Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

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1 Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.) vorgelegt von Kathrin Kopp (geb. Müller) an der Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie Konstanz, 2011

2 Tag der mündlichen Prüfung: 01. Juli Referent: Prof. Dr. Christof Hauck 2. Referentin: Prof. Dr. Iwona Adamska

3 Danksagung: An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Christof Hauck, der es mir ermöglichte meine Arbeit in seiner Gruppe anzufertigen und mich mit Rat und Ideen unterstützt hat. Ich möchte mich ganz herzlich bei Frau Prof. Dr. Iwona Adamska bedanken, die sich als Gutachterin bereit erklärt hat, sowie bei Herrn Prof. Dr. Alexander Bürkle für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes. Besonders möchte ich mich auch bei allen Kollegen meiner Arbeitsgruppe für die Unterstützung, den Spaß bei der Arbeit und das nette Arbeitsklima bedanken. Ganz besonderer Dank gilt Frau Susanne Feindler-Boeckh, für ihre tatkräftige Unterstützung und Hilfe bei großen und kleinen Nöten. Ein ebenso großes Dankeschön an Frau Anne Keller, Ruth Hohenberger-Bregger und Claudia Hentschel, für die Erledigung so vieler kleiner und großer Dinge des Laboralltags. Ganz besonders möchte ich mich bei all meinen Freunden in Nah und Fern bedanken, die mich über die gesamte Zeit meiner Promotion begleitet, motiviert und unterstützt haben und immer für mich da sind. Ich danke euch für all den Spaß und die schönen Momente sowie eure stets offenen Ohren, wenn ich euch brauchte! Schließlich möchte ich mich von ganzem Herzen bei meinen Eltern und meinem Bruder bedanken. Danke dafür, dass ihr mich all die Jahre unterstützt habt und immer für mich da seid.

4 Inhaltsverzeichnis ZUSAMMENFASSUNG EINLEITUNG Protein Arrays Proteinkopplung an Trägeroberflächen Detektion der gebundenen Probe Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Proteinkinasen Proteintyrosinkinasen Die Fokale Adhäsionskinase Die Familie der Src-Kinasen Tyrosinphosphorylierung von Proteinen SH2 Domänen wichtige Interaktionsdomänen in der zellulären Signalweiterleitung Struktur und Bindungseigenschaften von SH2 Domänen Proteinfamilien mit SH2 Domänen Die Familie der CEACAMs Strukturelle und funktionelle Eigenschaften CEACAMs als Rezeptoren für humanspezifische Bakterien Regulation der CEACAM3-vermittelten Phagozytose Zielsetzungen SH2 DOMÄNEN ARRAYS - EINE METHODE ZUR IDENTIFIZIERUNG VON PHOSPHOTYROSIN-ABHÄNGIGEN PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN Einleitung Ergebnisse Immobilisierung von rekombinanten SH2 Domänen auf einer aldehydbeschichteten Trägermatrix Blockierung und Beprobung von SH2 Domänen Arrays Detektion der an die SH2 Domänen gebundenen Phosphotyrosinproteine mittels spezifischer Antikörper Verifikation des SH2 Domänen Arrays Nachweis zytoplasmatischer Proteintyrosinkinasen Diskussion BETEILIGUNG VON PROTEINEN MIT SH2 DOMÄNEN AN CEACAM-VERMITTELTEN SIGNALWEGEN Die Phosphatidylinositol-3 -Kinase als wichtiges Signalprotein in der CEACAM3- vermittelten Phagozytose und Abtötung von human pathogenen Bakterien Einleitung Ergebnisse...76

5 Die SH2 Domänen der PI3KR3 assoziieren mit dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM Die SH2 Domänen der PI3KR3 binden phosphorylierungsabhängig an CEACAM Die Bindung Opa 52 -exprimierender Gonokokken an CEACAM3 führt zur Rekrutierung der N-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 an den Rezeptor Die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien ist unabhängig von der Aktivität der Phosphatidylinositol-3 -Kinase Die Aktivität der Phosphatidylinositol-3 -Kinase ist notwendig für die Abtötung CEACAM3-bindender pathogener Bakterien Diskussion Das Signalprotein Grb14 ist am CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess beteiligt Einleitung Ergebnisse Grb14 interagiert über seine SH2 Domäne direkt mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM Grb14 wird in humanen Granulozyten exprimiert Die Bindung von Opa 52 -exprimierenden Gonokokken an CEACAM3 führt zur Rekrutierung von Grb Grb14 ist ein Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose Diskussion Identifikation Phosphotyrosin-abhängiger Interaktionspartner für den zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM Einleitung Ergebnisse Identifikation von Interaktionspartnern für CEACAM4 mittels SH2 Domänen Array Verifikation und Konkretisierung der mittels SH2 Domänen Array identifizierten Interaktionen für CEACAM Die Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne kolokalisiert mit Bakterien-assoziierter CEACAM3/4-Chimäre Die Überexpression der Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne behindert die CEACAM3/4-vermittelte Phagozytose Diskussion SCHLUSSBETRACHTUNG Etablierung des SH2 Domänen Arrays Untersuchungen zu SH2 Domänen-abhängigen Protein-Protein Interaktionen bei granulozytischen CEACAMs EIGENABGRENZUNGEN PUBLIKATIONEN MATERIAL Bakterien...136

6 7.1.1 Neisseria gonorrhoeae-stämme Escherichia Coli-Stämme Zelllinien Nährmedien für Bakterien und Zellkultur Flüssigmedien und Agarplatten für Bakterien Medien für Zellkultur Plasmide und Oligonukleotide Plasmide Oligonukleotide Antikörper, Enzyme und Proteine Antikörper Enzyme und Proteine Lösungen und Puffer Lösungen und Puffer für eukaryotische Zellen Lösungen und Puffer für molekularbiologische Methoden Lösungen und Puffer für biochemische Methoden Puffer und Lösungen für SDS-PAGE, Coomassiefärbung, Western Blot und Protein Array Lösungen und Puffer für die Proteinexpression und aufreinigung von GST-Fusionsproteinen Chemikalien und Kits Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien Software METHODEN Molekularbiologische Methoden Präparation von Plasmid-DNA (nach Birnboim-Doley) Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) In-Fusion Reaktion Cre-Lox-site spezifische Rekombination Restriktionsverdau Ligation Agarosegelelektrophorese Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Präparation von RNA Reverse Transkription Biochemische Methoden SDS-Gelelektrophorese Coomassie-Färbung von Polyacrylamid-Gelen Western Blot Immundetektion von Proteinen Strippen von PVDF-Membranen Peptid-Bindeexperiment...151

7 8.2.5 Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Bakterien Expression rekombinanter Proteine Reinigung von GST-Fusionsproteinen Analyse von Protein Interaktionen mittels ELISA Pull down Experimente mittels GST-Fusionsproteinen Phosphorylierung von Proteinen in vitro Herstellung und Beprobung von Protein Arrays Zellbiologische Methoden Transfektion von Zellen mittels Calcium-Phosphat-Kopräzipitation Herstellung von Zelllysaten FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) Rezeptorfärbung für FACS Herstellung stabiler shrna-zelllinien Klonierung von shrna in den lentiviralen Vektor plko Produktion lentiviraler Partikel Transduktion von Zellen mit lentiviralen Partikeln Infektionsexperimente Kultivierung von Neisserien Beschichten von Platten für den Gentamicin-Protektions Assay Gentamicin-Protektions Assay Markierung von Bakterien mit Fluoreszenzfarbstoffen Beschichten von Deckgläsern für Konfokalmikroskopie Herstellung von Präparaten für Konfokalmikroskopie FACS-Invasionsassay Aufreinigung von Granulozyten aus humanem Blut Bakterien-Degradations Assay Quantifizierung der Phagozytoserate von humanen Granulozyten Messung der Entstehung reaktiver Sauerstoffderivate (Oxidative Burst Messung) in humanen Granulozyten ABKÜRZUNGEN LITERATURVERZEICHNIS...167

8 Zusammenfassung Zusammenfassung Zur Klärung verschiedenster biologischer Fragestellungen haben Biochips seit nunmehr 20 Jahren einen festen Platz in der Wissenschaft. Die Verwendung von DNA Arrays zur Erstellung von Genexpressionsprofilen im Hochdurchsatzverfahren ist zu einem festen Bestandteil der molekularbiologischen Forschung geworden. Im Gegensatz dazu kann die Untersuchung von Proteinen hinsichtlich ihrer Einbindung in zelluläre Signalnetzwerke bisher nur minimal in parallelen Ansätzen durchgeführt werden. Protein Arrays bieten eine gute Möglichkeit, um auch diese Untersuchungen in großem Maßstab durchführen zu können und somit Einblicke in die Beteiligung einzelner Proteine an verschiedenen Signalwegen zu bekommen. So stellen beispielsweise Protein Arrays mit immobilisierten SH2 Domänen als Affinitätsmatrix eine sehr gute Möglichkeit dar, um Proteine in kürzester Zeit auf Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen mit allen im menschlichen Genom kodierten SH2 Domänen zu untersuchen. Mit der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für eine solche globale Protein-Protein Interaktionsanalyse gelegt. Etwa zwei Dutzend humane SH2 Domänen wurden rekombinant als GST-Fusionsproteine exprimiert, aufgereinigt und auf einer Trägeroberfläche immobilisiert. Durch Verwendung von Aldehydoberflächen als Trägermatrix wurde eine robuste, da kovalente, Bindung der Proteine an die Oberfläche erreicht. Die nicht durch SH2 Domänen abgesättigten Aldehydgruppen der Oberfläche wurden mittels Natriumborhydrid (NaBH 4 ) reduziert, wodurch die unspezifische Bindung von Proteinen der Beprobungslösung effektiv verhindert wurde. Ebenso erfolgreich war auch die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit Ganzzelllysaten und die anschließende Detektion der gebundenen Phosphotyrosinproteine durch spezifische Antiköper. Die erfolgreiche Verwendung unterschiedlicher Antikörper zur Detektion zeigt die breite Anwendbarkeit des SH2 Domänen Arrays zur Untersuchung verschiedenster Proteine und Proteingruppen. In diesem Zusammenhang konnten Membranproteine wie CEACAM3 und CEACAM4, die zytoplasmatisch lokalisierende Fokale Adhäsionskinase (FAK) sowie die Gesamtheit der tyrosinphosphorylierten Proteine einer Zelllinie hinsichtlich ihrer Bindefähigkeit an unterschiedliche SH2 Domänen untersucht werden. Im Zuge der Etablierung des SH2 Domänen Arrays konnten sowohl bereits bekannte als auch bisher unbekannte Interaktionspartner für den phagozytischen Rezeptor CEACAM3 identifiziert werden. Die nähere Analyse der neu identifizierten Interaktionspartner, Grb14 7

9 Zusammenfassung und Phosphatidylinositol-3 -Kinase (PI3K), gaben Einblicke in die Beteiligung dieser Proteine an CEACAM3-vermittelten Signalwegen und bestätigten somit die physiologische Relevanz dieser Interaktionen. So konnte das Signalprotein Grb14 als Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose identifiziert werden, während die PI3K für die Abtötung der internalisierten Pathogene von essentieller Bedeutung ist. Durch die Anwendung des SH2 Domänen Arrays zur Interaktionspartnersuche für CEACAM4, den evolutionären Vorläufer von CEACAM3, konnten sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschiede im Bindungsverhalten dieser Proteine an verschiedene SH2 Domänen ermittelt werden. Genau wie für CEACAM3 konnten auch für CEACAM4 phosphorylierungsabhängige Assoziationen mit den SH2 Domänen der Src-Kinase Yes, dem Adapterprotein Nck2 und der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K festgestellt werden. Da für CEACAM4 kein natürlicher Ligand bekannt ist, wurden erste funktionelle Untersuchungen nicht mit CEACAM4 selbst, sondern unter Einsatz eines chimären Proteins, durchgeführt. Diese Chimäre bestand aus der Opa CEA -bindenden N-terminalen Domäne des phagozytischen Rezeptors CEACAM3 und dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 und ermöglichte die Beobachtung der Lokalisation sowie Untersuchung der Funktion der neu identifizierten Interaktionspartner im Infektionsverlauf. Neben diesen Gemeinsamkeiten wurden allerdings auch interessante Unterschiede zwischen CEACAM3 und CEACAM4 festgestellt. So konnte weder für den neu identifizierten Negativregulator, der CEACAM3- vermittelten Phagozytose, Grb14 noch für den, für die Phagozytose über CEACAM3 essentiellen, Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav eine phosphorylierungsabhängige Assoziation mit CEACAM4 gefunden werden. Diese Befunde deuten trotz enger Verwandtschaft beider Rezeptoren auf abweichende Signalwege hin. 8

10 Einleitung Protein Arrays 1 Einleitung 1.1 Protein Arrays Seit nunmehr 20 Jahren haben DNA Arrays einen festen Platz in der molekularbiologischen Forschung. Sie finden beispielsweise Anwendung bei der Erstellung von Genexpressionsprofilen, der Detektion von Sequenzdeletionen und mutationen, sowie der Identifikation von Transkriptionsfaktorbindestellen (Bertone and Snyder 2005). Die DNA Arrays können im Hochdurchsatzverfahren angewendet werden, geben jedoch lediglich Auskunft über die Präsenz oder Transkription der untersuchten Gene und nur in einem sehr geringem Umfang Aufschluss über die Funktion der Proteine, für welche sie kodieren (Hall et al. 2007). Bisher gibt es viele verschiedene Methoden, um beispielsweise die Interaktionsund Signaltransduktionseigenschaften von isolierten Proteinen zu untersuchen. Jedoch sind diese Methoden (z. B. Far-Western, pull-down Experimente oder Koimmunpräzipitation) sehr zeitintensiv und nicht im Hochdurchsatzverfahren sowie in großem Maßstab anwendbar (Wolf-Yadlin et al. 2009). In diesem Zusammenhang stellt die seit einigen Jahren immer mehr an Aufschwung gewinnende Protein Array Technologie eine sehr viel versprechende Alternative dar. Im Gegensatz zu den DNA Arrays ermöglichen die Protein Arrays unter anderem die funktionelle Analyse von Protein-Protein Interaktionen in einem sehr schnellen und großen Maßstab (Bertone and Snyder 2005; Wolf-Yadlin et al. 2009). Weitere Einsatzmöglichkeiten von Protein Arrays ist ihre Verwendung zur Untersuchung von Protein- DNA (Bulyk et al. 1999; Bulyk 2007), Substrat-Enzym (z. B. Proteasen, Peroxidasen, Phosphatasen, Kinasen) (Arenkov et al. 2000; MacBeath and Schreiber 2000; Zhu et al. 2000) oder Protein-Ligand (Bradner et al. 2006) Interaktionen. Ähnlich wie die DNA Arrays enthalten auch die Protein Arrays sehr viel Information auf sehr engem Raum. Dies ist so zu verstehen, dass eine sehr geringe Menge an Protein (im Piko- oder Nanogrammbereich) auf eine sehr kleine Fläche von oft nur wenigen Mikrometern Durchmesser aufgebracht wird. Werden viele verschiedene Proteine auf diese Weise in punktförmigen Mustern (Spots) auf einer speziellen Trägeroberfläche immobilisiert, so wird die Gesamtheit dieser individuell angeordneten Spots als Array bezeichnet. In der Literatur werden in diesem Zusammenhang auch oft die Begriffe Biochip oder Mikroarray verwendet. Diese Bezeichnungen verdeutlichen die Miniaturisierung der Testansätze, bei denen eine hohe Anzahl von Molekülen auf sehr kleinem Raum immobilisiert wird. Heutzutage gibt es beispielsweise DNA Arrays die aus bis zu einzelnen Spots pro cm 2 bestehen. Durch diese 9

11 Einleitung Protein Arrays Miniaturisierung der Testansätze ist es möglich, mehrere hundert bis tausend verschiedene Protein-Spots auf eine Trägeroberfläche aufzubringen, die den Maßen eines normalen Mikroskopobjektträgers entspricht. In der Folge können diese Arrays unterschiedlich beprobt werden. Zum einen kann die Beprobung mittels markierter, löslicher Proben (z. B. Fluoreszenz-markierter Proteine) erfolgen. Zum anderen ist aber auch eine Inkubation mit unmarkierten Proben möglich. Bei dieser Beprobungsform wird die gebundene Probe in weiteren Inkubationsschritten mit Hilfe spezifischer Primär- und fluoreszenzgekoppelter Zweitantikörper nachgewiesen. Durch Auslesen der Fluoreszenzintensität kann die Bindung der Probe an jeden einzelnen Spot quantitativ erfasst werden. Mittels dieser Methodik konnte bereits ein Großteil des gesamten Hefe-Proteoms (etwa 5800 Genprodukte) im Array Format aufgetragen und analysiert werden, wobei Protein-Protein und Protein-Lipid Interaktionen im Vordergrund standen (Zhu et al. 2001). Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von Protein Arrays wurde von Jones et al. im Jahr 2006 vorgestellt. Sie zeigten, dass ein funktionaler Proteindomänen Array, auf der Basis von isolierten SH2 Domänen, eine realistische Methodik darstellt, um Bindungseigenschaften von Phosphotyrosin (ptyr)-modifizierten Peptiden quantitativ zu bestimmen (Jones et al. 2006) Proteinkopplung an Trägeroberflächen Das Aufbringen der Proteine auf speziell beschichteten Mikroskopobjektträgern erfolgt unter Verwendung eines Kontakt-Mikroarraydruckers (MacBeath and Schreiber 2000; Zhu et al. 2001) oder mittels eines kontaktfreien Druckers (Delehanty and Ligler 2003; Delehanty 2004; Jones et al. 2006). Um die Stabilität der Proteine während und auch nach dem Druckvorgang zu gewährleisten, müssen diese vor Austrocknung geschützt werden. Aus diesem Grund wird dem Immobilisierungspuffer eine möglichst hohe Konzentration Glycerin zugesetzt. Zusätzlich sollte der Druckprozess bei einer konstant hohen Luftfeuchtigkeit (circa %) durchgeführt werden (MacBeath and Schreiber 2000; Jones et al. 2006; Kaushansky et al. 2010). Zur Proteinimmobilisierung steht eine große Auswahl unterschiedlich behandelter Trägeroberflächen zur Verfügung. Bei der Wahl eines geeigneten Trägers sollte darauf geachtet werden, dass der Kontakt zwischen Protein und Oberfläche keinen negativen Einfluss auf die Proteinkonformation und funktionalität hat und dass eine maximale Bindekapazität erreicht wird (Zhu et al. 2003). Eine weitere wichtige Überlegung für die Wahl einer geeigneten Oberfläche ist, ob die Proteine in räumlich ungerichteter oder gerichteter Orientierung gebunden werden sollen. 10

12 Einleitung Protein Arrays Eine Möglichkeit, Proteine in einer einheitlichen räumlichen Orientierung zu immobilisieren, ist die Verwendung von Affinitäts-getaggten Oberflächen. Für diesen Zweck verwendbare Oberflächenvarianten sind zum Beispiel mit Nickelionen beschichtete Glasobjektträger, welche die Immobilisierung von Hexa-Histidin-markierten Proteinen ermöglichen (Zhu et al. 2003). Jedoch ist die Bindung zwischen Nickel-NTA und Histidin-markierten Proteinen weder sehr stark, noch sehr stabil. Im Gegensatz dazu ist die Interaktion zwischen Biotin und Avidin eine der stärksten und stabilsten nicht-kovalenten Bindungen. Im Jahr 2002 veröffentlichten Lesaicherre et al. eine Methode, die es ermöglicht Proteine seiten-spezifisch zu biotinylieren, um sie im folgenden auf einer Avidin-beschichteten Glasoberfläche zu immobilisieren (Lesaicherre et al. 2002). Diese Form eines Protein Arrays bietet, genau wie die Immobilisierung von Histidin-markierten Proteinen auf Nickel-Oberflächen, eine nichtkovalente Bindung und räumlich einheitliche Orientierung der Proteine. Allerdings ist diese Interaktion zwischen Protein und Oberfläche wesentlich robuster und extrem stabil. Für eine nach dem Zufallsprinzip räumlich ungerichtete Proteinimmobilisierung stehen derzeit Glasobjektträger mit Aminosilan-, Aldehyd- oder Epoxybeschichtung zur Verfügung (MacBeath and Schreiber 2000; Kusnezow et al. 2003). Auch die Verwendung von Glasträgern beschichtet mit Nitrozellulose oder Poly-L-Lysin bewirkt eine ungerichtete Immobilisierung der Proteine. Bei diesen beiden Oberflächenbeschichtungen werden die Proteine durch passive Adsorption an die Oberflächen gebunden (Stillman and Tonkinson 2000; Angenendt et al. 2002; Zhu et al. 2003; Charles et al. 2004; Kramer et al. 2004). Bei der Verwendung von Aminosilan-beschichteten Oberflächen erfolgt die Immobilisierung ebenfalls nicht-kovalent durch die Ausbildung von unspezifischen elektrostatischen Ionenbindungen zwischen negativ geladenen Aminosäureseitenketten (z. B. Glutamat oder Aspartat) des Proteins und den positiv geladenen primären Aminen der Oberfläche (Abb ). Abb Darstellung der nicht-kovalenten, elektrostatischen Bindung einer Peptidkette an eine Aminosilanoberfläche. Die negativ geladene Aminosäureseitenkette (COO - ) eines Peptids/Proteins (R-) geht mit dem positiv geladenen primären Amin ( + NH 3 ) eine unspezifische elektrostatische Ionenbindung (Doppelpfeil) ein. Als Beispiel eines negativ geladenen Aminosäurerests wurde Glutamat (Glu) gewählt. Der Bereich der elektrostatischen Bindung ist umrandet. Aus (Müller and Röder 2004). 11

13 Einleitung Protein Arrays Eine kovalente Alternative der Bindung von Proteinen an aktivierte Glasobjektträger ist die Verwendung von Aldehyd-beschichteten Oberflächen. Zwischen den reaktiven Aldehyden (R-HC=O) der Oberfläche und primären Aminen (R-NH 2 ) der Aminosäureseitenketten des Proteins kommt es durch nukleophile Addition unter Wasserabspaltung (Kondensation) zur Ausbildung von kovalenten C=N Doppelbindungen, die auch als Schiff sche Basen bezeichnet werden (Abb ). Abb Bildung der Schiff schen Basen durch Kondensation zwischen Protein und Aldehydoberfläche. (A) Reaktive Aldehydgruppen der Oberfläche interagieren mit den primären Aminen (-NH 2 ) der Peptide/Proteine. (B) Zwischen dem primären Amin einer Arginin-Seitenkette (Arg) und der Aldehydgruppe (R-HC=O) kommt es zu einer nukleophilen Addition unter Abspaltung von Wasser (H 2 O). (C) Dadurch entsteht eine kovalente Verbindung (Schiff sche Base). Aus (Müller and Röder 2004). Die Kondensation findet ohne zusätzliche Energie oder Katalysatoren statt. Ein Vorteil gegenüber den Aminosilanoberflächen besteht neben der kovalenten Bindung darin, dass die Aldehydoberfläche hydrophob ist, wodurch sich die wässrige Proteinlösung nach dem Auftragen nicht so stark ausbreitet und somit wesentlich kleinere Spots erzeugt werden können. Eine dritte Möglichkeit zur Immobilisierung von Proteinen besteht in der Verwendung von Epoxy-modifizierten Glasobjektträgern (Abb ). Epoxy-Ringstrukturen sind sehr reaktive elektrophile Gruppen, welche ebenfalls kovalente Bindungen mit nukleophilen primären Aminen der Proteine ausbilden. Abb Bindung von Peptiden und Proteinen an reaktive Epoxyoberflächen. Das positiv geladene primäre Amin ( + NH 3 ) einer Aminosäure (Arg) attackiert mit einer nukleophilen Addition das CH 2 innerhalb der Epoxy-Ringstruktur. Die kovalente Bindung zwischen dem Sauerstoffatom und dem CH 2 innerhalb der Epoxy-Ringstruktur wird aufgelöst und es entsteht eine kovalente Bindung zwischen dem Peptid/Protein und der Oberfläche. Aus (Müller and Röder 2004). 12

14 Einleitung Protein Arrays Dabei wird die kovalente Bindung zwischen dem Sauerstoffatom und dem CH 2 innerhalb der Epoxy-Ringstruktur durch nukleophile Addition des positiv geladenen primären Amins aufgelöst. In der Folge entsteht eine kovalente Bindung zwischen dem Stickstoffatom des Proteins und dem Kohlenstoffatom der CH 2 -Gruppe der Oberfläche Detektion der gebundenen Probe Abhängig vom Typ des verwendeten Arrays gibt es viele verschiedene Detektionsmöglichkeiten der gebundenen Probe. So können zum Beispiel Enzym-Substrat Interaktionen mittels Fluoreszenzmarkierung, Chemilumineszenz oder radioaktiver Markierung detektiert werden. Im Allgemeinen wird derzeit die Fluoreszenzmarkierung für Hochdurchsatzanalysen bevorzugt angewendet, da sie mit den gegenwärtig gängigen Modellen von DNA Array-Laserscannern kompatibel ist (Bertone and Snyder 2005). Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von affinitäts- oder photochemisch-markierten Proben (Colca and Harrigan 2004; Mitsopoulos et al. 2004). Ein Beispiel für die Verwendung von affinitätsmarkierten Proben sind die Interaktionsstudien von Huang et al. aus dem Jahr Ziel dieser Untersuchungen war es, neue chemische Substanzen zu identifizieren, welche den antiproliferativen Effekt von Rapamycin sowohl verstärkend als auch inhibierend modulieren und somit Einfluss auf das target of rapamycin (TOR)-Signalnetzwerk haben. Hierzu wurde ein Hefeproteom Array mit Biotin-markierten chemischen Substanzen inkubiert. Im Anschluss wurden die gebundenen biotinylierten Moleküle mittels Cy3-markiertem Streptavidin nachgewiesen (Huang et al. 2004). Auf gleiche Weise können auch Protein-Protein Interaktionen detektiert werden. Hierzu wird die Proteinprobe vor der Inkubation mit dem Array biotinyliert. Nach der Beprobung des Arrays mit der biotinylierten Proteinprobe wird der Array nach einem Waschschritt mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin inkubiert. Die Bindung des Fluorophor-konjugierten Streptavidins an die gebundenen biotinylierten Proteine ermöglicht somit die Detektion der spezifischen Interaktion mittels eines Mikroarray-Laserscanners. Bei dieser Beprobungsform sollte allerdings sichergestellt werden, dass die Biotinmarkierung der Probe nicht die Protein- Protein Interaktionsdomäne maskiert. Ein wesentlich einfacheres Verfahren besteht darin, dass die zur Beprobung verwendeten Proteine direkt mit einem Fluorophor markiert werden. Die direkte Markierung von Proteinen wird durch die Verwendung von aminreaktiven Farbstoffen gewährleistet. Diese 13

15 Einleitung Protein Arrays Succinimidylester reagieren mit primären Aminen der Proteine und bilden stabile Konjugate. Um ungebundenen Farbstoff zu entfernen, werden die fluoreszenzmarkierten Proteine dialysiert oder durch Größenausschlußchromatografie aufgereinigt. Auch bei der Beprobung mit direkt markierten Proben erfolgt die Detektion der gebundenen Probe mittels eines Mikroarry-Laserscanners. Ebenso wie bei der Biotinmarkierung ist auch in diesem Fall darauf zu achten, dass der gebundene Fluoreszenzfarbstoff keinen Effekt auf die Protein-Protein Interaktion hat. Neben den bisher beschriebenen Beprobungsmöglichkeiten mit chemischen Substanzen und Proteinen können auch andere Substanzen zur Beprobung eines Protein Arrays verwendet werden, um unterschiedliche molekulare Interaktionen zu untersuchen. Ein Beispiel hierfür sind Untersuchungen zu molekularen Interaktionen zwischen Proteinen und DNA. Bei diesen Versuchsansätzen wird der Protein Array mit fluoreszenzmarkierter DNA beprobt. Dafür wurde die DNA zuvor entweder durch Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden während DNA-Synthese oder durch die Konjugation von aminreaktiven Succinimidylestern an 5-(3-aminoallyl)-dUTPs markiert (Bertone and Snyder 2005) Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays Mittels Protein Arrays ist es möglich tausende von Proteinen gleichzeitig hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften zu charakterisieren und zu quantifizieren. Protein Arrays werden nicht nur zur Funktionsaufklärung von bislang uncharakterisierten Proteinen genutzt, sondern auch zur Analyse der Funktion bereits bekannter Proteine. Abb Anwendungsmöglichkeiten für funktionelle Protein Arrays. Unterschiedliche Beprobungsmöglichkeiten von Protein Arrays. Die Proteine wurden auf sehr kleinem Raum auf beschichteten Mikroskopobjektträgern immobilisiert. Im Anschluss erfolgte die Inkubation des Objektträgers mit fluoreszenzmarktierter Probe. Neben dem hier als Beispiel aufgeführten Fluorophor Cy5 gibt es noch eine große Anzahl anderer Fluorophore, die zur Detektion verwendet werden können. Modifiziert aus (Hall et al. 2007). 14

16 Einleitung Protein Arrays Protein Arrays finden bereits bei der Aufklärung verschiedenster Fragestellungen Anwendung. Beispiele hierfür sind Untersuchungen auf den Gebieten der Protein-Protein Interaktionen des Hefeproteoms (Zhu et al. 2001), der Protein-Rezeptor Interaktionen, der Protein-DNA Interaktionen (Hall et al. 2004), der Protein-Lipid Interaktionen (Zhu et al. 2001), der Antigen-Antikörper Interaktionen (Michaud et al. 2003) und Interaktionen zwischen Proteinen und chemischen Substanzen (Abb ) (Huang et al. 2004). Weitere Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays sind die Untersuchung von Kinaseaktivitäten (Zhu et al. 2000; Ptacek et al. 2005) oder die Charakterisierung verschiedener humaner Seren hinsichtlich ihrer Antikörperzusammensetzung (Zhu et al. 2006). 15

17 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen 1.2 Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Die Weiterleitung eines Signals innerhalb der Zelle ist ein sehr komplexer Prozess, an dessen Ende unterschiedliche zelluläre Reaktionen wie zum Beispiel Gentranskription, Proteintransport, Proteindegradation, Zellwachstum, Zellmotilität oder Immunantwort stehen. Um die temporäre, reversible und dynamische Regulation von intrazellulären Signalwegen zu gewährleisten, ist eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen notwendig. Die fundamentalen Komponenten der intrazellulären Signalleitung sind Proteine und niedermolekulare Stoffe (z. B. die second messenger Ca 2+ oder Diacylglycerol). Wenn ein Signal die Zelle erreicht, wird es über einen Rezeptor an nachgeschaltete Proteine weitergegeben. Diesen Proteinen sind wiederum weitere Proteine als nachgeschaltete Effektoren in der Reaktionskette zugeordnet. Auf diesem Weg werden nacheinander viele verschiedene Signalproteine in die Weitergabe eines Signals einbezogen, wodurch sich eine intrazelluläre Signalkette ausbildet. Die wichtigsten Proteinkomponenten der intrazellulären Signalleitung sind Proteinkinasen, Proteinphosphatasen, regulatorische GTPasen sowie Adapter- und Gerüstproteine. Die regulatorischen GTPasen haben die Funktion eines Schalters. Dieser kann in einer aktiven oder inaktiven Form vorliegen. In ihrer aktiven Form können GTPasen Signale an nachgeschaltete Komponenten des Signalwegs weitergeben. In der inaktiven Form ist die Weiterleitung des Signals unterbunden. Die Adapter- und Gerüstproteine vermitteln die Weiterleitung eines Signals zwischen einzelnen Proteinen eines Signalweges. Indem sie die einzelnen Signalproteine der Signalkette in eine nahe räumliche Beziehung bringen, wird eine effektive und spezifische Signalübertragung gewährleistet. Das zentrale Werkzeug zur Weitergabe von Signalen innerhalb einer Zelle stellt jedoch die Proteinphosphorylierung durch Proteinkinasen dar. Der Phosphorylierungsstatus eines Proteins wird durch das Zusammenspiel von Proteinkinasen und Phosphatasen reguliert. Die enzymatischen Prozesse der Phosphorylierung und Dephosphorylierung ermöglichen es, Proteine in reversibler Weise zu aktivieren oder zu inaktivieren. Sowohl Proteinkinasen als auch Proteinphosphatasen sind elementare Bestandteile von Signalwegen. Ihre Aktivität kann auf unterschiedlichste Weise reguliert werden. 16

18 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Proteinkinasen Die Phosphorylierung von Proteinen durch Kinasen ist ein wichtiger Mechanismus in der intrazellulären Signalweiterleitung und reguliert dadurch die verschiedensten zellulären Prozesse. Im menschlichen Genom finden sich circa 600 Gene, welche für Proteinkinasen kodieren, so dass diese Enzymgruppe alleine etwa 2,5 % aller Gene umfasst (Lander et al. 2001). Proteinkinasen werden hinsichtlich ihrer Substratspezifität in drei Familien eingeteilt: Serin-Threonin-Kinasen verestern einen Phosphatrest mit der alkoholischen Gruppe von Serin- oder Threoninresten Tyrosinkinasen erzeugen einen Phosphatester mit der phenolischen Hydroxyl (OH)- Gruppe von Tyrosinresten Bispezifische Kinasen phosphorylieren sowohl Serin-/Threoninreste als auch Tyrosinreste (z. B. die Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase, kurz MAPKK oder MEK). Sämtliche Proteinkinasen besitzen eine konservierte katalytische Domäne, welche für den Transfer des -Phosphats von Adenosintriphosphat (ATP) auf Serin-, Threonin- oder Tyrosinreste des Substratproteins verantwortlich ist. Anhand von Homologiebetrachtungen lässt sich in allen Kinasefamilien ein circa 300 Aminosäuren langer hoch konservierter Abschnitt identifizieren. Im Gegensatz dazu sind die an den homologen Bereich angrenzenden N- und C-terminalen Abschnitte nicht konserviert und in den einzelnen Familien sehr unterschiedlich. Alle Mitglieder der verschiedenen Kinasefamilien haben das gleiche Faltungsmuster wie die camp-abhängige Proteinkinase (PKA) eine Serin-Threonin-Kinase und die erste Kinase, die kristallisiert wurde (Knighton et al. 1991). Die katalytische Domäne ist in 12 hoch konservierte Subdomänen unterteilt und hat eine globuläre zweiflüglige Struktur, bestehend aus einem kleinen N-terminalen Flügel und einem größeren C-terminalen Flügel (Abb ). Beide Flügel sind durch einen Peptidabschnitt, der wie ein Scharnier fungiert, verbunden. Der kleine N-terminale Flügel besteht aus einem fünfsträngigen antiparallelem -Faltblatt und (bei den meisten Kinasen) aus einer einzelnen -Helix, der so genannten C-Helix. Diese Nomenklatur ist begründet in der Struktur der PKA, deren N-terminaler Flügel drei -Helices enthält (A-, B- und C-Helix), wovon die C-Helix diejenige ist, welche in allen Proteinkinasen konserviert ist. Der große C-terminale Flügel ist hauptsächlich -helikaler Struktur und 17

19 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen verantwortlich für die Bindung des zu phosphorylierenden Peptidabschnittes sowie für die Phosphotransferreaktion. Abb Struktureller Aufbau der katalytischen Domäne einer Proteinkinase. Repräsentative Bänderdarstellung einer katalytischen Kinasedomäne, basierend auf der Struktur der Insulinrezeptor- Tyrosinkinase. Der N-terminale Flügel ist in grün dargestellt, der C- terminale Flügel in lila. Die aktivierende Schleife ist gelb gefärbt. Das Substratpeptid, welches mit der Aktivierungsschleife interagiert, ist schwarz dargestellt. Das mit dem N-terminalen Flügel assoziierende ATP-Analog ist rot-blau gefärbt. Die C-Helix (enthält für die Katalyse wichtige Aminosäurereste) und die G-Helix (beteiligt an der Substratbindung) sind durch Beschriftung gekennzeichnet. Modifiziert aus (Pellicena and Kuriyan 2006). Die Bindestelle für das Nukleotidsubstrat ATP befindet sich im N-terminalen Flügel. Durch die Bindung von ATP und Peptid kommen sich N- und C-terminaler Flügel räumlich näher und die Oberfläche beider Flügel formt ein aktives Zentrum. Die Hauptkomponenten dieses aktiven Zentrums sind die Phosphat-bindende Schleife (P-Schleife) des N-terminalen Flügels sowie die katalytische (C-) Schleife und die Aktivierungsschleife (A-), beides Bestandteile des C-terminalen Flügels (Knighton et al. 1991). Die Fixierung des ATP erfolgt über die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen der - und -Phosphatgruppe des ATP und den Aminosäureseitenketten der Glycin-reichen Sequenz der P-Schleife. Für die Phosphotransfer- Reaktion ist es wichtig, dass die drei Phosphatgruppen des ATP linear angeordnet sind dies wird durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen Mg 2+ -Ionen und dem - sowie dem -Phosphat gewährleistet. Durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen einem konservierten Lysinrest des N-terminalen Flügels und dem - und -Phosphat des ATP werden die negativen Ladungen dieser Phosphatgruppen neutralisiert. Für die Übertragung der -Phosphatgruppe des ATP auf das Substratprotein ist die C-Schleife von entscheidender Bedeutung. Sie enthält zwei konservierte Aminosäurereste einen Aspartatrest, essentiell für die Phosphotransfer-Reaktion, und einen basischen Aminosäurerest (Lysin oder Arginin), welcher die negative Ladung der -Phosphatgruppe neutralisiert und somit einen nukleophilen Angriff durch das Substratprotein ermöglicht (Abb ). 18

20 Einleitung Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen Abb Interaktionen zwischen dem katalytischen Teil der Proteinkinase, dem ATP und dem zu phosphorylierenden Substrat. (Aminosäurennummerierungen entsprechen der PKA) - Der rote Pfeil kennzeichnet den katalytischen Transfer des ATP-Phosphates auf die Hydroxylgruppe des Substratproteins. Für die Katalyse wichtige Aminosäurereste, die in Kontakt mit dem ATP oder Substrat stehen, sind gelb schraffiert. Sekundärstrukturen und Aminosäurereste, die an der Regulation der katalytischen Aktivität beteiligt sind, sind grau schattiert. Schwarze Doppelpfeile kennzeichnen hydrophobe Interaktionen. Die wichtigsten polaren Kontakte sind durch Punktlinien gekennzeichnet. Modifiziert aus (Kornev et al. 2006). Die Phosphorylierung von Aminosäureseitenketten durch Proteinkinasen ist die am weitesten verbreitete posttranslationale Proteinmodifikation zum Zweck der intrazellulären Signalweiterleitung sowie der Regulation von Enzymaktivitäten. In eukaryotischen Zellen stellen die Serin-Threonin-Kinasen die evolutionär älteste Proteinkinasefamilie dar. Die Enzymklasse der Tyrosinkinasen entstand vermutlich erst nach Verbreitung von Phosphotyrosin erkennenden Proteindomänen, wie Phosphotyrosinbinde (PTB) oder Src homology 2 (SH2) Domänen bzw. deren Vorläufern (Lim and Pawson 2010). Diese regulatorisch bedeutsamen Proteinkinasen haben eine zentrale Funktion bei Wachstums- und Differenzierungsvorgängen und werden im nachfolgenden Kapitel näher beschrieben Proteintyrosinkinasen Im humanen Genom finden sich circa 90 Gene, die für Proteintyrosinkinasen (PTKs) kodieren (Lim and Pawson 2010). Tyrosin-spezifische katalytische Domänen finden sich sowohl in Transmembranproteinen, den Rezeptortyrosinkinasen (RTKs), als auch in zytoplasmatischen PTKs. Die RTKs sind integrale Membranproteine, welche auf der extrazellulären Seite eine Ligandenbindedomäne und auf der zytosolischen Seite eine Tyrosinkinase-Domäne besitzen. Der Proteinabschnitt, welcher die Membran durchquert, ist -helikaler Struktur. Im zytoplasmatische Abschnitt weisen die RTKs neben der konservierten Tyrosinkinase Domäne noch weitere regulatorische Sequenzabschnitte auf, an denen Autophosphorylierung sowie Phosphorylierung durch andere Proteinkinasen stattfinden kann. Von den 90 humanen PTKs gehören 58 zur Familie der RTKs (Manning et al. 2002). Die meisten RTKs werden durch die Bindung eines spezifischen Proteinliganden (z. B. Wachstumsfaktoren und Cytokine) an den 19