Gesundheitsfördernde Effekte von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen auf die Darm- Morphologie und das Darmimmunsystem von Monogastriern

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1 Gesundheitsfördernde Effekte von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen auf die Darm- Morphologie und das Darmimmunsystem von Monogastriern The influence of apple pomace or red-wine pomace rich diet on the gut morphology in weaning piglets Sehm, J.; Lindermayer, H.; Dummer, C.; Treutter, D.; Pfaffl, M.W.: Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition 91 (2007) Effekte von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen auf die Darm-Morphologie und das Immunsystem von Monogastriern Pfaffl, M.W.: Tagungsband 6. BOKU Symposium Tierernährung 2007, , Wien, Österreich, (2007) 1-9 Effekte von Pinienpollenextrakten auf das Wachstum von ilealen Schweinezellkulturen Masanetz, S.; Schedle, K.; Windisch, W.; Pfaffl, M.W.: Tagungsband 6. BOKU Symposium Tierernährung 2007, , Wien, Österreich, (2007) Das Darmepithel stellt die erste Zellschicht zum Eintritt von ernährungsphysiologisch erwünschten Nährstoffen in den Organismus dar. Toxische Inhaltsstoffe der Nahrung oder pathogene Mikroorganismen werden nur dann ausgeprägte pathologische Wirkungen im Darm entfalten können, wenn die morphologische und funktionelle Barriere des Darmepithels eingeschränkt ist. Das Ileum, der hinterste Teil des Dünndarms, stellt den immunologisch aktivsten Teil des Verdauungstraktes dar, sozusagen den Schnittpunkt zwischen Nahrung und Immunsystem. 70% der Immunantwort im Säugerorganismus gehen von Darmgeweben und deren lokalem Immunsystem aus. Alternative Maßnahmen, die der Erhaltung oder Verbesserung der Struktur, der funktionellen Integrität des Epithels und der eingelagerten Lymphknoten dienen, erhalten so eine neue und besondere Bedeutung. Um Schweine, vor allem Ferkel dennoch gesund zu erhalten, drängen viele alternative Futtermittelzusätze auf den Markt. Von Substanzen, die als Pro-, Prä- und Synbiotika wirken sollen, bis hin zu Kräutermischungen und seltenen Erden sind verschiedenste Futtermittelzusätze und Additive im Handel erhältlich. Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe lassen sich aufgrund ihrer Molekülstruktur in unterschiedliche chemische Gruppen zusammenfassen (z.b. Flavonoide, Carotinoide, Terpene, Isothiozyanate). Die zunehmende Zahl an Fütterungsadditiven auf Pflanzenbasis kennzeichnet bereits einen aufkommenden Trend. Heute sind schon einige Kräuterbeimischungen für die Schweinefütterung erhältlich, aber die eigentlich immunologisch aktiven Substanzen und deren Wirkungen liegen noch im Dunkeln. Es besteht aber keineswegs ein Verständnis für die Wirkungsspektren dieser Stoffe, und damit für eine gezielte Bewertung bzw. einen gezielten Einsatz in der Fütterung. Weiterhin sind mögliche Wechselwirkungen mit anderen Substanzen und etwaige Risiken in der Futterherstellung sowie im Fütterungseinsatz unerforscht. Zum sicheren Einsatz gehören auch praxistaugliche Analyseund Nachweisverfahren. Über die immun-stimulierenden und immun-modulatorischen Wirkmechanismen von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen liegen bisher wenig wissenschaftliche Kenntnisse vor. Hinweise für eine Beeinflussung des Immunsystems durch sekundäre Pflanzenstoffe gibt es für Carotinoide, Flavonoide, Phytoöstrogene, und Saponine. Im Weiteren ist bekannt, dass Flavonoide die Aktivität von Immunzellen sowie wichtigen Schlüsselenzymen beeinflussen und einzelne Schritte in der Signaltransduktion hemmen können. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass besonders sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe wie Carotinoide und Flavonoide im physiologischen Dosisbereich das Immunsystem modulieren können, wobei sowohl von stimulierenden als auch von suppressiven Wirkungen auszugehen ist. Forschungsziele Ziel ist es, alternative Futterzusätze zu testen, die die Gesundheitsstörungen beim Nutztier vermindern oder ganz vermeiden. Ein besonderer Aspekt war die Verwendung natürlicher Pflanzeninhaltsstoffe, z.b. polyphenolreicher Apfel- und Rotweintrester, Kräutermischungen reich an etherischen Ölen, ballaststoffreiche Fütterungen oder Laktulose und Inulin mit pre-biotischen Effekten. Folgende Fragestellungen und Forschungsziele stehen im Mittelpunkt: 1. Aufbau einer Versuchsanordung in der Ferkel- und Schweinefütterung zur detaillierten Untersuchung von potentiellen Futterzusatzstoffen mit gesundheitsfördernder, immunmodulierender und gegebenfalls leistungsfördernder Wirkung. 2. Verknüpfung der praxisbezogenen ernährungsphysiologischen Forschung mit molekularen Forschungsansätzen: Histologie und Darmmorphometrie, molekulare Physiologie, molekulare Immunologie und Systembiologie.

2 3. Suche nach potenten und umweltfreundlichen Alternativen gegenüber Antibiotika, insbesondere in der Fütterung von Monogastriern. 4. Definierung der Wirkungsspektren von Reinsubstanzen, Kräutermischungen sowie Reststoffen aus der Lebensmittelindustrie. 5. Erhaltung und Verbesserung der Bakterienflora, der Darmmorphologie, und somit der funktionellen Integrität des Darmepithels und der eingelagerten Lymphknoten. 6. Erfassung und Analyse der Bakterienpopulationen im Darm und des Blutbildes zur Abschätzung des Immunstatus. 7. Gewinnung neuer Erkenntnisse auf dem Gebiet der immun-stimmulierenden bzw. immunmodulierende Effekte und deren physiologische Auswirkungen. => Stimulation der körpereigenen Immunabwehr über eine natürliche Gesund- und Leistungsfütterung Versuchsansätze Um Erkenntnisse über die Effekte auf das Immunsystem und das Wachstum in Ferkeln zu gewinnen, wurden im Rahmen diverser Forschungsansätze verschiedene in vitro und in vivo Versuche durchgeführt. Auf zwei unserer Studien wird im Folgenden eingegangen: A) Im ersten Tierversuch wurden Apfel- und Rotweintrester aus der Lebensmittelproduktion, die reich an sekundären Flavanoiden sind, als Futterzusatz verwendet. Man kann die natürlichen Potentiale der sekundären Inhaltsstoffe nutzen und sie kostengünstig in der Tierfütterung einsetzen. B) Im zweiten Ansatz hat man die Pollen der chinesischen Gelbkiefer (pinus massoniana) als Zusatz in einem Ferkelversuch verwendet, um deren bis dato unbeschriebene Wirkungen auf molekularer Ebene zu beschreiben. A) Flavonoide in Trestern: Flavonoide sind die in der Nahrung am häufigsten vorkommenden Polyphenole und bestehen grundsätzlich aus 3 Kohlenstoffringen mit 2 aromatischen und einem O- heterozyklischen Ring. Sie besitzen anti-oxidative, anti-virale, anti-kanzerogene sowie antiinflammatorische Wirkungen und stellen in den Pflanzen einen wirksamen Schutzwall gegenüber exogenen Angriffen dar. Flavanole sind primär in Tee, Früchten und daraus hergestellten Getränken enthalten, v.a im Apfelsaft und Rotwein. Neben den monomeren Flavanolen enthalten pflanzliche Lebensmittel auch oligomere Flavanole wie die Procyanidine in Äpfeln, dunkler Schokolade und Rotwein. Die Flavonoide befinden sich überwiegend in den Randschichten der Pflanzen sowie den äußeren Blättern. So beinhaltet der Apfeltrester 80% der in den Äpfeln enthaltenen Flavonoide. Als Modellsysteme dienten Ferkel im Fütterungsversuch sowie weiße Blutzellen (WBC = Leukozyten isoliert aus dem Blut), die in Zellkultur mit verschiedenen Flavanoiden stimuliert wurden. In einem ersten in vitro Vorversuch wurde mit primären weißen Blutzellen gearbeitet. Die kultivierten Zellen konnten mit zwei wichtigen phenolischen Vertretern, z.b. EGCG und Catechin (isoliert aus grünen Tee-Extrakten) stimuliert werden. Dabei zeigten sich einige stimulierende und konzentrationsabhängige Effekte auf die gesamten RNA Expression und auf die mrna Expressionslevel von ausgewählten Markergenen. In unseren Studien bewirkten höhere EGCG- und Catechin-Konzentrationen eine Verringerung der gesamten RNA Expression, wobei EGCG den größeren Effekt zeigte. Bei dem zweiten in vitro Versuchsansatz konnte festgestellt werden, dass EGCG und Catechin meist die beobachteten mrna Expressionen von pro-inflammatorischen Markergenen abregulierte. Catechin verursachte eine Aufregulierung des pro-inflammatorischen Zytokins TNFa. EGCG erhöhte TNFa mrna Expression nur in sehr hohen Konzentrationen. Zusammenfassend kann man in den zwei in vitro Zellkulturversuchen von positiven Effekten bei beiden Flavanoide sowohl auf die immunrelevanten Zytokine als auch auf die Expression der Transkriptionsfaktoren feststellen. Höhere Flavanoidgaben zeigten ausgeprägtere Einflüsse als geringere, wobei EGCG die mrna Genexpression stärker veränderte als Catechin. Der Schwerpunkt dieses Forschungsvorhabens bildete der in vivo Fütterungsversuch in Zusammenarbeit mit Dr. Lindermayer vom Institut für Tierernährung und Futterwirtschaft (LfL, Grub). Im Fütterungsversuch wurden 78 Ferkel mit 3,5% TS Apfel- oder Rotweintrester gefüttert. Als Beobachtungszeitraum wurden die Tage um den Absetztermin gewählt, da dort die meisten immunrelevanten Veränderungen in der Umwelt und beim Futterwechsel stattfinden, und auch bekanntermaßen die meisten Ferkelverluste zu verzeichnen sind. In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Obstbau, TUM Weihenstephan (Prof. Treutter) konnten die wichtigsten Polyphenolvertreter im Futter, im Mageninhalt und im Chymus nachgewiesen werden. In den tierischen Organen und Geweben waren mittels sensitiver HPLC Analytik nur Spuren der Polyphenole nachweisbar. Positiv ist zu bemerken, dass keines der Tiere aus der Studie wegen Krankheit oder Totalverlust

3 ausfiel. Leider konnten keine Unterschiede in den täglichen Zunahmen der einzelnen Fütterungsgruppen beobachtet werden. Die beiden polyphenolreichen Fütterungen zeigten einen positiven Einfluss auf die Bakterienpopulationen im Colon. In den Trester behandelten Gruppen wurden krankmachende E. coli Bakterienstämme mehr verdrängt, während sich die Anzahl der gesundheitsfördernden Laktobazillen erhöhte. Auch im Blutbild konnten unterschiedliche Effekte durch die Fütterungen gemessen werden. Die Ergebnisse des Blutbildes zeigten, dass die Leukozytenzahl in der Kontrollgruppe anstieg, was auf eine Aktivierung des Immunsystems hinweist, wobei sich in den Behandlungsgruppen keine Veränderungen zeigten. Die Thrombozytenzahl ging bei der Rotweintrestergruppe signifikant zurück. Einen weiteren Schwerpunkt bildete die Erfassung der Darmmorphometrie. Folgende Parameter wurden bei der Vermessung im GIT (Magen, Jejunum, Ileum, Colon; siehe Abbildung 1) und im mesenterialen Lymphknoten erfasst: Größe der Zotten und Krypten (Länge, Breite und Fläche) sowie der Lymphknoten und Peyersche Platten (Fläche, Anzahl und Lymphfollikel). Die darmmorphometrischen Studien via Histologie ergaben, dass die unterschiedlichsten Effekte der polyphenolreichen Fütterungen im Jejunum, Ileum und im Colon nachweisbar waren. Bei Rotwein- Tresterzulage verringerte sich das Zottenwachstum im Jejunum. Beide Tresterzulagen hatten wachstumsstimulierende Effekte im Colon. Die Lymphfollikelflächen der Peyerschen Platten im Ileum nahmen nur in der Kontrollgruppe zu, was, wie im Blut, für eine Aktivierung des Lymphsystems in der nicht behandelten Kontrollgruppe spricht. Abb 1: Darmmorphometriemessung im GIT: 1.) Lamina muscularis mucosae; 2.) Lieberkuhn Krypten; 3.) Darmzotte. Dünndarm: a) Länge und b) Breite der Zotten; Dickdarm: c) Tiefe und d) Breite der Krypten. In den Expressionsanalysen wurde gezeigt, das Caspase 3 im Jejunum mit der Zeit abreguliert wurde, dagegen im Colon aufreguliert. Die Veränderungen waren in den Behandlungsgruppen oft signifikant größer als in der Kontrollgruppe. Die in vivo Studie zeigte, dass sich die beiden Tresterfütterungen bei den Ferkeln gesundheitsfördernd auswirkten. Sowohl die Darmflora, Lymphknoten (Peyersche Platten im Ileum) sowie die Darmzotten wurden von beiden Tresterfütterungen positiv beeinflusst. B) Pinienpollen: Als Modellsubstanz für eine faserreiche Fütterung wurden Pollen der chinesischen Gelbkiefer (pinus massoniana) in einem Ferkelversuch eingesetzt. Die Pinienpollen haben einen sehr hohen Fasergehalt mit 60 % Ballaststoffe mit überwiegendem Anteil an Cellulose (ca. 15 %) und sind insgesamt kaum verdaulich. Ihre positive Wirkung auf die Darmgesundheit, v.a. bei Obstipation, ist in der traditionellen chinesischen Medizin bereits seit langem beschrieben. Durch den hohen Ballaststoffanteil kann von einer prebiotischen Wirkung durch die pinienpollen-reiche Fütterung im Nutztier ausgegangen werden. Es werden aber auch Wirkungen über Phytoöstrogene und

4 Polyphenole diskutiert. In diesem Zusammenhang sollte in dem vorliegenden Fütterungsversuch untersucht werden, inwieweit die Zulage (Pinienpollen vs. Weizenkleie) zu einem praxisüblichen Ferkelfutter die Aufzuchtleistung beeinflussen und das Immunsystem der Ferkel modulieren kann. Es wurde die Regulation diverser Markergenexpressionen im Verdauungstrakt und in verschiedenen Organen quantifiziert. Die Studie wurde mit 48 Absetzferkeln der Kreuzung Edelschwein x Pietrain an der landwirtschaftlichen Fachschule Hatzendorf in der Steiermark in Kooperation mit der Universität für Bodenkultur Wien (Prof. Windisch) durchgeführt. Eine Ferkelgruppe diente als Kontrolle, die keine extra zugesetzte Faserquelle erhielt. Die zweite Gruppe bekam 3 % Weizenkleie. Zwei weitere Fütterungsgruppen erhielten 1,275 % Pinienpollen oder 2,550 % Pinienpollen als Zulage. Der Zusatz in den beiden höher dosierten Fasergruppen wurde so gewählt, dass die Zulage an Ballaststoffen jeweils identisch waren (+16 g TDF/kg Futter). Nach fünf Wochen wurden die Tiere in der betriebseigenen Schlachtstätte (Hatzendorf, Steiermark) geschlachtet und Gewebeproben von Magen, Jejunum, Ileum, Colon und Lymphknoten entnommen. Für die Expressionsmessung wurden die Darmgewebeproben in NaCl gewaschen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 C gelagert. Zusätzlich wurden histologischen Proben für die Erfassung der Darmmorphologie des GIT entnommen. Die angewendeten Ballaststoffzusätze zeigten eine Steigerung der Zottenlänge im Dünndarm (Jejunum und Ileum): Weizenkleie + 7%, Pollen +9% bis +14%. Jedoch Weizenkleie (+10%) und Pollen niedrig (+7%) bewirkten eine Verbreiterung der Zotten, Pollen hoch dagegen verringerte die Breite. In der Folge steigerte sich auch die Zottenoberfläche bei Weizenkleie und Pollen. Ein ähnlicher Trend war auch im Ileum festzustellen. Im Colon konnte eine numerische Vertiefung der Crypten beobachtet werden. In den Peyerschen Platten des Ileums, sowie in den Lymphknoten, konnten keine Veränderungen der Lymphfollikel festgestellt werden. Die Anzahl der Lymphfollikel pro Lymphknoten konnte durch Pollen hoch signifikant gesenkt (-11%) werden, was die Verringerung der Immunaktivität zeigt. Zur Analyse der Genexpression wurde total-rna mittels TriFast (PeqLab, Erlangen, Deutschland) extrahiert. Anschließend wurde die RNA-Ausbeute mittels Biophotometer ermittelt. Die cdna Synthese erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers mit 1500 ng total RNA durch das Enzym Reverse Transkriptase (M-MLV RT RNase H(-) Point Mutant incl. Puffer, Promega, Mannheim, Deutschland), Random Hexamer Primer (Invitrogen, Carlsbad, USA) und dntps (10mM) (MBI Fermentas, St. Leon-Rot Deutschland). Die relative Quantifizierung der cdna wurde mit dem ep Cycler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. 20 ng cdna in einem Volumen von 2 µl wurden als PCR Vorlage verwendet. Zusätzliche wurden 0,76 µl forward-reverse Primer (10 pmol) (Invitrogen, Carlsbad, USA), 6,75 µl Real Master Mix (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und Wasser auf ein endgültiges Volumen von 15 µl gebracht. Die quantitative PCR wurde mit 45 Zyklen und einer Produkt-spezifischen Annealing Temperatur durchgeführt. Die crossing points (Ct Werte) wurden mit der Ct Methode (Eppendorf Software, Hamburg, Deutschland) ermittelt. Die relative Quantifikation wurde durch die Referenzgene Histon H3 und beta-actin sowie diversen physiologischen Markergenen nach der??cp Methode errechnet. Folgende Markergene wurden in allen Geweben quantifiziert: Wachstum: IGF1 und GHR; Apoptose: Caspase 3; Proliferation: CDK4; Proinflammatorisch: TNFa; Anti-inflammatorisch: TGFb; Transkriptionsfaktor: NFkB. Es wurden je nach Zulage unterschiedliche Effekte bei der Genexpression der einzelnen Gewebe gemessen. So zeigte die hohe Pollenzulage eine verringerte Expression bei Caspase 3, CDK4, TGFb, und IGF-1 im Magen und Jejunum. Im Lymphknoten konnte eine Abregulation der TGFb Expression beobachtet werden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass Pinienpollen die Proliferations-, Entzündungs- und Apoptose-Expressionsmarker auf mrna Ebene eher abregulieren als aufregulieren. In einer weiterführenden in vitro Studien wurde die Epithelzelllinie IPI-21 aus dem Schweineileum in Zellkultur etabliert und die Wirkung verschiedener Extrakte aus gemahlenen Pinienpollen (Wasser, Ethanol, Methanol und Hexan) untersucht. Man geht von weiteren unbekannten Effekten der Pollen auf die Epithelzellen aus. Da in den vorliegenden Extrakten keine unlöslichen Zellwandbestandteile enthalten sein sollten, besteht die begründete Vermutung, dass die hier beobachteten Effekte von anderen löslichen Inhaltsstoffen ausgelöst worden sind. Systembiologie Die Systembiologie versucht, biologische Organismen in ihrer Gesamtheit zu verstehen. Ziel ist es ein integriertes Bild über aller regulatorischen Prozesse in allen Organen vom Genom über das Proteom zum Metabolismus zu erhalten. Um die Vielzahl der erhaltenen physiologischen Daten in Einklang zu bringen, sind aufwendige mathematisch-analytische und statistische Algorithmen und Computersimulationen nötig. Die Systembiologie betrachtet die Gesamtheit des Organismus und

5 macht sich Gedanken über Prozesse und wie diese sich im Laufe der Zeit verändern, jedoch mit einer radikalen Erweiterung der Dimensionen. In der Systembiologie werden tausende Parameter erfasst, wodurch sie in einer deutlich dynamischeren Sichtweise der Biologie resultiert als die der klassischen Molekularbiologie oder Genetik. Um die unterschiedlichen Datensätze vergleichbar zu machen, müssen diese normalisiert werden. Das heißt, man muss sie alle in die gleiche Dimension konvertieren, so dass keiner der untersuchten Parameter in der Analyse bevorzugt wird. Nach der Normalisierung werden die Datensätze mittels einer hierarchischen Clusteranalyse ausgewertet. Um einen systembiologischen Ansatz zu zeigen haben wir im Pinienpollen Versuch 107 Datensätzen von 45 Ferkeln ausgewertet. Es wurden neben den Expressionsdaten der unterschiedlichsten Organe, die Ergebnissen der Darmmorphometrie sowie die Fütterungs- und Wachstumsdaten mit einbezogen (Abbildung 2). In einer weiteren neuen Studie sollen auch die metabolischen Daten sowie die Daten der Besiedlung der Darmflora mit integriert werden. Abbildung 2: Systembiologische Auswertung unterschiedlicher Datensätze am Beispiel des Pinienpollen Ferkelversuchs. Als Ergebnis der Clusteranalyse ist zu beobachten, dass verschiedene Organe Subcluster bilden, das heißt, dass die Regulation der Genexpressionen unterschiedlicher Gene innerhalb eines Gewebes ähnlich ist. Auch die morphologischen Daten zeigten alle ein abgeschlossenes Subcluster. Interessanterweise finden wir auch einen engen Zusammenhang in einem Subcluster zwischen der Expression immunologischer Parameter im Ileum und der Morphologie der Lymphfollikel sowie der Protein- und Rohfaserverdaulichkeiten. Ein weiteres Subcluster finden wir im Jejunum zwischen der Expression immunologischer Markergene und der absoluten Futterverwertung. Zusammenfassung Zusammenfassend ist zu sagen, dass sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe das Immunsystem sowie auch die ernährungsphysiologischen Parameter signifikant und gewebespezifisch modulieren können. Dies äußert sich in einem veränderten Wachstumsverhalten, einer veränderten Morphologie des GIT und einer Beeinflussung der endogenen mrna Expressionsmuster der Gewebe. Aus dem systembiologischen Ansatz, der Clusteranalyse, ergab sich ein direkter Zusammenhang

6 zwischen Futterverwertung und Immunparametern im Jejunum, sowie auch zwischen Verdaulichkeit, Morphologie der Lymphknoten und Expression immunrelevanter Markergene im Ileum. So lässt sich sehr schön der direkte Einfluss der Fütterung bzw. Ernährung auf die Morphologie des Darmes und auf das Immunsystem veranschaulichen.. Lehrstuhl für Physiologie, Letzte Änderung: , Renate Schöpf