Molekularpathologische Untersuchungen
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- Waltraud Daniela Scholz
- vor 6 Jahren
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Transkript
1 Molekularpathologische Untersuchungen Aufbruch in eine neue Welt Markus Tiemann Hämatopathologie Hamburg
2 Adenokarzinom der Lunge: molekulare Subtypen PIK3CA HER2 BRAF MET EGFR ALK KRAS EGFR Unbekannt Unbekannt KRAS Unbekannt KRAS Unselektierte Chemotherapie (AR 20-30%, mos < 1Jyear) EGFR mut. (12-14%) EGFR TKIs (AR 60-80%, mos 40 months) EML4/ALK + (3%) ALK Inhibitor AR 60-70%, mpfs 27 months
3 Sequenzierung Bestimmung der Basenabfolge der DNA 3 --GACCACCGCATCCGTTC CTGGTGGCGTAGGCAAG--3 1 st generation sequencing: Sanger-Sequenzierung 2 nd generation sequencing: Massives paralleles Sequenzieren 3 rd generation sequencing: Einzelmolekül-Sequenzierung
4 UnterschiedzwischenSanger-Seq. und NGS Sanger-Sequenzierung: 1 Probe Pool aus vielen PCR-Produkten 1 gemeinsame Sequenz Sensitivitätsgrenze: % NGS: 1 Probe viele PCR-Produkte jedes DNA-Molekül wird einzeln sequenziert sehr viele Sequenzen Sensitivitätsgrenze: 1-5 %
5 Multi-Gen-Panel-Sequenzierung Gleichzeitige Sequenzierung aller für eine Erkrankung relevanter Gen: schneller und kostengünstiger als stufenweise Gen-für-Gen-Sequenzierung führt häufiger zum Auffinden von diagnostisch oder prognostisch relevanten Mutationen Sinnvolle Panels: EGFR EZH2 TET2 KRAS TP53 BRAF KRAS NRAS DNMT3A ASXL1 BRAF
6 Lungen-Panel (NGS) Das Next Generation Sequencing ist ein Hochdurchsatz-Verfahren AKT1 ALK1 BRAF CTNNB1 DDR2 EGFR ERBB2 FGFR2 HRAS KRAS MAP2K1 MET NRAS PIK3CA PTEN PTPN11 TP53 17 Gene = 100 Exons = 254 Amplikons 20 Patienten/NGS-Lauf 20 Patienten x 254 Amplikons = 5080 Sanger-Sequenzierungen
7 Sequenzierung: Illumina Sequenzierung: Illumina Illumina Polymerase-basierte Sequenzierung ähnlich der Sanger- Sequenzierung: nacheinander Einbau farbmarkierter Basen
8 Das Lungen-Panel ALK (res.) AKT1 BRAF CTNNB1 DDR2 EGFR ERBB2 FGFR2 HRAS KRAS MAP2K1 MET NRAS PIK3CA PTEN PTPN11 TP53 + FISH/IHC für Translokationen
9 Im komplexen Netz der Signalwege
10 Test-AlgorithmusLungen-Ca Metastasiertes NSCLC Adeno Plattenepithel-Ca EGFR ALK ROS PD-L1 FGFR1 amp. Relevanz unklar DDR2 mut. selten, Relevanz unklar (außer S768R) cobas IHC Zielgerichtete Treiber selten FISH EGFR-Expression EGFR, ALK, ROS Wildtyp NGS-Panel
11 Mutationshäufigkeit NSCLC (Daten HpH) EGFR EGFR TKI sensitiv 13% (n=252) MUT 2,4% (n=31) ALK EGFR TKI prim. Resistenz 1% (n=17) WT 86% (n=1697) n = 1966 WT 97,6% (n=1280) n=1311 BRAF MUT 2% (n=16) KRAS MUT 29% (n=407) WT 98% (n=701) n = 717 WT 71% (n=986) n = 1393
12 EGFR-TKI Resistenz TKI TKI Tumor, EGFR + Partielle Remission Rezidiv Camidge et al., Nature Reviews Oncology, 2014
13 Material zur Rezidivanalyse Biopsie / Resektat Zytologische Präparate ctdna aus Plasma liquid biopsy Molekulargenetische Analyse
14 T790M positiv: Material 2013 Liquid Biopsy 0% 2014 Liquid Biopsy 0% Zytologie 30% Zytologie 29% FFPE 70% FFPE 71% n=10 n= Zytologie 8% Liquid Biopsy 15% Zytologie 19% FFPE 77% FFPE 19% Liquid Biopsy 62% n=13 n=19
15 T790M-Testung 4,50 4,00 Häufigkeit T790M in Relation zur EGFR-Testung Prozent T790M/EGFR 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0, Geschlecht T790M positiv Zusatzmutation zur T790M Einsender: Klinik/Praxis 15% Männer L858R 33% Praxis 24% 85% Frauen Exon 19 del 67% Klinik 76%
16 Diagnostisch-TherapeutischeZukunft 1st/2nd gen. TKI Diagnose Therapie 1st line 3rd gen. TKI 1. Rezidiv Therapie 2nd line 1st/2nd gen. TKI 3rd gen. TKI 2. Rezidiv Therapie 3rd line Tumorlast Biopsie Rebiopsie Rebiopsie Zeit Liquid Biopsy T790M
17 Das Colon Panel: Gen Exon AKT1 4 APC 1 bis 16 BRAF 11 und 15 CTNNB1 3 KRAS 2 bis 4 NRAS 2 bis 4 PIK3CA 2 bis 21 PTEN 1 bis 9 SMAD4 2 bis 12 TP53 2 bis 12
18 Fall 1: weibliche Patientin, geb primär metastasiertes Rektumkarzinom nicht mehr operabel, trotzdem Therapiewunsch KRAS- und ggf. NRAS-Mutationsstatus erbeten kein Gewebe zur Testung verfügbar Problem: Wie möglichst wenig invasiv vorgehen? Lösung: Molekularpathologische Analyse aus zellfreier DNA der Tumorzellen im Blutplasma
19 Fall 1: weibliche Patientin, geb primär metastasiertes Rektumkarzinom KRAS- und ggf. NRAS-Mutationsstatus erbeten ca. 10 ml peripheres Venenblut in Cell-Free DNA BCT (Streck) Extraktion der zellfreien DNA (cfdna) Colon-Panel (Next Generation Sequencing) Gen Exon Mutation Mutationsrate AKT1 4 Wildtyp --- APC 16 p.q1062ter (c.3184c>t) p.t1438hfs*35 (c.4312dela) BRAF 11, 15 Wildtyp --- CTNNB1 2 4 Wildtyp % 37 % KRAS 2 4 Exon 2: p.g12v (c.35g>t) 32 % NRAS 2 4 Wildtyp --- PIK3CA 2 21 Wildtyp --- PTEN 1 9 Wildtyp --- SMAD Wildtyp --- TP Exon 5: p.p177_c182del 53 %
20 Fall 1: KRAS Exon 2: p.g12v (c.35g>t) reads gesamt (coverage) mutiert sind 32 % (3166) [31% for (1539), 32 % rev (1627)] coverage
21 hg19-sequenz (Wildtyp) Anzahl der reads mit genau dieser Basenabfolge Basenaustausch (Mutation) forward reads reverse reads Gerät: MiSeq (Illumina) Software: SeqNext (JSI medical systems GmbH)
22 Fall 2: Lungentumor Patient 72 Jahre alter Mann (Allgemeinarzt) Körperlich aktiv (wandern, Fahrrad fahren, Gartenarbeit) Keine Laster (keine Zigaretten, kein Alkohol) Symptome Fatigue Thorax-Schmerzen Husten Diagnostik Schritt 1 Thorax-Röntgen: Multiple Schatten / Läsionen verdächtig auf Tumor oder Miliartuberkulose
23 Fall 2: Lungentumor Diagnostik: Schritt 2 CT: Bestätigung multipler Läsionen in beiden Lungenflügeln incl. Pleurainfiltration Intervention Chirurgie zur diagnostischen Gewebeentnahme Multiple Läsionen [4] exstirpiert (zentral und peripher) Diagnostik: Schritt 3 Schnellschnitt: Verdächtig auf Lungenkarzinom (NSCLC) Histologie: Kein Karzinom; maligner Tumor unklarer Histogenese
24 Fall 2: Lungentumor Diagnostik: Schritt 4 Spezielle Immunhistochemie zeigt histiozytäre Genese: (Histiozytisches Sarkom) a CD14 b CD68 d c Lysozym CD163
25 Fall 2: Lungentumor Diagnostik: Schritt 5 / Zweitmeinung 2 Wochen Aufenthalt im Uniklinikum 40+ zusätzliche Immunmarker an Leberstanze getestet, um die Diagnose zu sichern Keine konklusive Diagnose gestellt, Patient entlässt sich selbst (sauer!) Intervention Konventionelle Chemotherapie: Keine Tumorverkleinerung Diagnostik: Schritt 6 Next generation sequencing: Lungenpanel Unerwartetes Resultat (NRAS, TP53) vs Literatur (BRAF)
26 Fall 2: Lungentumor Diagnostik: Schritt 6 Next generation sequencing: Lungenpanel Bestätigung mit Sanger-Sequenzierung NRAS: p.q61k (c.181c>a) TP53: p.r196* (c.586c>t) TP53: p.c242y (c.725g>a) hg19 Next Generation Sequencing Q61 R196 Sanger Sequencing C242 for rev
27 Fall 2: Lungentumor Diagnostik: Schritt 7 Konventionelle Chemo zeigt keinen Effekt Weitere Immunhistochemie: Atypische Histiozyten (Makrophagen) mit PD-L1-Expression b e f CD68 PD-1 PD-L1 Therapie: Schritt 8 Checkpoint inhibitor als möglicher experimenteller Heilversuch empfohlen Diagnostische Ergebnisse wurden gebraucht, um Krankenkasse zu überzeugen (Therapiekosten sind hoch)
28 Fall 2: Lungentumor Verlauf Sofortige Besserung der klinischen Symptomatik Patient kann nach 2 wieder Rad fahren und im Garten arbeiten Follow-up CT zeigt komplette Remission nach 8 Wochen Nivolumab
29 Kritische Entscheidungen erfordern einen Lotsen
30 Fallbericht 1 67-jährige Patientin mit Verdacht auf Augenhintergrunds-Metastase. Primär-Tumor?
31 Erstvorstellung Straube, Goslar!!
32 Diagnostische Maßnahmen Thorax-Röntgen Sonografie Thorax, Abdomen, Weichteile Leberstanze CT-Thorax Bronchoskopie (unauffällig) PET-CT
33 Leber-Stanzbiopsie am Tag der Erstvorstellung 4 x2cm Zylinder 19Ch
34 Therapie mit Crizotinib bei Ros1 Fusionen EML4-Alk Fusionsprotein Kinase 77% Ähnlichkeit ROS1 Fusionsprotein (SLC34A2-ROS1 oder CD74-Ros1) Kinase Crizotinib Alectinib Ceritinib Crizotinib Patienten mit Ros1-Rearrangements sind ALK-Inhibitor-sensitiv
35 Bei positivem ALK-Re-Arrangement im Tumor Indikation zur Erstlinientherapie mit Crizotinib/Xalkori R, Dosis: 2x250mg/die. Therapie-versagen: Ceritinib/Zykadia R (2015) oder Alectinib (Compassionate use-programm; ROCHE/Studie); Brigatinib (Compassionate Use) 08/2016 (Lorlatinib?)
36 Diagnose/weiterer Verlauf Diagnose: Adenokarzinom Lunge, TTF1-positiv, G3, Metastasierung in Leber, Strukturen der Augenhöhle rechts, knöchernen Schädel, Hirn; EML4-ALK-Translokation. Therapiebeginn mit 1.tem Zyklus Pemetrexed/Carbo/Bevacizumab/Zoledronat Abbruch der Therapie wegen extrem schlechter Verträglichkeit. Umstellung auf Crizotinib ab Gute Verträglichkeit anhaltende Remission der Lungenherde
37 Thorax-CT Gutes Ansprechen auf Crizotinib
38 Remission Lungenherd, Progress Leber ab 03/2015 Umstellung Alectinib mit allm. Dosissteigerung auf 2x300mg/die
39 Resistenzbildung gegen Crizotinib EML4-Alk Crizotinib Resistenzbildung (häufig schon innerhalb eines Jahres) z.b. L1196M, Gatekeeper Mutation (Choi et al., 2010 NEJM) Entspr. T790M bei EGFR, T315I bei BCR-ABL Second line Alk TKI s werden notwendig
40 Crizotinib-Resistenzbildung Nature Reviews Clinical Oncology 11, (2014)
41 BrigatinibExhibits a Plan-Inhibitory Preclinical Profile against ALK Resistance Mutants Brigatinib overcomes mechanisms of resistance to first-and secondgeneration ALK inhibitors in preclinical models. 1 Potently inhibited all ALK resistance mutations tested, including G1202R, at clinically achievable levels. Significantly prolonged survival and reduced tumor burden in al ALK-dependent orthotopic brain tumor model in mice. Brigatinib yielded promising clinical activity in Crizotinib-treated ALK+ NSCLC patients in a phase 1/2 study. 2 EffectiveAverage Concentration(C ave ) in Patients* ExceedsIC 50 byat Least 2-fold ALK Variant TKI Activity, IC 50 (nm) Crizotinib Ceritinib Alectinib Brigatinib Native T1151Tins L1152R L1152P C1156Y I1171N F1174C F1174L F1174V V1180L L1196M L1198F G1202R D1203N S1206F S1206Y E1210K G1269A Yes NO 41 *Effective Cave at steady-state concentrations at approved/recommended phase 2 doses (180 mg for Brigatinib) corrected for functional effects of protein binding; ALK mutations previously associated with clinical resistance 3,4 1. Zhang. et al. Cancer Res. 2015;75(15 suppl) abstract 781.; 2. Camidge, et al. J ClinOncol. 2015;33(suppl); abstract 8062.; 3. Katayama, et al. ClinCancer Res. 2015;21: ; 4. Friboulet, et al. Cancer Discov. 2014;4: Mod. Kim DW et al. ASCO 2016, Oral Abstract Session - Lung Cancer Non-Small Cell Metastatic, Abstract No. 9007
42 Weiterer Verlauf Hemihepatektomie wegen langsamer hepatischer Progredienz 01/ /2016 Strahlentherapie- Metastasierung re. Hüftkopf 07/2016 Ende Alectinib nach Molekularpathologie Leberresektat
43 Vorstellung nach Therapie
44 AblaufNGS (targeted sequencing) Sammeln der Patientenproben über ca. 1 Woche Genomische DNA Herstellung der DNA-Bibliothek Tag 1 Tag 2 Target-spezifische Amplifikation Adapter Ligation, Barcoding 1Mio Moleküle pro Stecknadelkopf Cluster Generierung Tag 3 Sequenzierung T A G GC T A G ATC C Fluoreszenz Tag 3-4 Datenanalyse Tag 5-8
45 NGS-Analyse (Illumina) LKN-Ausstrichpräparat, Pat. unter ALK-TKI, 4,8ng/µl Molekulargenetische Untersuchung: Wir haben aus den Zellen des Ausstrichpräparates die DNA isoliert. Mittels Next Generation Sequencing (NGS) wurden folgende Gene auf Mutationen untersucht: Ergebnisse: AKT1 Exon 4 Wildtyp (unmutiert) ALK1 Exon 23 p.g1202r (c.3604g>a), Mutationsrate: 8% BRAF Exon 11 und 15 Wildtyp (unmutiert) CTNNB1 Exon 3 Wildtyp (unmutiert) DDR2 Exon 4 19 Wildtyp (unmutiert) EGFR Exon Wildtyp (unmutiert) ERBB2 Exon 20 Wildtyp (unmutiert) FGFR2 Exon 2 18 Wildtyp (unmutiert) HRAS Exon 2 4 Wildtyp (unmutiert) KRAS Exon 2 4 Wildtyp (unmutiert) MAP2K1 Exon 2 Wildtyp (unmutiert) MET Exon 2, 13, 14, 19 Wildtyp (unmutiert) NRAS Exon 2 4 Wildtyp (unmutiert) PIK3CA Exon 2 21 Wildtyp (unmutiert) PTEN Exon 1 9 Wildtyp (unmutiert) PTPN11 Exon 3 Wildtyp (unmutiert) TP53 Exon 7 p.n235d (c.703a>g), Mutationsrate: 12% Resistenz gegen die meisten ALK-TKI, Brigatinib evtl. wirksam
46 Therapeutische Maßnahme Einschluss der Patientin in das Härtefall-Programm Brigatinib
47 Therapie-Erfolg Bis heute anhaltende Remission!
48 Endlich fertig
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