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Einfluss des Anaphylatoxins C5a auf die Funktion proinflammatorischer 6-Sulfo LacNAc-exprämierender dendritischer Zellen (slandcs) des humanen Blutes Dissertationsschrift zur Erlangung eines doctor medicinae (Dr. med.) der medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden vorgelegt von Adele Stephanie Heinrich aus Dresden Dresden 2007
Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V VII VI11 1 Einleitung..., 1 1.1 Dendritische Zellen 1 1.1.1 Definition und Ursprung dendritischer Zellen 1 1.1.2 Heterogenität dendritischer Zellen 2 1.1.3 Dendritische Zellen und T-Zellstimulation 3 1.1.4 Charakterisierung derslandcs 8 1.1.5 Die Bedeutung dendritischer Zellen bei verschiedenen Krankheitsbildern 12 1.1.5.1 Tumorerkrankungen 12 1.1.5.2 Infektionskrankheiten 13 1.1.5.3 Allergien 15 1.1.5.4 Autoimmunität 15 1.1.5.5 Transplantatabstoßung 16 1.2 Das Komplementsystem 18 1.2.1 Aktivierung und Funktion des Komplementsystems 18 1.2.2 Charakterisierung von C5a 20 1.2.2.1 Einfluss von C5a auf die Sekretion inflammatorischer Zytokine 21 1.2.2.2 C5a und systemic inflammatory response syndrome / Sepsis 22 1.2.2.3 C5a und Autoimmunerkrankungen 24 1.2.2.4 C5a und allergische Erkrankungen 25 1.2.2.5 C5a-Defizienz 25 1.2.2.6 Therapeutischer Einsatz von C5a-Antikörpern 26 1.2.3 Der C5a-Rezeptor 26 1.2.4 Expression des C5a-Rezeptors 28 2 Aufgabenstellung 31 3 Material und Methoden 33 3.1 Anaphylatoxinpräparate 33 3.1.1 Rekombinantes humanes C5a 33
3.1.2 Rekombinantes humanes C3a 33 3.1.3 Humanes C5a der Firma Calbiochem 34 3.2 Zellkultur 34 3.3 Zeüpräparation 37 3.3.1 Isolation peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) aus buffy coats, Vollblut und Nabelschnurblut 37 3.3.2 Magnetische positive Anreicherung von slandcs und CD14 + Monozyten aus PBMC 38 3.3.3 Magnetische Depletion von CD4 + / CD45RA + T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut oder Vollblutspenden 40 3.3.4 Magnetische Depletion von slandcs aus PBMC 42 3.3.5 Elutriation von Monozyten aus PBMC 43 3.4 Durchflusszytometräe....45 3.4.1 Anfärbung von Zellen für die durchflusszytometrische Analyse 46 3.4.1.1 Markierung von Molekülen auf der Zelloberfläche 47 3.4.1.2 Intrazytoplasmatische Zytokinfärbung in slandcs und CD14 + Monozyten 48 3.4.2 Durchflusszytometrische Analyse der markierten Zellen 49 3.5 ELISA 49 3.6 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration mittels fluorimetrischer Analyse 51 3.7 Regulation der Expression des C5a- und C3a Rezeptors auf slandcs 54 3.8 Experimente zur T-Zell Stimulation in der gemischten Leukozytenkultur. 55 3.8.1 Präparation der Leukozyten 55 3.8.2 Proliferationsansatz 56 3.8.3 Bestimmung der Proliferation mittels Einbaurate von radioaktiv markiertem Thymidin 57 3.8.4 Ansatz zur T-Zell Differenzierung 57 3.8.5 Bestimmung der T-Zelldifferenzierung anhand der Messung von IFNy und IL-4 mittels Durchflusszytometrie und ELISA 58
4 Ergebnisse... 59 4.1 Expression des C5aR und C3aR 59 4.1.1 Expression der Anaphylatoxinrezeptoren auf humanen dendritischen Zellen des peripheren Blutes 59 4.1.2 Expression der Anaphylatoxinrezeptoren auf frisch isolierten Monozyten, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Granulozyten und NK- Zellen 61 4.1.3 Vergleich der Expressionsstärke des C5aR auf slandcs, Monozyten und Granulozyten 64 4.2 Regulation der Rezeptorexpression.. 64 4.2.1 Rezeptorendichte unter Zellkulturbedingungen 64 4.2.2 Regulation der C5aR und C3aR Expression nach Stimulation mit C5a und C3a 65 4.2.3 Calciummobilisation durch C5a 67 4.3 Phänotypische Maturation dersiandcs.. 72 4.3.1 Phänotypische Analyse der Maturation von slandcs unter Zellkulturbedingungen 73 4.3.2 Einfluss von C5a auf die Ausreifung dersiandcs 74 4.4 Zytokinsynthese 75 4.4.1 lnterleukin-12 76 4.4.1.1 Einfluss von C5a auf die IL-12 Produktion von Monozyten 78 4.4.1.2 Intrazelluläre Messung von IL-12p40/70 in slandcs 81 4.4.1.3 IL-12p40 Sekretion von slandcs 85 4.4.1.4 IL-12p70 Sekretion von slandcs 87 4.4.1.5 Synopsis des Einflusses von C5a auf die IL-12 Produktion 89 4.4.2 lnterleukin-10 90 4.4.2.1 C5a induziert die Produktion von IL-10 90 4.4.2.2 Zusammenhang zwischen der C5a abhängigen IL-10 und IL-12 Prod uktion 92 4.4.3 Tumor Nekrose Faktor-a und lnterleukin-6 als Vertreter proinflammatorischer Zytokine 94 4.4.3.1 TNF-a 94 4.4.3.2 IL-6 95
IV 4.5 T-Zeli Stimulation. 97 4.5.1 Proliferation von naiven T-Lymphozyten 97 4.5.2 Th1 /Th2 Differenzierung naiver T-Lymphozyten 102 4.5.2.1 Durchflusszytometrische Analyse dert-zelldifferenzierung 103 4.5.2.2 IFN-Y und IL-4 Sekretion im ELISA als Maß für die T- Zelldifferenzierung 106 5 Diskussion.. 109 5.1 FunktioneNe Expression des C5aR auf slandcs 109 5.2 Phänotypäsche Saturation von slandcs unter dem Einfluss von C5a 115 5.3 Einfluss von C5a auf die Zytokinsynthese von slandcs 117 5.3.1 Einsatz unterschiedlicher C5a-Konzentrationen 117 5.3.2 lnterleukin-12 119 5.3.3 lnterleukin-10 123 5.3.4 Zusammenhang zwischen der IL-10 und IL-12 Produktion 125 5.3.5 Tumor Nekrose Faktor-a 125 5.3.6 lnterleukin-6 127 5.4 Kontamination des rekombinanten C5a mit LPS 127 5.5 T-Zellstimulation durch slandcs unter C5a 128 5.6 Zusammenfassung 131 6 Literaturverzeichnis... 134 7 Anhang. 164 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 164 Danksagung 165