TEIL II. Struktur und Funktion

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2 TEIL II Struktur und Funktion 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen Proteine: Dreidimensionale Struktur und Funktion Enzyme Enzymatische Mechanismen oenzyme und Vitamine Kohlenhydrate Lipide und Membranen

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4 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen 3.1 Allgemeine Struktur von Aminosäuren Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren in Proteinen Andere Aminosäuren und Aminosäurederivate Ionisierung von Aminosäuren Peptidbindungen zwischen Aminosäuren in Proteinen Techniken der Proteinreinigung Analysetechniken Aminosäurenzusammensetzung von Proteinen Bestimmung der Aminosäuresequenz Strategien zur Proteinsequenzierung Bestimmung von evolutionären Beziehungen durch den Vergleich der Sequenz von Proteinen Zusammenfassung Übungsaufgaben Ausgewählte Literatur ÜBERBLIK

5 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen Das Studium von Proteinen beschäftigt Biochemiker seit mehr als 100 Jahren. Das Verständnis der Zusammensetzung, der dreidimensionalen Gestalt und der chemischen Aktivität von Proteinen kann der Schlüssel für die Klärung zentraler wissenschaftlicher Fragen sein. Der Prozess der Photosynthese ist zum Beispiel wegen seiner Rolle beim Einfangen der Sonnenenergie einer der wichtigsten biochemischen Stoffwechselwege. Die detaillierte Untersuchung der Strukturen der vielen Proteine, die an der Photosynthese beteiligt sind, führt zu einem immer tieferen Verständnis dieses fundamentalen Prozesses. Ein anderes aktives Forschungsgebiet ist das Studium der Proteine von thermophilen Bakterien. Diese Bakterien gedeihen bei hohen Temperaturen, die in manchen Fällen über 100 liegen, aber sie führen die gleiche Art von biochemischen Reaktionen durch, die in allen Zellen vorkommen. Worin unterscheiden sich die Proteine thermophiler Bakterien von denen anderer rganismen, so dass sie bei Temperaturen aktiv sein können, die zur Zerstörung der meisten anderen Proteine führen würden? Die Lösung vieler medizinisch relevanter Fragestellungen erfordert das Verständnis von Proteinen und ihrer Funktionsweise. Ein bekanntes Beispiel ist das humane Immunschwächevirus 1 (IV-1, engl. human immunodeficiency virus 1), dem Erreger des erworbenen Immunschwächesyndroms AIDS (engl. acquired immune deficiency syndrome). Wie die meisten Retroviren weist dieses Virus eine hohe Mutationsrate auf. Infolgedessen entstehen immer wieder neue Virusstämme, die sich gegenüber den Standardbehandlungen als resistent erweisen. Eine Wirkstoffklasse, die von solchen Mutationen betroffen ist, umfasst die Inhibitoren der viralen Reversen Transkriptase. Die Struktur und die Funktion der Reversen Transkriptase des I-Virus sind im Detail untersucht worden. Wir kennen außerdem die Strukturen der viralen üllproteine, deren Gene in neuen Stämmen mutiert sind. Wissenschaftler erforschen, auf welche Weise es diese Mutationen den Viren ermöglichen, auch die besten Verteidigungsstrategien der modernen Medizin zu überwinden. Es bleibt zu hoffen, dass die dabei gewonnenen Erkenntnisse zu immer besseren Behandlungsmethoden gegen AIDS und andere Krankheiten führen, die von Retroviren verursacht werden. Es gibt viele verschiedene Arten von Proteinen. Auch wenn sie keine erschöpfende Auskunft geben kann, umfasst die folgende Liste doch die meisten der wichtigen biologischen Funktionen von Proteinen: Viele Proteine fungieren als Enzyme, die biologischen Katalysatoren. Fast alle Reaktionen, die in lebenden rganismen ablaufen, werden durch Enzyme katalysiert. Einige Proteine binden andere Moleküle zum Zweck der Speicherung und des Transports. Myoglobin bindet zum Beispiel Sauerstoff in Skelett- und erzmuskelzellen, während ämoglobin Sauerstoff ( 2 ) und Kohlendioxid ( 2 ) in roten Blutkörperchen (Erythrocyten) bindet und transportiert. Einige Proteine, wie zum Beispiel Tubulin, Actin und Kollagen, verleihen Zellen und somit auch Geweben und rganismen ihre Formstabilität und Gestalt. Komplexe Aggregate von Proteinen können mechanische Arbeit verrichten, wie zum Beispiel die Bewegung von Geißeln (Flagellen), die Trennung von hromosomen während der Mitose oder die Kontraktion von Muskeln. Viele Proteine spielen eine Rolle bei der Entschlüsselung von Informationen in der Zelle. Einige sind an der Translation (Proteinbiosynthese) beteiligt, während andere in die Regulation der Genexpression eingreifen, indem sie an ucleinsäuren binden. 76

6 3.1 Allgemeine Struktur von Aminosäuren 6 7 Manche Proteine fungieren als ormone, die biochemische Aktivitäten in ihren Zielzellen regulieren. Schließlich weisen einige Proteine hoch spezialisierte Funktionen auf. Antikörper sind zum Beispiel ein wichtiges Glied in der Verteidigung von Wirbeltieren gegen bakterielle und virale Infektionen. Toxine, die von Bakterien produziert werden, können größere rganismen töten. Wir beginnen unser Studium der Proteine, die auch Polypeptide genannt werden, mit der Beschreibung der Strukturen und chemischen Eigenschaften ihrer Bausteine, den Aminosäuren. In diesem Kapitel werden wir außerdem die Isolierung und Reinigung, die Analyse sowie die Sequenzierung von Polypeptiden besprechen. Die dreidimensionale Struktur von Polypeptidketten werden wir in Kapitel 4 behandeln, während die Eigenschaften von Enzymen das Thema der Kapitel 5 und 6 darstellen. Allgemeine Struktur von Aminosäuren 3.1 Alle rganismen verwenden den gleichen Standardsatz von 20 Aminosäuren für den Aufbau von Proteinmolekülen. Trotz der begrenzten Anzahl von Aminosäuren kann eine enorme Vielfalt von unterschiedlichen Polypeptiden produziert werden, indem die 20 Standard-Aminosäuren in verschiedenen Kombinationen zu langen, linearen Ketten verknüpft werden. Aminosäuren werden deshalb so genannt, weil sie Aminoderivate von arbonsäuren darstellen. In den 20 Standard-Aminosäuren sind die Amino- und die arboxylgruppe an dasselbe Kohlenstoffatom gebunden, das so genannte α-kohlenstoffatom (α--atom). Der griechische Buchstabe α kennzeichnet die Position des Kohlenstoffatoms direkt neben der arboxylgruppe. Alle Aminosäuren, die in Proteinen vorkommen, sind α-aminosäuren. An das α--atom sind zwei weitere Substituenten gebunden, ein Wasserstoffatom und eine Seitenkette (R), in der sich die verschiedenen Aminosäuren unterscheiden. In den chemischen amen von Aminosäuren werden Kohlenstoffatome mit ummern gekennzeichnet, die die relative Position zur arboxylgruppe, deren -Atom die ummer 1 trägt, angeben. Der korrekte chemische ame oder systematische ame folgt Regeln, die von der International Union of Pure and Applied hemistry (IUPA) und der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) aufgestellt wurden. Der systematische ame der α-aminosäure, die eine Methylgruppe ( 3 ) als Seitenkette besitzt, lautet 2-Aminopropansäure, 3 ( 2 ) (Propansäure ist 3 2 ). Sie ist aber unter ihrem gebräuchlicheren Trivialnamen, Alanin, bekannter. Eine alternative omenklatur verwendet griechische Buchstaben, um das α--atom und die -Atome der Seitenkette zu identifizieren. Gemäß dieser omenklatur werden die -Atome bezüglich ihrer Position relativ zur arboxylgruppe spezifiziert, so dass das -Atom der arboxylgruppe im Gegensatz zur systematischen omenklatur nicht durch einen griechischen Buchstaben beziehungsweise eine Positionsnummer gekennzeichnet wird. Biochemiker verwenden traditionell die alte, alternative omenklatur und die Trivialnamen. Weil ihr pk S -Wert ca. 9 beträgt, liegt die Aminogruppe von (freien) Aminosäuren unter normalen physiologischen Bedingungen innerhalb von Zellen protoniert vor, also als positiv geladene Ammoniumgruppe ( 3 ). Die arboxylgruppe ist ebenfalls ionisiert, weist aber einen pk S -Wert von unter 3 auf (Abschnitt 2.9). Deswegen 2 2 R α R 2 1 Konventionen zur ummerierung von -Atomen in Aminosäuren. In der traditionellen omenklatur werden die -Atome in Abhängigkeit von ihrem Abstand vom arboxyl--atom mit den griechischen Buchstaben α, β, γ etc. gekennzeichnet. In den offiziellen systematischen amen gemäß IUPA und IUBMB erhält das arboxyl--atom die ummer 1 und die benachbarten -Atome werden sequenziell weiternummeriert. Somit entspricht das α--atom im traditionellen amen dem -2- Atom im systematischen amen. 77

7 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen (a) α R (b) α-arboxylatgruppe α-kohlenstoffatom α-aminogruppe β-kohlenstoffatom Seitenkette α-kohlenstoff Kohlenstoff Wasserstoff Stickstoff Sauerstoff Abbildung 3.1: Zwei Darstellungen einer L-Aminosäure bei neutralem p-wert. (a) Allgemeine Struktur einer Aminosäure in perspektivischer Darstellung. Eine Aminosäure besitzt eine arboxylatgruppe, deren -Atom die Positionsnummer 1 erhält, sowie eine Aminogruppe, ein -Atom und eine Seitenkette (R), die alle an das -2-Atom (das α--atom) gebunden sind. Die massiven Keile repräsentieren Bindungen, die nach vorn aus der Papierebene herausragen, während die gestrichelten, keilförmigen Bindungen hinter die Papierebene zeigen. Die breiten Enden der Keile befinden sich immer näher zum Betrachter als die spitzen Enden. (b) Kugel-Stab-Modell (engl. ball-and-stick model ) der Aminosäure Serin, die die Seitenkette 2 aufweist. Beachten Sie die unterschiedlichen omenklaturen bezüglich der Kennzeichnung beziehungsweise ummerierung der Kohlenstoffatome. tritt sie in der deprotonierten Form als negativ geladene arboxylatgruppe ( ) auf. Im physiologischen p-bereich existieren Aminosäuren somit als dipolare Ionen, so genannte Zwitterionen, auch wenn ihre ettoladung null beträgt. In Abschnitt 3.4 werden wir feststellen, dass auch einige der Seitenketten der Standard-Aminosäuren in ionischer Form vorkommen können. Biochemiker präsentieren die Strukturen von Aminosäuren immer in der biologisch relevanten Form, so dass Sie in den folgenden Abbildungen Zwitterionen vorfinden werden. Abbildung 3.1a zeigt die allgemeine Struktur einer Aminosäure in perspektivischer Darstellung, während Sie in Abbildung 3.1b ein Kugel-Stab-Modell (engl. ball-and-stick model) der Aminosäure Serin mit der Seitenkette 2 sehen. Die -Atome der Seitenkette einer Aminosäure werden sequenziell mit den griechischen Buchstaben β, γ, δ und ε gekennzeichnet, die den Positionsnummern 3, 4, 5 und 6 in der systematischen omenklatur entsprechen. Der systematische ame von Serin lautet 2-Amino-3-hydroxypropansäure. In 19 der 20 Standard-Aminosäuren, die für die Biosynthese von Proteinen verwendet werden, ist das α--atom asymmetrisch substituiert (es ist ein Stereozentrum), da es vier verschiedene Substituenten trägt, und diese Aminosäuren sind infolgedessen chiral. Die einzige Ausnahme bildet Glycin, dessen Seitenkette nur aus einem einfachen Wasserstoffatom besteht. Glycin ist deswegen nicht chiral, weil an das α--atom zwei -Atome und somit nicht vier verschiedene Substituenten gebunden sind. Die 19 chiralen Aminosäuren können aber in Form von verschiedenen Stereoisomeren vorkommen. Stereoisomere sind Verbindungen, deren Molekülformel beziehungsweise Konstitution übereinstimmt (entsprechende Atome in den Stereoisomeren sind mit den gleichen Atomen kovalent verbunden), die aber eine unterschiedliche räumliche Anordnung ihrer Atome oder Konfiguration aufweisen. Stereoisomere sind verschiedene Moleküle, die nicht ohne Weiteres ineinander überführt 78

8 3.1 Allgemeine Struktur von Aminosäuren werden können, weil zur Änderung der Konfiguration der Bruch (und die anschließende eubildung) von kovalenten Bindungen erforderlich wäre. Die Stereoisomere von Aminosäuren sind nicht deckungsgleich, sondern verhalten sich wie Bild und Spiegelbild zueinander. Solche Stereoisomere heißen Enantiomere. Zwei der 19 chiralen Aminosäuren, nämlich Isoleucin und Threonin, weisen jeweils ein zusätzliches, asymmetrisch substituiertes -Atom in der Seitenkette auf und besitzen somit jeweils zwei Stereozentren. Isoleucin und Threonin können infolgedessen jeweils in Form von vier verschiedenen Stereoisomeren (Diastereomeren) vorkommen, die zwei Enantiomerenpaare darstellen. Konventionsgemäß werden die Aminosäuren eines Enantiomerenpaares, die sich in ihrer Konfiguration am α--atom unterscheiden, mit den etwas kleiner geschriebenen Großbuchstaben D (lat. dexter, rechts) und L (lat. laevus, links) gekennzeichnet. Die Aminosäure in Abbildung 3.1a besitzt L-Konfiguration, ihr Enantiomer (Spiegelbild) weist D-Konfiguration auf. Um die Konfiguration einer Aminosäure zu bestimmen, zeichnet man die perspektivische Strukturformel der Aminosäure wie in Abbildung 3.1a in der Weise, dass die arboxylatgruppe oben und die Seitenkette unten steht und beide vom Betrachter wegweisen. In dieser Form zeigen die α-aminogruppe und das α--atom in Richtung des Betrachters. Befindet sich die α-aminogruppe in dieser Schreibweise auf der linken Seite der senkrechten Grundkette, handelt es sich um das L-Isomer, steht sie auf der rechten Seite um das D-Isomer ( Abbildung 3.2). Beachten Sie, dass die vier an das α--atom gebundenen Atome, ähnlich wie die maximale Anzahl von vier Wasserstoffatomen in der Umgebung des Sauerstoffatoms in Wasser (Abbildung 2.4), die vier Ecken eines Tetraeders besetzen. Die 19 chiralen Aminosäuren, die zum Aufbau von Proteinen verwendet werden, weisen alle L-Konfiguration (am α--atom) auf, obwohl in der atur auch ein paar D-Aminosäuren vorkommen. Konventionsgemäß setzt man in der Biochemie bei Aminosäuren eine L-Konfiguration voraus, wenn die Stereochemie nicht explizit (a) Spiegelebene (b) Spiegelebene α α L-Serin D-Serin L-Serin D-Serin α-kohlenstoff Kohlenstoff Wasserstoff Stickstoff Sauerstoff Abbildung 3.2: Enantiomerenpaare (Spiegelbildpaare) von Aminosäuren. (a) Kugel-Stab-Modell (engl. ball-and-stick model ) von L-Serin und D-Serin. Beachten Sie, dass die beiden Moleküle nicht identisch sind. Sie können nicht zur Deckung gebracht werden. (b) Perspektivische Strukturformeln von L-Serin und D-Serin. 79

9 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen durch den Buchstaben D spezifiziert ist. ft ist es bequemer und nicht schädlich, die Struktur von L-Aminosäuren in einer stereochemisch unkommentierten Form zu schreiben. Dies gilt besonders, wenn die korrekte Stereochemie für eine Diskussion keine entscheidende Rolle spielt. Die Tatsache, dass alle lebenden rganismen denselben Satz von Standard-Aminosäuren für die Proteinbiosynthese verwenden, ist ein Beleg für die Existenz eines gemeinsamen Vorfahren aller Lebewesen auf der Erde. Wie die modernen rganismen, muss auch der letzte gemeinsame Vorfahre L- und nicht D-Aminosäuren genutzt haben. In Mischungen, die die Bedingungen auf der Erde vor vier Milliarden Jahren, als das erste Leben entstand, nachahmen, bilden sich L- und D-Aminosäuren. Auch in Meteoriten sind beide Enantiomere gefunden worden. Es ist nicht bekannt, wie und warum die primitiven Lebensformen aus der Mischung von Enantiomeren, die zur Zeit der Entstehung des Lebens vermutlich vorgelegen hat, die L-Aminosäuren für eine weitere Verwendung selektiert haben. Wahrscheinlich war die Bildung der ersten Proteine, die aus einer kleinen Anzahl einfacher Aminosäuren aufgebaut waren, ein Zufallsereignis, ebenso wie die damit verknüpfte Selektion zwischen L- und D-Aminosäuren. Moderne lebende rganismen müssen die L-Aminosäuren nicht erst aus einer Enantiomerenmischung selektieren, weil sowieso nur die L-Aminosäuren in ausreichenden Mengen synthetisiert werden. Die vorherrschende Stellung der L-Aminosäuren ist somit eine Folge der Evolution der entsprechenden Stoffwechselwege, die zur Produktion von L- und nicht D-Aminosäuren geführt hat (Kapitel 17). Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren in Proteinen 3.2 Einige seltenere Aminosäuren werden in Abschnitt 3.3 beschrieben. Die Strukturen der 20 Aminosäuren, die gewöhnlich in Proteinen vorkommen, werden in den folgenden Abbildungen als Fischer-Projektionen dargestellt. In der Fischer- Projektion (Abschnitte 1.1 und 1.3.2) zeichnet man die Struktur der Aminosäure ähnlich wie in Abbildung 3.1a und mit der gleichen Anordnung der einzelnen Gruppen. Die Bindungen werden jedoch nicht keilförmig und nicht gestrichelt dargestellt, sondern als einfache, gerade, durchgehende Linien. Die Fischer-Projektion impliziert aber die in Abbildung 3.1a gezeigte Ausrichtung der Bindungen. orizontale Bindungen ragen also nach vorn aus der Papierebene heraus, während senkrechte Bindungen hinter die Ebene zeigen. Die Untersuchung der Strukturen offenbart erhebliche Unterschiede in den Seitenketten der 20 Aminosäuren. Einige Seitenketten sind unpolar und somit hydrophob, wohingegen andere polare Gruppen aufweisen oder bei neutralem p-wert in ionischer Form vorliegen und deshalb hydrophil sind. Die Eigenschaften der Seitenketten beeinflussen die dreidimensionale Gestalt, also die Konformation des gesamten Proteins in hohem Maße. Ein wasserlösliches Protein ist zum Beispiel so gefaltet, dass die meisten seiner hydrophoben Seitenketten im Inneren des Moleküls zusammengelagert sind, während die hydrophilen Seitenketten bevorzugt an der berfläche liegen. Infolgedessen besitzen diese Proteine meist eine eher kompakte, globuläre (kugelförmige) Gestalt. In den Abbildungen ist sowohl der Drei-Buchstaben-ode als auch der Ein- Buchstaben-ode für jede Aminosäure angegeben. Der Zusammenhang zwischen dem Drei-Buchstaben-ode und dem Trivialnamen ist leicht zu erkennen. Dagegen erscheint der Ein-Buchstaben-ode weniger offensichtlich, weil die Trivialnamen mehrerer Aminosäuren mit dem gleichen Buchstaben beginnen. Deswegen müssen 80

10 3.2 Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren in Proteinen EXKURS Eine alternative omenklatur zur Benennung der Konfiguration Auch die in der organischen hemie sehr verbreitete R,S-omenklatur zur Benennung der absoluten Konfiguration an einem Stereozentrum wird zur Beschreibung der Stereochemie von Aminosäuren manchmal verwendet. Die R,S-omenklatur basiert auf der Festlegung einer Prioritätenreihenfolge der vier Substituenten, die an ein Stereozentrum gebunden sind. Auf der Grundlage dieser Prioritätenreihenfolge und der räumlichen Anordnung der Substituenten wird die absolute Konfiguration an diesem Stereozentrum entweder als R oder als S bezeichnet. Ein Beispiel für solche Stereozentren sind die α--atome in den 19 chiralen Standard-Aminosäuren. Die Prioritäten werden von 1 (höchste Priorität) bis 4 (niedrigste Priorität) durchnummeriert und nach den folgenden, hier etwas vereinfacht dargestellten, so genannten ahn-ingold-prelog-regeln oder IP- Regeln, festgelegt: (a) L-Serin Von den vier Atomen, die direkt an das Stereozentrum gebunden sind, wird demjenigen die niedrigste Priorität (ummer 4) zugeordnet, welches die kleinste Atommasse besitzt. Die Priorität der restlichen drei Atome steigt mit deren Atommasse. Wenn zwei gleiche Atome direkt mit dem Stereozentrum verknüpft sind, ergeben sich deren Prioritäten entsprechend aus den Atommassen der nächsten mit ihnen verbundenen Atome. Eine 3 -Gruppe besitzt demnach also eine niedrigere Priorität als eine 2 Br-Gruppe, weil Brom eine größere Atommasse aufweist als Wasserstoff. Ist ein Atom durch eine Doppel- oder Dreifachbindung gebunden, wird es entsprechend doppelt oder dreifach gezählt. Eine -Gruppe mit einem doppelt gebundenen Sauerstoffatom besitzt somit eine höhere Priorität als eine 2 -Gruppe. Die Reihenfolge einiger der häufigsten Gruppen in der Biochemie, geordnet von der niedrigsten zur höchsten Priorität, lautet:, 3, 6 5,,, R, 2, R,, R und S. Stellen Sie sich das Molekül mit diesen Regeln im Gedächtnis als Lenkrad eines Autos vor, bei dem die Gruppe mit der niedrigsten Priorität (ummer 4) in Richtung der Lenksäule vom Fahrer wegzeigt, während die übrigen drei Gruppen auf dem Lenkradkranz angeordnet sind. Folgen Sie nun dem Lenkradkranz, ausgehend von der Gruppe mit der höchsten Priorität (1) über die Gruppe der zweithöchsten Priorität (2) bis zur Gruppe mit der niedrigsten Priorität (3). Sind diese drei Gruppen aus der Sicht des Betrachters (Autofahrers) im Uhrzeigersinn angeordnet, weist das Stereozentrum R-Konfiguration auf (lat. rectus, rechts). Resultiert aber eine Anordnung entgegen dem Uhrzeigersinn, besitzt das Stereozentrum S-Konfiguration (lat. sinister, links). Die Abbildung demonstriert die Feststellung der S-Konfiguration von L-Serin gemäß der R,S-omenklatur. Für L-ystein ergibt sich dagegen die entgegengesetzte R-Konfiguration. Die R,S-omenklatur und die D,L-omenklatur stehen also offensichtlich in keinem direkten Zusammenhang. In der Biochemie wird das D,L-System häufiger verwendet, weil alle Aminosäuren, die in Proteinen vorkommen, nach dem D,L-System dieselbe Konfiguration aufweisen, nach dem R,S-System aber nicht. (b) S-Konfiguration Bestimmung der absoluten Konfiguration nach dem R,S-System. (a) Jeder Gruppe, die an das Stereozentrum gebunden ist, wird auf der Grundlage der Atommassen der direkt mit dem Stereozentrum verbundenen Atome eine Priorität zugeordnet. Dem Substituenten mit der niedrigsten Priorität wird die ummer 4 gegeben. (b) Wenn man das Molekül so ausrichtet, dass der Substituent mit der kleinsten Priorität hinter die Papierebene, also vom Betrachter weg, zeigt, kann die absolute Konfiguration des Stereozentrums bestimmt werden. Sind die Substituenten in der Prioritätenreihenfolge 1, 2 und 3 vom Betrachter aus gesehen im Uhrzeigersinn angeordnet, besitzt das Stereozentrum R-Konfiguration, sind sie entgegen dem Uhrzeigersinn angeordnet, S-Konfiguration. Das hier dargestellte L-Serin weist S-Konfiguration auf. 3 als Ein-Buchstaben-ode für diese Aminosäuren auch noch andere Buchstaben des Alphabets verwendet werden. So lautet zum Beispiel der Ein-Buchstaben- ode für Threonin T, aber für Tyrosin Y und für Tryptophan W. Die Ein-Buchstaben- odes müssen einfach auswendig gelernt werden. Es ist wichtig, sich die Strukturen der Standard-Aminosäuren einzuprägen, weil wir deren Kenntnis in den Kapiteln zu den Proteinstrukturen, den Enzymen und zur Proteinbiosynthese noch oft voraussetzen werden. In den folgenden Abschnitten haben wir die Aminosäuren nach ihren allgemeinen Eigenschaften und der Struktur ihrer Seitenketten in Gruppen eingeteilt. Die Seitenketten können einer der folgenden chemischen Klassen zugeordnet werden: aliphatisch, aromatisch, schwefelhaltig, alkoholisch, basisch, sauer und amidhaltig. Außerdem können von den 20 81

11 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen Standard-Aminosäuren fünf als sehr hydrophob (blau) und sieben als sehr hydrophil (rot) klassifiziert werden. Das Verständnis der Klassifizierung der Seitenketten wird Ihnen das Auswendiglernen der Strukturen und amen vereinfachen. EXKURS Trivialnamen von Aminosäuren Trivialname erkunft des amens Alanin Wahrscheinlich von Aldehyd + an (als geeignetes Bindeglied) + Amin (1849) Arginin Asparagin Kristallisiert als Silbersalz; vom lateinischen Wort argentum (Silber) abgeleitet (1886) Wurde zuerst aus Spargel (botanisch asparagus) isoliert (1813) Aspartat Ähnlich wie Asparagin (1836) Glutamat Wurde zuerst im Pflanzenprotein Gluten gefunden (1866) Glutamin Ähnlich wie bei Glutamat (1866) Glycin ystein istidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Vom griechischen Wort glykys (süß) abgeleitet; schmeckt süß (1848) Vom griechischen Wort kystis (Blase) abgeleitet; wurde in Blasensteinen entdeckt (1882) Wurde zuerst aus Störsperma isoliert; vom griechischen Wort histos (etz, Stoff, Gewebe) abgeleitet (1896) Isomer von Leucin Vom griechischen Wort leukos (weiß) abgeleitet; bildet weiße Kristalle (1820) Produkt der Proteinhydrolyse; vom griechischen Wort lysis (Auflösung) abgeleitet (1891) Die Seitenkette enthält ein Schwefelatom (griech. theion, Schwefel) und eine Methylgruppe (1928). Phenylalanin Alanin mit einer Phenylgruppe (1883) Prolin Serin Verunstaltete Form des amens Pyrrolidin, weil Prolin einen Pyrrolidinring enthält (1904). Vom lateinischen Wort sericum (Seide) abgeleitet; häufiger Bestandteil von Seide (1865) Threonin Ähnelt dem 4 -Zucker Threose (1936) Tryptophan Isoliert aus dem Produkt der Trypsinverdauung von Proteinen + griech. phanein, sich zeigen (1890) Tyrosin Valin Kommt in Käse vor; vom griechischen Wort tyros (Käse) (1890) Derivat der Valeriansäure aus der Pflanzenfamilie Valeriana (1906) (Quellen: (1) xford English Dictionary, 2. Auflage. (2) Leung, S Amino Acids, Aromatic ompounds, and arboxylic Acids: ow Did They Get Their ommon ames? J. hem. Educ. 77:48 49.) 82

12 3.2 Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren in Proteinen Aliphatische Seitenketten Glycin (Gly, G) ist die kleinste Aminosäure, da seine Seitenkette nur aus einem Wasserstoffatom besteht. Das α--atom von Glycin trägt also zwei Wasserstoffatome und nicht vier verschiedene Substituenten. Infolgedessen ist das α--atom nicht asymmetrisch substituiert und Glycin ist nicht chiral. Die beiden Wasserstoffatome am α--atom verleihen dem Glycinmolekül einen geringfügigen hydrophoben harakter. Wir werden sehen, dass Glycin eine einzigartige Rolle für die Struktur von vielen Proteinen spielt, weil seine Seitenkette aufgrund ihrer geringen Größe in ischen passt, die keine andere Aminosäure besetzen kann Glycin [G] (Gly) Alanin [A] (Ala) Valin [V] (Val) Leucin [L] (Leu) Isoleucin [I] (Ile) Die vier Aminosäuren Alanin (Ala, A), Valin (Val, V), Leucin (Leu, L) und Isoleucin (Ile, I), ein Strukturisomer von Leucin, besitzen gesättigte, aliphatische Seitenketten. Während die Seitenkette von Alanin nur aus einer Methylgruppe besteht, weist Valin eine verzweigte 3 -Seitenkette auf. Leucin und Isoleucin enthalten jeweils eine verzweigte 4 -Seitenkette. Im Isoleucin ist neben dem α--atom noch ein -Atom asymmetrisch substituiert, das β--atom. Da Isoleucin somit zwei hiralitätszentren enthält, kann es in Form von vier möglichen Stereoisomeren auftreten. Das Stereoisomer, das in Proteinen vorkommt, wird L-Isoleucin genannt. Die Aminosäure, die sich von diesem nur durch die absolute Konfiguration am β--atom unterscheidet, heißt L-Alloisoleucin ( Abbildung 3.3). Die amen der beiden anderen Stereoisomere lauten D-Isoleucin und D-Alloisoleucin. Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin spielen eine wichtige Rolle bei der Ausbildung und Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen, weil sie dazu tendieren, sich vom Wasser abgewandt zusammenzulagern. Wegen der Verzweigung in der Kohlenstoffkette der Seitenkette sind Valin, Leucin und Isoleucin auch als verzweigtkettige Aminosäuren bekannt. Diese drei Aminosäuren sind sehr hydrophob. Prolin (Pro, P) unterscheidet sich von allen anderen 19 Aminosäuren durch die Verknüpfung der Seitenkette sowohl mit dem α--atom als auch mit dem Stickstoffatom der α-aminogruppe, so dass ein cyclisches Molekül entsteht. Prolin enthält deswegen keine primäre, sondern eine sekundäre Aminogruppe. Der heterocyclische Abbildung 3.3: Stereoisomere von Isoleucin L-Isoleucin D-Isoleucin L-Alloisoleucin D-Alloisoleucin 83

13 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen Prolin [P] (Pro) 3 Phenylalanin [F] (Phe) 3 2 Tryptophan [W] (Trp) S 3 Methionin [M] (Met) Tyrosin [Y] (Tyr) 2 S ystein [] (ys) Pyrrolidinring von Prolin schränkt die Geometrie von Polypeptiden ein. Manchmal führt der Einbau eines Prolinrestes zu einer abrupten Richtungsänderung der Polypeptidkette. Infolge der cyclischen Struktur ist Prolin viel weniger hydrophob als Valin, Leucin und Isoleucin Aromatische Seitenketten Die Seitenketten von Phenylalanin (Phe, F), Tyrosin (Tyr, Y) und Tryptophan (Trp, W) weisen aromatische Gruppen auf. Phenylalanin besitzt eine hydrophobe Benzyl- Seitenkette. Tyrosin ähnelt strukturell Phenylalanin, unterscheidet sich von diesem aber durch eine para-ydroxygruppe ( ) am Phenylring. Tyrosin ist also ein Phenol. Die ydroxylgruppe von Tyrosin kann ionisiert (deprotoniert) werden. Unter physiologischen Bedingungen liegt sie aber in nichtionischer, protonierter Form vor. Die Seitenkette von Tryptophan enthält eine bicyclische Indolgruppe. Tyrosin und Tryptophan sind nicht so hydrophob wie Phenylalanin, weil ihre Seitenketten polare Gruppen aufweisen. Alle drei aromatischen Aminosäuren absorbieren ultraviolettes Licht (UV-Licht), da sie im Gegensatz zu den aliphatischen Aminosäuren delokalisierte π-elektronen besitzen. Bei neutralem p-wert liegen die Absorptionsmaxima von Tryptophan und Tyrosin bei 280 nm, während Phenylalanin UV-Licht bei 280 nm kaum und bei seinem Absorptionsmaximum von 260 nm schwach absorbiert. Die meisten Proteine absorbieren UV-Licht mit einer Wellenlänge von 280 nm, da sie Tryptophan und Tyrosin enthalten. Die Extinktion bei 280 nm wird routinemäßig genutzt, um die Konzentration von Proteinen in Lösung abzuschätzen Schwefelhaltige Seitenketten Methionin (Met, M) und ystein (ys, ) sind die beiden einzigen schwefelhaltigen Standard-Aminosäuren. Die Seitenkette von Methionin enthält eine Methylthioether-Gruppe, die Methionin einen eher hydrophoben harakter verleiht. Methionin spielt bei der Proteinbiosynthese eine spezielle Rolle, weil es fast immer die erste Aminosäure bei der Synthese einer Polypeptidkette darstellt. Die Struktur von ystein ergibt sich formal aus der Struktur von Alanin, wenn man ein Wasserstoffatom der Seitenkette durch eine Sulfhydrylgruppe ( S) ersetzt. Auch wenn die Seitenkette von ystein leicht hydrophob ist, besitzt sie dennoch eine hohe Reaktivität. Wegen der Polarisierbarkeit des Schwefelatoms kann die Sulfhydrylgruppe Wasserstoffbrücken zu Sauerstoff- und Stickstoffatomen bilden. Darüber hinaus ist die Sulfhydrylgruppe eine schwache Säure, so dass sie durch die Abspaltung eines Protons in ein negativ geladenes Thiolat-Ion umgewandelt werden kann. ach der ydrolyse mancher Proteine kann eine Verbindung isoliert werden, die ystin genannt wird. ystin entsteht durch die oxidative Verknüpfung von zwei ysteinmolekülen über eine Disulfidbindung ( Abbildung 3.4). Die xidation der Sulfhydrylgruppen von ystein läuft am leichtesten bei schwach alkalischen p- Werten ab, weil die Sulfhydrylgruppen im Alkalischen in deprotonierter, ionischer Form vorliegen. Um eine Disulfidbindung bilden zu können, müssen sich die beiden beteiligten ystein-seitenketten in unmittelbarer räumlicher achbarschaft zueinander befinden, aber sie können in der Aminosäuresequenz der Polypeptidkette trotzdem weit auseinanderliegen. Disulfidbindungen, die auch Disulfidbrücken genannt werden, können die dreidimensionale Struktur von Proteinen durch die 84

14 3.2 Strukturen der zwanzig Standard-Aminosäuren in Proteinen 2 3 ystein S 3 + S 2 ystein Abbildung 3.4: Bildung von ystin. Wenn die Sulfhydrylgruppen zweier ysteinmoleküle durch xidation verknüpft werden, entsteht ein Disulfid, das ystin genannt wird. Dabei werden insgesamt zwei Elektronen von den ysteinmolekülen auf einen Akzeptor A (xidationsmittel) übertragen. xidation 2 e, 2 (A + 2 e + 2 " A) S S 2 3 ystin kovalente Vernetzung von ysteinresten in Peptidketten stabilisieren. Die meisten Proteine enthalten keine Disulfidbrücken, weil die reduktiven Bedingungen innerhalb von Zellen xidationen nicht begünstigen und die Stabilität der Disulfidbrücken vermindern. In vielen extrazellulären Proteinen findet man dagegen Disulfidbrücken. Dort dienen sie offensichtlich der Stabilisierung der Proteinstruktur gegenüber wechselnden Bedingungen mit weniger kontrollierten Temperaturen und p- Werten Seitenketten mit alkoholischen Gruppen Serin (Ser, S) und Threonin (Thr, T) besitzen ungeladene, polare Seitenketten mit β-ydroxygruppen. Diese alkoholischen Gruppen verleihen den aliphatischen Seitenketten einen hydrophilen harakter. Im Gegensatz zur phenolischen ydroxylgruppe von Tyrosin können der primäre und der sekundäre Alkohol Serin und Threonin nur wesentlich schwerer deprotoniert und somit ionisiert werden. Die ydroxymethylgruppe ( 2 ) von Serin liegt in wässriger Lösung kaum in ionischer Form vor. Trotzdem zeigt dieser Alkohol im aktiven Zentrum einer Vielzahl von Enzymen nucleophile Eigenschaften, die denen der ionischen Form ähneln. Threonin weist wie Isoleucin zwei hiralitätszentren auf, das α- und β--atom. Das einzige der vier möglichen Stereoisomere von Threonin, das in Proteinen vorkommt, ist L-Threonin. Die übrigen drei Stereoisomere heißen D-Threonin, L-Allothreonin und D-Allothreonin. 3 2 Serin [S] (Ser) 3 3 Threonin [T] (Thr) Basische Seitenketten istidin (is, ), Lysin (Lys, K) und Arginin (Arg, R) besitzen hydrophile Stickstoffbasen in ihren Seitenketten, die bei einem p-wert von 7 protoniert und somit positiv geladen sind. Die Seitenkette von istidin enthält einen Imidazolring, dessen protonierte Form Imidazolium-Ion genannt wird (Abschnitt 3.4). Lysin ist eine Diaminosäure, die sowohl eine α- als auch eine δ-aminogruppe aufweist. Die ε-aminogruppe liegt bei neutralem p-wert als Alkylammonium-Ion ( 2 3 ) vor und verleiht Proteinen somit eine positive Ladung. Von den 20 Standard-Aminosäuren ist Arginin diejenige mit der größten Basizität. Infolgedessen kommt seine Seitenkette unter den Bedingungen, die normalerweise in Zellen gefunden werden, nur in der protonierten Form als Guanidinium-Ion vor. Jede Arginin-Seitenkette trägt deswegen eine positive Ladung zur Gesamtladung des Proteins bei. 85

15 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen istidin [] (is) Lysin [K] (Lys) Arginin [R] (Arg) Saure Seitenketten und ihre Amidderivate Aspartat (Asp, D) und Glutamat (Glu, E) stellen Aminodicarbonsäuren, deren hydrophile Seitenketten bei einem p-wert von 7 negativ geladen vorliegen. Zusätzlich zur α-arboxylgruppe besitzt Aspartat noch eine β-arboxylgruppe und Glutamat eine γ-arboxylgruppe. Da ihre Seitenketten bei einem p-wert von 7 ionisiert sind, tragen Aspartat und Glutamat mit je einer negativen Ladung zur Gesamtladung des Proteins bei. Aspartat und Glutamat werden manchmal auch Asparaginsäure und Glutaminsäure genannt, aber unter den meisten physiologischen Bedingungen kommen sie in Form ihrer konjugierten Basen, den arboxylat-anionen, vor, deren amen durch die Endung -at gekennzeichnet werden. Das Mononatriumsalz von Glutamat (atriumglutamat) ist Ihnen wahrscheinlich als Geschmacksverstärker in ahrungsmitteln vertraut. Asparagin (Asn, ) und Glutamin (Gln, Q) sind die Monoamide von Asparaginsäure und Glutaminsäure, in denen jeweils die arboxylgruppe in der Seitenkette amidiert vorliegt. bwohl die Seitenketten von Asparagin und Glutamin ungeladen auftreten, sind diese Aminosäuren sehr polar und werden häufig auf der berfläche von Proteinen gefunden, wo sie mit den Wassermolekülen in der Umgebung des Proteins in Wechselwirkung treten können. Die polaren Amidgruppen von Asparagin und Glutamin können außerdem Wasserstoffbrücken zu Atomen in den Seitenketten anderer polarer Aminosäuren bilden Aspartate [D] (Asp) Glutamat [E] (Glu) Asparagin [] (Asn) Glutamin [Q] (Gln) Die ydrophobie der Seitenketten von Aminosäuren Die unterschiedlichen Eigenschaften der Seitenketten von Aminosäuren reichen von sehr hydrophob über schwach polar bis sehr hydrophil. Die relative ydrophobie oder ydrophilie einer Aminosäure wird auch ihre ydropathie genannt. 86

16 3.3 Andere Aminosäuren und Aminosäurederivate Es gibt mehrere Wege die ydropathie von Aminosäuren zu messen. Die meisten dieser Methoden stützen sich auf die Berechnung der Tendenz einer Aminosäure, eine hydrophobe oder eine hydrophile Umgebung zu bevorzugen. Eine häufig verwendete ydropathie-skala finden Sie in Tabelle 3.1. Aminosäuren mit stark positiven ydropathie-werten gelten als hydrophob, während diejenigen mit großen negativen ydropathie-werten als hydrophil angesehen werden. Die Bestimmung der ydropathie-werte mancher Aminosäuren, die in der ähe des Zentrums der Skala liegen, erweist sich als schwierig. Es existieren zum Beispiel Meinungsverschiedenheiten über die ydrophilie der Indolgruppe von Tryptophan, so dass Tryptophan in einigen Skalen viel niedrigere ydropathie-werte aufweist. Die ydropathie ist ein wichtiger Faktor bei der Faltung von Proteinketten, weil hydrophobe Seitenketten dazu neigen, sich im Inneren eines Proteins zusammenzulagern, während hydrophile Aminosäurereste meistens auf der berfläche des Proteins gefunden werden. Allerdings ist es noch nicht möglich genau vorherzusagen, ob sich ein gegebener Aminosäurerest im nichtwässrigen Inneren eines Proteins oder auf dessen berfläche, die mit der Umgebung in Kontakt steht, befindet. ydropathie- Messwerte von freien Aminosäuren, wie sie in Tabelle 3.1 zu finden sind, werden genutzt, um vorherzusagen, welche Segmente von Membranproteinen wahrscheinlich in die hydrophobe Lipiddoppelschicht (Kapitel 9) eingebettet sind. Andere Aminosäuren und Aminosäurederivate 3.3 In lebenden rganismen kommen mehr als 200 verschiedene Aminosäuren vor. Zusätzlich zu den Standard-Aminosäuren, die in Proteine eingebaut werden, enthalten alle Spezies eine Vielfalt von L-Aminosäuren, die entweder Vorstufen von Standard-Aminosäuren oder Zwischenprodukte bei anderen biochemischen Stoffwechselwegen darstellen. Beispiele für solche Aminosäuren sind omocystein, omoserin, rnithin und itrullin (Kapitel 17). S-Adenosylmethionin (SAM) stellt einen häufigen Methylgruppen-Donator in vielen biochemischen Stoffwechselwegen dar (Abschnitt 7.2). Viele Spezies von Bakterien und Pilzen synthetisieren auch D-Aminosäuren, die in Zellwänden oder in komplexen Peptidantibiotika, wie zum Beispiel Actinomycin D, Verwendung finden. Mehrere Standard-Aminosäuren werden chemisch modifiziert, um wichtige biologisch aktive Amine zu produzieren. Diese Amine entstehen in enzymatisch katalysierten Reaktionen, die Decarboxylierungen beinhalten. Im Gehirn von Säugetieren wird zum Beispiel Glutamat in den eurotransmitter γ-aminobutyrat umgewandelt (GABA; engl. γ-aminobutyric acid, γ-aminobuttersäure, Abbildung 3.5a). Säugetiere können außerdem istamin (Abbildung 3.5b) aus istidin synthetisieren. istamin ist eine der Substanzen, die die Konstriktion bestimmter Blutgefäße und die Sekretion von Salzsäure im Magen steuern. Im ebennierenmark wird Tyrosin zu Epinephrin (Abbildung 3.5 c) verstoffwechselt, das im deutschen Sprachraum besser unter dem amen Adrenalin bekannt ist. Adrenalin und sein Vorläufer, oradrenalin (unterscheidet sich von Adrenalin durch die fehlende -Methylgruppe), sind ormone, die bei Säugetieren an der Regulation des Stoffwechsels beteiligt sind. Tyrosin stellt auch die Vorstufe der Schilddrüsenhormone Thyroxin und Triiodthyronin dar (Abbildung 3.5d). Weil für die Biosynthese der Schilddrüsenhormone Iodid erforderlich ist, werden dem gewöhnlichen Tafelsalz häufig kleine Mengen Aminosäure Änderung der Freien Enthalpie beim Transfer a (kj mol 1 ) Stark hydrophob Isoleucin 3,1 Phenylalanin 2,5 Valin 2,3 Leucin 2,2 Methionin 1,1 Weniger hydrophob Tryptophan 1,5 b Alanin 1,01 Glycin 0,67 ystein 0,17 Tyrosin 0,08 Prolin 0,29 Threonin 0,75 Serin 1,1 Stark hydrophil istidin 1,7 Glutamat 2,6 Asparagin 2,7 Glutamin 2,9 Aspartat 3,0 Lysin 4,6 Arginin 7,5 a Die Änderung der Freien Enthalpie bezieht sich auf den Transfer des jeweiligen Aminosäurerestes aus dem Inneren einer Lipiddoppelschicht in Wasser. b In anderen ydropathie-skalen weist Tryptophan einen niedrigeren ydropathie-wert auf. (Aus: Eisenberg, D., Weiss, R.M., Terwilliger, T.., Wilcox, W ydrophobic moments in protein structure. Faraday Symp. hem. Soc. 17: ) Tabelle 3.1: ydropathie-skala für Aminosäurereste. 87

17 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen (a) (b) γ-aminobutyrat istamin (c) (d) I I Epinephrin (Adrenalin) (I) I Thyroxin / Triiodthyronin Abbildung 3.5: Von Standard-Aminosäuren abgeleitete Verbindungen. (a) γ-aminobutyrat ist ein Derivat von Glutamat. (b) istamin stellt ein istidinderivat dar. (c) Das Tyrosinderivat Epinephrin ist im deutschsprachigen Raum besser als Adrenalin bekannt. (d) Die Schilddrüsenhormone Thyroxin und Triiodthyronin sind ebenfalls Derivate von Tyrosin. Thyroxin unterscheidet sich von Triiodthyronin durch ein zusätzliches, viertes Iodatom (in Klammern). 3 2 Se Selenocystein Pyrrolysin atriumiodid zugemischt, um Kropfbildung zu vermeiden. Ein Kropf ist die Folge einer Schilddrüsenunterfunktion, die durch einen Mangel an Iodid in der ahrung verursacht wird. Manche Aminosäuren werden chemisch modifiziert, nachdem sie in Polypeptide eingebaut wurden. Einige Prolinreste im Protein Kollagen werden zum Beispiel zu ydroxyprolinresten oxidiert (Abschnitt 4.11). Eine weitere häufige Modifizierung besteht in der Anknüpfung von komplexen Kohlenhydratketten. Dieser Prozess wird Glycosylierung (Kapitel 8 und 22) genannt. Viele Proteine werden durch die Addition von Phosphorylgruppen an die Seitenketten von Serin, Threonin oder Tyrosin phosphoryliert. Auch die Bildung von ystinresten durch die oxidative Verknüpfung von Paaren von ysteinresten findet nach der Synthese einer Polypeptidkette statt. In Bakterien beginnen Polypeptidketten von Proteinen meistens mit einem Methioninrest, der durch die Addition eines Formylrestes in -Formylmethionin umgewandelt wurde (Kapitel 22). Es war eine überraschende Entdeckung, dass zusätzlich zu den 20 Standard-Aminosäuren eine weitere Aminosäure in einige Proteine vieler Spezies eingebaut wird. Dabei handelt es sich um Selenocystein, bei dem im Vergleich zu ystein das Schwefelatom gegen ein Selenatom ausgetauscht worden ist. Selenocystein wird als Selenocysteinylrest durch die enzymatische Umwandlung von Seryl-AminoacyltRA Sec in Selenocysteinyl-tRA Sec gebildet, die dann als Substrat für die Proteinbiosynthese dient (Kapitel 22). Eine 22. Aminosäure, die in einigen Spezies von Archaeen vorkommt, heißt Pyrrolysin. Pyrrolysin stellt eine modifizierte Form von Lysin dar, deren Synthese vor dem Einbau in die wachsende Polypeptidkette stattfindet. Selenocystein und Pyrrolysin werden durch eigene odons codiert. Deswegen werden sie als zusätzliche Mitglieder des Standardrepertoires der proteinogenen Aminosäuren betrachtet. Infolge posttranslationaler Modifizierungen enthalten viele Proteine mehr als die 22 Standard-Aminosäuren, die bei der Proteinbiosynthese verwendet werden. 88

18 3.4 Ionisierung von Aminosäuren Ionisierung von Aminosäuren 3.4 Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Aminosäuren werden von den ionischen Zuständen der α-arboxylgruppe, der α-aminogruppe sowie jeder ionisierbaren Gruppe in der Seitenkette beeinflusst. Jede ionisierbare Gruppe ist mit einem spezifischen pk S -Wert verbunden, der dem p-wert entspricht, bei dem die Konzentrationen der protonierten und der deprotonierten Form der jeweiligen Gruppe gleich sind (Abschnitt 2.9). Wenn der p-wert einer Lösung unterhalb des pk S -Wertes mindestens einer der ionisierbaren Gruppen liegt, existiert die Aminosäure überwiegend als echte Säure, die ein Proton abgeben kann. Liegt der p-wert einer Lösung oberhalb des pk S -Wertes einer ionisierbaren Gruppe, überwiegt die deprotonierte, konjugierte Base dieser Gruppe, die in dieser Form ein Proton aufnehmen kann. Jede Aminosäure zeigt mindestens zwei pk S -Werte, die den Protolysegleichgewichten der α-arboxyl- und der α-aminogruppe zuzuordnen sind. Außerdem besitzen sieben der Standard-Aminosäuren ionisierbare Seitenketten mit zusätzlichen, messbaren pk S -Werten. Diese pk S -Werte variieren in Abhängigkeit von der jeweiligen Aminosäure. Bei einem gegebenen p-wert weisen Aminosäuren somit häufig unterschiedliche ettoladungen auf. Die ionischen Zustände der Seitenketten von Aminosäuren beeinflussen die dreidimensionale Struktur von Proteinen. Außerdem ist die Kenntnis der ionischen Zustände von Aminosäuren für das Verständnis von enzymatischen Mechanismen von Bedeutung, weil an der Enzymkatalyse häufig ionisierbare Aminosäurereste direkt beteiligt sind (Kapitel 6). Die pk S -Werte von Aminosäuren werden mithilfe von Titrationskurven bestimmt, die wir bereits im letzten Kapitel kennen gelernt haben. In Abbildung 3.6 finden Sie zum Beispiel die Titrationskurve von Alanin. Alanin besitzt zwei ionisierbare Gruppen, die α-arboxylgruppe und die α-aminogruppe. Die Titrationskurve von Alanin zeigt deswegen zwei pk S -Werte bei p-werten von 2,4 und 9,9. Jeder pk S -Wert ist mit einer Pufferzone verbunden, in der sich der p-wert der Lösung durch die Zugabe von Base (oder Säure) nur wenig ändert. Der pk S -Wert einer ionisierbaren Gruppe entspricht einem Wendepunkt in einem flachen Bereich der Titrationskurve. Bei diesem p-wert sind die Konzentrationen p pi Ala 3 pk 2 2 (Anion) 3 3 (Zwitterion) pk ,5 1,0 1,5 2,0 Äquivalente 3 (Kation) Abbildung 3.6: Titrationskurve von Alanin. Der erste pk S -Wert beträgt 2,4 und der zweite 9,9. pi Ala repräsentiert den isoelektrischen Punkt von Alanin. 89

19 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen der Säure (Protonendonator) und der konjugierten Base (Protonenakzeptor) genau gleich. Bei dem Beispiel in Abbildung 3.6 stimmen bei einem p-wert von 2,4 die Konzentrationen der positiv geladenen Form und des Zwitterions von Alanin exakt überein. Der zugehörige pk S -Wert beschreibt das folgende Gleichgewicht: 3 3 ƒ ƒ 3 IRJ 3 + (3.1) Bei einem p-wert von 9,9 sind die Konzentrationen des Zwitterions und der negativ geladenen Form von Alanin gleich. Die beiden Spezies stehen folgendermaßen im Gleichgewicht: 3 3 ƒ ƒ 3 IRJ 2 + (3.2) Beachten Sie, dass das Zwitterion im ersten Protolysegleichgewicht (Reaktionsgleichung 3.1) die konjugierte Base zur Säureform von Alanin darstellt, während es im zweiten Protolysegleichgewicht (Reaktionsgleichung 3.2) den Protonendonator beziehungsweise die konjugierte Säure zur basischen Form von Alanin repräsentiert, die bei höheren p-werten überwiegt. Aus den Konzentrationsverhältnissen und den ettoladungen der einzelnen Formen von Alanin ergibt sich bei einem p-wert von 2,4 eine durchschnittliche ettoladung eines Alaninmoleküls von +0,5 und bei einem p-wert von 9,9 eine durchschnittliche ettoladung von 0,5. In der Mitte zwischen diesen beiden p-werten von 2,4 und 9,9 liegt, bei einem p-wert von 6,15 im steilen Abschnitt der Titrationskurve, ein weiterer Wendepunkt. An diesem Punkt beträgt die durchschnittliche ettoladung eines Alaninmoleküls null. Deswegen wird dieser Punkt isoelektrischer Punkt (pi) oder auch isoelektrischer p-wert genannt. Wenn eine Alaninlösung mit einem p-wert unterhalb von pi in einem elektrischen Feld positioniert wird, wandern die Alaninmoleküle zur Kathode (negativ geladene Elektrode), weil die Alaninmoleküle eine positive ettoladung tragen. Bei einem p-wert oberhalb von pi bewegen sich die Alaninmoleküle im elektrischen Feld aufgrund ihrer negativen ettoladung in Richtung Anode (positiv geladene Elektrode). Entspricht der p-wert der Lösung genau dem pi-wert von Alanin, findet wegen der fehlenden ettoladung der Alaninmoleküle keine ettowanderung im elektrischen Feld statt. istidin besitzt eine ionisierbare Seitenkette. Die Titrationskurve von istidin weist deswegen einen weiteren Wendepunkt auf, der dem pk S -Wert der Seitenkette entspricht ( Abbildung 3.7a). Wie im Fall von Alanin repräsentiert der erste, niedrigste pk S -Wert (1,8) das Protolysegleichgewicht der α-arboxylgruppe und der größte pk S -Wert (9,3) das der α-aminogruppe. Der mittlere pk S -Wert (6,0) in der Titrationskurve entspricht der Deprotonierung des Imidazolium-Ions der Seitenkette des istidins (Abbildung 3.7b). Bei einem p-wert von 7,0 beträgt das Verhältnis der Imidazolform (konjugierte Base) zum Imidazolium-Ion (konjugierte Säure) 10: 1. Somit treten sowohl die protonierte, positiv geladene als auch die neutrale Form der Seitenkette von istidin in der ähe der physiologischen p-werte in signifikanten Konzentrationen auf. Die Seitenkette eines bestimmten istidinrestes kann in Abhängigkeit von ihrer unmittelbaren Umgebung im Protein entweder protoniert oder deprotoniert vorliegen. Mit anderen Worten: Der tatsächliche 90

20 3.4 Ionisierung von Aminosäuren (a) 12 (b) 10 pk pk 2 2 pk S = 6,0 2 p 6 4 pk 1 piis ,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Imidazolium-Ion (protonierte Form) der istidin-seitenkette Imidazol (deprotonierte Form) der istidin-seitenkette Äquivalente Abbildung 3.7: Ionisierung von istidin. (a) Titrationskurve von istidin. Die drei pk S -Werte betragen 1,8, 6,0 und 9,3. pi is repräsentiert den isoelektrischen Punkt von istidin. (b) Protolysegleichgewicht des Imidazolrings in der Seitenkette von istidin. pk S -Wert einer istidin-seitenkette innerhalb eines Proteins kann sich von dem pk S -Wert der freien Aminosäure in wässriger Lösung unterscheiden. Infolge dieser Eigenschaften ist istidin sehr gut als Protonenüberträger im aktiven Zentrum von Enzymen geeignet. Der isoelektrische Punkt einer Aminosäure, die nur zwei ionisierbare Gruppen (die α-arboxyl- und die α-aminogruppe) enthält, ergibt sich aus dem arithmetischen Mittel ihrer beiden pk S -Werte: pi = (pk 1 + pk 2 )/2. Für eine Aminosäure mit drei ionisierbaren Gruppen, wie zum Beispiel istidin, muss man jedoch die ettoladung aller ionischen Spezies berücksichtigen. Der isoelektrische Punkt von istidin liegt zum Beispiel zwischen den pk S -Werten auf beiden Seiten der Spezies ohne ettoladung. Dieser Punkt entspricht dem Wendepunkt der Titrationskurve im zweiten steilen Abschnitt, der auch den Endpunkt der Titration der Seitenkette repräsentiert und bei einem p-wert von 7,65 in der Mitte zwischen 6,0 und 9,3 liegt. Wie man der Tabelle 3.2 entnehmen kann, weisen die pk S -Werte der α-arboxylgruppen freier Aminosäuren Werte zwischen 1,8 und 2,5 auf. Diese Werte sind niedriger als die einer typischen arbonsäure wie Essigsäure (pk S = 4,8), weil die benachbarte 3 -Gruppe Elektronendichte aus der α-arboxylgruppe abzieht, wodurch die -Bindung noch stärker polarisiert wird. Infolgedessen wird die heterolytische Abspaltung des Protons zusätzlich erleichtert. eterolytisch heißt: Das Bindungselektronenpaar verbleibt vollständig am Sauerstoffatom. Die α-arboxylgruppen der verschiedenen Aminosäuren zeigen unterschiedliche pk S -Werte, weil diese auch durch die Seitenketten beeinflusst werden. Wir haben gerade im Beispiel gesehen, dass die Werte von istidin und Alanin nicht übereinstimmen. Die α-arboxylgruppe einer Aminosäure stellt eine relativ schwache Säure dar. Der Anteil der Gruppe, der bei einem gegebenen p-wert in ionischer Form vorliegt, kann mithilfe der enderson-asselbalch-gleichung (Abschnitt 2.9) berechnet werden: [Protonenakzeptor] p = pk S + log (3.3) [Protonendonator] Für eine typische Aminosäure, deren α-arboxylgruppe einen pk S -Wert von 2,0 aufweist, erhält man das Verhältnis von Protonenakzeptor (arboxylat-anion) zu Protonendonator (arbonsäure) bei einem p-wert von 7,0, indem man die folgende Aminosäure pk S -Wert arboxyl- Amino- Seitengruppe gruppe kette Glycin 2,4 9,8 Alanin 2,4 9,9 Valin 2,3 9,7 Leucin 2,3 9,7 Isoleucin 2,3 9,8 Methionin 2,1 9,3 Prolin 2,0 10,6 Phenylalanin 2,2 9,3 Tryptophan 2,5 9,4 Serin 2,2 9,2 Threonin 2,1 9,1 ystein 1,9 10,7 8,4 Tyrosin 2,2 9,2 10,5 Asparagin 2,1 8,7 Glutamin 2,2 9,1 Asparagin- 2,0 9,9 3,9 säure Glutamin- 2,1 9,5 4,1 säure Lysin 2,2 9,1 10,5 Arginin 1,8 9,0 12,5 istidin 1,8 9,3 6,0 Tabelle 3.2: pk S -Werte der sauren und basischen Gruppen von freien Aminosäuren bei

21 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen enderson-asselbalch-gleichung nach dem logarithmischen Term auflöst und dann delogarithmiert: [R ] 7,0 = 2,0 + log [R] (3.4) In diesem Fall ergibt sich ein Verhältnis von arboxylat-anionen zu arbonsäuremolekülen von :1. Unter den normalerweise innerhalb von Zellen herrschenden Bedingungen liegen die arboxylgruppen von freien Aminosäuren also fast ausschließlich als arboxylat-anionen vor. Die α-aminogruppe einer freien Aminosäure kann als ungeladenes, freies Amin, 2 (Protonenakzeptor), oder in ihrer protonierten Form als Ammonium-Kation, 3 (Protonendonator), auftreten. Die pk S -Werte der Ammonium-Ionen der Standard-Aminosäuren variieren von 8,7 bis 10,7 (Tabelle 3.2). Bei einem p-wert von 7,0 beträgt das Verhältnis von Protonenakzeptor zu Protonendonator für eine Ammoniumgruppe, die einen pk S -Wert von 10,0 aufweist, 1:1000. Unter physiologischen Bedingungen liegen die Aminogruppen von freien Aminosäuren somit hauptsächlich als protonierte, positiv geladene Ammonium-Ionen vor. Diese Berechnungen bestätigen unsere frühere Behauptung, dass freie Aminosäuren bei neutralem p-wert vorwiegend als Zwitterionen auftreten. Sie zeigen auch die Realitätsferne der Strukturformeln von Aminosäuren, die sowohl eine -Gruppe als auch eine 2 -Gruppe zeigen. Denn bei keinem p-wert existiert eine signifikante Anzahl von Molekülen, die gleichzeitig eine neutrale, protonierte arboxylgruppe und eine neutrale, unprotonierte Aminogruppe besitzen. Beachten Sie, dass auch die sekundäre Aminogruppe von Prolin (pk S = 10,6) bei neutralem p-wert protoniert ist, auch wenn die Seitenkette zusätzlich an die Aminogruppe gebunden ist. Auch freies Prolin liegt bei einem p-wert von 7,0 somit als Zwitterion vor. Die sieben Standard-Aminosäuren mit leicht ionisierbaren Gruppen in ihren Seitenketten sind Aspartat, Glutamat, istidin, ystein, Tyrosin, Lysin und Arginin. Die Protolysegleichgewichte dieser Gruppen folgen denselben Prinzipien wie diejenigen der α-arboxyl- und α-aminogruppen. Deswegen kann die enderson- asselbalch-gleichung auch auf diese Gleichgewichte angewandt werden. Die Ionisierung der γ-arboxylgruppe von Glutamat (pk S = 4,1) ist in Abbildung 3.8a illustriert. Beachten Sie die geringere Beeinflussung der γ-arboxylgruppe durch das Ammonium-Ion, was eine Folge der größeren Entfernung im Molekül darstellt, die zu einem für eine arbonsäure typischen pk S -Wert einer schwachen Säure von 4,1 führt. Die Säurestärke der γ-arboxylgruppe ähnelt somit der Säurestärke von Essigsäure (pk S = 4,8), während die α-arboxylgruppe als eine stärkere Säure (pk S = 2,1) auftritt. Abbildung 3.8b zeigt das Protolysegleichgewicht der Guanidiniumgruppe in der Seitenkette von Arginin in stark basischer Lösung. Die Stabilisierung des Guanidinium-Ions durch die Delokalisierung der Ladung trägt zu dem hohen pk S -Wert von 12,5 bei. Wie wir bereits erwähnt haben, können sich die pk S -Werte der ionisierbaren Seitenketten von Aminosäuren in Proteinen von denen der entsprechenden freien Aminosäuren unterscheiden. Diese Abweichungen in den Ionisierungskonstanten werden hauptsächlich durch zwei Faktoren hervorgerufen. Wenn die α-arboxylund die α-aminogruppen bei der Synthese von Proteinen durch Peptidbindungen verknüpft werden, verlieren sie ihre Ladungen. Infolgedessen werden ihre induktiven Effekte auf die benachbarten Seitenketten schwächer. Außerdem kann der pk S -Wert einer ionisierbaren Seitenkette durch ihre Position innerhalb der drei- 92

22 3.5 Peptidbindungen zwischen Aminosäuren in Proteinen (a) 3 α β 2 γ 2 = 4,1 pk S 3 α β 2 γ 2 Abbildung 3.8: Ionisierung von Aminosäureseitenketten. (a) Protolysegleichgewicht der γ-arboxylgruppe von Glutamat. Die negative Ladung des arboxylat-anions ist delokalisiert. (b) Protolysegleichgewicht der Guanidiniumgruppe in der Seitenkette von Arginin. Die positive Ladung des Guanidinium-Ions ist stark delokalisiert. arbonsäure (protonierte Form) der Glutamat-Seitenkette arboxylat-ion (deprotonierte Form) der Glutamat-Seitenkette (b) pk S = 12, Guanidinium-Ion (protonierte Form) der Arginin-Seitenkette Guanidinogruppe (deprotonierte Form) der Arginin-Seitenkette dimensionalen Struktur des Proteins beeinflusst werden. Das Enzym Ribonuclease A besitzt zum Beispiel vier istidinreste, deren Seitenketten aufgrund unterschiedlicher unmittelbarer Umgebungen (Mikroumgebungen) im Protein leichte Differenzen in ihren pk S -Werten aufweisen. Peptidbindungen zwischen Aminosäuren in Proteinen 3.5 Die lineare Sequenz (Reihenfolge) der Aminosäuren in der Polypeptidkette wird die Primärstruktur eines Proteins genannt. Die Sekundärstruktur, Tertiärstruktur und Quartärstruktur sind weitere, höhere rganisationsebenen von Proteinstrukturen. Die Struktur von Proteinen wird im nächsten Kapitel näher besprochen, aber es ist an dieser Stelle für das Verständnis einiger der verbleibenden Themen in diesem Kapitel bereits notwendig, die Grundlagen von Peptidbindungen und Primärstrukturen zu erläutern. Aminosäuren können durch Amidbindungen verknüpft werden, die man bei Polypeptiden auch Peptidbindungen nennt ( Abbildung 3.9). Eine Peptidbindung kann man sich formal vorstellen als Ergebnis der Kondensation einer α-arboxylgruppe einer Aminosäure mit der α-aminogruppe einer anderen Aminosäure. Beachten Sie, dass bei der Kondensationsreaktion zwischen zwei Aminosäuren ein Wassermolekül freigesetzt wird. Wie in Abschnitt 2.6 bereits erklärt wurde, ist die ein- Die Struktur von Peptidbindungen wird in Abschnitt 4.3 genauer beschrieben. Die Proteinbiosynthese (Translation) wird in Kapitel 22 behandelt. 93

23 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen Abbildung 3.9: Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren. Die Struktur einer Peptidbindung ist formal das Ergebnis einer Kondensationsreaktion zwischen der α-arboxylgruppe einer Aminosäure und der α-aminogruppe einer anderen Aminosäure. Durch die Kondensation wird ein Dipeptid gebildet, in dem die Aminosäuren über die Peptidbindung verknüpft sind. In dem hier gezeigten Beispiel kondensiert Alanin mit Serin zu Alanylserin. -Terminus Terminus Peptidbindung fache Kondensationsreaktion in wässriger Lösung wegen des riesigen Überschusses von Wassermolekülen sehr stark benachteiligt. Der tatsächliche Reaktionsweg in der Proteinbiosynthese überwindet beziehungsweise umgeht diese Einschränkung. Im Gegensatz zu den α-arboxyl- und α-aminogruppen von freien Aminosäuren in wässriger Lösung tragen die in Peptidbindungen eingebundenen arboxyl- und Aminogruppen der Aminosäuren in Proteinen keine Ladungen. Die in einer Polypeptidkette verknüpften Aminosäuren werden Aminosäurereste genannt. Bei der Benennung von ligo- oder Polypeptiden werden die amen der einzelnen Reste durch den Ersatz der Endungen -in, -an und -at gegen die Endung -yl gebildet. Ein Glycinrest erhält im amen eines Polypeptids zum Beispiel die Bezeichnung Glycyl- und ein Glutamatrest wird durch den amensbestandteil Glutamylvertreten. Bei Asparagin, Glutamin und ystein bleibt die Silbe in erhalten und die Endung -yl wird am Ende hinzugefügt, woraus sich die amensbestandteile Asparaginyl-, Glutaminyl- und ysteinyl- ergeben. Die Endung -yl deutet an, dass der Rest eine Acyleinheit darstellt, also einen arbonsäurerest, bei dem der ydroxylanteil der arboxylgruppe durch eine andere Gruppe substituiert wurde. Das Dipeptid in Abbildung 3.9 heißt Alanylserin, weil der Alaninrest als Acylgruppe vorliegt, während der Serinrest am Ende der Kette seine arboxyl- beziehungsweise arboxylatgruppe behält. Die freie Aminogruppe und die freie arboxylgruppe an den entgegengesetzten Enden einer Polypeptidkette werden -Terminus (Amino-Terminus) und -Terminus (arboxyl-terminus) genannt. Bei neutralem p-wert trägt jeder Terminus eine Ionenladung. Konventionsgemäß werden die Aminosäurereste in einer Polypeptidkette vom -Terminus zum -Terminus durchnummeriert und in der Regel von links nach rechts hintereinandergeschrieben. Diese Übereinkunft spiegelt die Richtung der Proteinbiosynthese wider (Abschnitt 22.6). Die Synthese beginnt mit der -terminalen Aminosäure, bei der es sich fast immer um Methionin handelt (Abschnitt 22.5), und wird sequenziell in Richtung des -Terminus durch Addition einer Aminosäure nach der anderen fortgesetzt. Zur Beschreibung der Sequenzen von Aminosäureresten in Peptiden und Polypeptiden können sowohl die Drei-Buchstaben-odes der Aminosäuren (zum Beispiel Gly-Arg-Phe-Ala-Lys) als auch die Ein-Buchstaben-odes (zum Beispiel GRFAK) verwendet werden. Es ist wichtig, beide odesysteme zu kennen. Die Begriffe Dipeptid, Tripeptid, ligopeptid und Polypeptid beschreiben Peptidketten mit zwei, drei, mehreren (bis zu ca. 20) beziehungsweise vielen (in der Regel mehr als 20) Aminosäureresten. Ein Dipeptid enthält eine, ein Tripeptid zwei Peptidbindungen usw. Im Allgemeinen besitzt jede Peptidkette, egal wie lang sie ist, eine freie α-amino- 94

24 3.6 Techniken der Proteinreinigung gruppe und eine freie α-arboxylgruppe. Ausnahmen von dieser Regel bilden Ketten mit kovalent modifizierten, terminalen Resten sowie cyclische Peptidketten. Beachten Sie, dass durch die Bildung von Peptidbindungen die ionisierbaren α-aminound α-arboxylgruppen, die in freien Aminosäuren vorkommen, ihre Ionisierbarkeit verlieren. Die meisten Ionenladungen, die ein Protein trägt, werden durch die Seitenketten der Aminosäuren beigesteuert. Folglich werden die Löslichkeit und die ionischen Eigenschaften eines Proteins weitgehend durch seine Aminosäurenzusammensetzung bestimmt. Außerdem wechselwirken die Seitenketten der Aminosäurereste miteinander und tragen damit zur dreidimensionalen Gestalt und zur Stabilität eines Proteins bei (Kapitel 4). Einige Peptide sind wichtige biologische Verbindungen und die hemie von Peptiden stellt ein aktives Forschungsgebiet dar. Manche ormone sind Peptide. Endorphine sind zum Beispiel natürlich vorkommende Moleküle, die als Schmerzmodulatoren in Wirbeltieren wirken. Einige sehr einfache Peptide werden als ahrungsmittelzusätze verwendet. Der Süßstoff Aspartam ist zum Beispiel der Methylester von Aspartylphenylalanin ( Abbildung 3.10). Aspartam ist ca. 200-mal süßer als normaler Tafelzucker und wird verbreitet Diätgetränken zugesetzt. Viele Peptide, wie sie zum Beispiel in Schlangengiften und giftigen Pilzen gefunden werden, stellen hochpotente Toxine dar Abbildung 3.10: Aspartam (Aspartylphenylalaninmethylester). Techniken der Proteinreinigung 3.6 Um ein bestimmtes Protein im Labor zu untersuchen, muss man es in der Regel von allen anderen Zellkomponenten abtrennen, einschließlich anderer, ähnlicher Proteine. ur wenige analytische Techniken können direkt auf die Rohmischung zellulärer Proteine angewandt werden, weil diese hunderte (oder sogar tausende) von verschiedenen Proteinen enthält. Die zur Reinigung erforderlichen Schritte sind für jedes Protein unterschiedlich. Sie werden durch Ausprobieren einer Anzahl von verschiedenen Techniken ausgearbeitet, bis eine Prozedur entwickelt werden kann, die reproduzierbar hohe Ausbeuten des aufgereinigten und biologisch aktiven Proteins liefert. Die Reinigungsschritte nutzen in der Regel kleine Unterschiede in den Löslichkeiten, den ettoladungen, den Größen und den Bindungsspezifitäten der verschiedenen Proteine. In diesem Abschnitt betrachten wir einige der gebräuchlichsten Methoden der Proteinreinigung. Die meisten Reinigungstechniken werden zwischen 0 und 4 durchgeführt, um störende, temperaturabhängige Prozesse, wie den Abbau und die Denaturierung (Entfaltung) der Proteine, während der Reinigung zu minimieren. Der erste Schritt bei der Proteinreinigung besteht in der erstellung einer Proteinlösung. Die Quelle dafür sind häufig ganze Zellen, in denen der Anteil des Zielproteins an der Trockenmasse der Zelle normalerweise weniger als 0,1 Prozent beträgt. Für die Isolierung eines intrazellulären Proteins ist es erforderlich, die Zellen in einer Pufferlösung zu suspendieren und zu homogenisieren beziehungsweise in Zellfragmente zu zerschlagen. Unter diesen Bedingungen bleiben die meisten cytosolischen Proteine gelöst. Dies gilt für viele Membranproteine nicht, weil sie aufgrund ihrer Einbettung in eine hydrophobe Membran eine überwiegend hydrophobe berfläche aufweisen und deswegen nicht wasserlöslich sind. Zur Aufreinigung solcher Proteine sind spezielle Reinigungstechniken erforderlich. Lassen Sie uns im Folgen- 95

25 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen den aber annehmen, das gewünschte Protein sei eines der in der wässrigen Pufferlösung gelösten Proteine. Der nächste Schritt der Proteinreinigung ist häufig eine relativ grobe Trennung oder Fraktionierung, die die unterschiedlich guten Löslichkeiten der Proteine in Salzlösungen ausnutzt. Für solche Fraktionierungen wird oft Ammoniumsulfat eingesetzt. Zu diesem Zweck wird zunächst gerade so viel Ammoniumsulfat zur Proteinlösung gegeben, dass die schlecht wasserlöslichen Verunreinigungen ausgefällt werden. Diese werden dann durch Zentrifugation entfernt. Das Zielprotein und andere, besser lösliche Proteine verbleiben dabei in der Lösung, die man Überstand nennt. Anschließend wird mehr Ammoniumsulfat zum Überstand hinzugefügt, bis sich ein iederschlag des gewünschten Proteins bildet. Die Mischung wird erneut zentrifugiert, aber diesmal wird die überstehende Flüssigkeit entfernt und der iederschlag in einer möglichst kleinen Menge einer geeigneten Pufferlösung wieder gelöst. Typischerweise kann durch die Fraktionierung mit der ilfe von Ammoniumsulfat eine zwei- bis dreifache Aufreinigung erreicht werden. Das bedeutet: Die älfte bis zwei Drittel der unerwünschten Proteine konnten aus der resultierenden aufkonzentrierten Proteinfraktion entfernt werden. An diesem Punkt wird nun die Pufferlösung, welche das Zielprotein und niedermolekulare Verunreinigungen, wie Reste des Ammoniumsulfats, enthält, durch Dialyse gegen eine Pufferlösung ausgetauscht, die für die folgende hromatographie geeignet ist. Zur Dialyse wird die Proteinlösung in einen auf einer Seite verschlossenen ellophanschlauch gegeben. Im Anschluss wird auch das andere Ende des Dialyseschlauchs verschlossen und der Schlauch wird in ein großes Volumen einer Pufferlösung gehängt. Die ellophanmembran ist semipermeabel, so dass Proteine aufgrund ihrer hohen Molekülmasse nicht durch die Poren der Membran wandern können und somit im Inneren des Dialyseschlauchs verbleiben. Gleichzeitig diffundieren die gelösten Substanzen mit einer niedrigen Molekülmasse, in diesem Fall also auch die Ammonium- und Sulfat-Ionen, heraus und werden durch die gelösten Substanzen des Puffers ersetzt (Konzentrationsausgleich bezüglich aller gelösten Substanzen, die durch die Membran wandern können, auf beiden Seiten; Abschnitt 2.3.3). Die Proteinmischung, die man durch die Ammoniumsulfatfällung und die anschließende Dialyse erhält, kann nun mithilfe der Säulenchromatographie weiter aufgetrennt werden. Dazu wird eine zylinderförmige Säule mit einem unlöslichen Material, wie zum Beispiel mit substituierten ellulosefasern oder einem synthetischen Säulenmaterial, dicht gefüllt und mit Puffer gespült. Die Proteinmischung wird dann oben auf das Säulenmaterial aufgetragen. ach dem Öffnen des ahns am unteren Ende der Säule wird das Proteingemisch durch die Matrix des unlöslichen Säulenmaterials getrieben. Dies geschieht mithilfe der Schwerkraft und der kontinuierlichen, von oben erfolgenden Zugabe von Lösungsmittel, das in diesem Fall auch Laufmittel genannt wird. Solange Laufmittel durch die Säule fließt, wird das Eluat (die Lösung, die unten aus der Säule herausläuft) auf Fraktionen aufgeteilt, von denen einige in Abbildung 3.11a dargestellt sind. Die Geschwindigkeit, mit der die Proteine durch die Matrix wandern, hängt von den für jedes Protein unterschiedlichen Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und der Matrix ab. Die verschiedenen Proteine werden also mit ungleichen Geschwindigkeiten beziehungsweise nach unterschiedlichen Zeiten eluiert und befinden sich daher in getrennten Fraktionen. Um den Verlauf der chromatographischen Trennung während der Prozedur zu verfolgen, kann die Proteinkonzentration im Eluat durch Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280nm näherungsweise bestimmt werden (Abbil- 96

26 3.6 Techniken der Proteinreinigung (a) Proteinmischung (b) kontinuierlicher Fluss eines Elutionsmittels sequenziell gesammelte Fraktionen Abbildung 3.11: Säulenchromatographie. (a) Eine Proteinmischung wird oben auf eine Säule, die mit einer festen Matrix dicht gepackt ist, aufgetragen. Anschließend fließt das Laufmittel aus einem Vorratsbehälter kontinuierlich durch die Säule. Durch das Laufmittel und die Schwerkraft angetrieben, wandern die verschiedenen Proteine (dargestellt als blaue und orangefarbene Banden) mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten, die von den Wechselwirkungen der jeweiligen Proteine mit der festen Matrix abhängen, durch die Säule. Das Eluat wird in einer Reihe von Fraktionen, von denen nur einige gezeigt sind, getrennt aufgefangen. (b) Der Proteingehalt in den einzelnen Fraktionen wird während der hromatographie durch Messung der Extinktion bei 280nm näherungsweise bestimmt. Die Signale entsprechen der Elution der in (a) gezeigten Proteinbanden. Die Fraktionen werden schließlich auf die Anwesenheit des Zielproteins getestet. A 280 Fraktionsnummer dung 3.11b). Wie in Abschnitt bereits erwähnt wurde, absorbieren Tyrosin und Tryptophan bei einem neutralen p-wert UV-Licht mit einer Wellenlänge von 280 nm. Um das gewünschte Zielprotein zu lokalisieren, müssen schließlich die biologischen Aktivitäten oder andere charakteristische Eigenschaften der proteinhaltigen Fraktionen untersucht werden. Die Säulenchromatographie ist technisch zur sehr leistungsfähigen so genannten PL (engl. high-performance liquid chromatography) weiterentwickelt worden. Bei der PL wird das Laufmittel heute in der Regel computergesteuert unter hohem Druck durch eine kleine, dicht gepackte Säule mit einem Metallmantel und einem sehr feinkörnigen Matrixmaterial gepumpt. Die hohe Trennleistung ergibt sich dabei hauptsächlich aus der großen berfläche des Matrixmaterials, die mit den zu trennenden Probemolekülen in Wechselwirkung treten kann. hromatographische Techniken werden bezüglich der Struktur und Funktion der verwendeten Matrix klassifiziert. Bei der Ionenaustausch-hromatographie trägt die Matrix positive (Anionenaustauscher-arz) oder negative (Kationenaustauscher-arz) Ladungen. Ein Anionenaustauscher bindet negativ geladene Proteine und hält sie bis zur nachfolgenden Elution zurück. Im Gegensatz dazu binden Kationenaustauscher positiv geladene Proteine. Die gebundenen Proteine können anschließend durch allmähliche Steigerung der Salzkonzentration des Laufmittels nach und nach eluiert werden. Im Verlauf des Konzentrationsgradienten des Salzes im Laufmittel wird irgendwann eine ausreichend große Salzkonzentration erreicht, um einen Austausch der Proteine an den Bindungsstellen der Matrix gegen die Ionen des Salzes zu bewirken. Das abgelöste Protein wird eluiert und aufgefangen. Die Trennung beruht darauf, dass die verschiedenen gebundenen Proteine bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen eluiert werden. Wegen des guten Trenneffektes ist die Ionenaustausch-hromatographie ein wirksames Werkzeug zur Proteinreinigung. 97

27 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen Bei der Gelfiltrations-hromatographie werden Proteine auf der Grundlage ihrer molekularen Größe getrennt. Das Gel ist eine Matrix aus porösen Kügelchen. Proteine, die kleiner sind als der durchschnittliche Porendurchmesser, dringen leicht und häufig in das Innere der Kügelchen ein und werden auf diese Weise durch die Matrix aufgehalten, während die Pufferlösung durch die Säule fließt. Für größere Proteine sind entsprechend weniger Poren zugänglich. Infolgedessen wandern die größten Proteine praktisch ungebremst zwischen den Kügelchen hindurch und werden zuerst eluiert. Die Affinitätschromatographie ist die selektivste Art der Säulenchromatographie. Sie beruht auf spezifischen, bindenden Wechselwirkungen zwischen dem Zielprotein und einem anderen Molekül, das kovalent an die Matrix der Säule gebunden ist. Das an die Matrix gebundene Molekül kann ein kleiner Ligand sein, der auch in vivo an das Protein bindet, oder ein Antikörper, der das Zielprotein spezifisch erkennt, oder ein anderes Protein, das mit dem Zielprotein innerhalb der Zelle bekanntermaßen in spezifische Wechselwirkung tritt. Wenn eine Proteinmischung durch eine solche Säule wandert, wird nur das Zielprotein spezifisch an die Matrix gebunden. Die Säule wird dann mehrmals mit Pufferlösung gewaschen, um nichtspezifisch gebundene Proteine auszuspülen. Schließlich kann das Zielprotein mit einer hochkonzentrierten Salzlösung, die die bindenden Wechselwirkungen zwischen dem Protein und der Säulenmatrix aufhebt, eluiert werden. In manchen Fällen kann das Zielprotein auch von der Affinitätsmatrix abgelöst werden, indem man dem Elutionspuffer einen Überschuss des ungebundenen Liganden hinzufügt. Dann bindet das Protein bevorzugt an den in hoher Konzentration gelösten Liganden im Elutionspuffer statt an den niedriger konzentrierten, matrixgebundenen Liganden. Diese Methode ist am effektivsten, wenn der Ligand ein kleines Molekül ist. Mit der Affinitätschromatographie allein kann ein Protein um den Faktor 1000 bis aufgereinigt werden. Analysetechniken 3.7 Die Elektrophorese dient zur Trennung von Proteinen auf der Grundlage ihrer Wanderung in einem elektrischen Feld. Bei der Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) werden die Proteinproben auf eine hochvernetzte Gelmatrix aus Polyacrylamid gegeben, an die anschließend ein elektrisches Feld gelegt wird. Die Matrix wird durch Pufferung auf einen schwach alkalischen p-wert eingestellt, so dass die meisten Proteine in anionischer Form vorliegen und zur Anode wandern. Typischerweise werden mehrere Proben parallel zusammen mit einer Referenzprobe analysiert. Die Gelmatrix bremst die durch das elektrische Feld erzwungene Wanderung der Proteine in Abhängigkeit von ihrer Größe. Dabei werden im Gegensatz zur Gelfiltration die größeren Moleküle stärker zurückgehalten. Im Endeffekt werden die Proteine bei der PAGE also sowohl auf der Basis ihrer Ladung als auch ihrer Größe beziehungsweise Masse getrennt. Eine Modifikation der Elektrophoresetechnik verwendet die negativ geladenen Anionen des Detergens atriumdodecylsulfat (SDS, engl. sodium dodecyl sulfate, Abbildung 2.8), um die natürliche Ladung der Proteine zu maskieren, so dass die Trennung nur noch aufgrund der Masse der Proteine erfolgt. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wird eingesetzt, um die Reinheit eines Proteins und sein Molekülgewicht abzuschätzen. Bei der SDS-PAGE wird das Detergens sowohl dem Polyacrylamidgel als auch den Proteinproben hinzugefügt. Zu 98

28 3.7 Analysetechniken (a) Puffer SDS-behandelte Proben in den Taschen des Gels SDS-Polyacrylamidgel zwischen Glasplatten (b) Puffer Probenspuren Energieversorgung Abbildung 3.12: SDS-PAGE. (a) Eine Elektrophoreseapparatur umfasst ein SDS-Polyacrylamidgel zwischen zwei Glasplatten und eine Pufferlösung in einem oberen und einem unteren Vorratsbehälter. Die Proteinproben werden in die Taschen des Gels gefüllt und anschließend wird eine elektrische Spannung angelegt. Da die mit SDS komplexierten Proteine negativ geladen sind, wandern sie zur Anode. (b) Das Bandenmuster einer Proteinprobe kann nach der Elektrophorese durch Anfärben sichtbar gemacht werden. Da die kleinsten Proteine am schnellsten wandern, befinden sich die Banden der Proteine mit der geringsten Molekülmasse nach der Elektrophorese am Fuße des Gels (unten). Wanderungsrichtung sinkende Molekülmasse angefärbtes Polyacrylamidgel den Proteinproben wird außerdem ein Reduktionsmittel gegeben, um alle Disulfidbindungen zu reduzieren. Das Dodecylsulfat-Anion ( 3 ( 2 ) 11 S 3 ; Abbildung 2.8), das einen langen hydrophoben Schwanz aufweist, bindet an die hydrophoben Seitenketten von Aminosäureresten in der Polypeptidkette. Die Bindung von SDS an ein typisches Protein erfolgt etwa in einem Verhältnis von einem SDS- Anion (Dodecylsulfat-Anion) pro zwei Aminosäurereste. Da größere Proteine entsprechend mehr SDS-Anionen binden als kleinere, ist das Ladungs-Masse-Verhältnis für alle behandelten Proteine annähernd gleich. Alle SDS-Protein-Komplexe sind stark negativ geladen und wandern zur Anode, wie in Abbildung 3.12a illustriert. Dabei ist ihre Wanderungsgeschwindigkeit durch das Gel umgekehrt proportional zum Logarithmus ihrer Masse, da größere Proteine durch die netzartige Struktur des Gels einen größeren Widerstand überwinden müssen und deswegen langsamer wandern als die SDS-Komplexe kleinerer Proteine. Dieser Siebeffekt unterscheidet sich von der Gelfiltrations-hromatographie, da bei der Gelfiltration größere Moleküle vom Zugang zu den zu kleinen Poren ausgeschlossen sind und somit schneller wandern als kleinere Proteine. Bei der SDS-PAGE müssen alle Proteinmoleküle die Poren beziehungsweise Siebmaschen des Gels durchdringen, so dass die größten Proteine am langsamsten wandern. Die Proteinbanden, die durch diese unterschiedlich schnellen Wanderungen der verschiedenen Proteine entstehen, können durch Anfärben sichtbar gemacht werden (Abbildung 3.12b und Abbildung 3.13). Die Molekülmasse eines unbekannten Proteins kann durch den Vergleich seiner Wanderungsgeschwindigkeit mit derjenigen eines Referenzproteins auf demselben Gel annäherungsweise bestimmt werden. bwohl die SDS-PAGE hauptsächlich als analytisches Werkzeug zum Einsatz kommt, kann die Technik auch für die Reinigung von Proteinen angepasst werden. Die denaturierten Proteine können bei der SDS-PAGE durch Ausschneiden der Banden wiedergewonnen werden. Das jeweilige Protein wird durch Elektroelution, bei der das Protein infolge eines elektrischen Feldes in eine Pufferlösung hinein- Myosin -Galactosidase Rinder-Serumalbumin valbumin arboanhydrase Sojabohnen-Trypsin- Inhibitor Lysozym Aprotinin Abbildung 3.13: Angefärbte Proteine, die auf einem SDS-Polyacrylamidgel durch Elektrophorese getrennt wurden. 99

29 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen wandert, aus dem ausgeschnittenen Gel extrahiert. ach der Konzentrierung und der Entfernung von Salzen kann ein solches Proteinpräparat für strukturelle Analysen, für die erstellung von Antikörpern oder andere Zwecke verwendet werden. Wie der ame bereits andeutet, handelt es sich bei der Massenspektrometrie um eine Technik, mit der unter anderem die Massen von Molekülen bestimmt werden können. Im einfachsten Typ eines Massenspektrometers wird die Zeit gemessen, die ein geladenes Gasphasen-Molekül benötigt, um eine definierte Wegstrecke bis zu einem Detektor nach einer definierten Beschleunigung in einem elektrischen Feld im Vakuum zu durchfliegen (Flugzeitanalysator oder TF-Analysator; engl. time-offlight analysator). Die Flugzeit hängt von der Ladung und von der Masse des Moleküls ab. Deswegen wird als Ergebnis das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) dokumentiert. Diese Technik wird in der hemie bereits seit fast einhundert Jahren eingesetzt, aber ihre Anwendung auf Proteine war bis vor kurzer Zeit nur sehr eingeschränkt realisierbar, weil es nicht möglich war, geladene Proteinmoleküle in einen gasförmigen Partikelstrom im Vakuum zu überführen. Dieses Problem wurde in den späten 1980er-Jahren mit der Entwicklung zweier neuer Typen von Massenspektrometern gelöst. Bei der Elektrospray-Massenspektrometrie wird die Proteinlösung durch eine feine Kapillare in ein Vakuum gepumpt. Zwischen der Spitze der Kapillare und einer Gegenelektrode liegt dabei eine hohe Spannung an. Die winzigen Tröpfchen, die ins Vakuum eingespritzt werden, verdampfen sofort und setzen gasförmige, durch die Spannung an der Spitze der Kapillare ionisierte, geladene Proteine in die Gasphase frei. Diese geladenen Proteine werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und ihre Masse wird auf der Grundlage der Ablenkung ihrer Flugbahn in einem definierten Magnetfeld analysiert. Die zweite neue Technik ist die so genannte Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization (MALDI). Bei dieser Technik wird das Protein mit einer chemischen Matrix gemischt und diese proteinhaltige Matrix wird auf einen Metallträger aufgebracht. Die Matrix besteht aus kleinen, sauren, organischen Molekülen, die Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren, die in der Regel im UV-Bereich liegt. Die Proteine werden infolge einer Protonierung durch die sauren Matrixmoleküle ionisiert. Im Vakuum des Massenspektrometers absorbieren nun die Matrixmoleküle das Licht von Laserpulsen, die die Absorptionswellenlänge der Matrixmoleküle aufweisen, und werden dadurch explosionsartig ins Vakuum freigesetzt. Dabei reißen sie die geladenen Proteinmoleküle aus dem Substrat mit ins Vakuum (Desorption). Die geladenen Proteine in der Gasphase werden durch ein definiertes elektrisches Feld in Richtung des Detektors beschleunigt ( Abbildung 3.14). Wenn die Masse des Proteins mit einem TF-Analysator ermittelt wird, nennt man diese Technik MALDI-TF. Die Rohdaten aus einem Massenspektrometrie-Experiment können, wie in Abbildung 3.14c gezeigt, relativ einfach sein. Bei einem einzelnen Teilchen, das genau eine positive Ladung trägt, entspricht der Zahlenwert des gemessenen Masse-Ladungs- Verhältnisses (m/z) gleichzeitig dem Zahlenwert der Masse des Teilchens. In anderen Fällen, insbesondere bei der Elektrospray-Massenspektrometrie, kann das Massenspektrum ein wesentlich komplizierteres Bild bieten. äufig treten Signale mehrerer unterschiedlich geladener Spezies im Spektrum auf, so dass die korrekte Masse des Proteins durch die Analyse einer größeren Zahl von Signalen von Molekülen mit einer Ladung von +1, +2, +3 etc. bestimmt werden muss. Das Spektrum kann regelrecht entmutigen, wenn die Proteinprobe nicht gut genug aufgereinigt wurde und deswegen noch aus einer Mischung verschiedener Proteine besteht. Glücklicherweise sind heute hochentwickelte omputerprogramme verfügbar, mit denen die Daten ana- 100

30 3.7 Analysetechniken (a) Metallträger (Abstoßungselektrode) Laser Proteine Abbildung 3.14: MALDI-TF-Massenspektrometrie. (a) Durch die Energie von Laserpulsen werden geladene Proteinmoleküle aus der Matrix ins Vakuum freigesetzt. (b) Die geladenen Proteine werden durch ein elektrisches Feld in Richtung des Detektors beschleunigt. (c) Die Flugzeit bis zum Detektor hängt von der Ladung und der Masse des Proteins ab. Matrixmoleküle (b) Laser Detektor Matrix TF-Analysator Beschleunigungselektrode (c) relative Intensität m/z lysiert und die korrekte Masse berechnet werden kann. Die Massenspektrometrie verdankt ihre derzeitige Popularität in gleichem Maß der Entwicklung dieser Software wie auch der neuen Gerätetechnik und den neuen Methoden der Probenpräparation. Die Massenspektrometrie stellt eine sehr empfindliche und äußerst genaue Analysentechnik dar. äufig kann die Masse eines Proteins bereits aus picomolaren Mengen, die von einem SDS-PAGE-Gel isoliert worden sind, erhalten werden. Die korrekte Masse kann durch die Massenspektrometrie mit einer Genauigkeit von weniger als der Masse eines einzelnen Protons bestimmt werden. 101

31 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen Abbildung 3.15: Säurekatalysierte ydrolyse eines Peptids. Durch die Behandlung mit 6 M l bei 110 über 16 bis 72 Stunden werden die Aminosäuren eines Peptids freigesetzt. 3 R 1 R 2 R M l R 1 R 2 R Aminosäurenzusammensetzung von Proteinen 3.8 PIT S p = 9,0.. Aminosäure R S R PT-Aminosäure Abbildung 3.16: Behandlung einer Aminosäure mit Phenylisothiocyanat (PIT). Die α-aminogruppe einer Aminosäure reagiert mit Phenylisothiocyanat zur entsprechenden Phenylthiocarbamoyl-Aminosäure (PT-Aminosäure). achdem ein Protein isoliert wurde, kann seine Aminosäurenzusammensetzung ermittelt werden. Zu diesem Zweck werden zunächst die Peptidbindungen des Proteins gespalten. Dies erfolgt durch eine saure ydrolyse, die typischerweise mit 6 M l durchgeführt wird ( Abbildung 3.15). Im Anschluss wird das ydrolysat (die Lösung mit dem hydrolysierten Protein) chromatographisch getrennt und die einzelnen Aminosäuren werden quantitativ analysiert. Diese Prozedur nennt man Aminosäurenanalyse. Bei einer sehr gebräuchlichen Methode zur Aminosäurenanalyse wird das Proteinhydrolysat bei einem p-wert von 9,0 mit Phenylisothiocyanat (PIT) behandelt, um die Phenylthiocarbamoyl-Aminosäurederivate (PT-Aminosäuren) zu erzeugen ( Abbildung 3.16). Die Mischung der PT-Aminosäuren wird dann mithilfe der PL getrennt. Dabei wird eine PL-Säule eingesetzt, die mit einem feinen Kieselgel gefüllt ist, an welches kurze Kohlenwasserstoffketten angeknüpft sind. Auf einer solchen Säule werden die Aminosäuren aufgrund der unterschiedlichen hydrophoben Eigenschaften ihrer Seitenketten getrennt. Jedes der PT- Aminosäurederivate wird bei der Elution detektiert und seine Konzentration wird durch Messung der Extinktion des Eluats bei 254 nm (Absorptionsmaximum des PT-Restes) bestimmt. Ein Beispiel eines Diagramms der Extinktion des Eluats in Abhängigkeit von der Zeit finden Sie in Abbildung Jedes Signal entspricht einer bestimmten PT-Aminosäure und repräsentiert damit auch eine Aminosäure, die im ursprünglichen Protein enthalten war. Da die verschiedenen PT-Amino- BZ S G TA R P Y VM IL F K Extinktion Zeit (min) Abbildung 3.17: hromatogramm aus einer PL-Trennung von PT-Aminosäuren. PT-Aminosäuren im Eluat der Säule werden durch ihre Extinktion bei 254 nm detektiert. Die Signale sind mit dem Ein-Buchstaben-ode der zugehörigen Aminosäuren gekennzeichnet. Die Buchstaben B und Z stehen für alle Aspartat- und Asparaginreste (B) beziehungsweise alle Glutamin- und Glutamatreste (Z) zusammen. (Aus: unkapiller, M.W., Strickler, J.E., Wilson, K.J ontemporary methodology for protein structure determination. Science 226: ) 102

32 3.9 Bestimmung der Aminosäuresequenz säurederivate mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten eluiert werden, kann man mithilfe des Elutionszeitpunktes durch den Vergleich mit bekannten Standards die jeweilige Aminosäure identifizieren. Die Gesamtmenge jeder Aminosäure ist proportional zur Fläche unter ihrem Signal. Mit dieser Methode der Aminosäurenanalyse können noch Proben untersucht werden, die nur etwa ein Picomol (10 12 mol) eines Proteins mit etwa 200 Aminosäureresten enthalten. Trotz ihrer ützlichkeit kann die saure ydrolyse keine vollständige Aminosäurenanalyse liefern. Die Amidbindungen in den Seitenketten von Asparagin und Glutamin werden nämlich durch die Säure ebenfalls gespalten, so dass Asparaginsäure und Glutaminsäure entstehen. Eine Unterscheidung zwischen Asparagin und Asparaginsäure sowie zwischen Glutamin und Glutaminsäure ist auf diese Weise also nicht möglich. Deswegen werden bei der Anwendung der sauren ydrolyse die gefundenen Glutamat- und Glutaminreste gemeinsam mit Glx beziehungsweise Z sowie die Asparagin- und Aspartatreste gemeinsam mit Asx beziehungsweise B gekennzeichnet. Diese Benennung wurde auch im Diagramm der Abbildung 3.17 verwendet. Weitere Einschränkungen der Anwendbarkeit der sauren ydrolyse ergeben sich aus den kleinen Verlusten von Serin, Threonin und Tyrosin. Außerdem wird die Seitenkette von Tryptophan fast vollständig zerstört. Durch die Anwendung der verschiedenen Analysetechniken ist die vollständige Aminosäurenzusammensetzung von vielen Proteinen bestimmt worden. Dabei wurden teilweise dramatische Unterschiede in der Zusammensetzung der Proteine gefunden, die das enorme Potenzial widerspiegeln, das sich aus der großen Zahl möglicher Kombinationen der 20 verschiedenen Aminosäuren ergibt. Die Aminosäurenzusammensetzung wie auch die Sequenz eines Proteins kann prinzipiell auch aus der Sequenz des zugehörigen Gens ermittelt werden. eutzutage ist es tatsächlich häufig einfacher, DA zu klonen und ihre Sequenz zu ermitteln, als ein Protein zu reinigen und zu sequenzieren. Tabelle 3.3 zeigt die durchschnittliche äufigkeit von Aminosäuren in mehr als 1000 untersuchten Proteinen, deren Sequenzen in Proteindatenbanken gespeichert sind. Danach kommen die Aminosäuren Leucin, Alanin und Glycin am häufigsten vor, gefolgt von Serin, Valin und Glutamat. Tryptophan, ystein und istidin sind dagegen die seltensten Aminosäuren in typischen Proteinen. Aminosäure äufigkeit in Proteinen (%) Stark hydrophob Ile (I) 5,2 Leu (L) 9,0 Phe (F) 3,9 Met (M) 2,4 Weniger hydrophob Ala (A) 8,3 Gly (G) 7,2 ys () 1,7 Trp (W) 1,3 Tyr (Y) 3,2 Pro (P) 5,1 Thr (T) 5,8 Ser (S) 6,9 Stark hydrophil Asn () 4,4 Gln (Q) 4,0 Sauer Asp (D) 5,3 Glu (E) 6,2 Basisch is () 2,2 Lys (K) 5,7 Arg (R) 5,7 Tabelle 3.3: Aminosäurenzusammensetzung von Proteinen. Bestimmung der Aminosäuresequenz 3.9 Die Aminosäurenanalyse liefert Informationen über die Zusammensetzung eines Proteins, aber nicht zu seiner Primärstruktur (Sequenz oder Reihenfolge der Aminosäurereste in der Peptidkette). Im Jahr 1950 entwickelte Pehr Edman eine Technik, die die Abspaltung und Identifikation jeweils nur eines Aminosäurerestes vom -Terminus eines Proteins pro Arbeitsgang ermöglicht. Bei diesem so genannten Edman-Abbau wird das Protein bei einem p-wert von 9,0 mit PIT (Phenylisothiocyanat) behandelt, das auch als Edman-Reagens bekannt ist. Erinnern Sie sich, dass PIT bei der Aminosäurenanalyse zur Behandlung freier Aminosäuren eingesetzt wird (Abbildung 3.16). Beim Edman-Abbau wird das Protein aber vorher nicht hydrolysiert. Stattdessen reagiert PIT nur mit dem freien -Terminus der Polypeptidkette zu deren Phenylthiocarbamoyl-Derivat oder PT-Peptid ( Abbildung 3.18). Durch die Behandlung des PT-Peptids mit einer wasserfreien Säure, wie zum Beispiel Trifluoressigsäure, wird selektiv die Peptidbindung zum endständigen PT-Aminosäurerest gespalten. Dabei wird das Anilinthiazoli- Pehr Edman ( ). Edman entwickelte eine Technik zur Sequenzierung von Polypeptiden. 103

33 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen Abbildung 3.18: Edman-Abbau. Der -terminale Rest einer Polypeptidkette reagiert mit Phenylisothiocyanat zum entsprechenden Phenylthiocarbamoyl-Peptid. Durch die Behandlung dieses Derivats mit wasserfreier Trifluoressigsäure (F 3 ) wird das Anilinthiazolinon-Derivat des -terminalen Aminosäurerestes gebildet. Das Anilinthiazolinon-Derivat wird extrahiert und anschließend mit wässriger Säure behandelt, wodurch eine Umlagerung zum stabilen Phenylthiohydantoin-Derivat (PT-Derivat) eingeleitet wird. Das PT-Derivat kann dann chromatographisch identifiziert werden. Die zurückbleibende Polypeptidkette, deren neuer -Terminus sich zuvor in Position 2 befand, wird nun dem nächsten Zyklus des Edman-Abbaus unterworfen. S + 2 Phenylisothiocyanat (PIT, Edman-Reagens) p = 9,0 S.. R 1 -terminale Aminosäure eines Polypeptids R 1 R 2 R 2 Phenylthiocarbamoyl-Peptid (PT-Peptid) F 3 S Anilinthiazolinon-Derivat R R 2 Polypeptidkette mit n 1 Aminosäureresten wässrige Säure Phenylthiohydantoin-Derivat (PT-Derivat) der abgespaltenen -terminalen Aminosäure S R 1 Rückkehr zu alkalischen Bedingungen für eine erneute Reaktion mit Phenylisothiocyanat im nächsten Zyklus des Edman-Abbaus Die Aminosäure wird chromatographisch identifiziert. non-derivat des -terminalen Aminosäurerestes freigesetzt. Dieses Derivat kann mit einem organischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel hlorbutan, extrahiert werden, wobei das restliche Peptid in der wässrigen Lösung verbleibt. Das instabile Anilinthiazolinon-Derivat wird anschließend durch wässrige Säure in das stabile Phenylthiohydantoin-Derivat (PT-Aminosäure) der ursprünglichen -terminalen Aminosäure umgewandelt. Die in der wässrigen Phase zurückgebliebene Polypeptidkette ist also um die -terminale Aminosäure verkürzt worden, so dass jetzt der Aminosäurerest 2 des ursprünglichen Proteins den -Terminus darstellt. Diese Polypeptidkette kann erneut bei einem p-wert von 9,0 mit PIT behandelt werden. Dieser Edman-Zyklus kann mit einer Sequencer genannten Apparatur automatisch 104

34 3.9 Bestimmung der Aminosäuresequenz (a) 2 S S 2 ystin 2 S S S 2 zwei ysteinreste + S S Abbildung 3.19: Spaltung und Blockierung von Disulfidbindungen. (a) Wenn ein Protein mit einem Überschuss von 2-Mercaptoethanol (S 2 2 ) umgesetzt wird, findet ein Disulfid-Austausch statt, bei dem jeder ystinrest zu zwei ysteinresten reduziert und 2-Mercaptoethanol zu einem Disulfid oxidiert wird.(b) Die Behandlung des reduzierten Proteins mit dem Alkylierungsmittel Iodacetat führt zur Umwandlung aller ysteinreste in oxidationsstabile S-arboxymethylcysteinreste und somit zum Schutz vor einer erneuten Bildung von Disulfidbindungen in der Anwesenheit von Sauerstoff. (b) 2.. S I 2 S I Iodacetat 2 S-arboxymethylcystein vielfach wiederholt werden. Dabei liefert jeder Zyklus eine PT-Aminosäure, die chromatographisch, in der Regel durch PL, identifiziert werden kann. Auf diese Weise erhält man schließlich die gesamte oder zumindest einen großen Teil der Sequenz (Primärstruktur) des Proteins. Wenn ein Protein einen oder mehrere ystinreste enthält, müssen die Disulfidbindungen zunächst gespalten werden, damit die zugehörigen ysteinreste während der entsprechenden Zyklen des Edman-Abbaus als PT-Aminosäuren (beziehungsweise PT-Aminosäuren) abgespalten werden können und die Aminosäure nicht über die Disulfidbindung an die Polypeptidkette gebunden bleibt. Zur Spaltung der Disulfidbindungen werden häufig Thiole eingesetzt, wie zum Beispiel 2-Mercaptoethanol. Thiole reduzieren ystinreste zu Paaren von ysteinresten ( Abbildung 3.19a). Die reaktiven Sulfhydrylgruppen der ysteinreste werden vor Beginn des Edman-Abbaus noch mithilfe eines Alkylierungsmittels, beispielsweise mit Iodacetat, behandelt. Auf diese Weise werden die oxidierbaren ysteinreste in stabile S-arboxymethylcysteinreste überführt und somit vor der erneuten Umwandlung zu ystinresten mit Disulfidbindungen in der Anwesenheit von Sauerstoff geschützt (Abbildung 3.19b). Die Ausbeute des Edman-Abbaus liegt unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen bei annähernd 100 Prozent und wenige Picomol eines Proteins genügen, um die Sequenz von 30 Resten oder mehr zu bestimmen, bevor weitere Messungen durch die steigenden Konzentrationen der Produkte, die in den vorhergehenden Zyklen nicht zurückgewonnen werden konnten, zu stark beeinträchtigt werden. Wenn ein Zyklus des Edman-Abbaus zum Beispiel mit einer Ausbeute von 98 Prozent durchgeführt werden kann, würde die Gesamtausbeute nach dem dreißigsten Zyklus (0,98) 30 = 0,55 = 55 Prozent betragen. Mit anderen Worten: ur etwa die älfte der PT-Aminosäuren, die im dreißigsten Zyklus produziert werden, würde tatsächlich von dem ursprünglich vom -Terminus dreißig Reste entfernten Aminosäurerest stammen. 105

35 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen 3 Gly Arg Phe Ala Lys Met Trp Val Br (+ 2 ) 3 Gly Arg Phe Ala Lys Trp Val + 3 S + + Br 2 Peptidylhomoserinlacton Abbildung 3.20: Spaltung eines Proteins mit Bromcyan. Bromcyan spaltet Polypeptidketten am -terminalen Ende von Methioninresten. Bei der Reaktion entstehen ein Peptidylhomoserinlacton und ein neuer -Terminus. Strategien zur Proteinsequenzierung 3.10 Die meisten Proteine enthalten zu viele Aminosäurereste, um mit Erfolg vollständig durch einen nur vom -Terminus ausgehenden Edman-Abbau sequenziert werden zu können. Deswegen werden zunächst Proteasen, das sind Enzyme, die die ydrolyse von Peptidbindungen in Proteinen katalysieren, oder bestimmte chemische Reagenzien zur selektiven Spaltung einiger Peptidbindungen des Proteins eingesetzt. Die dabei gebildeten kleineren Polypeptide werden anschließend isoliert und mithilfe des Edman-Abbaus vollständig sequenziert. Das chemische Reagens Bromcyan (Br) spaltet Polypeptide spezifisch am -terminalen Ende von Methioninresten. Das Ergebnis der Behandlung eines methioninhaltigen Polypeptids mit Bromcyan sind kleinere Polypeptide mit -terminalen omoserinlacton-resten und neuen -terminalen Aminosäureresten ( Abbildung 3.20). Da die meisten Proteine nur relativ wenige Methioninreste besitzen, führt die Behandlung mit Bromcyan in der Regel nur zu ein paar unterschiedlichen Polypeptidfragmenten. Bei der Umsetzung eines Polypeptids, das drei innere, nicht endständige Methioninreste enthält, mit Bromcyan sollten zum Beispiel vier unterschiedliche Peptidfragmente erzeugt werden. Jedes der Fragmente kann dann, ausgehend von seinem -Terminus, sequenziert werden. Viele verschiedene Proteasen stehen für die Erzeugung von Fragmenten zur Proteinsequenzierung zur Verfügung. Trypsin katalysiert zum Beispiel die spezifische Spaltung am arbonylende von Lysin- und Argininresten, die beide positiv geladene Seitenketten aufweisen ( Abbildung 3.21a). Die Staphylococcus aureus-v8-protease katalysiert dagegen die Spaltung von Peptidbindungen am arbonylende von negativ geladenen Aminosäureresten (Glutamat und Aspartat). Unter geeigneten Bedingungen (50mM Ammoniumhydrogencarbonat) spaltet sie nur Glutamyl-Peptidbindungen. hymotrypsin ist eine weniger selektive Protease, die bevorzugt die ydrolyse von Peptidbindungen am arbonylende von ungeladenen Resten mit aromatischen oder voluminösen, hydrophoben Seitenketten, wie zum Beispiel Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, katalysiert (Abbildung 3.21b). Durch eine wohlüberlegte Anwendung von Bromcyan, Trypsin, Staphylococcus aureus-v8-protease und hymotrypsin auf einzelne Proben eines großen Proteins kann man viele Peptidfragmente unterschiedlicher Größe erzeugen. Diese Fragmente werden dann getrennt und mithilfe des Edman-Abbaus sequenziert. Im abschließen- 106

36 3.10 Strategien zur Proteinsequenzierung (a) 3 Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu Val Trypsin 3 Gly Arg + 3 Ala Ser Phe Gly Asn Lys + 3 Trp Glu Val (b) 3 Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu Val hymotrypsin 3 Gly Arg Ala Ser Phe + 3 Gly Asn Lys Trp + 3 Glu Val (c) Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu Val Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu Val Abbildung 3.21: Spaltung und Sequenzierung eines ligopeptids. (a) Trypsin katalysiert die Spaltung von Peptiden am arbonylende der basischen Reste Arginin und Lysin. (b) hymotrypsin katalysiert dagegen die Spaltung von Peptiden am arbonylende von ungeladenen Resten mit aromatischen oder voluminösen, hydrophoben Seitenketten, wie zum Beispiel Phenylalanin,Tyrosin und Tryptophan. (c) Durch die Sequenzierung jedes Fragments (hervorgehoben durch die Kästen) mithilfe des Edman-Abbaus und die Aneinanderreihung von übereinstimmenden Sequenzen überlappender Fragmente kann man deren Reihenfolge und damit die Sequenz des gesamten ligopeptids ableiten. den Schritt der Sequenzbestimmung wird die Aminosäuresequenz einer großen Polypeptidkette durch die Aneinanderreihung von übereinstimmenden Sequenzen überlappender Fragmente aus den Peptidspaltungen mit den unterschiedlichen Reagenzien ermittelt. Dieser letzte Schritt wird in Abbildung 3.21c nochmals an einem Beispiel verdeutlicht. In der Schriftsprache ist es üblich, einen Aminosäurerest an einer bestimmten Position mit dem Drei-Buchstaben-ode der zugehörigen Aminosäure zu benennen, gefolgt von einem Leerzeichen und der Sequenznummer dieses speziellen Restes. Der dritte Rest des in Abbildung 3.21a gezeigten Startpeptids wird gemäß dieser omenklatur zum Beispiel als Ala 3 bezeichnet. Der Prozess der Erzeugung und Sequenzierung von Peptidfragmenten ist von besonderer Bedeutung, wenn der -Terminus des Proteins blockiert ist. Die -terminale α-aminogruppe vieler bakterieller Proteine liegt zum Beispiel formyliert vor, reagiert deshalb nicht mit dem Edman-Reagens und ist somit einem Edman- Abbau nicht zugänglich. Durch die gezielte Spaltung eines solchen Proteins mit den oben beschriebenen Reagenzien in mehrere Peptidfragmente mit unblockierten -Termini und deren anschließende Trennung kann zumindest ein Teil der inneren Sequenzabschnitte des Proteins ermittelt werden. Die kovalente Struktur von Proteinen mit Disulfidbindungen ist erst aufgeklärt, wenn auch die Positionen dieser Disulfidbindungen bekannt sind. Diese können bestimmt werden, indem man das intakte Protein fragmentiert, die Peptidfragmente isoliert und feststellt, welche Fragmente ystinreste enthalten. Allerdings kann sich diese Aufgabe als ziemlich kompliziert herausstellen, wenn das Protein mehrere Disulfidbindungen aufweist. Mithilfe der Ableitung der Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins aus der Sequenz seines Gens ( Abbildung 3.22) werden technische Einschränkungen 107

37 3 Aminosäuren und die Primärstruktur von Proteinen DA Protein A A G A G T G A A TGT Lys Ser Glu Pro Val Abbildung 3.22: DA-Sequenzabschnitt und zugehörige Proteinsequenz. Die Aminosäuresequenz eines Proteins kann prinzipiell aus der Sequenz der ucleotide im zugehörigen Gen abgeleitet werden. Dabei wird jede Aminosäure durch eine spezifische Sequenz von drei ucleotiden festgelegt. Die Buchstaben A,, G und T repräsentieren die ucleotidreste der DA. Frederick Sanger (*1918). Sanger bekam für seine Arbeiten zur Sequenzierung von Proteinen 1956 den obelpreis für hemie verliehen. Im Jahr 1980 wurde er für die Entwicklung von Methoden zur Sequenzierung von DA zum zweiten Mal mit dem obelpreis für hemie geehrt. der direkten Analysemethoden überwunden. So kann zum Beispiel auf diesem Weg nicht nur die Menge des Tryptophans bestimmt werden, sondern es ist auch möglich, zwischen Aspartat und Asparagin zu unterscheiden, weil diese Aminosäurereste durch verschiedene odons codiert werden. Trotzdem ist die direkte Sequenzierung von Proteinen immer noch von Bedeutung, da diese Methode die einzige Möglichkeit darstellt, festzustellen, ob Aminosäuren des Proteins nach vollendeter Proteinbiosynthese modifiziert oder ganz entfernt wurden. Im Jahr 1953 war Frederick Sanger der erste Wissenschaftler, der die vollständige Sequenz eines Proteins (Insulin) aufklären konnte. Für diese Arbeiten wurde er 1956 mit dem obelpreis für hemie geehrt und 24 Jahre später erhielt Sanger den zweiten obelpreis für seine Pionierarbeiten auf dem Gebiet der Sequenzierung von ucleinsäuren. eute kennen wir die Aminosäuresequenzen zehntausender verschiedener Proteine. Diese Sequenzen enthüllen nicht nur Details der Struktur einzelner Proteine, sondern sie geben den Wissenschaftlern auch die Möglichkeit, Familien verwandter Proteine zu identifizieren sowie die dreidimensionale Struktur und manchmal auch die Funktion neu entdeckter Proteine zumindest näherungsweise vorherzusagen. Bestimmung von evolutionären Beziehungen durch den Vergleich der Sequenz von Proteinen 3.11 In vielen Fällen ist das gleiche Protein aus einer Anzahl verschiedener Spezies sequenziert worden. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Sequenzen von Proteinen aus eng verwandten Spezies stark ähneln, während sich die Sequenzen von Proteinen aus nur entfernt verwandten Spezies schon etwas deutlicher unterscheiden können. Diese Unterschiede spiegeln die evolutionären Veränderungen gegenüber der Proteinsequenz eines gemeinsamen Vorfahren wider. Das Protein ytochrom c, das aus einer einzelnen Polypeptidkette von etwa 104 Aminosäuren besteht, ist ein ausgezeichnetes Beispiel für die Evolution auf molekularer Ebene. ytochrom c kommt in allen aeroben rganismen vor und seine Proteinsequenzen in nur sehr entfernt verwandten Spezies, wie zum Beispiel Säugetieren und Bakterien, sind ähnlich genug, um mit großer Sicherheit darauf schließen zu können, dass die Proteine homolog sind. Verschiedene Proteine oder Gene werden als homolog definiert, wenn sie von einem gemeinsamen Vorläuferprotein beziehungsweise Vorläufergen abstammen. Der anerkannte achweis einer omologie erfolgt auf der Grundlage von Sequenzähnlichkeiten. Der erste Schritt zur Enthüllung evolutionärer Beziehungen besteht in der direkten, parallelen Gegenüberstellung der Sequenzen des untersuchten Proteins aus verschiedenen Spezies. In Abbildung 3.23 finden Sie für ytochrom c ein Beispiel 108