AIDS bei Tieren und was der Mensch davon lernen kann

Transkript

1 AIDS bei Tieren und was der Mensch davon lernen kann Regina Hofmann-Lehmann Veterinärmedizinisches Labor, Vetsuisse-Fakultät, Universität Zürich

2 ÜBERSICHT Einleitung AIDS bei Mensch und Tier Tiermodelle Infektionen bei der Hauskatze und wilden Katzenarten Felines Immunschwächevirus (FIV) Felines Leukämievirus (FeLV) Infektionen beim Rhesusaffen Simianes Immunschwächevirus (SIV) Chimäres Simianes/humanes Immunschwächevirus (SHIV) Passive Immunisierung (Schutz vor Mutter-Kind-Übertragung) Synthese

3 HIV-1 und AIDS beim Menschen 40 Mio. Menschen mit HIV-1 / AIDS Ende Mio. Erwachsene 2,5 Mio. Kinder 3 Mio. AIDS-Tote in ,5 Mio. Erwachsene Kinder AP Keine Heilung, kein Impfstoff

4 Struktur von Retroviren (HIV-1) 100 nm Osms.otago.ac.nz Elektronenmikroskopisches Bild von HIV-1 Partikeln Erbsubstanz: RNS vereinfacht Innenproteine: Matrixproteine Kapsidproteine Nukleokapsid LTR gag pol env LTR Enzyme: Protease Reverse Transkriptase Integrase Hüllproteine: Oberflächenproteine Transmembranproteine

5 Replikation von HIV-1 Andocken Knospung Fusion CD4 Penetration Uncoating Lipid raft Corezeptor Reifung Zusammenbau Reverse Transkription RNS Genomische RNS Translation + Prozessierung Transkription DNS ds DNS Integration (Provirus) Zellkern Gespleisste mrns Zielzelle

6 Verlauf der Infektion (HIV-1) Akute Virämie Asymptomatische Phase AIDS Opportunistische Infektionen CD4 + T-Zellen (Helferzellen) Zelluläre Immunabwehr (CTL) Neutralisierende Antikörper Virusmenge Monate nach der Infektion Jahre nach der Infektion

7 Retroviren und AIDS bei Tieren Host Disease Prototype virus(es) References Mouse MAIDS Du5H LP-BM5 Aziz et al. (1989) Chattopadhyay et al. (1989) Mouse thymic atrophy ts1 Mo-MLV Wong (1990) Cat FeLV-FAIDS 61e Hoover and Mullins (1993) Cat FIV-FAIDS Petaluma Pedersen et al. (1987) Monkey (M. SRV-SAIDS SRV-1 (CPRC) Marx et al. (1984) mulatta) Monkey (M. cyclopis) SRV-SAIDS SRV-1 (NERPRC) Daniel et al. (1984) Monkey (M. nigra) SRV-SAIDS a SRV-2 (ORPRC) Marx et al. (1985) Monkey (M. mulatta) SRV-SAIDS SRV-2 (WRPRC) Stromberg et al. (1984) Monkey (M. mulatta) SRV-SAIDS SRV-3 M-PMV Fine and Schochetman (1978) Monkey SIV-SAIDS see Chapter 11 Human HIV-AIDS see Chapter 11 Katze - Felines Leukämievirus (FeLV) Katze - Felines Immunschwächevirus (FIV) Affen - Simianes Immunschwächevirus (SIV) Retroviruses. Coffin et al Cold Spring Harbor Laboratory Press

8 Bedeutung dieser Infektionen Tiermedizinische Aspekte 10% der schweizerischen Katzen sind FeLV- und/oder FIV-positiv* Todbringende Krankheiten Forschung für die Katze AIDS- und Tumorforschung Katzenmodell Rhesusaffenmodell * Gruber 2000; Hofmann-Lehmann et al. 2001

9 Infektion in der Katze: Felines Immunschwächevirus (FIV) Lentivirus (wie HIV-1) Lentivirus-Stammbaum Veterinärmedizinisches Labor, Vetsuisse-Fakultät, Universität Zürich From Goudsmit Viral Sex: the Nature of AIDS, Oxford

10 Infektion in der Katze: Felines Immunschwächevirus (FIV) Hauptübertragungsweg: Biss (Deckackt); Mutter-Kätzchen Bilder: Hans Silvester, 1995 Katzen unter südlicher Sonne

11 Infektion in der Katze: Felines Immunschwächevirus (FIV) Verlauf: Akut Grippe-ähnlich Später Abnahme der CD4 + Helferzellen Immunschwäche nach mehreren Jahren Kater Mikesch mit FIV (Bild Prof. Isenbügel) Veterinärmedizinisches Labor, Vetsuisse-Fakultät, Universität Zürich

12 FIV in wilden Katzenarten Untersuchungen bei Löwen Afrika Indien 0% Gujarat 0% 90% 90% Serengeti, Tansania Verschiebung von Tieren (Reservate, Zoos) Etosha, Namibia Krüger, Südafrika Lutz et al, 1992, 1996; Hofmann-Lehmann et al, 1996; Roelke-Parker et al, 1996; Packer et al, 1999

13 FIV in wilden Katzenarten Untersuchungen auch bei anderen wilden Katzenarten: Löwen und Geparden in Simbabwe und Botswana (G. Bay) 16 verschiedene wilde Katzenarten in Brasilien (C. Filoni, Universität Sao Paulo)

14 Experimentelle FIV- Impfstudien Subunit-Impfstoffe: Oberflächenproteine Gegen FeLV erfolgreich Nicht so erfolgreich gegen FIV DNA Impfstoff: Gen für Oberflächenprotein (gp140) Protein wird in der geimpften Katze produziert Zusätzlich Gen für Felines Interleukin-12 (Zytokin; Aktivator der zellulären Immunantwort) Lutz et al. 1995; Hofmann-Lehmann et al. 1995; Leutenegger et al. 1998, 2000; Boretti et al. 2000

15 Ziele: FIV-DNA-Impfstoff Studie Messen der Wirksamkeit der DNA-Impfstoffe Messen der induzierten Immunantwort 3 Gruppen à 4 SPF-Katzen (spezifisch pathogenfrei) Gruppe Katzen Impfantigen FIV-Testinfektion Kontrollgruppe 4 Negative Kontrolle Impfstoff 1 Impfstoff DNA kodierend für gp140 des FIV Zürich 2 DNA kodierend für gp140 des FIV Zürich 2 + felines Interleukin TCID 50 FIV Zürich 2 Boretti et al. 2000; Leutenegger et al. 2000

16 Katzenhaltung

17 Resultate FIV-DNA-Impfstudie Nachweis von FIV-Provirus-DNA und spez. Antikörpern gegen FIV im Blut (Mass für Infektion) Kontrollgruppe (Gold) Impfstoff 1 (gp140) Impfstoff 2 (gp140+il-12) Katze /8 infiziert 3/ geschützt Wochen nach Testinfektion FIV-Provirus PCR: negativ positiv Antikörpernachweis im Western Blot: FIV-p15 negativ FIV-p24 negativ FIV-p15 positiv FIV-p24 positiv

18 Resultate Zytokin Transkription Charakterisierung der Immunantwort Zytokinmessung nach 3x Impfen (Tag der Test- infektion), mrna aus Blutzellen (PBMC), RT-PCR Kontrollgruppe (Gold) Impfstoff 1 (gp140) Interleukin-4 Interleukin-10 Interferon-γ Interleukin-12 p35 Interleukin-12 p40 Humorale Immunantwort (Th2; Antikörper) Zelluläre Immunantwort (Th1) Impfstoff 2 (gp140+il-12) Relative Zytokin Transkription

19 Fazit FIV-Studie DNA-Impfstoff schützt 3 von 4 Katzen gegen die FIV-Infektion Art der Immunantwort in geimpften Katzen deutet auf Vorherrschen einer zellulären Immunantwort hin Ansatz geeignet für andere Lentivirusinfektion...?

20 Infektion in der Katze: Felines Leukämievirus (FeLV) Retrovirus (kein Lentivirus) Tödliche Infektion unserer Hauskatzen Immunschwäche (AIDS), Tumoren, Blutarmut Hauptübertragungsweg: Speichel Test für FeLV-Infektion: Bisher Antigennachweis Veterinärmedizinisches Labor, Vetsuisse-Fakultät, Universität Zürich

21 Nachweis der FeLV-Infektion Antigen-Nachweis mittels Sandwich-ELISA Antigen = p27 Innenkörperprotein S S PO PO PO PO PO S S S S S S S p27 Antigen Mikrotiterplatte 1. spezifische Antikörper gegen FeLV p27 p27 FeLV-Antigen Lutz et al., 1983 PO S Enzym (Peroxidase) gekoppelt an 2. spezifischen Antikörper gegen FeLV Substrat für Enzym

22 Ausgang der FeLV-Infektion Nicht virämisch (28%*) Vorübergehend virämisch (42%*) FeLV Latente / fokale Infektion Immun FeLV-A Antigen (p27) Nachweis: ELISA-negativ ELISA-positiv Persistierend virämisch (30%*) * in einem geschlossenen Haushalt mit vielen Katzen

23 Neuere Methode - TaqMan PCR: Provirusnachweis und Quantifizierung 1. Denaturierung (95 ) 2. Anlagerung der Sonde und Primer (62 ) 3. Polymerisation; Basen werden angelagert und Strang verlängert (72 ) 4. Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase, Reporter wird frei, dadurch wird Reporter Fluoreszenz freigesetzt 5. Zyklus beginnt von vorne exponentielle Vermehrung R = Reporterfarbstoff Q = Quencher Taq-Polymerase 5' 3' Spez. Primer R R Spez. Sonde 5' 3' Q DNS Leutenegger et al. 1999; Hofmann-Lehmann et al. 2000, ' 5'

24 Verlaufsuntersuchungen nach experimenteller FeLV-Infektion Ziel der Untersuchung: Provirusnachweis und Quantifizierung (PCR) 15 SPF Katzen Experimentelle Infektion mit FeLV Blutentnahmen Antigennachweis (p27 ELISA) Nachweis und Quantifizieren von Provirus (TaqMan PCR)

25 Resultate FeLV-p27 ELISA und Provirus TaqMan PCR Nicht oder vorübergehend virämisch (n = 5) Persistierend virämisch (n = 10) Katze p27-negativ p27-positiv PCR-negativ PCR-positiv Wochen nach experimenteller FeLV-Infektion

26 Ausgang der FeLV Infektion: Bedeutung des Provirus? Nicht virämisch (28%*) Provirus positiv Vorübergehend virämisch (42%*) Provirus positiv FeLV-A Latente / fokale Infektion Immun Provirus positiv FeLV-Antigen-negativ FeLV-Antigen-positiv Persistierend virämisch (30%*) * in einem geschlossenen Haushalt mit vielen Katzen FeLV-A

27 Natürliche FeLV-Infektion 597 schweizerische Hauskatzen untersucht auf FeLV-Antigen (p27 ELISA) FeLV-Provirus (TaqMan PCR) n = 597 Antigen positiv Antigen negativ Total Provirus positiv 41 (7%) 61 (10%) 102 (17%) Provirus negativ 0 (0%) 495 (83%) 495 (83%) Total 41 (7%) 556 (93%) Dissertation Sabine Frank-Gruber, 2000

28 Biologische Relevanz? Langzeituntersuchung einer experimentell infizierten Katze (seit 1989) FIV FeLV Klinik: Gewichtsverlust Schwäche Atemnot Regelmässige Blutentnahmen Alter der Katze (Jahre) FIV-positiv FeLV-p27 ELISA negativ FeLV-PCR-positiv FeLV-p27 ELISA positiv!

29 Resultate Langzeituntersuchung x 10 3 Zellen/ml WBC Lymphozyten Neutrophile GC CD4 + T-Zellen Alter der Katze (Jahre) FIV-Infektion (CD4 + ) Zusammenbruch des Immunsystems Reaktivierung von FeLV Sektion: Lymphosarkom Organe PCR-positiv (Provirus) Immunhistologie-positiv (p27)* In-situ Hybridisierung-positiv (gp70 und p27)* Lymphosarkom Niere (Bild: Dr. P. Ossent) * Prof. M. Reinacher, Giessen

30 Fazit FeLV-Studien FeLV-Infektion häufiger als bisher angenommen Biologische Relevanz des Provirus? Reaktivieren möglich Ist wohl nicht die Regel Katze kann FeLV-Infektion erfolgreich in Schach halten

31 Infektion im Rhesusaffen: Simianes Immunschwächevirus (SIV) SIV nahe verwandt mit HIV Studien über Infektionsvorbeugung und Infektionsverlauf Modell für Mutter-Kind HIV-1 Übertragung Bild: Dr. D. Anderson Lentivirus-Stammbaum From Goudsmit Viral Sex: the Nature of AIDS, Oxford Baba et al. 1995; Hofmann-Lehmann et al. 2001, 2002

32 Verabreichung von Plasmid-SIV-DNA SIVmac239 Provirus DNA in Plasmid 1 Jungtier (BR-2) 2 Erwachsene (458U, 270W) SIV-DNA verursacht Infektion und AIDS Log RNA Kopien/ml BR-2 458U 270W Wochen nach i.m. Verabreichung The Durban Declaration, 2000: Wissenschaftler und Mediziner bestätigen noch einmal HIV als Ursache von AIDS Liska, Hofmann-Lehmann et al. 1999; 2001

33 Simianes/humanes Immunschwächevirus (SHIV) Hüllproteine (env) von HIV-1 Anti-HIV-1 Antikörper wirksam Rest SIV Replikation in Rhesusaffen; AIDS gag vif vpx tat 1 vpu rev 2 tat 2 nef Anti-HIV-1 Antikörper LTR pol vpr env LTR rev 1 SIV HIV-1 SIV Li et al. 1995

34 Experimentelle Infektion mit SHIVvpu + in Rhesusaffen Neutral. Antikörpertiter x CD4 + Zellen (10 3 /µl) Wochen nach oraler Verabreichung neg. Log RNA Kopien / ml HIV-1 IIIB env Labor-adaptiert Resultate von Rhesusaffe 95-3 Virus resistent gegenüber neutralisierenden Antikörpern AIDS nach 5.9 Jahre Hofmann-Lehmann et al. 2002

35 Charakterisierung des aus SHIVvpu + entstandenen Virus Charakteristika Virus Infiziert neu Makrophagen Korezeptor unverändert (CXCR4) Veränderungen in env Ähnliche Virusvarianten Laborant versehentlich mit HIV-1 IIIB infiziert AIDS nach 8 Jahren Parallele Entwicklung von HIV-1 Hüllprotein-Gen in Mensch und Affe Bestätigt Bedeutung des Rhesusaffen-SHIV-Modells Modell ist gut geeignet für Untersuchungen von Infektionsverlauf und Anti-HIV- 1 Antikörper Evaluation Hofmann-Lehmann et al. 2002

36 Mutter-Kind HIV-1 Übertragung Kinder infiziert pro Tag Infektionsrate hoch in Drittweltländer Übertragung meist während der Geburt oder über Muttermilch Antiretrovirale Medikamente Nebenwirkungen Mütter in Drittweltländern schlecht erreichbar Wirksamkeit durch Übertragung via Muttermilch reduziert Resistenzbildung Neuer Ansatz? Passive Immunisierung

37 Passive Immunisierung = Verabreichung von spez. Antikörpern Rhesusaffenmodell SHIV oral verabreicht unmittelbar nach Kaiserschnitt führt zu AIDS Bild: Dr. D. Anderson Selektionierte Antikörper Neutralisierende Antikörper Von HIV-1 Subtyp B infizierten Menschen Monoklonale Antikörper Konservierte Epitope (Resistenzbildung ) In Kombination synergistisch (Resistenzbildung ) Baba et al. 1994

38 Testen der Neutralisationsaktivität der Antikörper-Kombinationen Zellkultur + Virus + Antikörper -> Hemmung der Virusvermehrung Neutralisation (%) Monoklonale Antikörper (log µg/ml) Einzelne Antikörper (mak): 2G12 2F5 IgGb12 Kombinationen: 2G12+2F5 2G12+IgGb12 2F5+IgGb12 2G12+2F5+IgGb12 2G12+2F5+F105 2G12+2F5+IgGb12+F105 Hofmann-Lehmann et al. 2001

39 In vivo Experiment: Passive Immunisierung Rhesusaffen Verabreichung der mak-kombination (i.v.) 5 Tage vor Geburt Unmittelbar nach Geburt 8 Tage später Testinfektion 1 Std. nach mak- Verabreichung am Tag der Geburt Bild: K. Van Rompay mak SHIV-vpu + oral mak mak 4 mak-behandelte Tiere 4 Kontrolltiere Tag Geburt Monat 6 Baba, Liska, Hofmann-Lehmann et al. Nat. Medicine, 2000

40 Ausgang des Experiments Kontrolltiere Zellkultur (Virus Blut) positiv PCR (Provirus Blut) positiv RT-PCR (RNA Blut) positiv PCR von Geweben positiv Infektion angegangen mak-behandelte Tiere Zellkultur (Virus Blut) negativ PCR (Provirus Blut) negativ RT-PCR (RNA Blut) negativ PCR von Geweben negativ Tiere geschützt vor Infektion durch mak- Kombination Baba, Liska, Hofmann-Lehmann et al. Nat. Medicine, 2000

41 Post-Exposure-Prophylaxe (PEP) Zuerst Virus, dann mak-verabreichung Wie bei Mutter-Kind HIV-1 Übertragung unter der Geburt Verabreichung von mak-kombination (i.v.) Am Tag der Geburt 1 Std. NACH der Testinfektion 8 Tage später SHIV-vpu + oral mak mak 2 mak-behandelte Tiere 2 Kontrolltiere Tag 0 8 Geburt Monat 6 Hofmann-Lehmann et al. 2002

42 Ausgang des Experiments Kontrolltiere infiziert Tiere geschützt vor Infektion durch mak Log RNA Kopien/ml P3 P6 P4 P5 Kontrollen mak neg Wochen nach Testinfektion Bisher: total 22 von 31 Affen vor Infektion geschützt Hofmann-Lehmann et al. 2001, 2002; Ferrantelli et al. 2003; Ruprecht et al. 2003; Safrit et al. 2004

43 HIV-1 Gruppen und Subtypen 3 grosse Gruppen M, N, O Innerhalb von M Subtypen A, B, C, etc. Antikörper gegen B The Human Immunodeficiency Viruses. Emini, 2002

44 HIV-1 Gruppen und Subtypen Nordamerika 1 Mio. Subtyp: B Europa 1.5 Mio. Subtyp: B Asien 9 Mio. Subtypen: C, E, B Dargestellt: - Gruppe M (ohne F-J, da selten) Nicht dargestellt: - Gruppen N, O Lateinamerika 1.5 Mio. Subtypen: B, C Afrika Mio. Subtypen: C, A, D, E, B Global Ende 2003 ca. 40 Mio.

45 Wirksamkeit und Sicherheit der neutralisierenden Antikörper mak Kombinationen neutralisieren: Verschiedene Subtypen (A, B, C, D, E und F) der Gruppe M Gruppe O Isolate mak haben sehr breites Potential Intramuskulär verabreicht wirksam (unpublizierte Daten Prof. Ruth Ruprecht) - Praxisrelevanz Phase I klinische Studien (Sicherheit) im Gang Bisher getestete 4 mak sind sicher für Menschen Geringe Toxizität war zu erwarten, da es sich um menschliche Antikörper handelt Zwick et al. 2001; Xu et al. 2002; Kitabwalla et al. 2003; Ferrantelli et al. 2004; Safrit et al. 2004

46 Fazit Rhesusaffen-Studien Rhesusaffenmodell Ideal für Studien über Vorbeugung und Infektionsverlauf mab-kombinationen Schützten Affen Resultate relevant für Mensch Vielversprechend gegen Mutter-Kind HIV-1 Übertragung Lange Halbwertszeit: Potential gegen Übertragung via Muttermilch Grosse Bedeutung für Drittweltländer Bild: Georges-Louis Buffon

47 Tierärztliche Aspekte Synthese AIDS bei Tieren... und was der Mensch davon lernen kann Neue Erkenntnisse -> bessere Diagnostik und besserer Schutz unserer Hauskatzen vor Retrovirusinfektionen Wilde Katzenarten Erkenntnisse dienen dem Artenschutz Retrovirologie Tiermodelle: Ermöglichen die Prinzipien der Krankheitsentstehung und spezifischen Immunantwort zu verstehen Mensch und Tier Neutralisierende Antikörper schützen gegen Retrovirusinfektionen Zelluläre Immunantwort scheint ebenfalls wichtig Kombination von humoraler und zellulärer Immunantwort ideal...?

48 VERDANKUNG Prof. Ruth Ruprecht and co-workers, Viral Pathogenesis, Dana-Farber Cancer Institute & Harvard Medical School, Boston Prof. Hans Lutz und MitarbeiterInnen Veterinärmedizinisches Labor Vetsuisse-Fakultät Universität Zürich

49 Zeit für Apéro...