGEN für die Besprechung vor Versuchsbeginn und die Abschlussbesprechung 1) Fragestellungen - Wissenschaftliche Fragestellung: * Welche Proben wollen Sie analysiert und was war der Ursprung der Proben (was werden Sie von uns zu Beginn des Praktikums bekommen, wie könnte das hergestellt worden sein?) * Welche Effekte wollen Sie analysieren? Hierzu bitte auch kurz anreißen, wie die Ni-IMAC funktioniert. * Welche möglichen Antworten könnten Sie bekommen? - Kurze Wiederholung was beim Western-Blot und der Entwicklung des Blots passiert und was das Ziel eines Western-Blots ist - Fragestellungen zum experimentellen Ablauf: * Welche Parameter haben Sie variiert? - SDS-PAGE - Coomassie-Färbung - Western-Blot und was könnte man sich davon versprechen? 2) Ergebnis-Präsentation und Interpretation Bitte gehen Sie zunächst auf die Fragestellungen zum experimentellen Ablauf ein: * Verteilung der Banden bei den versch. Gelen inkl. Erklärung * Vergleich der Coomassie-Färbungen inkl. Diskussion von Vor- und Nachteilen * Vergleich der Blotsignale bei den versch. Färbungen inkl. Diskussion von Vor- und Nachteilen Anschließend folgt die Präsentation und Interpretation zu den wissenschaftlichen Ergebnissen. Bitte gehen Sie auf folgende Punkte ein: - Welches ist die Bande von EGFP? Größe, Western Blot, Vergleich zu Mock - Reinheit der Aufreinigungen inkl. Erklärung - Relative Intensitäten der Banden im Western Blot in Ladefraktion und Elution 18