Statistische Untersuchungen zu genetisch komplexen Erkrankungen: Beispiel Multiple Sklerose

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1 Aus der Abteilung Molekulare Humangenetik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen Statistische Untersuchungen zu genetisch komplexen Erkrankungen: Beispiel Multiple Sklerose Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum Stefan Böhringer aus Bielefeld Dezember, 2001

2 Statistische Untersuchungen zu genetisch komplexen Erkrankungen: Beispiel Multiple Sklerose - Stefan Böhringer Genetisch komplexe Erkrankungen zeichnen sich ätiologisch durch Beteiligung mehrerer Gene und Umweltfaktoren aus. Dabei ist die genaue Zahl der beteiligten Faktoren sowie die Art der Wechselwirkungen untereinander unbekannt. Unter bestimmten Annahmen läßt sich die Zahl beteiligter Gene aus Konkordanzraten von ein- und zweieiigen Zwillingen abschätzen und ergibt für die Multiple Sklerose (MS) beispielsweise 8-30 beteiligte Gene. Bislang stehen keine ausreichenden statistischen Methoden zur Fallzahlabschätzung für Studien zu genetisch komplexen Erkrankungen, sowie zur Erfassung der beteiligten genetischen Faktoren und zur Analyse deren Wechselwirkungen untereinander zur Verfügung. Um komplexe Erkrankungen wie die MS zu untersuchen, wurde ein statistisches Verfahren entwickelt, das für genetische Assoziationsstudien (Fall/Kontrollstudien) sowohl eine statistische Testung ermöglicht als auch prädisponierende und protektierende Allele und Allelkombinationen aufdeckt. Berücksichtigt wurden insbesondere Wechselwirkung zwischen verschiedenen Allelen, so daß durch simultanes Auftreten von Allelen verursachte Effekte entdeckt werden können (epistatische Effekte). Das statistische Problem des multiplen Testens wurde durch Betrachten einer globalen Nullhypothese berücksichtigt, die zunächst nur nach der Existenz eines Unterschiedes zwischen einer Fall- und Kontrollgruppe fragt. Das Verfahren wurde mittels Simulation validiert. Anhand eines Datensatzes zur MS wurden die Statistiken praktisch angewendet. Es stellte sich heraus, daß mit der verwendeten Statistik auch bei nur mäßigen Unterschieden zwischen den Gruppen sowie bei einem Hintergrund von 40 irrelevanten Loci (bei zwei relevanten Loci) dieser Unterschied statistisch entdeckt werden kann, so daß eine gute statistische Power gewährleistet ist. Liegen epistatische Wechselwirkungen vor, fällt die Power einer Einzellokusanalyse hinter die Statistik, die durch simultane Analyse diesen Effekt direkt berücksichtigt, deutlich zurück (z.b. Power von 12% gegenüber 80%). Die statistische Testung der MS-Daten zeigt eine hochsignifikante Assoziation (p < 2e-4) mit MS unter der globalen Nullhypothese. Eine deskriptive Auswertung zeigt, daß bei den Einzelfaktoren insbesonder IFNA1 und NFKBIA hervortreten. Epistatische Effekte zeigen sich zwischen diesen beiden Loci sowie zwischen HLA-DRB1/NFKBIA aber auch zwischen NFKBIA und weiteren Loci, sowie zwischen CTLA4 und TEA. In der Untergruppe der primär chronisch verlaufenden MS zeigen sich Abweichungen, wobei HLA-DRB1 und der Mikrosatellit D18S41 eine wichtigere Rolle als in der Gesamtgruppe zu spielen scheinen, während IFNA1 in dieser Untergruppe nicht mit MS assoziiert ist. Bei den Paarwechselwirkungen tauchen neue Kombinationen auf, die allerdings zumindestens ein beteiligtes Allel mit der Gesamtgruppe teilt (z.b. CTLA4/LTA). Die entwickelte statistische Methode kann die Versuchplanung genetischer Studien verbessern und bietet die Möglichkeit, vorhandene Datensätze mit verbesserter Power neu zu evaluieren. Mit diesem Verfahren kann die Aussagekraft genetischer Assoziationsstudien deutlich verbessert werden. 2

3 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr 1. Referent: Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen 2. Referent: Tag der mündlichen Prüfung: 3

4 Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungen 8 2. Einleitung Volkskrankheiten als Herausforderung der modernen Genetik Multifaktorielle Erkrankungen Schwierigkeiten der genetischen und statistischen Analyse Ziele der Arbeit Komplexe genetische Erkrankungen Definition Genetische Modelle Polygenie Epistatische Effekte und Abhängigkeiten zwischen verschiedenen Genorten Umwelteinflüsse Genetische Heterogenität Strategien zur genetischen Analyse Kopplungsstudien Assoziationsstudien Vergleich der Strategien Diagnostik Statistische Modellierung komplexer Erkrankungen Bezeichnungen Die Penetranzfunktion Kodominantes Penetranzmodell Additives Modell Rezessives Modell Multiplikatives Modell Allelische Wechselwirkung und epistatische Wechselwirkung Statistiken zur Unterschiedsmessung Kombinatorische Analyse Statistische Testung Statistische Simulation multifaktorieller Erkrankungen Einleitung Modelle Simulation komplexer Erkrankungen Simulationsergebnisse Fehlspezifikation Multiples Testen

5 Deskriptive Analyse Mögliche Probleme und weiterführende Simulation MS Definition Symptomatik und Verlauf Epidemiologie Ätiologische Modelle Genetische Epidemiologie Kandidatengene Die HLA Region NFκB Schlußfolgerungen Auswertung genetischer Typisierungsdaten zur MS Datenmaterial Ethnische Stratifikation des Datensatzes Datenauswertung Statistische Testung Deskriptive Auswertung Diskussion Literatur Danksagungen Lebenslauf 91 A. Implementation 93 A.1. Wahl der Implementationssprache A.2. Genotypdaten A.3. Statistikklassen A.4. Klassen zu Penetranzmodellen A.5. Ausgabeklassen A.6. Datenformat der Eingabe A.7. Programmaufruf A.8. Beispiel-Konfigurationsdatei für die statistischen Simulationen A.9. Datenkonversion A.9.1. Konvertierungsspezifikation A.10. Datenformat der Konfigurationsdateien

6 B. Anhang zu Kapitel B.1. Mathematica-Programm zur Berechnung von Allelfrequenzen unter Selektion B.2. Prävalenz komplexer Erkrankungen B.2.1. Modellvoraussetzungen und Herleitung B.2.2. Modellabweichungen B.2.3. Implementierung der Prävalenzberechnungen C. Anhang zu Kapitel C.1. Statistische Testung D. Anhang zu Kapitel D.1. Koaleszenzprozeß D.1.1. Simulation von Populationen D.2. Formelle Behandlung des Koaleszenzprozesses D.3. Mutationsmodelle D.3.1. Mikrosatelliten D.3.2. SNPs D.4. Verfügbare Rechenleistung D.5. Deskriptive Auswertung D.5.1. Assoziationsmaße D.5.2. Epistatische Effekte D.5.3. Deskriptive Beispielauswertung E. Anhang zu Kapitel E.1. Auflistung paarweiser Wechselwirkungen unter dem kodominanten Modell F. Wechselwirkungsdiagramme für unterschiedliche Modelle, Parameter und Gruppen 145 G. Auszüge der Implementation 178 G.1. Klasse AbstractGenotypeSet G.1.1. Deklaration G.2. Klasse PartitionedCoalescentSet G.2.1. Deklaration G.2.2. Definition G.3. Klasse AbstractCoalescentMutator G.3.1. Deklaration G.4. Klasse MicrosatelliteMutator G.4.1. Deklaration G.4.2. Definition G.5. Klasse SNPMutator

7 G.5.1. Deklaration G.5.2. Definition G.6. Die Klasse CodominantSearcher G.6.1. Deklaration G.6.2. Definition H. Glossar 190 7

8 1. Abkürzungen Abkürzung Erklärung AK Allelkombination Abb. Abbildung Anh. Anhang Bsp. Beispiel bzgl. bezüglich bzw. beziehungsweise d.h. das heißt DNA deoxyribonucleic acid EDSS enhanced disability status score et al. et alii etc. et cetera evtl. eventuell Freq. Frequenz ggf. gegebenenfalls HLA human leucocyte antigen IBD identity by descent IBS identity by state IFNA Interferonα inkl. inklusive insb. insbesondere LTA lymphotoxin alpha J. Jahre Kap. Kapitel LD linkage disequilibrium KI Konfidenzintervall M. Morbus max. maximal MIM mendelian inheritance in man min. minimal MBP myelin basic protein MRCA most recent common ancestor Mik Mikrosatellit MS Multiple Sklerose NFκB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 8

9 Fortsetzung von Tabelle 1. Beginn S. 8. Abkürzung Erklärung NFκBIL nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor-like o.ä. oder ähnlich OMIM online mendelian inheritance in man OR Odds ratio PCR polymerase chain reaction PP-MS primary progressive MS; primär progressive MS REE relativer epistatischer Effekt RR Relatives Risiko RR-MS relapsing remitting MS; schubförmige MS s. siehe S. Seite s.u. siehe unten Tab. Tabelle TCR T cell receptor TNF tumor necrosis factor SK Selektionskoeffizient SNP single nucleotide polymorphism u.a. unter anderem u.ä.m. und ähnliches mehr usw. und so weiter vgl. vergleiche z.b. zum Beispiel ZNS Zentralnervensystem z.t. zum Teil ZV Zufallsvariable 9

10 2. Einleitung Vice Versa Ein Hase sitzt auf einer Wiese, des Glaubens niemand sähe diese. Doch, im Besitze eines Zeisses, betrachtet voll gehaltnen Fleißes vom vis-a-vis gelegnen Berg ein Mensch den kleinen Löffelzwerg. Ihn aber blickt hinwiederum ein Gott von fern an, mild und stumm. Christian Morgenstern 2.1. Volkskrankheiten als Herausforderung der modernen Genetik Volkskrankheiten zählen zu den ätiologisch noch nicht aufgeklärten Erkrankungen. Dabei sind diese Erkrankungen, wie Altersdiabetes, Bluthochdruck, Fettleibigkeit, Glaukom, Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose (MS), Morbus Crohn usw. medizinsch hoch relevant, da sie häufig vorkommen (> 0,1%; Kap. 3.1, S. 14). Auf Grund familiärer Häufungen sowie Zwillingsstudien und genetischen Kopplungsuntersuchungen der letzten Jahre wird diesen Erkrankungen eine genetische Komponente zugeschrieben. Im scharfen Gegensatz zu diesen Volkskrankheiten stehen monogene Erbleiden für die in vielen Fällen kausale Mutationen definiert werden konnten. Von etwa 6000 bekannten mendelnden Erbleiden (OMIM) wurden gut 2000 bereits molekulargenetisch charakterisiert und definiert. Die dazu nötigen Schritte der chromosomalen Lokalisierung und Genisolierung werden immer weiter durch Laborautomatisierungen, effizientere Strategien und leistungsfähigere Computersysteme unterstützt. Zudem wird mit dem Abschluß des Humanen Genomprojektes im Jahr 2003 (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001) ein Zugriff auf jeden Abschnitt des Genoms (etwa mittels polymerase chain reaction: Newton und Graham, 1997) bestehen. Eine gemeinsame Eigenschaft der monogenen Erkrankungen ist dabei (abgesehen von Ausnahmen wie α1-antitrypsinmangel oder cystischer Fibrose) ihre Seltenheit von Prävalenzen um 1:10000 oder weniger. Warum sind häufige Erkrankungen (mit Prävalenzen bis zu 30%) im Hinblick auf ihre Genetik nur mit größten Schwierigkeiten aufzuklären im Vergleich mit seltenen, monogenen Erkrankungen? Ein wichtiger Grund sind die beobachteten Vererbungsmuster. Monogene Erkrankungen zeigen mendelsche Vererbungsmuster entsprechend einem dominanten, rezessiven und/oder geschlechtschromosomalem Erbgang. Stammbäume, in denen gehäuft Volkskrankheiten vorkommen, lassen sich hingegen nicht mit 10

11 einem solchen Vererbungsmuster vereinbaren. Somit liegt kein Ansatzpunkt für eine Kopplungsanalyse im Familienverbund vor (Kap. 3.3, S. 25), die zur Aufklärung monogener Erkrankungen dient. Falls kein einzelnes Gen für die Entstehung einer Krankheit verantwortlich ist, können mehrere Gene Einfluß nehmen und erst in Kombination krankheitsauslösend sein. Zusätzlich können Umwelteinflüsse bestehen, die je nach Erkrankung größere oder kleinere Auswirkungen haben können. Ein Beispiel für einen Umwelteffekt ist bei MS der Breitengrad des Wohnortes in der Kindheit und frühen Jugend (Kap. 6, S. 55) Multifaktorielle Erkrankungen Das Konzept der multifaktoriellen Erkrankung definiert eine Erkrankung als von verschiedenen genetischen sowie Umweltfaktoren abhängig. Dieses Modell kann an vielen Stellen unterschiedlich komplex formuliert werden, um z.b. Wechselwirkungen zwischen Genen (sogenannte epistatische Effekte) o.ä. zu erfassen (Kap. 3, S. 14). Volkskrankheiten müssen als multifaktorielle Erkrankungen angesehen werden, sofern ein genetischer Einfluß existiert. Dieser läßt sich durch Vergleich von ein- und zweieiigen Zwillingspaaren abschätzen, da ein gleiches Spektrum an Umweltbedingungen angenommen, und der Einfluß der unterschiedlichen genetischen Verwandtschaft untersucht werden kann. Für genetische Studien zu komplexen Erkrankungen stellt die Rekrutierung von Multiplexfamilien (Familien mit mehreren Erkrankten) bzw. von betroffenen Verwandtenpaaren (z.b. Geschwister), wie sie für Kopplungsanalysen benötigt werden, ein praktisches Problem dar, das sich häufig nicht lösen läßt. Zudem sind Kopplungsstatistiken bei gleichen Stichprobenumfängen Assoziationsstatistiken hinsichtlich der statistischen Schärfe häufig unterlegen (Kap. 3.3, S. 25). In dieser Arbeit werden Assoziationsstudien betrachtet, bei denen eine Fall- mit einer Kontrollpopulation verglichen wird (im Fall familienbasierter Assoziation werden diese Gruppen rekonstruiert; s. Kap. 3.3). Grundsätzlich existieren dabei zwei Vorgehensweisen zur Aufklärung des genetischen Einflusses auf eine Erkrankung. Zum einen lassen sich aus den Informationen, die über die Erkrankungen vorhanden sind, mögliche Kandidatengene ableiten, die für die Krankheitsentstehung verantwortlich sein könnten (Kap. 6.5, S. 56); zum anderen können über das Genom gleichmäßig verteilte Loci ausgewählt und untersucht werden (sogenannter genome screen), in der Hoffnung, daß Allele eines untersuchten Lokus mit Allelen eines krankheitsrelevanten Lokus im Kopplungsungleichgewicht stehen (d.h. das untersuchte Allel enthält Information über das krankheitsrelevante Allel; Kap , S. 25) Schwierigkeiten der genetischen und statistischen Analyse Der Kandidatengenansatz kann nur dann einen Beitrag zur Analyse der genetischen (Mit-)Bedingtheit liefern, falls krankheitsrelevante Gene tatsächlich unter den untersuchten zu finden sind. Dieses Manko scheint ein genome screen zu umgehen, doch 11

12 ist gegenwärtig noch unklar, wie viele Loci tatsächlich untersucht werden müssen, um das gesamte Genom auf relevante Gene abzusuchen. Pessimistische Schätzungen gehen von Loci aus (Kruglyak, 1999), die von gegenwärtigen Studien noch nicht erreicht werden. Experimentelle Ergebnisse weisen jedoch darauf hin, daß regionenabhängig weit weniger Loci untersucht werden müssen (Abecasis et al., 2001; Reich et al., 2001). Aufgrund des hohen Typisierungsaufwandes eines genome screens, werden genetische Untersuchungen heutzutage u.a. mit gepoolter DNA, d.h. unter getrenntem zusammenpipettieren der DNA von Patienten und Kontrollen, durchgeführt (Gödde et al., unveröffentlichte Ergebnisse). Dadurch geht allerdings die Information über epistatische Effekte verloren, da keine Rückschlüsse auf Frequenzen von Allelkombinationen an verschiedenen Loci möglich sind. Bisherige Studien zu multifaktoriellen Erkankungen konnten nur wenige Gene (als Einzelfaktoren) als krankheitsbeeinflussend reproduzierbar aufdecken. Ein Problem von Studien zu multifaktoriellen Erkrankungen stellt die Interpretation der statistischen Ergebnisse dar. Solche Ergebnisse, selbst wenn sie statistische Tests einschließen, müssen als explorative Datenanalyse aufgefaßt werden (diskutiert z.b. in Böhringer et al., 2000; Bender und Lange, 1999; Perneger, 1998). Dies hat seinen Grund darin, daß Studien zu diesen Erkrankungen keine abgeschlossenen Einheiten darstellen, da sequentiell viele Einzeluntersuchungen an jeweils etlichen Loci durchgeführt werden. Eine Korrektur über den gemeinsamen statistschen Fehler aller Loci mit Standardverfahren (Troendle, 1996; Holm, 1979) führt zu praktisch sinnlosen Ergebnissen, da die Korrekturfaktoren beliebig groß werden. Insofern scheint eine regionweise, unkorrigierte Interpretation genetischer Assoziationen sinnvoll (Böhringer et al., 2000), die dann als deskriptive Analyse zu werten ist Ziele der Arbeit Ein Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, statistische Methoden zu entwickeln, die die oben angesprochenen statistischen Schwierigkeiten umgehen oder abschwächen. Das Problem der statistischen Korrektur wird durch Betrachten einer globalen Nullhypothese angegangen. Die globale Nullhypothese fragt nur nach der Existenz eines Unterschiedes zwischen Fall- und Kontrollgruppe. Aus dem statistischen Test kann nicht geschlossen werden, welche Marker (s. Glossar) oder Markerkombinationen Krankheitsrelevanz haben. Andererseits liefert dieser Test ein Ergebnis für den gesamten Datensatz, das nicht weiter korrigiert werden muß. Der Test soll auch Wechselwirkungen zwischen Genen berücksichtigen, so daß eine simultane Untersuchung mehrerer Loci erfolgt. Die Güteeigenschaften des Tests (Power) werden durch Simulationen untersucht und Stichprobenumfänge für einige mögliche Situationen bestimmt (Kap. 5.3, S. 40). Der Vorteil einer simultanen Analyse gegenüber herkömmlicher Einzellokusanalyse wird für einen Fall simuliert (Kap , S. 43). Eine globale Hypothesentestung muß durch eine deskriptive Analyse ergänzt werden, um den Datensatz interpretieren zu können. Dazu werden Einzelallele sowie Allelkombinationen hinsichtlich gewisser Assoziationsmaße sortiert, die einer Interpre- 12

13 tation zugänglich sind. Außerdem werden graphische Darstellungen entwickelt, die eine sehr schnelle Orientierung über einen Datensatz zulassen (Kap , S. 47). Eine Simulation der deskriptiven Auswertung liefert Richtlinien für die Interpretation realer Daten (Kap ). Die betrachteten Statistiken sind abhängig von globalen Parametern, etwa die Zahl der in eine simultane Analyse einzubeziehenden Loci. Relativ einfache Überlegungen lassen es jedoch zu, grobe Abschätzungen etwa über die Zahl beteiligter Gene zu treffen (Kap , S. 21), die helfen können globale Parameter festzulegen. Die entwickelten Analysemethoden werden auf genetische Daten zur MS angewandt, um an einem bereits bestehendem genetischen Datensatz die Methoden zu demonstrieren und zu diskutieren. 13

14 3. Komplexe genetische Erkrankungen 3.1. Definition Als genetisch komplex werden solche Erkrankungen bezeichnet, für die zwar ein genetischer Einfluß als gesichert gilt, der Erbgang selbst aber nicht den klassischen Mendelschen Regeln folgt und die eine Prävalenz > 0,1% aufweisen. Der Nachweis der Erblichkeit wird u.a. über Zwillingsstudien durch Vergleich der Konkordanzraten von ein- und zweieiigen Zwillingen geführt, wobei der Unterschied zwischen den Konkordanzraten ein Maß für die Stärke des genetischen Einflusses ist. Tabelle 1 listet exemplarisch einige wenige Volkserkrankungen auf, die als genetisch komplex anzusehen sind. Die Häufigkeit dieser Volkskrankheiten übertrifft die der Erbkrankheiten im engeren Sinn bei weitem. Volkskrankheiten beschäftigen die Medizin viel intensiver als alle anderen Erkrankungen zusammengenommen (monogene Erbkrankheiten, Traumata, Infektionen, Vergiftungen und sonstige Notfälle). Es ist davon auszugehen, daß auch Anfälligkeiten für eine Vielzahl an Umwelteinflüssen genetisch beeinflußt sind, so daß die genannte Gruppe der Nicht-Volkskrankheiten weiter einzuschränken ist. Tabelle 1: Exemplarisch ausgewählte komplexe genetische Erkrankungen mit epidemiologischen und genetischen Daten. Erkrankung Prävalenz Mendelnde Loci Prädisponierende Loci Neurologische Erkrankungen M. Parkinson 2% > 60J. r PARK1-PARK6 a, Synuclein b ApoE2, Immunmodulatorische Gene c ApoE4 d Alzheimer 3% > 70J. βapp, Presenilin 1, Presenilin 2 10% > 80J. Schizophrenie 1% 22qDS 1q21-q22, 13q32 e MS 0,1-0,15% - HLA-DRB1/DQA2 f Metabolische Erkrankungen Hypertonie 30% > 45J. ENaC, CYP11B1/CYP11B2, HSD g Angiotensinogen, α-adducin, β 2 -adrenoreceptor g Adipositas 30% - 40% - Pro-opiomelanocortin (POMC), β-3-adrenergic receptor (ADRB3) h 14

15 Fortsetzung von Tabelle 1. Beginn S. 14. Erkrankung Prävalenz Mendelnde Loci Prädisponierende Loci Erkrankungen des Immunsystems M. Crohn 0,03% - 0,1% i - IBD1 j Colitis ulcerosa 0,01% - 0,09% i - - Rheumatoide 2% - HLA-DRB1 k Arthritis Asthma < 30J. 5% - 10% l - 14q32? m bronchiale > 30J. 1% Systemeigenschaften Krebsanfälligkeit >70 J. 0.3% z.b. RB1 n, MSH2 o p53: Progression p Toxizitätstoleranz - - z.b. P450, G6PD, NAT1, NAT2 q Inzidenz pro Jahr (Nepomuk et al., 1999) a Polymeropoulos (2000), b Krüger et al. (1999), c Krüger et al. (2000), d Selkoe (2001), e Bassett et al. (2001), f Epplen et al. (1997), g O Shaughnessy (2001), h Comuzzie et al. (2001), i Adler (1996), j Cavanaugh (2001), k Jawaheer et al. (2001), l Heppt et al. (1998), m Xu et al. (2001), n MIM 18020, o MIM , p MIM , q Nebert und Roe (2001) r Jahre (J.) 3.2. Genetische Modelle Polygenie Da bei komplexen Erkrankungen für den Großteil der Patienten kein Hauptlokus verantwortlich ist, liegt für die Krankheitsentstehung die Vermutung nahe, daß mehrere Gene gemeinsam Einfluß auf die Krankheitsentstehung ausüben. Dies kann z.b. über additive Effekte geschehen, indem jedes Allel einen unabhängigen Beitrag zur Erkrankungswahrscheinlichkeit liefert. In diesem Fall ist das Konzept der genetischen Determination aufgegeben, da es keine Allele oder Allelkombinationen gibt, die für sich genommen, notwendig für die Krankheitsentstehung wären. Statt dessen verändert ein Allel die Krankheitsanfälligkeit (liability; Risch, 2000). Ein solches polygenes Modell kann z.b. Prävalenz, Wiederholungsrisiko und den Beitrag der Umwelt bzgl. Volkskrankheiten gut erklären. Ebenso können experimentelle Untersuchungen dieses Modell stützen. Bei der MS z.b. ist gut belegbar, daß kein einzelner Lokus für das Leiden prädisponiert, sondern eine Reihe von verschiedenen Faktoren (Hemmer und Epplen, 2001; Epplen et al., 1997). Zusätzlich ist es möglich, daß das Erkrankungsrisiko bei gemeinsamem Auftreten bestimmter Allele von einer additiven Vorhersage abweicht. 15

16 In diesem Fall spricht man von epistatischen Effekten, die das polygene Krankheitsmodell komplizieren (Kap ). Wiederholungsrisiken für Volkskrankheiten in der Familie Das Wiederholungsrisiko für Volkskrankheiten, sofern ein betroffener Elternteil vorliegt, beträgt in der Regel wenige Prozent (z.b. MS 1-2%), ist aber gegenüber der Allgemeinbevölkerung um ein Vielfaches erhöht (MS: 0,1%). Dies ist mit der Annahme vereinbar, daß ein Kind im Mittel die Hälfte der prädisponierenden Allele erbt und oft unter ähnlichen - für die Erkrankung relevanten - Umweltbedingungen aufwächst wie die Eltern (Kap ). Abb. 1 zeigt die Risiken für Verwandte eines Indexpatienten, an MS zu erkranken. Diese epidemiologischen Maßzahlen können unter entsprechenden Modellannahmen zur Schätzung von Zahl und Frequenz beteiligter Allele genutzt werden (s. Kap ). Elter 10-20x Ehepartner 1x Geschwister 20-30x Eineiiger Zwilling x Kind 10-20x Abbildung 1: Risiken für Verwandte einer Indexpatientin (schwarz), an MS zu erkranken. Häufigkeiten von Volkskrankheiten in der Bevölkerung Definitionsgemäß sind Volkskrankheiten als komplexe genetische Erkrankungen in der Bevölkerung häufig im Vergleich zu monogenen Erbleiden. Tabelle 2 listet Wahrscheinlichkeiten auf, wenigstens ein prädisponierendes Allel zu tragen, falls eine bestimmte Zahl an Loci (und damit Allelen) und eine bestimmte Verteilung der Allelfrequenzen angenommen wird 1. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Wahrscheinlichkeit, wenigstens ein prädisponierendes Allel zu tragen sowohl mit der Frequenz 1 Die Allelfrequenzen werden dabei als gleichverteilt auf dem Intervall 0 x angenommen, wobei x der in der Spalte Häufigst. Frequenz angegeben ist. Diese Gleichverteilungsannahme ist gut vereinbar mit einer Reihe von populationsgenetischen Modellen ohne Selektion, z.b. Wright-Fischer oder das Arche-Noah-Modell (Spiess, 1977, Kap. 12). Im vorliegenden Fall sind die Allelfrequenzen 16

17 der Allele als auch mit der Zahl der Loci schnell steigt 2. Erkrankungen wie Bluthochdruck, M. Alzheimer oder M. Parkinson erreichen in der Bevölkerungsgruppe > 60 J. Prävalenzen von 30, 10 bzw. 3%. Diese Beobachtungen sind nicht vereinbar mit einem monogenen Erbgang, bei dem die Fitness eines Allels auch nur geringfügig vermindert ist. Abb. 2 3 zeigt (durchgezogene Linie) die Frequenz eines Allels mit einem Selektionskoeffizienten (SK) von 0,1 (d.h. 10% der Allelträger werden selektiert) im Verlauf von 100 Generationen unter haploider Selektion (d.h. Selektion gegen Homound Heterozygote; Spiess, 1977, Kap. 14). Dabei verschwindet das Allel praktisch Allelfrequenz Zahl der Generationen Abbildung 2: Allelfrequenzen eines selektierten Allels über 100 Generationen mit einem Selektionskoeffizienten von 0,1. Gestrichelt: haploide Selektion, durchgezogen: Selektion gegen Homozygote. vollständig nach 40 Generationen. Dieser exponentielle Frequenzabfall ist mit einer konstanten Prävalenz nicht vereinbar. Zwar können auch monogenen Erkrankungen nahezu Fitness-neutrale Allele zugrunde liegen, jedoch ist insbesondere ein polygenes Krankheitsmodell mit hohen Prävalenzraten vereinbar. Ein Allel mit für sich genommen durchschnittlicher bzw. überdurchschnittlicher Fitness, das einen geringen Beitrag zur Erhöhung des Krankheitsrisikos liefert, wird im Genpool (s. Glossar) verbleiben, selbst wenn es in Kombination mit anderen Allelen die Krankheit auslöst und Erkrankte eine verminderte Fitness aufweisen. Richtet sich die Selektion gegen Genotypen, so kann ein anderes Bild entstehen. parametrisiert, d.h. die Frequenzen sind fest in der Reihenfolge nx n die größte Frequenz ist und n die Zahl der beteiligten Loci ist. 2 Die Erkrankungswahrscheinlichkeit steht noch mit der Häufigkeit auslösender Umweltbedingungen n 1 x x n n gewählt, wobei x in Verbindung, s. Kap s. Anh. B.1 für ein Mathematica-Programm zur Berechnung der Allelfrequenzen. Eine Herleitung der Formeln findet sich in (Spiess, 1977, Kap. 14). 17

18 Tabelle 2: Häufigkeit wenigstens eine prädisponierende Allelkombination zu tragen, gegeben eine Zahl an Loci, wobei die Frequenz des häufigsten Allels in der Spalte Häufigst. Frequenz angegeben ist (s. Text). Zahl d. Loci Häufigst. Frequenz Häufigkeit 2 0,001 0, ,001 0, ,001 0, ,2 0, ,2 0, ,2 0, ,4 0, ,4 0, ,4 0, ,6 0, ,6 0, ,6 0,998 Selektion gegen einen homozygoten Genotyp läßt ein Allel mehrere tausend Generationen im Genpool verbleiben, falls die Selektion relativ gering ist (Abb. 2, durchgezogene Linie). Tritt Selektion gegen beide homozygoten Genotypen an einem biallelischen Marker auf (sog. Überdominanz), so bleiben beide Allele auf Dauer im Genpool vorhanden (Abb. 3). Die resultierenden Allelfrequenzen hängen von der Größe der Allelfrequenz Zahl der Generationen Abbildung 3: Effekte von Überdominanz über 80 Generationen mit einem Selektionskoeffizienten (SK) von 0,1 für einen homozygoten Genotyp und einem SK von 0,1 (durchgezogen), 0,2 (gepunktet), 0,3 ( gestrichpunktet ) für den anderen homozygoten Genotyp. 18

19 SK ab und können beliebige Werte annehmen. Falls ein Genotyp-Selektionsmodell auf mehrere Loci verallgemeinert wird, d.h. nur bestimmte Genotype- bzw. Allelkombination einen überdurchschnittlichen SK aufweisen, werden alle zugehörigen Allele im Genpool verbleiben. Diese Überlegung schließt auch Wechselwirkungen zwischen Allelen ein (s.u.), da sie die Abweichung der Fitness der Allelkombination von einer additiven Vorhersage beschreibt. Eine andere Überlegung betrifft Erkrankungen mit hohem Manifestationsalter nach der Reproduktionsphase. In diesem Fall haben krankheitsprädisponierende Genotypen nur einen sehr indirekten Einfluß auf den Reproduktionserfolg und sollten daher auch nur einer sehr schwachen Selektion unterliegen. Tatsächlich zeigt Tab. 1 (S. 14), daß gerade für spät manifestierende Erkrankungen wie M. Parkinson und M. Alzheimer (mit sogar infauster Prognose) mendelnde Loci mit monogenem Erbgang bekannt sind, die die These fehlender Selektion auf die zugehörigen Allele stützt. Andererseits können mendelnde Loci für die aufgeführten Erkrankungen immer nur einen z.t. kleinen Teil der Erkrankungen erklären. Die Erkranktengruppe, bei der eine mendelnde Mutation nicht auftritt, scheint nach wie vor am plausibelsten durch ein polygenes Modell erklärbar zu sein, da einerseits die Suche nach mendelnden Loci in dieser Gruppe erfolglos verlaufen ist (s. Kap. 3.3, S. 25), andererseits neue Umweltbedingungen in den meisten westlichen Populationen auftreten, wie verlängerte Lebenserwartung, voranschreitende medizinische Entwicklung, Ernährungsgewohnheiten u.a., so daß die Auswirkungen auf den Genpool durch Selektion auf nachteilige Allelkombinationen noch nicht beobachtbar sind. Klinische Heterogenität bei Volkskrankheiten Sind viele Genorte an der Pathogenese eines Krankheitsbildes beteiligt, so ist wahrscheinlich, daß die Beiträge der Einzelallele nicht unabhängig sind, sowie der weitere genetische Hintergrund eines Individuums eine Rolle spielen kann. Krankheitsmodifizierende Gene ohne einen prädisponierenden Einzelbeitrag können die individuelle Symptomatik bestimmen (epistatische Effekte, s.u.). Zwar unterscheiden sich multifaktorielle Erkrankungen in dieser Hinsicht nicht prinzipiell von monogenen Erkrankungen, jedoch ist es sehr unwahrscheinlich, daß eine multifaktorielle Erkrankung ein homogenes klinisches Bild zeigt. Z.B. ist die klinische Definition der MS dadurch erschwert, daß es keine obligaten klinischen oder pathologischen Symptome gibt (Hemmer und Epplen, 2001). Diese variable phänotypische Ausprägung der Erkrankung (Expressivität) ist gut durch die Beteiligung mehrerer Gene zu erklären. Resistenz gegen klassische genetische Untersuchungsverfahren Klassische Kopplungsanalysen im Familienverbund sind für multifaktorielle Erkrankungen ungeeignet. Aufgrund des geringen Wiederholungsrisikos im Vergleich etwa zu dominant vererbten Erkrankungen, weisen Stammbäume nur wenige erkrankte Familienmitglieder auf, was die Schärfe (Power) der Kopplungsanalyse reduziert. Als Alternative bieten sich Kopplungsanalysen mit erkrankten Verwandtenpaaren 19

20 (z.b. sib-pairs), familienbasierte Assoziationsstudien (trios) oder Fall/Kontrollstudien an. Bei letzterer Strategie werden erkrankte Personen selektiv rekrutiert, so daß die Prävalenz bzw. das Wiederholungsrisiko nur eine untergeordnete Rolle spielt. Solange diese Analysen die Effekte genetischer Loci einzeln und nicht simultan untersuchen, können nur unabhängige Effekte aufgedeckt werden, nicht aber Wechselwirkungen zwischen Loci (epistatische Effekte, s.u.). Da einerseits unabhängige Einzeleffekte klein sein können, andererseits Wechselwirkung wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielen, wird erklärlich, daß bisher nur geringe Erfolge durch solche Studien zu verzeichnen sind. So sind z.b. für die Schizophrenie nur vereinzelt Loci identifiziert worden, die in mehreren Studien als prädisponierend nachgewiesen werden konnten (Bassett et al., 2001). Dies gilt mit Einschränkungen ebenso für die MS (s. Kap. 6, S. 55) und andere multifaktorielle Erkrankungen. Multifaktorielle Erkrankungen sind populationsgenetisch zu erwarten Ist die Fitness von heterozygoten gegenüber der von homozygoten Individuen erhöht, spricht man von Überdominanz (super dominance, heterosis). In diesem Fall stabilisieren sich die Allelfrequenzen auf bestimmten Werten, ohne daß ein Allel aus der Population verschwindet (Spiess, 1977, Kap. 19). Wird dieses Konzept auf mehrere Loci verallgemeinert, so ist anzunehmen, daß Allele vieler Polymorphismen (s. Glossar) lediglich in Kombination mit anderen Allelen die Krankheitsprädisposition so weit erhöhen, daß die Erkrankung wahrscheinlich wird und damit Fitness des Individuums vermindert ist. Andernfalls kann die Gesamt-Suszeptibilität klein (entsprechend weniger Riskoallele) und die Fitness dementsprechend durchschnittlich bis überdurchschnittlich bleiben Epistatische Effekte und Abhängigkeiten zwischen verschiedenen Genorten In der obigen Diskussion wurde zunächst davon ausgegangen, daß Allele einen unabhängigen, additiven Effekt auf das Erkrankungsrisiko ausüben. Dieses Modell muß ergänzt werden um Wechselwirkungen, die beim gemeinsamen Auftreten von Allelen eine Abweichung vom rein additiven Modell bewirken (Risch, 2000). Eine Allelkombination kann dabei ein abweichendes Risiko im Vergleich zu der Summe der Risiken der Einzelallele z.b. bei M. Parkinson aufweisen (s. z.b. Krüger et al., 1999, 2000). Während Einzelallele schützend wirken, kann deren Kombination prädisponierend sein. In der statistischen Analyse werden Wechselwirkungen durch entsprechende Terme modelliert (McCullagh und Nelder, 1989). Dabei muß die mögliche Anzahl wechselwirkender Allele berücksichtigt werden, um die genetische Situation statistisch korrekt zu modellieren. Deren Zahl ist jedoch unbekannt und muß im konkreten Fall geschätzt werden. Ist das Auftreten mehrerer Allele notwendige Voraussetzung für das Auftreten der Erkrankung, setzt diese Bedingung eine Obergrenze für die Zahl der Allele. Wären z.b. für MS 5 Allele beteiligt, müßte jedes der beteiligten Allele eine 20

21 Frequenz von 25% 4 haben, falls die Penetranz für diese Allelkombination vollständig wäre, ansonsten müßte die Frequenz größer sein 5. Dies entspricht dem Extremfall epistatischer Effekte für den Einzelallele nur in einer bestimmten Kombination das Erkrankungsrisiko erhöhen und ansonsten dieses Risiko nicht beeinflussen. Insgesamt ist es wahrscheinlich, daß starke epistatische Effekte zwischen einer eher kleinen Zahl von Allelen auftritt und ansonsten zwischen solchen Allelkombinationen epistatische Effekte eher klein anzunehmen sind Umwelteinflüsse Für viele genetisch komplexe Erkrankungen sind Umwelteinflüsse belegt, wenn sie meist auch nicht konkretisiert werden können. Ein Beispiel für einen nachgewiesenen Umwelteinfluß stellt die MS dar. In diesem Fall ist der Einfluß der geographischen Breite des kindlichen Aufenthaltsortes auf die Erkrankungswahrscheinlichkeit belegt (s. Kap. 6, S. 55). Zusätzlich ist MS eine Erkrankung mit genetischer Beteiligung, so daß sowohl Umweltfaktoren als auch genetische Faktoren Einfluß auf die Manifestationswahrscheinlichkeit der MS ausüben. Unterschiede in den Konkordanzraten von ein- und zweieiigen Zwillingen aller genetisch komplexer Erkrankungen belegen einen variablen Umwelteinfluß, auch wenn noch kein spezifischer Umweltfaktor identifiziert werden konnte. Eine Interpretation der Konkordanzrate setzt sie zum Umwelteinfluß in Beziehung. Zwei eineiige Zwillinge haben identisches Erbmaterial und, falls einer der Zwillinge erkrankt, so ist eine Umweltbedingung aufgetreten, die bei dem vorliegenden Erbmaterial zur Erkrankung führt. Falls der 2. Zwilling nun alle Umweltbedingungen mit dem 1. teilte, so müßte er zwangsläufig erkranken, da er identisches Erbmaterial besitzt. Offenbar ist dies nicht der Fall. Die Konkordanzrate gibt gerade die Wahrscheinlichkeit an, daß eine die Erkrankung auslösende Umweltbedingung für den 2. Zwilling auftritt 6. Zu beachten ist, daß dies nicht notwendigerweise die Wahrscheinlichkeit ist, mit der in der Allgemeinbevölkerung eine Umweltbedingung auftritt, die die Erkrankung auslösen kann, da die Umweltbedingungen zwischen Zwillingen ähnlicher sein können, als zwischen nicht verwandten Individuen. Dies ist z.b. bei einem Einfluß der Ernährung anzunehmen, da Zwillinge häufiger gleiche Speisen zu sich nehmen als Nicht-Verwandte. Andererseits ist es etwa für Infektionen im Kindesalter plausibel anzunehmen, daß sich Zwillinge und Nicht-Verwandte hinsichtlich der Exposition nicht stark unterscheiden, da Durchseuchungsraten für viele Infektionen sehr hoch sind und daher das Infektionsspektrum ähnlich ist. Einschränkend könnte die zeitliche Reihenfolge von Infektionen u.a. eine Rolle spielen. Insgesamt ist es Nimmt man nicht an, daß die Allele alle gleiche Frequenz haben, so muß das häufigste Allel entsprechend häufiger sein. Nimmt man andererseits genetische Heterogenität an, also die Existenz mehrerer Allelkombinationen, die nur in der Kombination prädisponieren, können die Allelfrequenzen wieder kleiner sein, da sich die Prävalenz auf mehrere Kombinationen verteilt. 6 Nicht alle Umwelteinflüsse lassen sich beobachten. Z.B. können somatische Mutationen das Risiko für einen der eineiigen Zwillinge verändern. Dies ist ein Beispiel für einen experimentell nicht (oder nur sehr schwer) kontrollierbaren Einflußfaktor ( Zufall ). 21

22 plausibel anzunehmen, daß die Konkordanzrate eineiiger Zwillinge eine Obergrenze für die Wahrscheinlichkeit ist, einer Umweltbedingung ausgesetzt zu werden, die bei entsprechender genetischer Prädisposition zur Erkrankung führt. Unter Annahmen über die Häufigkeiten von prädisponierenden Allelen, auslösenden Umweltbedingungen, deren Zahl und die Art der Wechselwirkungen, lassen sich Prävalenzraten, Konkordanzraten und Riskikoverhältnisse zwischen Verwandten berechnen (Anh. B.2, S. 101). Umgekehrt lassen sich mit den Parametern Konkordanzrate, Prävalenz und Risiko für Verwandte 1. Grades, Zahl und Frequenz beteiligter Allele oder Allelkombinationen abschätzen. Tab. 3 (S. 23) zeigt eine Beispielrechnung, die an Daten für MS angepaßt wurde 7 (Abb. 1, S. 16). Die Konkorandzrate wurde mit 30% angenommen und die Frequenz der Umweltbedingungen so angepaßt, daß diese Konkordanzrate erfüllt wird. Die Tabelle listet Kombinationen von Lokus-Anzahlen und Allelfrequenzen auf. Die Allelfrequenzen wurden so gewählt, daß ein relatives Risiko für Verwandte 1. Grades im Vergleich zur Normalbevölkerung (hier mit Prävalenz gleichgesetzt) von 20 auftaucht. Die sich ergebenden Prävalenzraten liegen in der Tabelle über dem für MS gültigen Wert (0,1%). Extrapoliert man die Tabelle (was aus Rechenzeitgründen für diese Beispielrechnung nicht erfolgte), so ist etwa von einer Beteiligung von 8-15 Loci auszugehen, die entsprechend niedrige Frequenzen haben. Wie in Anh. B.2 diskutiert können, die hier angenommenen Einzelallele in der Realität auch epistatischen Effekten zwischen Allelkombinationen entsprechen, dann kann die Zahl der beteiligten Loci auf steigen. Die Frequenz der Allele liegt in der Tabelle ab 5 Loci unter 1%, so daß es sich nicht mehr um Polymorphismen handelt. Spielen Allelkombinationen eine Rolle können die Frequenzen der zugehörigen Einzelallele evtl. auch deutlich höher liegen. Insgesamt ist es wahrscheinlich, daß beide Möglichkeiten vorkommen, so daß die heutzutage noch nicht für komplexe Erkrankungen beachteten Variationen ebenso eine Rolle spielen könnten. Diese zu untersuchen stellt selbstverständlich eine deutliche Komplexitäts- und Aufwandssteigerung des experimentellen Zugangs dar. Für die im Beispiel gewählten Werte entspricht die Häufigkeit der zur Erkrankung führenden Umweltbedingungen praktisch der Konkordanzrate. Festzuhalten ist, daß Umweltbedingungen häufig sind. Für die MS kommen dafür Infektionen mit Allgemeinerregern in Betracht, wobei vermutlich auch gewisse Einschränkungen, wie Kombination bestimmter Erreger oder eine bestimmte zeitliche Abfolge noch in dieser Häufigkeit anzutreffen sind. Anders als für den genetischen Hintergrund scheinen somit für die Umweltbedingungen sehr seltene Ereignisse eher einen kleinen Einfluß zu haben Genetische Heterogenität Für manche genetisch komplexen Erkrankungen sind Gene bekannt, die nach einem klassischen Mendelschen Vererbungsmodus zur Erkrankung führen (s. Tab. 1). Diese 7 Dabei wurden sowohl Allel- als auch Umweltfrequenzen identisch wie angegeben angenommen. In Anh. B.2 (S. 101) werden die zu Grunde liegenden Formeln hergeleitet, sowie diskutiert. 22

23 Tabelle 3: Epidemiologische Maßzahlen unter Annahmen über Allel- und Umweltbedingungsfrequenzen (s. Text). Umweltfrequenzen: Frequenz der auslösenden Umweltbedingungen, Prävalenzrate: Schätzung für die Prävalenzrate, Risiko für Verwandte: Risiko für einen Verwandten 1. Grades zu erkranken, Konkordanzrate: Konkordanzrate eineiiger Zwillinge, RR: Faktor der Risikoerhöhung für einen Verwandten 1. Grades im Vergleich zur Normalbevölkerung (RR=Verwandte/Prävalenz) Zahl der Loci Risiko für Verwandte Allelfrequenzen Umweltfrequenzen Prävalenzrate Konkordanzrate 2 0,0010 0,2996 0,0012 0,2781 0,30 232,24 2 0,0135 0,2952 0,0158 0,2858 0,30 18,12 2 0,0260 0,2909 0,0296 0,2930 0,30 9,89 2 0,0385 0,2866 0,0428 0,2997 0,30 7,00 2 0,0510 0,2825 0,0554 0,3059 0,30 5,53 2 0,0635 0,2784 0,0673 0,3117 0,30 4,63 3 0,0010 0,2993 0,0018 0,2721 0,30 151,69 3 0,0073 0,2949 0,0127 0,2787 0,30 21,90 3 0,0135 0,2905 0,0232 0,2850 0,30 12,29 3 0,0198 0,2863 0,0332 0,2909 0,30 8,76 3 0,0260 0,2821 0,0428 0,2966 0,30 6,93 3 0,0323 0,2780 0,0520 0,3019 0,30 5,80 4 0,0010 0,2989 0,0024 0,2694 0,30 112,83 4 0,0041 0,2956 0,0097 0,2741 0,30 28,26 4 0,0073 0,2924 0,0168 0,2787 0,30 16,60 4 0,0104 0,2891 0,0237 0,2830 0,30 11,96 4 0,0135 0,2860 0,0303 0,2872 0,30 9,47 4 0,0166 0,2828 0,0368 0,2913 0,30 7,92 5 0,0010 0,2986 0,0030 0,2681 0,30 89,94 5 0,0026 0,2964 0,0076 0,2711 0,30 35,85 5 0,0041 0,2942 0,0121 0,2741 0,30 22,74 5 0,0057 0,2920 0,0165 0,2770 0,30 16,84 5 0,0073 0,2899 0,0208 0,2798 0,30 13,48 5 0,0088 0,2877 0,0250 0,2826 0,30 11,31 6 0,0010 0,2982 0,0036 0,2673 0,30 74,85 6 0,0018 0,2968 0,0063 0,2692 0,30 42,58 6 0,0026 0,2955 0,0090 0,2710 0,30 29,98 6 0,0033 0,2941 0,0117 0,2729 0,30 23,27 6 0,0041 0,2927 0,0144 0,2746 0,30 19,11 RR 23

24 Fortsetzung von Tabelle 3. Beginn S. 23. Zahl Allel- Umwelt- Prävalenzrate Risiko für Konkor- RR der fre- fre- Verwandte danz- Loci quenzen quenzen rate 7 0,0010 0,2979 0,0042 0,2669 0,30 64,16 7 0,0014 0,2970 0,0058 0,2680 0,30 46,50 7 0,0018 0,2962 0,0074 0,2691 0,30 36,58 7 0,0022 0,2954 0,0089 0,2702 0,30 30,23 7 0,0026 0,2946 0,0105 0,2713 0,30 25,82 7 0,0030 0,2938 0,0121 0,2724 0,30 22,58 8 0,0010 0,2975 0,0047 0,2667 0,30 56,18 8 0,0012 0,2970 0,0057 0,2674 0,30 47,21 8 0,0014 0,2965 0,0066 0,2680 0,30 40,77 8 0,0016 0,2961 0,0075 0,2686 0,30 35,91 8 0,0018 0,2956 0,0084 0,2693 0,30 32,11 8 0,0020 0,2951 0,0093 0,2699 0,30 29,07 betreffen die sogenannten familiären Formen dieser Erkrankungen und machen einen kleinen Prozentsatz des Patientenkollektivs aus. Führen unterschiedliche Allele oder Allelkombinationen unabhängig voneinander zu demselben klinischen Krankheitsbild, bezeichnet man dies als genetische Heterogenität. Dieses Modell trifft auf M. Parkinson und M. Alzheimer sowie höchstwahrscheinlich auf die meisten genetisch komplexen Erkrankungen zu. Im Fall epistatischer Effekte können unterschiedliche, wechselwirkende Allelkombinationen unabhängig zur Erkrankung führen. Im Fall additiver Effekte muß die Zahl prädisponierender Allele einen Schwellenwert überschreiten, um eine Erkrankung wahrscheinlich zu machen. Es kommt also im Wesentlichen auf die Zahl prädisponierender Allele an, so daß verschiedene Patienten eine variable Zahl an Allelen (evtl. auch null) gemeinsam haben. Liegen sowohl epistatische, wie auch additive Effekte vor, ist die Komplexität beider Allelverteilungen zu erwarten. Das genetische Modell komplexer Erkrankungen umfaßt sowohl ein multifaktorielles Geschehen mit genetischen und Umwelteinflüssen wie auch genetische und klinische Heterogenität. Da für die sporadischen Formen komplexer Erkrankungen keine genetische Definition existiert, bleibt die klinische Diagnose entscheidend, die sich mit einem variablen Phänotyp auseinandersetzen muß. Dies wiederum erschwert die genetische Analyse, da bei klinischer auch von genetischer Heterogenität auszugehen ist. Umgekehrt kann eine genetische Charakterisierung komplexer Erkrankungen die klinische Diagnostik stützen, die wiederum die Effizienz weiterer genetischer Untersuchungen verbessern kann. 24

25 3.3. Strategien zur genetischen Analyse Molekularbiologische Studien zur Aufdeckung genetischer Faktoren, die für komplexe Erkrankungen ursächlich sind, sollten das zugrunde liegende genetische Modell möglichst exakt berücksichtigen. Neben der Entscheidung einen genome screen durchzuführen bzw. nach dem Kandidatengenansatz vorzugehen (s. Kap. 2.3, S. 11), muß zwischen Kopplungs- (Untersuchung auf Kopplung; z.b. Risch, 1990a,b,c) und Assoziationsstudien gewählt werden (Untersuchung auf Kopplungsungleichgewicht, s. u.; z.b. Spielman et al., 1993) Kopplungsstudien Bei einer Kopplungsanalyse untersucht man die gemeinsame Weitergabe von Phänotyp und Allel an einem Kandidatengenort. Wird ein Allel häufiger gemeinsam an erkrankte Nachkommen weitergegeben als unter freier Rekombination zu erwarten, spricht dies für eine Kopplung von untersuchtem Marker und kausalem Genort (Abb. 4). Dabei Zahl gemeinsamer Allele Wahrscheinlichkeit der Geschwister 0 (z.b. 1 3, 2 4) 0,25 1 (z.b. 1 3, 2 3) 0,5 2 (z.b. 2 3, 2 3) 0,25 Abbildung 4: identity by descent (IBD)-Analyse: Vergleich der gemeinsamen Vererbung eines Allels mit der Erkrankung. Hier ist der Fall eines erkrankten Geschwisterpaars mit einem möglichen Vererbungsmuster gezeigt (entsprechend dem Fall IBD=1). Die Wahrscheinlichkeiten für gemeinsame Vererbung unter freier Rekombination ist in der Tabelle angegeben. Abweichungen von dieser Verteilung sprechen für Kopplung. spielt es keine Rolle, welches Allel gemeinsam weitergegeben wird, sondern lediglich wie häufig ein oder mehrere Allele gemeinsam mit dem Phänotyp (Erkrankungsstatus) weitergegeben werden (Terwilliger und Ott, 1994) Assoziationsstudien Im Gegensatz dazu wird bei Assoziationsstudien ein Risikoallel ausgezeichnet und die Frequenz dieses Allels in Patienten- und Kontrollgruppe verglichen, wobei die Kontrollgruppe entweder eine zusätzliche Personengruppe darstellt (Fall/Kontrollstudie) oder bei familienbasierten Analysen aus nicht vererbten Allelen gebildet wird (z.b. Spielman et al., 1993). Wird nachgewiesen, daß ein Allel tatsächlich häufiger in einer Patienten- als in einer Kontrollgruppe vorkommt, spricht man von genetischer Assoziation der Erkrankung mit diesem Allel. Entscheidend für die Entdeckung einer genetischen Assoziation ist, daß das betrachtete Allel entweder selbst kausal das 25

26 Erkrankungsrisiko beeinflußt oder mit einem solchen Allel im Kopplungsungleichgewicht (linkage disequilibrium; LD) steht. Das Konzept des LD wird in Abb. 5 illustriert. Weicht die beobachtete Haplotypfrequenz an zwei Loci von der erwarteten ab Lokus Lokus 1 Lokus 2 Allel beobachtete Freq. 0,3 0,7 0,6 0,4 Haplotypen erwartete Freq. beobachtete Freq. δ Lokus 2 Lokus 1 0,18 0,3 0,12 0,12 0-0,12 0,42 0,3-0,12 0,28 0,4 0,12 Abbildung 5: linkage disequilibrium (LD): Ausgehend von Allelfrequenzen an zwei gekoppelten Loci (Lokus 1, Lokus 2) können Haplotypfrequenzen geschätzt werden (erwartete Freq.). Weichen die beobachteten Haplotypfrequenzen von diesen ab, herrscht LD. δ ist der LD-Koeffizient, der im Text definiert wird. (als Produkt der Allelfrequenzen), herrscht LD. Der LD-Koeffizient δ i j gibt dabei die Differenz zwischen diesen Frequenzen an (für Allel i an Lokus 1 und Allel j an Lokus 2): δ i j h i j p i p j h i j ist dabei die Haplotypfrequenz für das gemeinsame Auftreten von Allel i und j auf einem Chromosomenstrang, während p i die Allelfrequenz von Allel i und p j die Allelfrequenz von Allel j ist 8. Für δ i j existieren noch verschieden normierte Varianten (vgl. Schneider et al., 2000). Ein positives LD hat zur Folge, daß bei Beobachtung eines der Allele die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten des anderen Allels über dessen Allelfrequenz hinaus erhöht ist. Damit liefert die Beobachtung eines Lokus Informationen über einen anderen Lokus. Auftretende Rekombinationen zwischen den 8 Wahrscheinlichkeitstheoretisch stehen zwei Allele an gekoppelten Loci genau dann im LD, wenn die gemeinsame Verteilung der Allele (die Verteilung der Haplotypen) nicht die Produktverteilung der Allele ist. 26