Humane mesenchymale Stammzellen (HMSC): Differenzierung und Fusion mit anderen Zellarten Dissertation Zur Erlangung des Akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Manja Schulze geboren am 24.12.1974 in Halle/Saale Gutachter 1. Prof. Dr. Dr. Thomas Braun 2. Prof. Dr. Anna Wobus Datum der Verteidigung: 07.06.2006 urn:nbn:de:gbv:3-000011715 [http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3ade%3agbv%3a3-000011715]
Diese Dissertation ist von der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Martin- Luther-Universität Halle-Wittenberg genehmigt worden. Hiermit versichere ich, Manja Schulze, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine anderen, als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Die aus fremden Quellen übernommenen Gedanken oder Graphiken sind als solche kenntlich gemacht. Die vorliegende Arbeit wurde noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Manja Schulze Halle(Saale), den 15.11.2005
Danksagung An erster Stelle möchte ich Prof. Dr. Dr. Thomas Braun für die Überlassung des interessanten Themas danken, der die Arbeit mit ständigem Interesse, motivierender Unterstützung und stetiger Diskussionsbereitschaft begleitet hat. PD. Dr. Eva Bober möchte ich für die gute Zusammenarbeit danken und ins Besondere für das Aufzeigen von beruflichen Perspektiven. Ein besonderer Dank gilt Dr. Herbert Neuhaus und Dr. Petra Neuhaus für die Hilfsbereitschaft, Unterstützung und ständige Gesprächsbereitschaft. Die konstruktiven Diskussionen haben oft zur Horizonterweiterung beigetragen und mich zu neuen Ideen angeregt. Besonders bedanken möchte ich mich für die Durchsicht meines Manuskripts. Für das gute Arbeitsklima möchte ich vor allem Julia, Annette, Undine, Annelies, Nicole, Jens, Daniela, und Stefan danken. Ganz besonders möchte ich meiner Familie und meinen Freunden danken, die mich immer liebevoll unterstützt haben und das Verständnis für meine Arbeit aufbrachten.
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1. Stammzellen-ein Überblick 1 1.2. Fusionsereignisse bei mesenchymalen Stammzellen 5 1.3. Die Entstehung von multinucleären Myotuben 6 1.4. Ziele der Arbeit 9 2. Materialien 10 2.1. Chemikalien und Materialen 10 2.1.1. Gebrauchswaren 10 2.1.2. Enzyme 10 2.1.3. Chemikalien 10 2.1.4. Antikörper 11 2.1.4.1. primäre Antiköper 11 2.1.4.2. sekundäre Antikörper 11 2.1.5. Versuchstiere 11 2.1.6. Kits 12 2.1.7. DNA-Größenstandards 12 2.1.8. Oligonucleotid-Sequenz 12 2.2. Lösungen und Puffer 14 2.2.1. Lösungen und Puffer für molekularbiologische Methoden 14 2.2.1.1. Gel-Elektrophoresematerialien 14 2.2.1.2. Lösungen für RNA-Isolation 14 2.2.2. Lösung für operativen Eingriff 14 2.2.3. Lösungen für die Präparation von Geweben 15 2.3. Materialien und Lösungen für die Zellkultur 15 2.3.1. Zellen 15 2.3.1.1. Zelllinien 15 2.3.1.2. Primäre Zellen 16 2.3.2. Medien und Lösungen für die Zellkultur 16
2.3.2.1. Wachstumsmedien 16 2.3.2.2. Differenzierungsmedien 17 2.3.3. zellbiologisches Enzym 18 2.3.4. Färbelösung für vitale Zellen 2.3.5. GFP-Adenovirus 18 2.3.6. Lösungen für immunhistochemische Färbungen 19 2.3.7. Lösungen für histologische Färbungen 19 2.3.8. Zellkernfärbungen 20 2.3.9. Lösungen für ß-Galaktosidase-Färbung 20 3. Methoden 21 3.1. Molekularbiologische Methoden 21 3.1.1. Molekularbiologische Standartmethoden 21 3.1.2. RNA-Isolation mit Trizol 21 3.1.3. Methoden der Polymerase-Ketten-Reaktion 22 3.1.3.1. RT-PCR 22 3.1.3.2. Amplifikation von DNA-Fragmenten mit Hilfe der PCR 22 3.1.4. Sequenzierungen 23 3.2. Methoden der Zellkultur 23 3.2.1. Isolation von primären Zellen 23 3.2.1.1. Isolation von humanen Knochenmarkzellen aus dem Hüftgelenkskopf 23 3.2.1.2. Isolation von Satelliten-Zellen 24 3.2.2. DiI-Markierung der HMSC 24 3.2.3. Kryoschädigung und Injektion von DiI-markierten HMSC 24 3.2.4. Generation und Analyse von chimären Mäusen 25 3.2.5. Präparation von Embryonen 25 3.2.6. Einbettung der Embryonen mittels Agarose 25 3.2.7. Kryotomschnitte von Geweben 26 3.2.8. Differenzierungsassays 26 3.2.8.1. Adipogene Differenzierung 26 3.2.8.2. Osteogene Differenzierung 26 3.2.8.3. Chondrogene Differenzierung 26 3.2.9. Infektion der humanen mesenchymalen Stammzellen mit GFP-exprimierenden Adenoviren 27 3.2.10. Kokultivierungsexperiment 27
3.2.11. Kokultivierungsexperiment mit Zugabe von Zytokinen oder Antikörpern 27 3.2.12. Kokultivierungsexperiment mit Polykarbonat-Filtermembranen 28 3.3. Immunhistochemische und histochemische Färbungen 28 3.3.1. Immunhistochemische Färbung von Zellen und Gewebeschnitten 28 3.3.2. Doppelfärbung der chimären Myotuben mit zwei anti-maus-antikörpern 28 3.3.3. Färbung der Zellkerne 29 3.3.4. DAB-Färbung 29 3.3.5. Oil-Red-Färbung 29 3.3.6. von Kossa -Färbung 29 3.3.7. Safranin-O-Färbung 29 3.3.8. ß-Galactosidase-Färbung 30 3.4. Photodokumentation 30 3.5. Statistische Auswertung 30 3. Ergebnisse 31 4.1. Isolierung adulter Knochenmarkszellen und Untersuchung ihres Differenzierungspotentials 31 4.1.1. Histochemischer Nachweis der Differenzierung der Knochenmarkszellen in drei mesenchymale Zelltypen 32 4.1.2. HMSC exprimieren nach Induktion verschiedene gewebsspezifische mrnas 32 4.2. Teilnahme von DiI-markierten HMSC an der Regeneration von murinen Muskelzellen 35 4.3. Untersuchung des Mechanismus der Teilnahme der HMSC durch in vitro-experimente 36 4.3.1. Kokultivierung der humanen mesenchymalen Stammzellen mit C2C12-Zellen 36 4.3.2. Kokultivierungs-Experimnent mittels Polykarbonat-Filter 38 4.3.3. Humane mesenchymale Stammzellen nehmen mittels Zellfusion an den sich bildenden Myotuben teil 40 4.3.4. Fusionen zwischen HMSC und primären, von Satelliten-Zellen-abstammenden Myoblasten 42 4.3.5. Humane mesenchymale Stammzellen erfahren keine myogene Reprogrammierung nach Fusion mit Myotuben 44 4.3.6. Expression von humanem Vimentin in chimären Myotuben 45 4.3.7. Koexpression von murinem Myogenin und der humanen
Prolyl 4-Hydroxylase in chimären Myotuben 46 4.4. IL-4 steuert die Fusion von HMSC mit Myotuben 48 4.4.1. HMSC exprimieren den IL-4-Rezeptor 49 4.4.2. Histochemischer Nachweis des IL-4-Rezeptors 50 4.4.3. Erhöhung der Fusionsereignisse nach IL-4-Zugabe 50 4.4.4. Die Fusion von HMSC mit Myotuben wird durch Blockierung des IL-4- Signalweges eingeschränkt 52 4.4.5. Teilnahme mesenchymaler adulter Stammzellen (MASC) an der Entwicklung der Skelletmuskulatur, aber nicht an der Herzentwicklung 53 4.4.6. Der NFATC2- und NFATC2/3/IL-4-Signalweg ist erforderlich für Fusionen zwischen adulten mesenchymalen Stammzellen (MASC) und Muskelzellen in vivo 53 4.5. Untersuchung des Fusions- und Differenzierungspotentials dermaler 56 Fibroblasten verschiedenen Ursprungs im Vergleich zu den HMSC 4.5.1. Fusionen von dermalen Fibroblasten und Vorhautzellen nach Kokultivierung mit C2C12-Zellen 57 4.5.2. Abschaltung der Myogenin-Expression von murinen Kernen in chimären Myotuben 59 4.5.3. Die Fibroblasten zeigten eine geringere Fusionspotenz und IL-4-Rezeptor- Expression, als die HMSC 60 4.5.4. Dermale Fibroblasten zeigen gegenüber den HMSC eine geringere Kompetenz der adipogenen Differenzierung 5. Diskussion 62 5.1. Humane adulte Knochenmarkszellen haben ein multipotentes Differenzierungspotential 62 5.2. Teilnahme von HMSC an der Regeneration von Muskelzellen nach Kryoschädigung 63 5.3. Teilnahme von HMSC an der Bildung von Myotuben durch Fusion 64 5.4. HMSC halten ihre endogene Expression aufrecht und führen zur Reprogrammierung muriner Myotubenkerne 66 5.5. Regulation der Fusionsprozesse 79 5.6. Mesenchymale Stammzellen nehmen durch eine NFAT/IL-4- vermittelte Fusion an der Muskelbildung teil 72
5.7. Potentielle Zielgene von IL-4 73 5.8. Fusionsereignisse bei dermaler Fibroblasten und Vorhaut- Fibroblasten 74 6. Ausblick 77 7. Zusammenfassung 78 8. Literaturverzeichnis 79 9. Anhang 89 9.1. Abkürzungen 90 9.2. Lebenslauf 92 9.3. Tagungsbeiträge und Puplikationen 101