V-Modul 427. Methoden der Zellfraktionierung und Proteomanalyse bis

V-Modul 427 Methoden der Zellfraktionierung und Proteomanalyse 05.12.2016 bis 16.12.2016 Institut für Molekulare Evolution Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Methodik der Proteomanalyse Schritt 1: Isolierung der Fraktion, deren Proteom bestimmt werden soll Äußere Ein#üsse Ganze Zelle PROTEOM Einzelne Fraktionen Vorfraktionierung? Schritt 2: Trennung der erhaltenen Proteine Trennung Gel- Analyse Protein- Identi"kation Gel Datenbanken Protein Datenbanken Posttranslationale Modi"kationen Genom Datenbanken Schritt 3: Identi"zierung einzelner Proteine

Methodik der Proteomanalyse Schritt 1: Isolierung der Fraktion, deren Proteom bestimmt werden soll Äußere Ein#üsse Ganze Zelle PROTEOM Einzelne Fraktionen Zellfraktionierung

Ablauf einer Zellfraktionierung Zellen / Gewebe Lyse und Homogenisierung (Zellaufschluss) In Anwesenheit von Proteasehemmern Trennung der Zellbestandteile durch Zentrifugation Di$erentielle und Dichtegradientenzentrifugation Proteinbestimmung und Überprüfung von Identität und Reinheit der Fraktion Markerenzyme, Western Blot

Proteinbestimmung Messung der Proteinkonzentration in den erhaltenen Fraktionen mittels dem Bradford-Assay, dem Biuret-Assay, dem Lowry-Assay, dem BCA-Assay, Messung der UV-Absorption, oder der Fluoreszenzmethode.

Bradford-Assay entwickelt von Marion M. Bradford (1976) Grundlage der Färbemethode ist der Farbsto$ Coomassie-Brilliantblau G250 wikipedia.org

Bradford-Assay Coomassie geht im sauren Milieu (Phosphorsäure) unspezi"sche Wechselwirkungen mit kationischen und nicht-polaren, hydrophoben Seitenketten der Proteine ein wichtigste beteiligte Aminosäure: Arginin weniger Ein#uss haben: Lysin, Histidin, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin Bei der Bindung an Proteine verschiebt sich das Absorptionsmaximum von Coomassie von 465 nm zu 595 nm [Stabilisierung der unprotonierten, anionischen Sulfonat-Form des Coomassie durch die Komplexbildung] invitrogen.com

Bradford-Assay Gemessen wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 595 nm (Absorptionsmaximum der an Protein gebundenen Form). Zur Kalibrierung wird eine Kalibrierungsgerade mit de"nierten Proteinkonzentrationen von BSA (Rinderserumalbumin) erstellt. Extinktion = Absorption BSA-Kalibrierungsgerade Protein [µg] chondrex.com

Biuret-Assay Farbreaktion von Kupfersulfat (CuSO 4 ) mit Peptidbindungen in alkalischer Lösung. Da CuSO 4 die Reaktion auch mit Biuret eingehen kann, heißt es Biuret-Assay. Biuret/Carbamoylharnstoff sigmaaldrich.com

Biuret-Assay Durch die Komplexbildung zwischen den Cu 2+ -Ionen und je zwei Peptidbindungen (CO-NH-Gruppen) kommt es zu einem Farbumschlag von blau zu violett. Auch Tyrosinreste komplexieren Kupfer-Ionen und tragen zur Farbbildung bei. Gemessen wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 550 nm. Kupfer-Komplex seilnacht.com thewhyinbiochemistry.com

Lowry-Assay Lowry und Mitarbeiter entwickelten 1951 eine Kombination des Biuret-Assays mit einem gelben Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenz (Molybdat bzw. Wolframat in Form von Heteropolyphosphorsäuren). 1. Schritt: Biuret-Reaktion Komplexbildung zwischen Kupfer(II)-Ionen und Peptidbindungen in alkalischer Lösung dabei wird Cu 2+ zu Cu + reduziert aws.labome.com

Lowry-Assay 2. Schritt: Bildung von Molybdänblau Cu + im Komplex reduziert das gelbe Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenz zu Molybdänblau. Die Reduktion wird durch Tyrosin, Tryptophan und in geringem Maße auch durch Cystein und Histidin der Proteine unterstützt. Absorption des Molybdänblau wird bei einer Wellenlänge von 750 nm gemessen. aws.labome.com

Bicinchoninsäure (BCA)-Assay der 1985 verö$entlichte Assay kombiniert den Biuret-Assay mit BCA Cystein, Tyrosin, Tryptophan und Peptidbindungen können Cu 2+ zu Cu + reduzieren 2 Moleküle BCA bilden dann mit Cu + einen blau-violetten Farbkomplex Der Komplex ermöglicht einen sensitiven, kolorimetrischen Nachweis von Proteinen bei einer Wellenlänge von 562 nm. Die Intensität der Farbsto$bildung ist temperaturabhängig. wikipedia.org

UV-Absorption bekannt seit Anfang der 1940er Jahre (Warburg und Christian) Absorptionsmessung bei 280 nm (A 280 ) Bei 280 nm absorbieren die aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin, in geringen Mengen auch Phenylalanin. Korrektur bei Vorhandensein von Nukleinsäuren (A 260 ): Proteinkonzentration [mg/ml] = (1,55 A 280 ) (0,76 A 260 )

Fluoreszenzmethode Es wird die Eigen#uoreszenz der aromatischen Aminosäuren in Proteinen (Tryptophan) nach Anregung gemessen. Anregung: 280 nm Emission: 320 350 nm Methode ist stark abhängig vom ph-wert und von der Polarität des Lösungsmittels Anwendung kann nur bei sehr sauberen Proben erfolgen

Empfindlichkeit Nachweisgrenzen Methode Bradford Biuret Lowry BCA UV- AbsorpCon Fluoreszenz Nachweisgrenze (μg Protein/ml) 0,05 0,5 1 10 0,1 1 0,5 1.500 20 3.000 5 50

Ablauf einer Zellfraktionierung Zellen / Gewebe Lyse und Homogenisierung (Zellaufschluss) In Anwesenheit von Proteasehemmern Trennung der Zellbestandteile durch Zentrifugation Di$erentielle und Dichtegradientenzentrifugation Proteinbestimmung und Überprüfung von Identität und Reinheit der Fraktion Markerenzyme, Western Blot

Bestimmung von Identität und Reinheit der Fraktionen Messung von Markerenzym-Aktivitäten Western Blot und Immunodetektion mit fraktionsspezi"schen Antikörpern

Messung von Markerenzym-Aktivitäten Markerenzyme sind Enzyme, die für eine Fraktion spezi"sch sind: Sie kommen nur in dieser Fraktion vor. Ist eine Aktivität des Markerenzyms in der dafür spezifschen Fraktion messbar: Identität der Probe bestätigt und Fraktion biologisch aktiv. Die Aktivität des Markerenzyms sagt jedoch nichts über den Reinheitsgrad der Fraktion aus! Bestimmung des Reinheitsgrads: Bestimmung der spezi"schen Enzymaktivität von Markerenzymen anderer Fraktionen!! Es werden drei Fraktionen gewonnen: Cytosol, Lysosomen und Hydrohenosomen Daher werden die Aktivitäten von 3 Markerenzymen (von denen jedes für eine der Fraktionen spezi"sch ist) in allen drei Fraktionen bestimmt.

Bestimmung des Reinheitsgrads Enzymaktivität eines hydrogenosomalen Markerenzyms: messbar / nicht messbar Cytosol Hydrogenosomen Lysosomen Cytosol und Lysosomen sind frei von Hydrogenosomen. Cytosol-Fraktion ist mit Hydrogenosomen verunreinigt, die Lysosomen- Fraktion nicht.

Enzymassays im Praktikum Hydrogenosomen: Pyruvat:Ferredoxin Oxidoreduktase (PFOR) Lysosomen: Acid Phosphatase (AP) Cytosol: Malat Dehydrogenase (MDH)

Enzymassay Pyruvat:Ferredoxin Oxidoreduktase PFOR katalysiert in den Hydrogenosomen die Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA. Dabei freiwerdende Elektronen werden auf oxidiertes Ferredoxin übertragen. Im Assay wird Ferredoxin durch Methylviologen (Ammoniumverbindung) ersetzt.

PFOR-Assay Gemessen wird die Reduktion des Methylviologens bei 600 nm. Da reduziertes Methylviologen im Assay gebildet wird, sollte es zu einer Zunahme der Absorption kommen. PFOR ist sauersto$emp"ndlich: reversible Inaktivierung Schutz vor Sauersto$ im Assay: Zugabe von Glucose-Oxidase und Katalase und Überschichtung des Reaktionsansatzes mit Butanol

Enzymassay Acid Phosphatase (AP) AP dephosphoryliert in den Lysosomen Orthoposphat-Monoester zu Alkohol und Phosphat (H 3 PO 4 ). AP ist in den Lysosomen gespeichert und wird bei deren Fusion mit Endosomen aktiv. Da Endosomen im aktiven Zustand angesäuert sind, ist das ph-optimum der AP sauer. gemessen wird die Absorption des 4-Nitrophenolats bei 405 nm

Enzymassay Malat Dehydrogenase (MDH) MDH katalysiert im Cytosol die NAD + -abhängige reversible Umwandlung von Malat in Oxalacetat (im Assay wird die reversible Reaktion gemessen). Gemessen wird der NADH-Abbau bei 340 nm. Es sollte also zu einer Abnahme der Absorption kommen.

Western Blot Als Western Blot wird der Transfer von zuvor im SDS-Gel getrennten Proteinen auf eine Membran bezeichnet. Die Membran besteht aus Nitrocellulose, Nylon oder PVDF (Polyvinyliden#uorid). Nitrocellulose Ober#äche einer Nitrocellulosemembran wikimedia.org static."shersci.com

Western Blot Transfer Die Wanderung der Proteine vom Gel auf die Membran wird durch eine elektrische Spannung induziert. Nylon und PVDF: Haftung durch hydrophobe und polare Wechselwirkungen Nitrocellulose: Adsorption durch ionische und polare Wechselwirkungen

Western Blot Ponceau S Färbung Das Trennungsmuster der Proteine bleibt bei der Wanderung erhalten. Der Nachweis der Proteine auf der Membran kann mit Ponceau S erfolgen. Ponceau S ist ein Azofarbsto$, der reversibel an positiv geladene Aminogruppen der Proteine bindet. Ponceau S Chattopadhyay et al. 2008 PNAS wikimedia.org

Western Blot Immunodetektion Detektion von Proteinen auf der Membran mittels Antikörpern zuerst: Behandlung der Membran mit Magermilchpulver, BSA oder anderen Proteinen zur Sättigung der Membran: Verhinderung unspezi"scher Antikörper- Bindungen an die Membran Inkubation mit Erstantikörper: spezi"sche Bindung an ein Protein auf der Membran Inkubation mit Zweitantikörper: spezi"sche Bindung an den Erstantikörper

Immunodetektion Luminol-Nachweisreaktion der Zweitantikörper muss mit einer Peroxidase gekoppelt sein Peroxidase katalysiert die Oxidation von Luminol durch Wassersto$peroxid in alkalischem Milieu Luminol gerät durch die Reaktion in einen angeregten Zustand, der durch Emission von Licht mit einer Wellenlänge von 428 nm abklingt das Maximum der Lichtemission kann über einen Film oder eine Kamera erfasst werden die geschwärzte Stelle auf dem Film oder dem Foto entspricht der Position des gesuchten Proteins im SDS-Gel

Luminol-Nachweisreaktion SDS-PAGE Film

Methodik der Proteomanalyse Schritt 1: Isolierung der Fraktion, deren Proteom bestimmt werden soll Äußere Ein#üsse Ganze Zelle PROTEOM Einzelne Fraktionen Zellfraktionierung

Methodik der Proteomanalyse Schritt 1: Isolierung der Fraktion, deren Proteom bestimmt werden soll Äußere Ein#üsse Ganze Zelle PROTEOM Einzelne Fraktionen Vorfraktionierung? Schritt 2: Trennung der erhaltenen Proteine Trennung Gel- Analyse