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Assoziation des humanen Urattransporters huratl mit reduzierter renaler Harnsäureexkretion als Ursache der primären Hyperarikämie Dissertationsschrift zur Erlangung eines doctor medicinae (Dr. med.) der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden vorgelegt von Susette Unger aus Chemnitz Dresden 2005
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung und Zielstellung, 2 Theoretische Grundlagen 3 2.1 Definition der Hyperurikämie und der Gicht 3 2.2 Epidemiologie der Hyperurikämie und der Gicht 3 2.3 Klinische Manifestationen der Hyperurikämie 4 2.3.1 Asymptomatische Hyperurikämie 4 2.3.2 Akute Gichtarthritis 5 2.3.3 Interkritische Gicht 5 2.3.4 Chronische Gicht 6 2.3.5 Renale Manifestationen der Hyperurikämie 6 2.4 Ätiologie und Pathogenese der Hyperurikämie 7 2.4.1 Pathogenese der primären Hyperurikämie 7 2.4.2 Pathogenese sekundärer Hyperurikämien 8 2.5 Genetik der Hyperurikämie 8 2.6 Harnsäureentstehung und -exkretion 9 2.6.1 Harnsäureentstehung 9 2.6.2 Harnsäureexkretion 11 2.6.2.1 Renale Harnsäureexkretion 11 2.6.2.1.1 Harnsäuretransportproteine und das Modell des tubulären Harnsäuretransports... 12 2.6.2.1.1.1 Der Urat-Kanal/Transporter UAT 13 2.6.2.1.1.2 Organische Anion-Transporter 14 2.6.2.1.1.2.1 Das Multidrug Resistance Associated Protein MRP4 (ABCC4) 15 2.6.2.1.1.2.2 Der Organische Anion-Transporter 0AT1 15 2.6.2.1.1.2.3 Der Organische Anion-Transporter 0AT3 16 2.6.2.1.1.2.4 Der Urat/Anion-Transporter URAT 1 16 2.6.2.1.1.2.4.1 Molekularbiologische Charakterisierung des URAT1 16 2.6.2.1.1.2.4.2 Funktionelle Charakterisierung des URAT1 17 2.6.2.1.1.2.4.3 Regulation des URAT1 19 2.6.2.1.1.2.4.4 Assoziation des URAT1 mit der Genese der Hypo- und Hyperurikämie 20 3 Material und Methoden 22 3.1 Material 22 3.1.1 Reagenzien und Lösungen 22
3.1.1.1 DNA-Präparation 22 3.1.1.2 Polymerase-Kettenreaktion 23 3.1.1.3 Reinigung der PCR-Produkte 23 3.1.1.4 DNA-Sequenzierung 24 3.1.1.5 DNA-Restriktion 24 3.1.1.6 Agarosegelelektrophorese 25 3.1.1.7 Polyacrylainidgelelektrophorese 26 3.1.2 Geräte 27 3.1.3 Verbrauchsmaterialien 28 3.1.4 Software und Datenbanken 29 3.2 Methoden 30 3.2.1 Definition und Rekrutierung der Patienten- und der Kontrollgruppe 30 3.2.2 DNA-Präparation 32 3.2.2.1 DNA-Extraktion aus Vollblut 32 3.2.2.2 Konzentrationsbestimmung und Verdünnung der DNA-Lösungen 33 3.2.3 DNA-Amplifikation und Sequenzanalyse 33 3.2.3.1 DNA-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion 33 3.2.3.1.1 Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion 33 3.2.3.1.2 Primerkonzeption und Optimierung der Reaktionsparameter 34 3.2.3.1.3 Agarosegelelektrophorese 37 3.2.3.1.4 Reinigung der PCR-Produkte 37 3.2.3.2 DNA-Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Primern 38 3.2.3.2.1 Prinzip der DNA-Sequenzierung 38 3.2.3.2.2 Primerkonzeption und Optimierung der Reaktionsparameter 39 3.2.3.2.3 Polyacrylamidgelelektrophorese 42 3.2.3.2.4 Detektionsverfahren und Sequenzdatenanalyse 43 3.2.4 DNA-Amplifikation und Restriktionsfragmentanalyse 43 3.2.4.1 DNA-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion 44 3.2.4.1.1 Primerkonzeption und Optimierung der Reaktionsparameter 44 3.2.4.2 Restriktion der PCR-Produkte 45 3.2.4.2.1 Prinzip der Restriktionsfragmentanalyse 45 3.2.4.2.2 Auswahl der Restriktionsendonucleasen und Optimierung der Reaktionsparameter 45 3.2.4.2.3 Agarosegelelektrophorese 47 3.2.4.2.4 Polyacrylamidgelelektrophorese 47 3.2.4.2.5 Analyse der Restriktionsfragmentlängenpolymorphisrnen 47
3.2.5 Genetisch-statistische Auswertung 50 3.2.5.1 Genotyp- und Allelfrequenzen der Polymorphismen 50 3.2.5.2 Mathematische Konstruktion von Haplotypen 51 3.2.5.3 Assoziation der Geno- und Haplotypen der Polymorphismen mit klinisch-chemischen Parametern 51 3.2.6 Prädiktion der Sekundärstruktur und der Regulationsdomänen des Urat/Anion- AustauschersURATl 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Charakterisierung der Studienpopulation 53 4.2 Detektion von Polymorphismen im URATl-Gen mittels DNA-Sequenzdaten- und Restriktionsfragmentanalyse 54 4.3 Genotyp- und Allelfrequenzen der Polymorphismen des URATl-Gens 55 4.3.1 Genotyp- und Allelfrequenzen des Polymorphismus P-788 T>A im Promotor; rsl 1602903 56 4.3.2 Genotyp- und Allelfrequenzen des Polymorphismus T258C im Exon 1; rs3825016 56 4.3.3 Genotyp- und Allelfrequenzen des Polymorphismus C426T im Exon 2; rsl 1231825 57 4.3.4 Genotyp- und Allelfrequenzen des Polymorphismus T1309C im Exon 8; rs7932775 58 4.3.5 Genotyp- und Allelfrequenzen des Polymorphismus IVS9+18 C>T im Intron 9; rsl 1231837 59 4.4 Assoziation der Genotypen des URATl-Gens mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 60 4.4.1 Assoziation des Polymorphismus P-788 T>A mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 61 4.4.2 Assoziation des Polymorphismus T258C mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 62 4.4.3 Assoziation des Polymorphismus C426T mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 63 4.4.4 Assoziation des Polymorphismus T1309C mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 64 4.4.5 Assoziation des Polymorphismus IVS9+18 C>T mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 65 4.4.6 Assoziation der genetischen Varianten C274T, delcct 1703-1705 und IVS9-11 T>A mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 66 4.5 Mathematische Konstruktion von Haplotypen und Identifizierung von Risikohaplotypen 66 4.5.1 Mathematische Konstruktion der Haplotypen T258C/C426T 67 4.5.1.1 Frequenzen der Haplotypen T258C/C426T 67
4.5.1.2 Haplotypkombination T258C/C426T und -Verteilung in der Studienpopulation 68 4.5.1.3 Assoziation der Haplotypkombinationen T258C/C426T mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 69 4.5.2 Mathematische Konstruktion der Haplotypen P-788 T>A/T258C/C426T/T13O9C/ IVS9+18C>T 70 4.5.2.1 Frequenzen der Haplotypen P-788 T>A/T258C/C426T/T1309C/ IVS9+18OT 70 4.5.2.2 Haplotypkombination P-788 T>A/T258C/C426T/T1309C/IVS9+18 C>T und -Verteilung in der Studienpopulation 71 4.5.2.3 Assoziation der Haplotypkombination P-788 T>A/T258C/C426T/T1309C/ IVS9+18 C>T mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 72 4.5.2.4 Assoziation der Haplotypkombinationen 1 1, I 2, 1 3 mit klinisch-chemischen Parametern der Harnsäureexkretion 74 4.6 Prädiktion der Sekundärstruktur und der Regulationsdomänen des Urat/Anion- Austauschers URAT1 und Zusammenfassung der Ergebnisse 75 5 Diskussion 77 5.1 Methodenkritik 77 5.2 Diskussion der Ergebnisse 81 6 Zusammenfassung 101 7 Abkürzungsverzeichnis 103 8 Literaturverzeichnis 107 Erklärung Danksagung Veröffentlichungen Thesen