Berichte aus der Pharmazie Peter Ramge Untersuchungen zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe von Nanopartikein Shaker Verlag Aachen 1999
INHALTSVERZEICHNIS 1. HINTERGRUND UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT 1 TEIL A: THEORETISCHE EINFÜHRUNG 4 2. DIE BLUT-HIRN-SCHRANKE 4 2.1. Allgemeines 4 2.1.1. Aufbau der Blut-Hirn-Schranke 4 2. 1.2. Funktion 6 2.2. Blut-Hirn-Schranken-Modelle 11 2.3. Strategien zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke 14 2. 3. 1. Osmotische und chemische Öffnung 14 2. 3. 2. Direkte Injektion in das Gehirn, das Rückenmark und osmotische Minipumpensysteme 16 2. 3. 3. Induzierte Genexpression und Implantation von Gewebe 17 2. 3.4. Virale Transfektion 18 2. 3. 5. Erleichterter Transport durch Antikörperkonjugate (AKK) 19 2. 3. 6. Adsorption von Arzneistoffen an Polymere und Einkapselung lebender Zellen und Zeliinien 20 2. 3. 7. Implantation lebender Zeliinien 21 2. 3. 8. HDL/LDL ( high density" und Iow density lipoproteins") als Trägersystem zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke 22 2. 3. 9. Insulinfragmente 23 2. 3.10. Liposomen und Nanopartikel 24 2.3. 11. Magnetische Mikrosphären 25 2. 3. 12. Andere Methoden 26 Biochemische Modulation 26 Arzneistoffdesign und chemisch-pharmakologische Methoden 27 Genetische Modulation 28 Anpassung an die BHS im Tumorbereich 29 3. DRUG TARGETING 30 4. KOLLOIDALE ARZNEISTOFFTRÄGER 31 4. I.Einleitung 31 4. 1. 1. Definitionen 32
4.1.1. 1. Nanopartikel 32 4.1.1. 2. Liposomen 32 4.1.2. Andere kolloidale Arzneistoffträger 33 4.2. Materialien und Herstellungsverfahren 34 4.2.1.-Nanopartikel 34 4.2. 1. 1. Polyacrylate 34 4.3. Eigenschaften und Verwendung von Nanopartikein 36 4. 3. 1. Allgemeines 36 4. 3. 2. Kontrolle der Wirkstoffreigabe und -Verteilung 37 4.4. Überwindung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe von Nanopartikein 38 4. 4. I.Vorarbeiten 38 4. 4. 2. Tierversuche 39 4. 4. 3. Plasmaadsorptionsmuster und deren Konsequenzen 39 4.4. 4. Geeignete Tiermodelle 40 5. CHRONOPHARMAKOLOGIE 42 5. I.Definitionen 42 5.1.1. Chronopharmakologie 42 5.1.2. Chronopharmakokinetik 43 5.1. 3. Chronopharmakodynamik 43 5.2. Beispiel Blutdruck 44 5.3. Das Schmerzempfinden 44 5.4. Bedeutung für dieses Projekt 45 TEIL B: PRAKTISCHE ARBEITEN 47 6. MATERIALIEN UND METHODEN 47 6.1. MATERIALIEN UND GERÄTE 47 6.1.1. Nanopartikel 47 6.1.1. 1. Chemikalien und Reagenzien 47 6. 1.1. 2. Geräte 47 6.1.2. Zellkulturen 48 II
6. 1.2. 1. RBE4-Zellinie 48 6.1. 2. 1. 1. Medium und Inkubationen 48 6.1. 2.1. 2. Materialien und Geräte 49 6.1.2. 2. primäre Hirnendothelzellen 49 6.1. 2. 2. 1. Isolierung/Versuche 49 6. 1, 2. 2. 2. Medium 50 6. 1. 2. 2. 3. Materialien und Geräte 51 6.1.2. 3. Cecchelli-Modell 52 6. 1. 2. 3. 1. Medium und Inkubationen 52 6.1.2.3.2. Materialien und Geräte 52 6.1. 3. Tierversuche 53 6. 2. EIGENSCHAFTEN UND QUANTITATIVE ANALYTIK DER VERWENDETEN ARZNEISTOFFE UND SUBSTANZEN 54 6.2. LDalargin 54 6. 2. 2. Paclitaxel (Taxol ) 54 6. 2. 3. Rhodamin 6G 56 6. 3. NANOPARTIKEL 56 6.3.1. Herstellung der Nanopartikel 56 6. 3.1. 1. Polybutylcyanoacrylatnanopartikel (PBCA) 56 6. 3. 1. 1.1. PBCA-Nanopartikel mit Polysorbat 80 (P80) 57 6. 3. 1. 1. 2. PBCA-Nanopartikel mit FITC-Dextran und 3 H-lnulin 57 6. 3.1.1. 3. PBCA-Nanopartikel mit Rhodamin 6G 58 6. 3. 1. 1. 4. PBCA-Nanopartikel mit Dalargin 58 6. 3.1. 1. 5. PBCA-Nanopartikel mit Paclitaxel 58 6. 3.1. 2. 14 C-Polymethylmethacrylatnanopartikel ( 14 C-PMMA) 59 6. 4. CHARAKTERISIERUNG DER NANOPARTIKEL 60 6.4.1. Größenbestimmung 60 6.4. 2. Bestimmung des Polymergehaltes bei PBCA-NP 60 6. 5. ZELLKULTUR 61 6.5.1. RBE4-Zellinie (rat brain endothelial-cell line) 61 III
6. 5. 1. 1. Untersuchungen zur In-vitro-Toxizität von Nanopartikein mit Hilfe des MTT-Test 61 6. 5.1. 2. Inkubationen mit 3 H-lnulin markierten PBCA-Nanopartikeln 62 6.5.1. 3. Inkubationen mit FITC-markierten PBCA-Nanopartikeln 63 6. 5. 2. Primäre Rinderhirnendothetzellen 63 6. 5. 2. 1. Isolierung und Kultivierung 63 6. 5.2. 2. MTT-Tests 65 6. 5.2. 3. Immuncytochemische Charakterisierung 65 6. 5.2. 4. Inkubationen mit Rhodamin 6G-markierten Nanopartikein 66 6. 5.2. 5. Inhibitionsversuche zur Nanopartikelaufnahme 66 Filipin 66 LDL-Antikörper 67 Cvtochalasin 67 Colchicin 67 Lipoproteinarmes Fötales Kälberserum (FCS) 68 6.5.3. Primäre Humanendothelzetlen 68 6. 5. 3. 1. Isolierung und Kultivierung 68 6. 5. 3. 2. MTT-Tests 68 6. 5.3. 3. Immuncytochemische Charakterisierung 69 6. 5. 3. 4. Inkubationen mit Rhodamin 6G-markierten NP 69 6. 5. 4. Primäre Mäusehirnendothelzellen 69 6. 5.4. 1. Isolierung und Kultivierung 69 6. 5.4. 2. Inkubationen 70 6.5. 5. In-vitro-Modell für die Blut-Hirn-Schranke (Cecchelli-Modell) 70 6. 5. 5.1. Das Cecchelli-Modell 70 6. 5. 5. 2. Permeabilitätsassays mit PBCA-Nanopartikeln 71 6. 5. 5. 3. Inkubation mit 14 C-markierten PMMA-Nanopartikeln 72 6. 5. 5. 4. EM-Aufnahmen nach Inkubation von PBCA-Nanopartikeln 72 6. 6. TESTMETHODEN IM TIERVERSUCH 74 6. 6. 1.Hot-Plate-Test 74 6. 6. 2. Tail-Flick-Test 74 6. 7. TIERE 75 6.7. LICR-Mäuse 75 6 7 1.1. Anwendung verschiedener PBCA-Nanopartikelzubereitungen mit Dalargin und Polysorbat 80 im Tierversuch 75 6. 7.1. 2. 14 C-PMMA-Nanopartikel 76 IV 6.7.1. 3. Applikation von Trypanblaulösung und Nanopartikein 6.7.2. DBA/2 und Balb/C 6. 7. 2. 1. Ermittlung des biologischen Rhythmus zweier Inzuchtmäusestämme 6. 7.2. 2. Untersuchung zur Chronophanmakologie von verschiedenen Nanopartikelzubereitungen mit dem Hot-Plate-Test 6. 7.2. 3. Untersuchungen zur dosis- und tageszeitabhängigen Wirkung von Nanopartikelzubereitungen mit dem Tail-Flick-Test 6. 7. 2. 4. maximal possible effect" (MPE) 6. 7. 2. 5. Das PHARMFIT-Programm 6. 7. 3. ApoE-defiziente Mäuse und C57BL/6J-Stamm 6. 8. FLUORESZENZMIKROSKOPIE 6. 9. KONFOKALE LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE (CLSM) TEILC 7. ERGEBNISSE 7.1. ANALYTIK 7.1.1 Dalargin 7.1.1.1. Eichgerade für Dalargin 7. 1. 1.2. Beladungsrate für PBCA-Nanopartikel 7.1.2. Paclitaxel 7.1.2.1. Eichgerade für Paclitaxel 7.1.2. 2. Beladungsrate für PBCA-Nanopartikel 7.1.3. Rhodamin 6G 7.1. 3. 1. Eichgerade für Rhodamin 6G 7. 1.3. 2. Beladungsrate für PBCA-Nanopartikel 7. 2. NANOPARTIKEL 7.2.1. Polybutylcyanoacrylatnanopartikel 7. 2.1. 1. Größenbestimmung, Ermittlung der mittleren Teilchengröße 7. 2. 1. 1. 1. Wirkstofffreie PBCA- Nanopartikel 7.2. 1. 1. 2. Nanopartikel mit FITC-Dextran und 3 H-lnulin 76 77 78 78 79 79 80 81 82 82 84 84 84 85 85 85 87
7.2.1. 1. 3. Nanopartikel mit Dalargin 7.2.1.1. 4. Nanopartikel mit Paclitaxel 7. 2.1. 2. Bestimmung des Polymergehalts 87 68 88 7.2.2. Polymethylmethacrylatnanopartikel 7. 2.2.1. Größenbestimmung, Ermittlung der mittleren Teilchengröße 7. 2. 2. 1. 1. 14 C-PMMA- Nanopartikel 7. 3. ZELLBIOLOGISCHE VERSUCHE 88 88 89 7. 3.1. ISOLIERUNGEN 89 7.3.1.1. Rinderhirnendothetzellen (Bovine Brain Capiiiary Endothelial Cells, BBCEC) 89 7.3.1.2. Humane Hirnendothelzellen (Human Brain Capiiiary Endothelial Cells, HBCEC) 89 7.3.1.3. Hirnendothelzellen murinen Ursprungs (Mice Brain Capiiiary Endothelial Cells, MBCEC) 90 7. 3. 2. CHARAKTERISIERUNGEN 91 7.3.2.1. Rinderhirnendothelzellen 91 7.3.2.2. Hirnendothelzellen humanen Ursprungs 93 7. 3. 3. MTT-TESTS 93 7.3.3.1.RBE4-Zellinie 94 7.3. 3.2. Rinderhirnendothelzellen 95 7.3.3.3. Hirnendothelzellen humanen Ursprungs 97 7. 3. 4. INKUBATIONEN 99 7. 3. 4.1.RBE4-Zellinie 99 7. 3. 4.1.1. 3 H-lnulin-markierte Nanopartikel 99 7. 3. 4. 1. 2. FITC-markierte Nanopartikel 102 7.3.4.2. Inkubationen auf Rinderhirnendothelzellen 104 7. 3. 4. 2. 1. Rhodamin 6G-markierte Nanopartikel. 104 7. 3. 4. 2. 2. Inhibitionsversuche der Nanopartikelaufnahme 106 Filipin LDL-Antikörper Cytochalasin Colchicin Lipoproteinarmes Fötales Kälberserum 7.3.4.3. Hirnendothelzellen humanen Ursprungs 7. 3. 4. 3. 1. Rhodamin 6G-markierte Nanopartikel 7.3.4.4. Murine Hirnendothelzellen 7. 3.4. 4. 1. Rhodamin 6G-markierte Nanopartikel 7. 3. 4. 5. Cecchelli-Modell 7. 3.4. 5. 1. Permeabilitätsassays mit PBCA-Nanopartikeln 7. 3. 4. 5. 2. Elektronenmikroskopische Aufnahmen 7. 3. 4. 5. 3. 14 C-PMMA-Nanopartikel 7.4. IN-VIVO-VERSUCHE MIT 14 C-MARKIERTEN PMMA-NANOPARTIKELN 7.4.1. Alkaltne Phosphatase Assay 7.4.2. "C-PMMA-Verteilung im Gehirngewebe von Mäusen 7. 5. ICR-MÄUSE 7.5.1. PBCA-Nanopartikelzubereitungen 7.5.2. Trypanblaulösung und Nanopartikel 7. 6. UNTERSUCHUNGEN MIT APOE-DEFIZIENTEN MÄUSEN 7. 7. CHRONOPHARMAKOLOGIE 7. 7.1. Schmerzempfinden in Abhängigkeit von der Tageszeit bei DBA/2 und Balb/c-Mäusen 7.7.2. Chronopharmakologische Untersuchung von verschiedenen Nanopartikelzubereitungen 7.7. 3. Dosis/Wirkungstestung mit dem Tail-Flick-Test zu zwei Zeitpunkten TEIL D: DISKUSSION 106 106 106 107 107 108 108 109 109 111 111 113 116 119 119 119 123 123 127 128 132 132 134 138 140 VI vn
8.1. HERSTELLUNG UND EIGENSCHAFTEN DER VERWENDETEN NANOPARTIKEL 141 8.1.1. Nanopartikel mit adsorptiver Bindung von Wirkstoffen 141 8.1.2. Nanopartikel mit inkorporativer Bindung von Wirkstoffen 142 8. 2. ZELLULÄRE ANREICHERUNG UND MECHANISMEN 145 8. 2.1. RBE4-Zellinle 145 8.2. 2. Primäre Endothelzellkulturen 146 8. 2. 3. Cecchelli-Modell 148 8. 3. VERSUCHE MIT ICR-MÄUSEN 150 8.3.1. Wirkung von NP-Zubereitungen 150 8.3.2. Verteilungsstudien im Gehirn mit "C-PMMA-Nanopartikeln 151 8.3. 3. Trypanblaulösung 152 8. 4. APOE-DEFIZIENTE MÄUSE 153 8. 5. CHRONOPHARMAKOLOGIE 154 8. 5. SCHLUßFOLGERUNG UND AUSBLICK 157 ZUSAMMENFASSUNG 159 LITERATURVERZEICHNIS 162 ANHANG 170 Lebenslauf 170 Publikationen und Kongreßbeiträge 171 VIII