Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Im St. Josef Hospital - Universitätsklinik - Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C.

Transkript

1 Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Im St. Josef Hospital - Universitätsklinik - Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger Proliferation und Ausreifung hämatopoetischer Stammzellen des Nabelschnurblutes zu dendritischen Zellen unter veränderten Kulturbedingungen und Kryokonservierung Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Gerrit Scherf aus Hagen (Westf.) 2006

2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. U. Schauer Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. M. Köller Tag der mündlichen Prüfung:

3 Widmung Diese Arbeit ist meiner Frau und unseren Kindern gewidmet. Ihnen gilt meine ganze Liebe. 3

4 Inhaltsverzeichnis Widmung...3 Inhaltsverzeichnis Einleitung Die dendritische Zelle Historie Problem der klaren Zuordnung Phänotyp der dendritischen Zelle Das Beispiel der Langerhans Zelle Dendritische Vorläuferzellen, unreife dendritische Zellen Reife dendritische Zellen Adhäsionsmoleküle und Kostimulantien der dendritischen Zelle Anzucht von dendritischen Zellen aus hämatopoetischen Stammzellen CD 133 und CD DC wachstumsbeeinflussende Zytokine Tumor Nekrose Faktor- (TNF-α) Granulozyten Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (GM-CSF) Stammzellfaktor (SCF) Fms-like Tyrosinkinase 3-Ligand (Flt-3-Ligand) Kryokonservierung von Stammzellen Die Rolle der Stammzellkonservierung Kryobiologie der Zelle Gefrierlösungen Auftauen und Rekultivierung Fragestellung Stammzellisolation Kulturmedium

5 1.4.3 Einfrieren und Lagerung Material und Methoden Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut Isolierung aus mononukleären Zellen Isolierung von CD Stammzellen Isolierung von CD 34 + Stammzellen per MiniMACS- Säulen Isolierung von CD 34 + Stammzellen per AutoMACS Kulturmedien Kultivierung und Anzucht von isolierten Stammzellen Anzucht mit SCF, TNF-α und GM-CSF bis Tag Weiterzucht mit TNF-α und GM-CSF bis Tag Anzucht mit SCF und Flt-3-Ligand Einfrieren, Lagerung und Auftauen von angezüchteten Zellen Einfrieren und Lagerung Darstellung der Oberflächenantigene Färbungen der Oberflächen-Antigene mononukleärer Zellen Durchflußzytometrische Messung Probenzuführung Messung der Lichtstreuung Messung der Fluoreszenz Herstellernachweis Ergebnisse Vergleich der Methoden der Stammzellsortierung bezogen auf Zellzahl und Reinheit Während der Expansion verlieren die Zellen den Marker CD 34 und exprimieren zum Teil CD Vergleich der Medien RPMI und X-Vivo

6 3.4 In RPMI versechsfacht und in X-Vivo verdreifacht sich die Zahl der expandierten Zellen In RPMI reifen expandierte wie nicht expandierte Stammzellen zum gleichen Prozentsatz zu dendritischen Zellen und Makrophagen aus, wogegen bei Expansion in X-Vivo monozytäre CD 14 + Zellen vorherrschen Kryokonservierung von dendritischen Vorläuferzellen Ausreifung dendritischer Zellen aus expandierten und kryokonservierten Stammzellen Diskussion Stammzellisolation Kulturbedingungen Serumhaltiges Medium fördert die Proliferation von Stammzellen Serumhaltiges Medium fördert die Ausdifferenzierung von dendritischen Zellen Aus kryokonservierten Proben lassen sich vermehrt dendritische Zellen anzüchten Zukunftsperspektiven...66 Zusammenfassung...68 Literaturverzeichnis...71 Danksagung Lebenslauf

7 Abkürzungen Abb. Abbildung Ag Antigen Ak Antikörper APC Antigenpräsentierende Zelle CBMC Cord Blood Mononuclear Cells CD Cluster of differentiation CD40L CD40 Ligand CFU-DC Colony-Forming-Unit-Dendritic-Cell CTL Cytotoxic T-Cells d Tag DC Dendritic Cell DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessig Fc Konstantes Antikörperfragment FCS Fetal Calf Serum FITC Fluoresceinisothiocyanat g Gravitationskonstante GM-CSF Granulocyt-Makrophage-Colony- Stimulating-Factor G-CSF Granulocyt -Colony-Stimulating-Factor h Stunde(n) HANKS Hanks balanced salt solution, steril HBSS Hanks balanced salt solution Hepes 2-(N-Hydroxyethylpiperazil)-2 Ethansulfonsäure HLA Humanes Leukozyten Antigen I.E. Internationale Einheiten IFN - γ Interferon Gamma Ig Immunglobulin IL Interleukin LC Langerhans-Cell LPS Lipopolysaccharid MACS Magnet assoziierte Zellsortierung M-CSF Makrophage-Colony-Stimulating-Factor 7

8 Abkürzungen MHC MIIC MicroBead MLR NK-Zellen nt PBMC PCR PE SF Tab. TAP TZR TGF-ß Th-Zellen TNF- Major Histocompatibility Complex MHC-class-II-rich compartment Paramagnetisch markierte Antikörper Mixed Leukocyte Reaction Natürliche Killerzellen naive T-Zellen Peripheral Blood Mononuclear Cells Polymerase Chain Reaction Phytoerythrin Stammzellfaktor Tabelle Transporter-associated with Antigen Processing T-Zell-Rezeptor Transforming-Growth-Factor-ß T-Helfer-Zellen Tumor-Nekrose-Faktor-α 8

9 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Die dendritische Zelle Historie Der Beschreibung der dendritischen Zelle (DC) der Haut von Langerhans im Jahre 1868 (116) folgten Spekulationen über ihre Funktion identifizierten Steinman und Cohn dendritische Zellen, die sie aus der Milz von Mäusen gewannen (207), und starteten eine Reihe von Experimenten, die zeigten, dass aus lymphoidem Gewebe gewonnenen dendritische Zellen potente Stimulatoren der primären Immunantwort sein könnten (94, 205, 206, 240). Die Beobachtung, dass ähnliche Zellen in den nicht-lymphoiden Geweben von Nagern (75, 76, 77) und Menschen (72) präsent waren, kombiniert mit der Feststellung, dass sie eine nicht unwesentliche Rolle in der Abstoßungsreaktion von Herz- und Nierentransplantaten spielten (71, 140, 141), förderten das Interesse an dendritischen Zellen noch zusätzlich. Die Schwierigkeit, dendritische Zellen von Monozyten und Makrophagen zu unterscheiden und die Probleme, dendritische Zellen zu sortieren, bedingten nur einen langsamen Fortschritt. Die allgemeine Annahme besteht nun darin, dass dendritische Zellen diskrete Leukozytenpopulationen von spezialisierten Antigen-präsentierenden-Zellen (APC) repräsentieren, die eine außergewöhnliche Kapazität haben, primäre und sekundäre Antworten von T-Lymphozyten zu initiieren (204) Problem der klaren Zuordnung Heute ist es möglich, dendritische Zellen in Nährmedien anzuzüchten (92, 93, 129, 168, 191). Des Weiteren sind Mediatoren bekannt, welche die Migration von dendritischen Zellen beeinflussen (6). Eine klare Definition von dendritischen Zellen bereitet jedoch immer noch Schwierigkeiten, da sie in verschiedenen Geweben gefunden werden können, und auch verschiedene Phänotypen zu besitzen scheinen. Einige kardinale Eigenschaften dendritischer Zellen konnten bereits aufgezeigt werden. Zum einen sind sie in der Lage, Antigen aufzunehmen, zu prozessieren und an der Oberfläche zu repräsentieren. Zum anderen haben sie die Fähigkeit, 9

10 Einleitung selektiv durch Gewebe zu migrieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen die Fähigkeit besitzen, die Antworten von T- Lymphozyten zu stimulieren und zu dirigieren (204, 177, 238). Sie sind insbesonders in der Lage, naive T-Zellen zu stimulieren und zu aktivieren. Aus diesem Grund, sind sie klar von Makrophagen und Monozyten zu differenzieren. Eine klare Einteilung bereitet dennoch Schwierigkeiten, da verschiedene morphologische Eigenschaften bei dendritischen Zellen zu finden sind und somit auf mehrere verschiedene Populationen, abhängig vom Ursprung bzw. vom Einfluss verändernder Zytokine, geschlossen werden kann. Es wird angenommen, dass es sich bei den verschiedenen Arten von dendritischen Zellen um drei Subpopulationen handelt. Hierbei sind zwei in der myeloischen Reihe zu finden, Langerhans Zellen (LC) und interstitielle DC, und eine in der lymphatischen Reihe, lymphoide DC. Weiterhin gibt es drei Stufen der Entwicklung: Vorläufer DC patrouillieren durch das Blut, unreife DC befinden sich in fast allen Geweben und reife DC in sekundären Lymphorganen. DC scheinen ebenfalls einen entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung von immunologischer Toleranz zu haben. Dendritische Zellen des Thymus präsentieren neuen Thymozyten endogene Peptide, welche die Deletion von selbstreaktiven T-Zellen erlauben. Diese Thymus- DC (7) könnten den gleichen Ursprung haben wie Lymphozyten und natürliche Killerzellen (NK), und wurden deswegen lymphoide dendritische Zellen genannt. Es sind ebenfalls Beweise vorhanden, dass dendritische Zellen eine Rolle im Bereich der peripheren Toleranz spielen. Außerdem ergaben Studien, dass dendritische Zellen direkt B- und NK-Zellfunktionen modulieren können (132, 249) Phänotyp der dendritischen Zelle Das Beispiel der Langerhans Zelle Die Originalbeschreibung der dendritischen Zelle aus der Mausmilz von Steinman und Cohn 1973 zog die Aufmerksamkeit auf die irreguläre Oberfläche der dendritische Zelle, die zahlreiche polymorphe 10

11 Einleitung Zellmembranfortsätze enthielt (207). Interessanterweise adhärierten dendritische Zellen aus der Mausmilz sofort an Kunststoff, wurden allerdings non-adherent nach Kultivierung (207). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen major histocompatibility complex (MHC) II Moleküle in hoher Dichte exprimieren und dass sie ausgenommen effektive Stimulatoren der primären T-Zell-Antwort sind. Dies gilt für allogene gemischte Leukozyten-Reaktionen (MLR) sowie in antigenspezifischen Systemen (90, 205). Interstitielle dendritische Zellen mit hoher Dichte an MHC II Molekülen wurden in den meisten Geweben der Ratte gefunden, Gehirn und Testes ausgenommen (75, 76, 77, 83). Diese interstitiellen dendritische Zellen wurden als aus dem Knochenmark entwickelt und mit relativ niedriger phagozytotischer Aktivität angesehen, haben jedoch ähnliche Charakteristika wie dendritische Zellen der lymphoiden Gewebe (76). Menschliche interstitielle dendritische Zellen wurden zuerst in der Niere beschrieben (10), später auch in anderen Geweben (70). Die Langerhans Zelle (LC) ist ein Beispiel einer dendritischen Zelle und repräsentiert eine Stufe der DC-Entwicklung (177). Die Elektronenmikroskopie zeigt in LC charakteristischerweise Birbeck Granula (177), welche nicht in anderen DC Typen zu finden waren. Als Techniken zur Isolation von LC aus der Haut von Mäusen (242) und Menschen (176) entwickelt wurden, zeigten diese in Kultur ähnliche phänotypische Eigenschaften, wie dendritische Zellen, die aus lymphoiden Geweben stammten. Studien ergaben, dass LC eine starke MLR stimulieren konnten, wenn auch erst nach einer gewissen Zeit in Kultur (91, 194, 216). Langerhans Zellen können anhand der Ausprägung von CD 1a Antigen und der Präsenz von Birbeck-Granula (zytoplasmatische Verbindungen einer Doppelmembran) identifiziert werden. LC sind lokalisiert in basalen und suprabasalen Schichten der Epidermis (105, 178). Die CD 1 Antigene sind nicht-polymorphische Oberflächenproteine und assoziiert mit β2- Mikroglobulin. Strukturelle Ähnlichkeiten mit dem major histocompatibility complex (MHC) sind ebenfalls ersichtlich. An CD 1 Molekülen konnte gezeigt werden, dass sie sowohl Peptide, als auch mikrobielle, nicht- 11

12 Einleitung peptidische und lipidhaltige Antigene T-Zellen präsentieren können (128, 161). Andere Untergruppen von CD 1 wurden auch auf Langerhans Zellen entdeckt. Dermale und migrierende Langerhans Zellen exprimieren CD 1c (44) und CD 1b (171). Die Aktivierung der Langerhans Zelle geht mit einem Verlust von spezifischen Markern wie kutanem Lymphozyten-Antigen (CLA) und Birbeck Granula einher. Eine veränderte Expression der Oberflächen- Adhäsionsmoleküle ermöglicht es der Zelle, in die afferente Lymphe zu gelangen. Langerhans Zellen exprimieren E-cadherin, womit Interaktionen mit Keratinozyten möglich werden. Bei der Reifung wird dieses Molekül herunterreguliert (41, 214) Dendritische Vorläuferzellen, unreife dendritische Zellen Interstitielle dendritische Zellen stellen ein enormes Reservoir an unreifen dendritischen Zellen dar. Sie sind in Geweben und Organen wie Lunge (63, 78, 82, 192, 244), Herz, Niere (5) und der Haut (149, 152) zu finden. Diese Zellen unterscheiden sich von Langerhans Zellen in soweit, dass sie keine Birbeck-Granula und nicht immer CD 1 Antigen aufweisen (218). Nach Antigenexposition oder inflammatorische Stimuli gelangen sie in die afferenten Lymphknoten, wo sie in den T-Zell-reichen Arealen als reife interdigitierende dendritische Zellen (IDC) erscheinen. Interdigitierende dendritische Zellen sind auch in anderen sekundären lymphatischen Organen, wie Tonsillen und der weißen Pulpa der Milz zu finden (21, 73, 204). Im Lymphknoten präsentieren sie prozessiertes Antigen spezifischen T- Zellen, um deren Wachstum und Reifung zu initiieren. Dendritische Zellen interagieren nicht nur mit T-Helfer-Zellen, welche Lymphokine sezernieren, sondern auch mit zytotoxischen T-Effektor-Zellen. Diese zytotoxischen T- Zellen wiederum migrieren zu verletztem Gewebe, um dort Tumorzellen oder Zellen, die mit Viren infiziert sind, zu eliminieren. Die Fähigkeit T- 12

13 Einleitung Gedächtniszellen sowie naive T-Zellen zu aktivieren, machen dendritische Zellen zu spezialisierten antigen-präsentierende Zellen (APC) Antigen-Aufnahme und Präsentation von unreifen dendritischen Zellen Unreife dendritische Zellen können als Folge einer hohen endozytotischen Aktivität sehr effizient eine Reihe von Antigenen aufnehmen, prozessieren und auf MHC-II Molekülen präsentieren. Hier sind vier verschiedene Mechanismen bekannt. Durch Makropinozytose kann die dendritische Zelle sehr viel Flüssigkeit in 1-3 µm großen Vesikeln aufnehmen (188). Weiterhin kann über verschiedene F c -Rezeptoren Antigen effizient aufgenommen werden (133, 189). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Antigen rezeptorvermittelt per Endozytose über den Mannose-Rezeptor (188) und C-type lectin Rezeptor (102) aufzunehmen. Die Aufnahme apoptotischer Zellen und Zellteile über den Vitronectin-Rezeptor zeigt die vierte Möglichkeit (2, 185) Die Präsentation findet auf MHC-Molekülen der Klasse I und II statt. Dendritische Zellen sind effiziente Stimulatoren von B- und T-Lymphozyten (13). B-Zellen als Vorläufer von Plasmazellen, sind direkt in der Lage, Antigen durch den B-Zell-Rezeptor zu erkennen. T-Lymphozyten allerdings sind hierzu nicht in der Lage. Sie benötigen Antigen-präsentierende Zellen, die Antigen prozessieren und ihnen über Rezeptoren präsentieren. T-Zell- Rezeptoren (TCR) erkennen Antigenfragmente, wenn sie an Moleküle des major histocompatibility complex (MHC) an der Oberfläche der APC gebunden sind. Es sind zwei peptidbindende Proteine bekannt, MHC Klasse I und MHC Klasse II, welche zytotoxische T-Zellen und T-Helfer-Zellen stimulieren können. Die Präsentation von prozessiertem Antigen auf MHC-II ist hierbei bedeutend für CD 4-T-Zellen, MHC-I ist wichtig für zytotoxische CD 8-T-Zellen. Intrazelluläre Antigene, in Peptide im Zytosol der APC 13

14 Einleitung aufgetrennt, binden an MHC Klasse I Moleküle und werden von zytotoxischen T-Zellen erkannt und sind somit in der Lage, Zielzellen direkt zu töten. Extrazelluläre Antigene werden per Endozytose aufgenommen, prozessiert und im Allgemeinen auf MHC Klasse II Molekülen an der Oberfläche der APC T-Helfer-Zellen präsentiert, welche somit in der Lage sind, weitere immunregulatorische Effekte zu erzielen Reife dendritische Zellen Während der Ausreifung verändern dendritische Zellen ihren Phänotypus und ihre Funktion. Die Oberflächenmarker unterscheiden reife von unreifen dendritischen Zellen in CD 83, CD 80 und CD 86. CD 83 ist wohl einer der nützlichsten Marker für die Identifikation von reifen dendritischen Zellen (250). CD 83 + Zellen exprimieren, verglichen mit anderen Leukozytenlinien, den höchsten Level an MHC-II Molekülen. Immunhistologische Analysen zeigen, dass CD 83 hauptsächlich auf dendritischen Zellen im Bereich der T-Lymphozyten der lymphatischen Organe gefunden wird. Während der Ausreifung werden viele Moleküle heraufreguliert, eingeschlossen MHC-II (54, 81, 187, 194, 241), ICAM-I (CD 54), LFA-3 (CD 58), CD 11a/c, CD 40, CD 80 (88, 118, 120, 247) und CD 86 (33, 89). Im Gegensatz dazu nimmt die Expression des Fc-Rezeptors bei der Ausreifung der dendritischen Zelle kontinuierlich ab. Ebenso werden manche Zytokine abhängig von dem Stadium ihrer Entwicklung hochreguliert, andere dagegen herunterreguliert (49, 202). Zur Veranschaulichung dient hier Abb

15 Einleitung Abb. 1.1: Sich während der Reifung ändernde Eigenschaften der dendritischen Zelle (59). Reife dendritische Zellen sind in der Lage, T-Zell-Antworten zu initiieren. Diese T-Zellen, einmal aktiviert, sind nun in der Lage, komplexe Immunantworten mit anderen Zellen wie B-Zellen zur Antikörperbildung, Makrophagen zur Freisetzung von Zytokinen und Zielzellen zur Lyse zu bewegen. Unreife DC dagegen sind weniger potente Initiatoren der Immunität, dagegen aber hoch spezialisiert in der Aufnahme und Prozessierung von Antigen, um diese dann auf MHC Molekülen zu präsentieren Adhäsionsmoleküle und Kostimulantien der dendritischen Zelle Während der Migration und verschiedentlichen Interaktion mit T-Zellen sind DC in einer Vielzahl von Adhäsionsereignisse verwickelt. Eine herausragende Funktion von dendritischen Zellen ist hierbei die Fähigkeit, naive T-Zellen zu stimulieren (39, 40). 15

16 Einleitung Die Expression des kutanen Lymphozyten-Antigen (CLA), ermöglicht es den dendritischen Zellen an E-Selectin (CD 62E) von aktivierten endothelialen Zellen zu adhärieren (211, 212). Langerhans Zellen adhärieren an den umgebenden Keratinozyten mit Hilfe von E-Cadherin. Nach Antigenaufnahme regeln Langerhans Zellen E-Cadherin herunter, verlieren die Adhäsion mit umgebenden Keratinozyten und erlauben so eine Migration von der Haut in lympahtische Organe (215). Integrine und interzellulären Adhäsionsmoleküle verhelfen dendritischen Zellen zur Adhäsion und Migration durch Gefäßwände (97). Unreife dendritische Zellen des Blutes können durch CD 49d β-integrin in lymphatische Organe eindringen (26). ICAM-1 und ICAM-2 werden bei Aktivierung der dendritischen Zelle hochreguliert und verhelfen möglicherweise zur Migration von dendritischen Zellen, sowie zur späteren Aktivierung von T-Lymphozyten (17). ICAM-3 auf ruhenden dendritischen Zellen des Blutes wird möglicherweise für die initialen Interaktionen zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen benutzt (74, 203). Während der Reifung nach Antigenaufnahme unterziehen sich dendritische Zellen einer Veränderung in Phänotyp und Funktion. Dies stellt eine Kontrollstelle der Immunität dar. Die Ausreifung beinhaltet eine koordinierte Serie an Veränderungen, wie die Herunterregulierung der Pinozytose und F c -Rezeptoren, Überführung von MHC-II-reichen intrazellulären Kompartimenten zu Oberflächen-MHC-II-Komplexen und die Hochregulierung akzessorischer Moleküle (37, 80, 157, 166, 188). Eine große Anzahl an Agenzien führen zur Ausreifung. Diese beinhalten solche Zytokine wie IL-1, GM-CSF, TNF-α, welche von verschiedenen Zelltypen wie Keratinozyten, Mastzellen, Makrophagen oder T-Zellen sezerniert werden. Für die Fragestellung dieser Arbeit ist speziell GM-CSF und TNF- von besonderem Interesse. Auch andere T-Zell-Produkte wie IL- 2 und bakterielle Produkte wie Lipopolysacharide (LPS) mit Beteiligung von CD 14 führen zur Ausreifung von dendritischen Zellen. Einige Viren, wie beispielsweise Influenza, sind direkt in der Lage, dendritische Zellen zur Ausreifung zu veranlassen (174). Phagozytierte Bakterien induzieren die 16

17 Einleitung Reifung mit einer gesteigerten Synthese von MHC-I- und -II-Komplexen. Außerdem stabilisieren Bakterien MHC-I-Komplexe und erlauben eine effiziente Beladung mit MHC-I-Molekülen (170). Eine weitere interessante Beobachtung ist, dass verschiedene aktivierende Faktoren (LPS, TNF-α, CD 40-Ligand) in der Lage sind, unreife dendritische Zellen vor Apoptose zu schützen (123). Aktivierung veranlasst also die zunächst unreife dendritische Zelle durch Signale wie zum Beispiel TNF-α als spätere reife dendritische Zelle Antigen aufzunehmen, zu präsentieren und in die afferente Lymphwege zu migrieren (193, 233). Zusammengefasst ist die Aktivierung mit einer großen Anzahl von Änderungen verbunden. Eine erhöhte Expression kostimulierender und antigenpräsentierender Moleküle, eine Verringerung der Antigenaufnahme, die erhöhte Stabilisierung der MHC-Klasse I und II Moleküle, Veränderung der Expression von Liganden und Rezeptoren und die Translokation in lymphatische Gewebe spiegeln die Ereignisse einer Aktivierung von dendritischer Zellen wider. 17

18 Einleitung 1.2 Anzucht von dendritischen Zellen aus hämatopoetischen Stammzellen Myeloide dendritische Zellen entstehen in vivo aus hämtopoetischen Stammzellen. Diese Differenzierung kann in vitro nachvollzogen werden. Die Stammzellen werden dazu anhand ihrer Oberflächenmuster CD 133 oder CD 34 isoliert und mit verschiedenen Zytokinen kultiviert CD 133 und CD 34 Vorläuferzellen des Knochenmarkes und des Blutes teilen sich eine große Menge an Oberflächenmarkern mit anderen hämatopoetischen Zellen, machen aber nur 1% des Knochenmarkes und nur 0,5 % des peripheren Blutes aus (225). Der Goldstandard der Strategie der Vorläuferzellselektion bestand in einer Anreicherung von CD 34 positiven Zellen. CD 34 wurde als Marker für hämatopoetische Vorläuferzellen eingesetzt und Techniken zur Selektion wurden weiter verfeinert (46). CD 34 ist ein Antigen, welches mit hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen assoziiert ist. Des Weiteren kann es auch an Endothelien der kleinen Gefäße (55, 113) und Fibroblasten (27) von Embryonen gefunden werden. Reifere Zellen verlieren jedoch schnell das CD 34 Antigen. CD 133 (vormals AC 133) ist ein 5-transmembranes Glykoprotein und befindet sich nur auf CD 34 + hämatopoetischen Vorläuferzellen. Seine Funktion ist bisweit unbekannt (246). Yin et al. fanden heraus, dass CD 133 mit Ausnahme der primärer CD 34 + Zellen nur auf Retinoblastom-, Leukämie- und Teratokarzinomzellen zu finden war, möglicherweise auch auf wenigen Geweben wie Retina, Inselzellen des Pankreas und Plazenta (246). CD 34 und CD 133 werden von primitiven Vorläuferzellen koexpremiert und können als frühe Antigene angesehen werden. 18

19 Einleitung DC wachstumsbeeinflussende Zytokine Hämatopoeseverändernde Wachstumsfaktoren interagieren komplex mit spezifischen Rezeptoren auf der Zelloberfläche der Zielzellen. Für diese Arbeit relevante Wachstumsfaktoren, Mechanismen und Effekte werden nun folgend genauer betrachtet. Hierbei wird auch Bezug auf die allgemeinen biologischen Effekte und Grundlagen genommen Tumor Nekrose Faktor- (TNF-α) Morphologie von TNF-α und TNF-Rezeptor Die Bezeichnung Tumor Nekrose Faktor (TNF) bezieht sich auf zwei eng verwandte und durch zwei separate Gene kodierte Zytokine, TNF-α (TNF, Cachectin) und TNF-β. Beide Zytokine interagieren mit den gleichen Zellmembranrezeptoren, und beide werden als pathogene Mediatoren für menschliche Erkrankungen angesehen. Viele der bisherigen Erkenntnisse beziehen sich auf TNF-α, wobei nur wenig bekannt ist über TNF-β. Tabelle 1.1: Synopsis TNF- Struktur Stimuli zur TNF-α-Freisetzung Membranassoziierte Form 26 kda Sezernierte Form 17 kda Biologisch aktive Form besteht aus einer glockenförmigen Struktur aus drei nonkovalent gebundenen 17 kda Molekülen Bakterielle Toxine: (LPS, Enterotoxin, TSST) Viren: HIV, Influenza Mykobakterien Pilze Parasiten Produkte der Komplementaktivierung Antigen-Antikörper-Komplexe 19

20 Einleitung Zelluläre Quellen Zelluläre Aktivität Serumhalbwertzeit Zytokine Makrophagen Lymphozyten Polymorphkernige Leukozyten Eosinophile Astrozyten Langerhans-Zellen Kupfer sche Sternzellen Zytotoxisch bei einigen Tumorzellen Wachstumsfaktor einiger Tumorzellen Supprimiert LPL in Adipozyten 6-20 Minuten bei iv.-bolus TNF-α wird von Makrophagen und einer Reihe von anderen Zellen als Antwort auf bakterielle Toxine, inflammatorische Produkte und andere Stimuli synthetisiert. Das Gen für humanes TNF-α kodiert ein Prohormon, welches in die Zellmembran als Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 26 kda integriert wird (104, 114, 155). Es sind zwei Typen von TNF-Rezeptoren bekannt, Typ I (TNFR-55) und Typ II (TNFR-75), welche auf fast jeder Zelle mit Ausnahme der Erythrozyten exprimiert werden. Diese Rezeptoren sind strukturell homolog in ihrer extrazellulären TNF-bindenden Domäne, induzieren aber separate intrazelluläre Signalwege (200, 217). Rezeptor- Ligand-Interaktion führt zu einem Cluster von drei Rezeptoren zu einer TNF Trimer (14). Diese Interaktion triggert eine maximale zelluläre Antwort schon dann, wenn mind. 10 % der Membranrezeptoren besetzt sind. Die Internalisation des gebundenen Liganden ist nicht nötig für die zelluläre Aktivierung (51). 20

21 Einleitung Akute biologische Effekte in vivo Die ersten Studien systemischer Gabe von rekombinantem TNF-α berichten über Schocksyndrom und Gewebsverletzungen (222, 224). Innerhalb von Minuten konnten bei intravenöser oder intraarterieller Gabe von TNF-α kapilläre Lecks, Hypoxie, Lungenödem, und Multiorganversagen mit hoher Mortalität verzeichnet werden. Trotz der geringen Halbwertzeit triggert das phasische Auftreten von TNF-α in der peripheren Blutbahn eine Kaskade von Zytokinantworten, die auch noch Stunden nach Gabe persistieren (222, 224). Hämodynamische Studien ergaben, dass TNF-α zu einem geringeren kardialen Auswurf, reduzierten Füllungsdrücken und verminderter Ejektionsfraktion führen, ähnlich dem endotoxischem oder septischen Schock (147). Die Antworten auf TNF-α rühren von direkten Effekten her, aber auch indirekt sind sekundäre Mediatoren integriert. Einige dieser sekundären Mediatoren sind Adrenalin, Noradrenalin, Glukagon, Kortisol, ACTH, Wachstumshormone, Interleukin 1 und 6, γ-interferon, Plättchenaktivierungsfaktor (PAF) sowie eine Reihe von Eikosanoiden Chronische biologische Effekte in vivo Der Effekt einer verlängerten Verabreichung von TNF-α führt zu der Entwicklung von Kachexie charakterisiert durch Anorexie, Gewichtsabnahme, Dehydration und Verlust von Protein und Lipiden. Ähnlich wie bei den akuten biologischen Antworten sind einige Effekte direkt auf TNF-α zurückzuführen, während andere sekundär durch TNF-α getriggert werden. Direkte Wirkung auf den Hypothalamus sind Fieber, Anorexie und die Freisetzung von corticotropin-releasing factor (CRF) (130). Adipozyten TNF-α ausgesetzt zeigten einen Verlust von Lipiden und entwickelten eine Insulinresistenz (19). Myozyten verringerten ihr Ruhemembranpotenzial und zeigten auch eine Insulinresistenz auf einen TNF-α-Reiz (224). Die Wirkung von TNF-α auf die Leber ist ehr anabol. Eine Zunahme der Biosynthese von Akute Phase Proteinen, Lipiden und Zytokinen ist die Folge (56, 66). 21

22 Einleitung Tabelle 1.2: akute und chronische Wirkungen von TNF-α Akut, hohe Dosis Schock und Gewebsverletzung Freisetzung katabolischer Hormone Vascular leakage syndrome ARDS Gastrointestinale Nekrose Akute tubuläre Nekrose der Niere Hämorhagie der Nebenniere Herabgesetzte Muskelmembranpotentiale Dissiminierte intravasale Koagulation (DIC) Fieber Chronisch, niedrige Dosis Gewichtsverlust Anorexie Proteinkatabolismus Lipidverlust Hepatosplenomegalie Subendokardiale Entzündung Insulinresistenz Gesteigerte Rate von Tumormetastasierung Freisetzung von Akute Phase Proteine Endotheliale Aktivierung Biologische Effekte in Geweben TNF-α ist ein wichtiger Mediator bei der Entzündung. TNF-α aktiviert Leukozyten, beschleunigt die Adhärenz neutrophiler Granulozyten und Monozyten an Endothel, ist behilflich bei der Migration von inflammatorischen Zellen in die interzelluläre Matrix, stimuliert die Proliferation von Fibroblasten und triggert die Produktion anderer lokaler proinflammatorischer Zytokine Granulozyten Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (GM-CSF) GM-CSF erhielt seinen Namen durch die Fähigkeit, makroskopische Kolonien zu stimulieren, die neutrophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Makrophagen oder auch Gemische dieser Zelltypen beinhalten (143). Nicht nur die Reifung und Proliferation der myeloischen 22

23 Einleitung Vorläufer wird durch GM-CSF beeinflusst, es stimuliert auch die funktionelle Aktivierung reifer eosinophiler, neutrophiler Granulozyten und Makrophagen (36, 65, 67, 197, 227, 232, 237). Es konnte ebenso gezeigt werden, dass GM-CSF auch Effekte auf nichthämatopoetische Zellen hat (12, 18, 30, 45) GM-CSF sezernierende Zellen Eine Vielzahl von Zellen sind als Antwort auf verschiedene Stimuli in der Lage, GM-CSF zu sezernieren. Lymphatische Zellen, Makrophagen und Mastzellen sind hierzu befähigte Zellen, die an der immunologischen Überwachung beteiligt sind. Ebenfalls können Makrophagen, Endothelialzellen, Fibroblasten und Stromazellen im Bereich des Knochenmarkes zur Produktion von GM-CSF stimuliert werden. GM-CSF konnte nicht im Serum gefunden werden. Seine Produktion scheint auf den Ort der Stimulation beschränkt zu sein. Somit verhält es sich mehr wie ein parakrines als ein klassisches endokrines Hormon. Lokal-immune oder inflammatorische Stimuli veranlassen T-Zellen und Makrophagen in vivo, GM-CSF zu produzieren. Ebenso aktiviert Phagozytose die GM-CSF- Produktion in Makrophagen (96, 219). Die Produktion im Knochenmark ist wahrscheinlich ebenso eine Antwort inflammatorischer Stimuli auf IL-1 und TNF-α von Endothelialzellen und Fibroblasten. Mastzellen, welche eine zentrale Rolle bei allergischen Erkrankungen spielen, reagieren auch mit GM-CSF als Antwort auf IgE-rezeptorvermittelte Aktivierung (159, 243). Weiterhin lässt sich auch bei B-Lymphozyten und NK-Zellen eine GM-CSF Produktion nachweisen (158, 160). Das GM-CSF-Gen ist ca. 2,5 Kilobasen lang und umfasst vier Exons und drei Introns (107). Lokalisiert wurde es auf dem langen Arm von Chromosom 5 in einer Region, wo auch andere hämatopoetische Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren kodiert sind (86). Die Molekülstruktur besteht aus vier α-helices, welche in einem Bündel angeordnet sind (47). 23

24 Einleitung Die Präsenz spezifischer GM-CSF-Rezeptoren konnte auf allen verantwortlichen Zellen der hämatopoetischen Linie, einschließlich Stammzellen des Knochenmarks, myeloiden und erythroiden Vorläufern, aber auch reifen Effektorzellen, wie neutrophile und eosinophile Granulozyten sowie Makrophagen nachgewiesen werden (29, 48) Biologische Wirkung auf hämatopoetische Vorläufer GM-CSF wurde identifiziert als der früher benannte neutrophil migration inhibition factor (NIF-T) (233). Nachdem GM-CSF gentechnisch herstellbar war, konnten eine Reihe von Erkenntnissen gesammelt werden. GM-CSF stellte sich als ein multilinearer Stimulator für Granulozyten-, Granulozyten- Makrophagen- und Makrophagen-Kolonien heraus. Eine Reifung hämatopoetischer Vorläufer wird durch GM-CSF unterstützt. GM-CSF systemisch appliziert verursacht einen deutlichen Anstieg von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten sowie Monozyten im Blut, dosenabhängig assoziiert mit Müdigkeit, Arthralgien, Flüssigkeitsretention und Anorexie Biologische Wirkung auf reife hämatopoetische Zellen Die biologischen Effekte an Granulozyten und Makrophagen fallen in zwei Kategorien: direkte und indirekte Effekte. Die direkten Effekte umfassen die Verlängerung der Lebensspanne der neutrophilen Granulozyten (16), Inhibition neutrophiler Migration (59), Degranulation (106, 172) und Effekte am Zytoskelett (62). Die Effekte von GM-CSF sind schnell und nicht protein-gesteuert. Aus der Bindung an den Rezeptor resultiert eine Hochregulation von G-CSF, M-CSF, IFN-γ und Komplement-Rezeptoren (235). Indirekte Effekte werden durch GM-CSF in Zusammenarbeit mit einem weiteren Stimulus erzielt. Beispielsweise fördert GM-CSF in neutrophilen 24

25 Einleitung Granulozyten den oxidativen Metabolismus (234) und erleichtert somit, Mikroorganismen zu phagozytieren und antikörperbesetzte Tumorzellen zu töten (11). GM-CSF erhöht und moduliert die Expression bestimmter IgG und IgA Fc-Rezeptoren (28). Weiterhin ist GM-CSF ein starker Aktivator von Makrophagen und verringert die Freisetzung von Plasminogen-Aktivator, Prostaglandinen, Interferonen und TNF (36, 68). Weiter wird die Expression von MHC Klasse II Antigenen und anderen Wachstumsfaktoren wie G-CSF und M-CSF induziert (38). Die phänotypische Wandlung von Makrophagen durch GM-CSF steht für einen Wechsel von ruhender zu aktivierter Zellfunktion Stammzellfaktor (SCF) Verschiedene Untersuchungen führten zu der Entdeckung von c-kit und seinem Liganden Stammzellfaktor (SCF), auch bekannt als c-kit ligand, Steel factor und mast cell growth factor. c-kit wurde erstmals auf Zellen der akuten myeloischen Leukämie (AML) mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers identifiziert (58). Ein kda Protein konnte identifiziert werden, welches von normalen hämatopoetischen Vorläuferzellen (10, 35) und stark von Mastzellen in menschlichen Geweben exprimiert wurde (135) Expression von c-kit und SCF In normalen Geweben zeigten frühe Experimente die Expression von c-kit mrna oder Protein in Mastzellen (134, 135, 150), Melanozyten (150), Testis (134) und Knochenmark (230). Ebenfalls konnte c-kit mrna im Gehirn des Embryos gefunden werden (110, 162). Weiterhin konnte die Expression des c-kit Proteins in einer Reihe von nicht-hämatopoetischen Zelltypen inklusive Endothelialzellen der Gefäße (25), Astrozyten, Tubulizellen der Niere, epithelialer Zellen der Brustdrüse und Schweißdrüsen gefunden werden (115, 146). Im menschlichen hämatopoetischen System wird c-kit auf ca. 70% aller CD 34 + Zellen im Knochenmark exprimiert (9, 153, 198). Megakaryozyten sind ebenfalls c-kit positiv (173). Ein kleinerer Teil von menschlichen mononukleärer Zellen des Knochenmarkes mit lymphatischen 25

26 Einleitung Markern exprimiert c-kit (173, 198), was mit dem Effekt von SCF auf die humane Lymphopoese in vitro übereinstimmt (20). c-kit wird bei der Reifung aller hämatopoetischen Linien herunter reguliert, mit Ausnahme von Mastzellen. Es existieren zwei Isoformen des SCF, welche in verschiedenen Geweben variieren (20) Regulation der c-kit-expression Das humane c-kit-gen umfasst 21 Exons aus ca. 80 kb DNA (4, 60, 61, 229), und zeigt ähnliche Eigenschaften wie andere Typ III Rezeptor Tyrosinkinasen, PDGF-Rezeptor, c-fms und Flt-3. Andere Zytokine modulieren hierbei die Spiegel von c-kit mrna und Protein. GM-CSF reguliert c-kit mrna in murinen faktorabhängigen frühen myeloiden Zellen (FDC-PI) trotz der wachstumsfördernden Wirkung von SCF herunter (42, 236). IL-4 reguliert die Expression von c-kit in Mastzellen herunter (196), wobei es komplexe Wirkung auf dessen Reifung ausübt (109, 221). TGF-β modifiziert die Hämatopoese potent (109) und regelt c-kit durch die Beeinflussung der Stabilität der mrna in frühen hämatopoetischen Zellen herunter (50). TNF-α inhibiert den lebensverlängernden Effekt von SCF auf primitive hämatopoetische Vorläufer (98), während die Expression von c-kit der Zelloberfläche herunterreguliert wird (99). In endothelialen Zellen reguliert IL-1 c-kit-rna herunter, während die Expression von SCF gesteigert wird (112). Es wird angenommen, dass die Balance von c-kit und SCF in den Gefäßwänden wichtig ist bei Entzündungsprozessen Rolle von c-kit und SCF bei Überleben, Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Zellen In vitro Experimente zeigten, dass SCF ein potenter Wachstumsfaktor für hämatopoetische Vorläufer ist, welcher synergistisch mit anderen Zytokinen arbeitet (24, 125). SCF stellt für primitive hämatopoetische Zellen ein Überlebensfaktor dar, obwohl er nicht ihre Selbsterneuerung unterstützt (180). Dieser Effekt, was das Überleben betrifft, wurde ebenfalls beobachtet, selbst wenn die Zellproliferation supprimiert wurde (108). Verschiedene 26

27 Einleitung Berichte demonstrieren die Suppression der Apoptose hämatopoetischer Zellen durch SCF, wenn auch die Mechanismen zwischen den verschiedenen Zelltypen variieren. Beispielsweise verhilft SCF NK-Zellen durch die Hochregulation von antiapoptotischem Bcl-2 zu einer längeren Lebenszeit (31). SCF alleine ist in der Lage, unreife hämatopoetische Zellen im menschlichem Blut, Knochenmark oder fetaler Leber entwickeln zu lassen (95, 228). SCF ist ebenfalls ein chemotaktischer Faktor für Mastzellen (142) Fms-like Tyrosinkinase 3-Ligand (Flt-3-Ligand) Struktur des Flt-3-Rezeptors Der Flt-3-Rezeptor gehört zu der gleichen Subfamilie der Tyrosinkinase- Rezeptoren wie c-kit (Stammzellfaktor, Steel Faktor) c-fms und dem plateletderived growth factor (PDGF) A- und B-Rezeptoren. In dieser Familie hat jeder der Rezeptoren 5 immunglobulin-ähnliche Domänen in ihrer extrazellulären Region, sowie Aminosäuren in der Mitte ihrer zytoplasmatischen Domäne der Kinase (124). Flt-3 zeigt sehr starke genetisch-strukturelle Ähnlichkeiten mit c-kit in der Anzahl und Größe an Exons, sowie Grenzen der Exons und Introns (1). Alle Rezeptoren sind anhand ihrer Struktur gleichermaßen an der Hämatopoese beteiligt Expression des Flt-3-Rezeptors Durch die PCR konnten Flt-3-Rezeptoren in menschlicher Leber, Milz, Thymus, Knochenmark und schwach in der Plazenta nachgewiesen werden (180). In Mäusen konnte der Flt-3-Rezeptor nicht nur auf hämatopoetischen Zellen, sondern auch in fetalem und adultem Mäusehirn nachgewiesen werden (131, 181). Im Gegensatz zu den Ergebnissen bei Mäusen, konnten keine Flt-3-Rezeptoren auf reifen hämatopoetischen Zellen des peripheren Blutes gefunden werden (199). Allerdings wurden Flt-3-Rezeptoren sehrwohl auf CD 34 + Stammzellen des menschlichen Knochenmarkes gefunden (139, 199). 27

28 Einleitung Expression des Flt-3-Liganden Der Flt-3-Ligand ist auf menschlichem sowie murinem Geweben weit verbreitet (69, 126, 127). Monozyten des peripheren Blutes tragen ebenso Flt-3-Ligand wie Herz, Plazenta, Lunge, Milz, Thymus, Prostata, Testes, Ovarien, Leber, Skelettmuskel, Nieren, Pankreas und teilweise im Gehirn. Weiterhin wird Flt-3 auf hämatopoetischen Malignomen exprimiert. Beispielsweise konnte mrna Expression von Flt-3 in Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) von B- und T-Zellen, akuten myeloischen Leukämie (AML) gefunden werden (22, 87, 163, 180, 226, 231). 28

29 Einleitung 1.3 Kryokonservierung von Stammzellen Die Rolle der Stammzellkonservierung 1955 fanden Barnes und Loutit heraus, dass kryokonservierte Zellen aus der Mausmilz entnommen, nach Bestrahlung der Tiere in tödlicher Dosis reinjeziert, eine hämatologische Erholung der Mäuse verursachte (15). Ungefähr 40 Jahre später war die Kryokonservierung von Knochenmark Standard in der klinischen Praxis bei autologer Knochenmarkstransplantation (8, 183). Ebenfalls fand die Kryokonservierung erfolgreich Anwendung in der allogenen Knochenmarkstransplantation, wenn auch in geringerem Grade (119). Die Verarbeitung von hämatopoetischen Stammzellen wandelte sich in den letzten 10 Jahren beträchtlich. Stammzellen können nun aus einer Reihe von verschiedenen Quellen gewonnen werden. Die wichtigsten sind hierbei Knochenmark und Nabelschnurblut (46), wobei auch durch G-CSF Stimulation Stammzellen aus dem peripheren Blut gewonnen werden können (3). Dies weiterführend, wurde die Manipulation von Stammzellen möglich. Speziell wurde hier die Selektion von CD 34 + Zellen benutzt, um eine Graft-versus-host-Reaktion möglichst zu reduzieren (151). Die Ex-vivo Expansion von Stammzellen mit Zytokinen, um eine Aplasie nach einer Knochenmarkstransplantation zu reduzieren, wurde ebenfalls untersucht (165). Die Fähigkeit, die Linie der Stammzellentwicklung zu beeinflussen, führte dazu, dass eine Vielzahl an Immuntherapie-Konzepten entwickelt wurden, die auf Stammzellen basierten. Beispielsweise wurden auch hier CD 34 + Zellen mit einer Kombination aus Wachstumsfaktoren kultiviert, um Granulozyten für die Behandlung von Neutropenien während einer Knochenmarkstransplantation zu erhalten (239). CD 34 + Zellen wurden ebenfalls kultiviert, um dendritische Zellen für die Therapie maligner Tumoren zu erhalten (195). 29

30 Einleitung Für den Prozess der Kryokonservierung ist die Verwendung einer geeigneten Lösung essenziell wichtig, um der Alteration durch den Kryoprozess entgegenzuwirken Kryobiologie der Zelle Es wurden mehrere Mechanismen beschrieben, die einen Einfluss auf das Überleben wiederaufgetauter Zellen haben. Anfänglich werden die Zellen in eine Kryokonservierungslösung in Raumtemperatur überführt. Wird die Probe nun abgekühlt, formieren sich Eiskristalle in der extrazellulären Lösung, welche das Wasser der Umgebung als Eis entziehen. Die Entfernung des Wassers bewirkt eine abrupte Änderung der Konzentration der ungefrorenen extrazellulären Flüssigkeit. Um das Konzentrationsgleichgewicht mit der Umgebung aufrechtzuerhalten, wird, dem osmotischen Gradienten folgend, Wasser von intrazellulär nach extrazellulär verlagert. Bei hoher Kühlgeschwindigkeit kann sich nun kein Gleichgewicht mehr einstellen. Die Folge ist, dass sich auch intrazellulär Eiskristalle ausbilden. Dies ist nicht mehr mit dem Leben der Zelle vereinbar (220). Je schneller die Gefriergeschwindigkeit, desto ehr kommt es zu intrazellulärer Eisbildung. Der geschilderte Sachverhalt wird in Abbildung 1.2 dargestellt. 30

31 Einleitung Abb. 1.2: Ein langsames Einfrieren resultiert in osmotischer Beschädigung während der Dehydratation (64). Bei niedrigeren Kühlgeschwindigkeiten ist die Situation komplexer. Zellen, die einer längeren Zeit weit unter 0 C bei somit hohen extrazellulären Konzentrationen ausgesetzt sind, schädigen sich potenziell durch sehr hohe intrazelluläre Konzentrationen (122). Während des Gefriervorganges werden biologische Zellen in kleine Kanäle zwischen den Eiskristallen verlagert. Sinkt nun die Temperatur weiter ab, so nimmt auch die Größe dieser Kanäle ab. Studien belegen, dass die Schäden an den Zellen durch die mechanischen Kräfte der Eiskristallbildung entstehen (85, 136). Das Überleben der kryokonservierten Zellen hängt neben vielen anderen Parametern, aber prinzipiell direkt von der Permeabilität der Zellmembran und der Zusammenstellung der Gefrierlösung ab. Die Gefriergeschwindigkeit ist ein wichtiger Faktor für die Bestimmung der Lebensfähigkeit kryokonservierter Zellen. Ein anderer Faktor scheint die Konzentration der Zellen zu sein. In Studien wurde beobachtet, dass bei 31

32 Einleitung einem hohen Prozentsatz Erythrozyten hämolysierten, wenn die Zellkonzentration zu hoch gewählt wurde (148, 156) Gefrierlösungen Es werden annehmbare Überlebensraten für Gewebe und Zellen nur dann erreicht, wenn sich in Gefrierlösungen protektive Substanzen befinden. Gefrierprotektive Substanzen schützen vor Zellschäden auf verschiedenen Wegen. Einerseits inhibieren sie die Eiskristallbildung intrazellulär, weiterhin setzen sie den osmotischen Gradienten über der Membran herab und letztlich bilden sie eine Art Schutzschicht um die Zelle, ein Prozess, der Vitrifikation genannt wird (Abbildung 1.3). Abb. 1.3: Vitrifikation: Makromolekulare Kryoprotektoren wie Stärke ummanteln die Zellen und schützen so vor Dehydratation (136). Die beiden häufig benutzten Kryoprotektoren sind Dimethylsulfoxid (DMSO) und Glyzerol, andere sind Zucker, Polymere und Alkohole (138). Kryoprotektoren können grob in 2 Kategorien eingeteilt werden: Substanzen, welche die Zellmembranen durchdringen können (kolligative Substanzen) und Substanzen, die ihre Wirkung extrazellulär entfalten (vitrifizierende Substanzen). Einzelne Studien haben versucht, die Wirkungen von Kryoprotektoren zu ergründen. Bei einer Temperatur unter 0 C ist die Nettokonzentration einer ionischen Lösung bei vorhandener kryoprotektiver 32

33 Einleitung Substanz reduziert. Dieser Effekt tritt bei allen kryoprotektiven Substanzen auf (52). Ungeachtet des Mechanismus verringert ein Kryoprotektor die Tonizität der Gefrierlösung, dargestellt in Abbildung 1.4. Kolligative Kryoprotektoren (wie DMSO) durchdringen Zellmembranen, bewirken eine hohe Osmolarität innerhalb und außerhalb der Membran und setzen den Salzgradienten nahezu außer Kraft. Mit einer langsamen Gefriergeschwindigkeit (~1-3 C/min) wird nahezu alles freie Wasser aus der Zelle ausgeschleust und somit die intrazelluläre Bildung von Eiskristallen verhindert (64). Die vitrifizierende Kryoprotektoren (Polymere) ummanteln die Zelle und schützen sie so vor Dehydratation. Abb. 1.4: Kryoprotektoren wie Dimethylsulfoxid (DMSO) penetrieren die Zellmembran und verringern den osmotischen Stress über die Zellmembran (64). 33

34 Einleitung Auftauen und Rekultivierung Das Auftauen von Zellen ist das Gegenstück zur Kryokonservierung, mit vergleichbaren Risiken der Zellschädigung. Studien belegen, dass schnelles Auftauen den geringsten Verlust von Stammzellen bewirkt (64, 84). Die toxische Wirkung von DMSO auf Stammzellen bei kurzem Kontakt ist geringer als zuvor angenommen (23, 184). Der exakte Mechanismus der toxischen Wirkung von DMSO auf Stammzellen ist noch ungeklärt. DMSO ausgesetzte Zellen zeigten verschiedene Veränderungen, wie Alterationen im Zytoskelett oder Kreuzverbindungen von nukleären Proteinen. Der Zellverlust bei der Verwendung von DMSO kann hiermit erklärt werden (53). Über die Veränderung der Proliferation in Folge der Alteration durch die Kryokonservierung in Bezug auf Stammzellen ist nach wie vor nur wenig bekannt und auch im engeren Interesse dieser Arbeit. 1.4 Fragestellung Die nur begrenzte Menge an Stammzellen sowie dendritischer Zellen, welche aus Geweben und Körperflüssigkeiten isoliert werden können, stellt ein Problem in der Therapie und Forschung dar. Eine gute Ausbeute bei Zellisolationen, geeignete Kulturmedien mit optimaler Zytokinsubstitution zur Proliferation sowie eine geeignete Lagerung sind von extremer Wichtigkeit Stammzellisolation Aufgrund der leichten Verfügbarkeit wurden in vorliegender Arbeit Stammzellen aus dem Nabelschnurblut isoliert. Die Isolierung erfolgte mit Hilfe von magnetassozierten stammzellspezifischen Antikörpern. Als Zielmoleküle der Isolation dienten CD 34 oder CD 133, welche auf pluripotenten Stammzellen exprimiert werden. Durch die einfache 34

35 Einleitung Handhabung bei guter Vitalität der Zellen wird heute die magnetassoziierte Zellisolation (MACS) gewählt. Diese Sortierung kann manuell oder alternativ automatisch über das AutoMACS erfolgen. Zwei Antikörper standen zur Verfügung, anti-cd 34 und anti-cd 133. Es sollte geklärt werden, mit welchem Antikörper die höchste Ausbeute zu erzielen ist und ob sich die Stammzellen zur Anzucht von dendritischen Zellen eignen. Darüber hinaus standen zwei Isolationsverfahren zur Verfügung. Die manuelle Sortierung über eine MiniMACS-Säule sowie die maschinelle Sortierung mit dem AutoMACS-Gerät. Diese Verfahren sollten miteinander verglichen werden Kulturmedium Die Stammzellen werden in Kulturmedien zur Differenzierung gebracht. Kulturmedien können prinzipiell mit Seren angereichert werden oder als serumfreie Medien benutzt werden. In der vorliegenden Arbeit sollten RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum mit X-Vivo 15 verglichen werden. Neben den Medien sind für die Differenzierung der Zellen Zytokine unerlässlich. GM-CSF und TNF- haben sich für die Differenzierung von dendritischen Zellen als unerlässlich erwiesen. Darüber hinaus hat sich in Versuchen gezeigt, dass die Zugabe von Stammzellfaktor die Zahl der angezüchteten Zellen erhöhen lässt. Ähnliche Effekte werden in der Literatur Flt-3-Faktor zugeschrieben. In Vorversuchen konnte jedoch kein reproduzierbarer Unterschied unter Verwendung von Flt-3 und SCF gezeigt werden, so dass in weiteren Versuchen nur noch SCF verwendet wurde Einfrieren und Lagerung Es hat sich für die weitere Anwendung als vorteilhaft erwiesen, angezüchtete Zellen in speziellem Einfriermedium zu kryokonservieren. Die Wirkung dieses Einfriervorgangs auf angezüchtete dendritische Zellen sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden. 35

36 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut Das Nabelschnurblut wurde nach Abnabelung des Neugeborenen unter sterilen Bedingungen aus der Vena umbilicalis der Plazenta gewonnen und in sterile 50 ml Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss gegeben. Die Eltern haben der weiteren Verwendung des Nabelschnurblutes zugestimmt. Die Reagenzröhrchen enthielten bereits 7 ml einer keim- und gerinnungshemmenden Pufferlösung, bestehend aus 94% Citrat-Phosphat- Dextrose-Lösung, 2% HEPES-Puffer 1 M, 2% Penicillin/Streptomycin und 2% Amphotericin B 250 µg/ml. Berücksichtigt wurde nur Nabelschnurblut, welches maximal 24 Stunden nach Geburt verarbeitet wurde. Im Labor wurde das Nabelschnurblut in 5 ml Portionen aufgeteilt, mit HANKS Salzlösung im Verhältnis 1:7 verdünnt und mit 15 ml Ficoll-Isopaque (spezifische Dichte 1.077) vorsichtig unterschichtet. Die Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Nabelschnurblut wurde mit einer Ficoll- Isopaque-Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Bei dieser Zentrifugation werden die Erythrozyten und die polymorphkernigen Leukozyten aufgrund ihrer größeren Dichte von den mononukleären Zellen abgetrennt. Diese mononukleären Zellen (Lymphozyten und Monozyten) reichern sich an der Phasengrenze an. Hier können sie leicht abpipettiert werden (siehe Abbildung 2.1). Abb. 2.1: Abtrennung von Lymphozyten mit Ficoll-Isopaque 36

37 Material und Methoden Die Reagenzröhrchen wurden 20 Minuten lang bei 400xg ohne Bremse zentrifugiert. Anschließend wurde die Interphase sorgfältig abgenommen und zweimal mit HANKS Salzlösung gewaschen (10 Minuten, 300xg und 15 Minuten, 200xg). Die erhaltenen Zellen wurden mit einem Nylon-Zellsieb (40µm) von Zelltrümmern und Nabelschnurbestandteilen getrennt, mit Hilfe von Türk scher Lösung in einer Neubauer-Kammer gezählt und abschließend 10 Minuten lang mit 300xg erneut zentrifugiert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass sich die HANKS Salzlösung in gekühltem Zustand befand Isolierung aus mononukleären Zellen Die Isolation hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen wurde mit einer Positiv-Selektion anhand von MiniMACS-Säulen bzw. des AutoMACS (magnetic associated cell sorting) durchgeführt. Die mit magnetischen MicroBeads gekoppelten Antikörper, die sich nach Inkubation bei 6-12 C für bestimmte Zeit an den jeweils spezifischen Oberflächenrezeptoren der Stamm- und Vorläuferzellen befinden, sammeln sich hierbei im Magnetfeld der Magnetsäulen des MACS Separators an und können nach Entfernen aus dem Magnetfeld einfach mit Medium oder Salzlösung eluiert werden Isolierung von CD Stammzellen Für die Anzucht von dendritischen Zellen wurden CD Stammzellen aus den gewonnenen mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes isoliert. Hierbei wurden 1 x 10 8 Zellen in 300 µl HANKS Salzlösung aufgenommen und nachfolgend mit 100 µl Blocking-Reagenz (humanes IgG) und 100 µl CD Antikörper (monoklonale anti-humane IgG1 Maus-AK) bei 6-12 C 30 Minuten lang inkubiert. Hierbei sollte sich ein Volumen von 500 µl pro 1 x 10 8 Zellen einstellen. Nach einem Waschgang (10 Minuten, 300xg) mit 5- fachem Überschuss an HANKS Salzlösung wurde die erste Säule mit 500 µl HANKS Salzlösung vorgespült und die gewaschenen Zellen (aufgenommen 37