DNA Genexpressionsnachweis 2: Proteinnachweise Detektion Protein BC-Praktikum II WS 2008/09 Ralf Dürr AG Dietrich
Genom - Proteom Einzelprotein- Analyse Genom größtenteils bekannt eher statisch Proteomik Proteom relativ unbekannt hoch dynamisch aufgrund veränderter Bedingungen (Umweltfaktoren, Temperatur, Genexpression, Wirkstoffgabe etc.), z.b.: Raupe und Schmetterling: gleiches Genom, aber unterschiedliches Proteom! Veränderungen des Proteoms oftmals sehr schnell, z.b. Phosphorylierungen und Dephosphorylierung von Proteinen (wichtig für Signaltransduktion). Erforschung des Proteoms, das heißt der Gesamtheit aller in einer Zelle oder einem Lebewesen unter definierten Bedingungen und zu einem definierten Zeitpunkt vorliegenden Proteine.
Proteomik
Proteomik Proteinanalyse im großen Maßstab Protein-Expressionsprofile, Proteinmodifikationen und Protein- Netzwerke in Relation zu Zellfunktion und biologischen Prozessen, z.b. Entwicklung, Gesundheit und Krankheit
Microarrays modernes molekularbiologisches Untersuchungssystem erlaubt die parallele Analyse von mehreren tausend Einzelnachweisen in einer geringen Menge biologischen Probenmaterials "Genchips" oder "Biochips" (viele Informationen auf kleinstem Raum) DNA-Microarrays Protein-Microarrays
A) DNA-Microarrays Chip mit Oligos bzw. cdnas Probenmaterial (fluoreszenzmarkierte cdna) Genomanalyse, Diagnostik, differenzielle Genexpression Bestimmung der mrna-menge bestimmter Gene 1.) Sonden (Oligos / cdnas) an definierten Positionen eines Rasters, z. B. Glasträger 2.) RNA-Extraktion, cdna- oder crna-synthese mit Fluoreszenzfarbstoffen 3.) Hybridisierung mit Microarrays: markierte cdna/crna Stücke binden an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array Hybridisierung, Exzitation, Auswertung 4b.) Bioinformatischer Signalausgleich, Normalisierung, Auswertung 4a.) Auslesen der Fluoreszenzsignale jeder Position des DNA-Microarrays mittels Lasers
Auswertung der DNA-Microarrays
B) Protein-Microarrays A.) kleine Protein-Mengen auf dem Trägermaterial fixiert Spots: Vielzahl von Testfeldern auf engstem Raum C.) Detektion: Spots mit und ohne Protein- Protein-Interaktion (auch quantitative Detektionsverfahren möglich) B.) Auftrag der zu testenden Probe (Proteinmix / Antikörper)
Einzelprotein-Nachweise
verschiedenen Eigenschaften der Proteine verschiedene Möglichkeiten der Proteindetektion
Methoden der Proteindetektion Objektive Methoden Molekulargewicht Aminosäuresequenz Subjektive Methoden colorimetrisch absorptionsspektroskopisch abhängig von funktionellen Gruppen relative Quantifizierung anhand Proteinstandards Strukturelle Analyse NMR-Analyse (Magnet- Resonanz-Tomographie) Röntgenkristall-Analyse Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion Funktionelle Analyse immunologisch enzymatisch radioaktiv
1. Colorimetrische Methoden Prinzip Quantifizierung von Protein-Farbstoff-Komplexen durch Messung der Absorption bei spezifischer Wellenlänge anhand einer Standardkurve. abhängig von funktionellen Gruppen der Aminosäuren, welche mit einem Farbstoff reagieren keine absolute Quantifizierung verschiedene Assays und Versuchsbedingungen können > 20 % Abweichung hervorrufen Proteine denaturiert infolge von Färbung bei extremen ph-werten
1. Colorimetrische Methoden Assay Prinzip Sensitivität Bradford Coomassie brilliant blue G250 bindet 0.2 20 µg/ml an aromatische und basische AS-Reste Biuret Komplexierung der Peptidbindungen mit 1 20 mg/ml Cu 2+ unter Bildung eines Farbumschlags Bicinchoninic acid (BCA) Reduktion von Cu 2+ durch Peptide unter 0.2 50 µg/ml Bildung eines Farbumschlags Lowry Komplexierung der Peptidbindungen mit 2 100 µg/ml Cu 2+ unter Bildung eines Farbumschlags
1. Colorimetrische Methoden Bradford assay: Coomassie brilliant blue G250 + aromatische od. basische Seitenketten der Proteine (insbesondere Arginin) in saurem Milieu; sehr sensitiv, einfache Durchführung, auch zur Färbung von Proteingelen geeignet Quantifizierung: Absorption bei 595 nm Beeinträchtigung: Sensitivität gegenüber Detergenzien (z. B. sodium dodecylsulfate (SDS)) oder reduzierende Substanzen (z. B. Dithiothreitol (DTT)).
1. Colorimetrische Methoden Biuret assay: (Fehlings Reagenz) A 540; geringe Sensitivität Bicinchoninic acid assay (BCA): Kupferreduktion violett A 562 Lowry assay: (Molybdän- / Wolfram-Heteropolysäure)
1. Colorimetrische Methoden Ninhydrinreaktion exakte Bestimmung der AS-Konzentration nach Hydrolyse des Proteins Ninhydrin reagiert mit freien Aminogruppen der AS. Nach oxidativer Decarboxylierung bildet sich ein Farbnierderschlag (Ruhemanns Purpur) Detektionslimit: 2.5 µg Ruhemanns Purpur Anwendung: Erstellung von Fingerabdrücken Visualisierung der AS im Handschweiß!
2. Absorptionsspektroskopie Prinzip Proteine absorbieren und fluoreszieren im UV-Bereich (1 400 nm) Proteinabsorption wird bei definierter Wellenlänge gemessen Proteine werden nicht denaturiert Assay reaktive Gruppe Detektionslimit (µg/ml) Photometrisch A 280 Tryptophan, Tyrosin 20-3000 A 205 Peptidbindung 1-100 Fluorimetrisch Anregung 280 aromatische AS 5 50 Emission 320-350
Proteindetektion und Charakterisierung
3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese 3.1 1-D-Gelelektrophorese / SDS-PAGE Proteine wandern durch Poren eines Polyacrylamid-Gels innnerhalb eines elektrischen Feldes Molekülgröße und Reinheit eines Proteins
3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese 3.2 2-D-Gelelektrophorese 1-D: erste Trennung nach pi 2-D: Trennung nach Größe (SDS-PAGE) pi-elektrophorese wird einem SDS-Gel aufgelegt Gel mit ph-gradient Gel mit Protein beladen Proteine wandern senkrecht zur 1. Dimension in das SDS-Gel pi-elektrophorese Ende der Auftrennung nach der pi-elektrophorese
3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese 3.2 2-D-Gelelektrophorese Tausende von Proteinen können als einzelne Spots getrennt werden, geeignet zum Vergleich von Protein-Expressionsprofilen verschiedener Zellpopulationen, z. B. unterschiedliche Entwicklungsstadien, Tumor vs. Normalgewebe.
4. Proteindetektion nach Trennung durch Gelelektrophorese Prinzip Direkte Färbung des Gels (Coomassie, Silber, Fluoreszenzfarbstoffe) Indirekt nach Gel-Blotting auf eine Membran Detektion durch Autoradiografie radioaktiv markierter Proteine [ 35 S]. 4.1 Direkte Färbung des Gels Coomassie: bindet unspezifisch an Proteine, die durch Methanol/Essigsäure in einem Polyacrylamid-Gel fixiert sind. Detektionslimit: 0,3 1 µg/proteinbande. Silbernitrat: bindet an chemische Gruppen (Sulfhydryl, Carboxyl etc.). Nach Fixierung wird ein Polyacrylamid-Gel mit Silbernitrat gefärbt. Detektionslimit: 2 5 ng/proteinbande. Fluoreszenzfarbstoffe: z. B. SYPRO-Orange od. SYPRO-Red werden durch UV angeregt. Gefärbte Gele können in einem Transilluminator fotografiert oder mit einem Laserscanner gescannt werden. Detektionslimit: 1 2 ng/proteinbande.
4. Proteindetektion nach Trennung durch Gelelektrophorese 4.2 Detektion durch Gel-Blotting (Western Blot) Proteinübertragung auf Membran durch elektrisches Feld (blotting) Detektion direkt colorimetrisch oder durch spezifische, signalmarkierte Antikörperbindung (India ink: 50 ng; Gold: 3 ng; SYPRO Ruby: 2 ng; Western Blot: 0.1-1 ng Antigen)
Konzentration radioaktiv markiertes Antigen ( 125 J) Kompetitive Bindung eines spezifischen Antikörpers an ein Zielantigen sowie an ein mit bekannter 5. Radio immuno assay (RIA) Bestimmung kleinster Antigenkonzentrationen (0,5 pg/ml, z. B. Hormone, Enzyme, Tumormarker, Arzneimittel) Messung der Strahlungsaktivität der Antigen-Antikörperkomplexe Antigenkonzentration
6. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) Basiert auf spezifischen Antigen- Antikörper-Komplexen, einer der Partner ist immobilisiert Detektion durch einen markierten Antikörper (Enzym, Farbstoff etc.) ELISA erfordert Optimierung hinsichtlich unspezifischer Bindungen (z. B. Bindung an Plastikoberfläche, unspezifische Bindung der Reaktionspartner Reduktion durch Blockierung der unspezifischen Bindestellen nach Immobilisierung der Bindepartner)
6. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)
7. Funktionelle assays Bsp: Enzymdetektion anhand ihrer katalytischen Aktivität Für Nachweis der Expression eines unbekannten Proteins wird das codierende Gen an ein bekanntes Reportergen (z. B. β-galactosidase oder Luciferase) gekoppelt, welches quantifiziert werden kann. Hela/CD4/CCR5/CXCR4 LTR GAG Tat POL VIF VPR VPU TAT REV ENV NEF Assay zur Detektion von HIV-1 infizierten Zellen basierend auf β- gal Reportergen. TAR β-gal
7. Funktionelle assays Detektion der Inhibierung einer HIV-1 Infektion durch reduzierte Expression eines Reportergens Infection of Hela P4/CCR5/CXCR4 with HIV-1 Lai 10 µl 30 µl 50 µl 0 µl Inhibition of infection of Hela P4 with HIV-1 Lai (30 µl) by Tat10 10 µm 25 µm 45 µm
8. Massenspektrometrie Quelle: IZKF Ulm, Dr. Markus Wunderlin
Quelle: IZKF Ulm, Dr. Markus Wunderlin 8. Massenspektrometrie
9. Proteinsequenzierung durch Edman-Abbau Prinzip Aminogruppe der terminalen AS-Reste reagieren mit Phenylisothiocyanat (PITC) zu einer Anilinthiazolin-AS Flüssige oder gasförmige Trifluoressigsäure spaltet die AS-Derivate Konversion der Anilinthiazolin- AS in Phenylthiohydantoin- AS, identifiziert durch reverse Phasechromatografie.
10. Strukturelle Analysen a) Röntgenbeugungsanalyse (X-ray) Atomare Auflösung
a) Röntgenbeugungsanalyse 1.) Züchten eines Proteinkristalls 2.) Synchotron (Teilchenbeschleuniger) - Röntgenbeugung 4.) Computeranalyse und Proteinstruktur in atomarer Auflösung 3.) Streuungsbild
b) Elektronenmikroskopie und 3D- Rekonstruktion 1.) Probenvorbereitung und Elektronenmikroskopie 2.) EM-Aufnahme Keine atomare Auflösung, aber große Proteine möglich! 4.) 3D rekonstruiertes Protein 3.) Picken einzelner Moleküle, Einteilung in Klassen, Winkelbestimmung, Rückprojektion, Computerberechnungen in iterativen Verfahrung um Unschärfe zu minimieren
Fitting a) Röntgenkristallstruktur + b) 3D-Rekonstruktion Struktur im Ganzen: Durch Einpassen der Röntgenkristallstruktur in die 3D- Rekonstruktion! +