Multimodale Spektroskopie und Multivariate Datenanalyse
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1 ZAFH PHOTONische Verfahren in neuen Dimensionen Hochschule Reutlingen Prof. Dr. Rudolf Kessler Prof. W. Kessler Reutlingen Research Institute Multimodale Spektroskopie und Multivariate Datenanalyse 2. Aalener Photoniktag
2 Agenda Toolbox Spektroskopie und Chemometrie Beispiel Farbstoffgemisch und Kristallisation Beispiele aus der Biotechnologie Beispiel spektrales Imaging Photonendiffusion und Multipoint Spektroskopie
3 Toolbox: Optische Spektroskopie I UV/VIS N NIR N MIR/Raman N Fluorescence N Reflexion Fluorescence UV NIR IR Raman Großer Spektralbereich unterschiedliche Konfiguration Transmission y x Ortsaufgelöst (x,y) Hyperspectral imaging
4 Multivariate Datenanalyse Etwas Information + keine Information Etwas Information + redundante Information Etwas Information + nicht-spezifische Information Extrahiere die nützliche Information Univariate Daten Analyse Explorative multivariate Daten Analyse (PCA, etc.) Multivariate Regression und Klassifizierung (PLS, MCR, MIA, RBF, Kohonen..) Optische Hauptkomponentenanalyse
5 Prinzip der PCA S N S S P N X Loadings = + T Faktorenmatrix E Z Datenmatrix Z Gewichtsmatrix Scores Z Residuenmatrix (Noise,Error)
6 Besipiel: Gliobastomzellen (ATR-FTIR) cm Ableitung mit 5 Glättungspunkten cm Ableitung mit 5 Glättungspunkten Amid I (C=O Peptid) Amid II (CN mit NH gekoppelt) C-H Gruppe
7 Multivariate Curve Resolution: MCR: Integration von Wissen Ziel: Herausrechnen der Reinkomponenten Im Prinzip möglich über PCA oder PLS aber: Reiner mathematischer Ansatz Referenzwerte und Kalibrierung nötig Kalibrierungsfreie Lösung: Multivariate Curve Resolution (MCR) - ALS Mathematischer Ansatz + physikalische und chemische Nebenbedingungen
8 "Natürliche" Nebenbedingungen für die MCR Nichtnegativität - Spektren und/oder Konzentrationsprofile müssen positiv sein Unimodalität - einige Konzentrationsprofile oder Spektren haben nur ein Maximum Selektivität - es ist bekannt, welche der Komponenten zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhanden ist. (Reaktant, Produkt) Geschlossenheit (Massenkonstanz) - die Summe der Konzentrationen aller beteiligten Komponenten ist eine bekannte Konstante (z.b. die Massenbilanzgleichung bei bekannten Reaktionen)
9 log 1/R wavelength [nm] ASA 100 ASA 150 ASA 200 ASA 250 ASA 300 Multi Modal Spatially Resolved - Spectroscopy Multi-Information Spectroscopy A B C Fluorescence UV VIS NIR IR Raman A + Setup geometry A + B + 2D-scan Reutlingen Research Institute (RRI) - Process Analysis Technology - Kubelka-Munk Radiative Transfer (Maxwell Equations) Science Based Analysis K + S µ a + µ s + g Theory Models Approximations Raw Spectra Data Pretreatmen t Derivatives Normalizations SNV, EMSC... Data Analysis PCA, PCR, PLS, SIMCA Reduced Number of calibration Samples Data Matrix Concentration Pure spectra Residuals Matrix (noise, errors) Chemometrics / Multivariate Data Analysis Pure Statistics?! Mixed spectra = Concentration profiles Pure component spectra Multivariate Curve Resolution (MCR)
10 Agenda Toolbox Spektroskopie und Chemometrie Beispiel Farbstoffgemisch und Kristallisation Beispiele aus der Biotechnologie Beispiel spektrales Imaging Photonendiffusion und Multipoint Spektroskopie
11 Beispiel: Mischung aus 3 Einzelfarben UVVIS-Spektren von 3 Farbstoffen (grün, orange, blau) Mischungen unterschiedlicher Konzentrationen
12 Extraktion der Reinspektren mit MCR green orig green MCR Eingabe: Mischungsspektren Nebenbedingung: Nichtnegativität orange orig orange MCR blue orig blue MCR Ergebnis: Spektren der Reinkomponenten und zugehörige Konzentrationen
13 Beispiel Kristallisation: Messaufbau Lichtquelle 2 Diff. Reflexion UV/VIS UV/VIS ATR Diff. Reflexion VIS/NIR Raman Foss NIR UV/VIS Transmission Lichtquelle 1
14 Diffuse Reflectance / % Temperature / C Bestimmung der metastabilen Phase: alpha-phenylalanne Diffuse Transmission Spektren D=gelöst und dann Wasser hinzugefügt C=Kristallisation D D D D C C C Reaction Time Diffuse Reflexions Spektren
15 Kristallisation: Multivariate Charakterisierung α - Phenylalanin Kristallisationsverlauf crystallisation E β - Phenylalanin E
16 Raman Spektroskopie MCR: Kristallisation von Phenylalanin Kaiser Optical System
17 Agenda Toolbox Spektroskopie und Chemometrie Beispiel Farbstoffgemisch und Kristallisation Beispiele aus der Biotechnologie Beispiel spektrales Imaging Photonendiffusion und Multipoint Spektroskopie
18 Microarray und Spektroscopische Daten PRI (Reijmers, Maliepard et al.) IAF (Kessler and Kessler) Clone 27A3: 1450 nm (Water??) (Variety contrast: hypothetical protein) ν- C=O: Pectine 1740 cm Regression Coefficients Bast ν- C=C/ ν- C-H/: : Lignin, Hydrocarbons, Fats Regression Coefficients Clone C11 and inversely 4H1: 2052 nm RESULT5, (Y-var, PC): (2050,5) B0W = Core-Bast Contrast: S-adenosyl methionine synthetase 2 / bacterial-induced peroxidase precursor Core X-variab les RESULT6, (Y-var, PC): (2050,5) B0W = X-variab les
19 - log (T) E. Coli Fermentation Cytosin Guanin Adenin Samples/Scores Plot of data Scores on Comp 1 (32.00%) Scores on Comp 2 (29.33%) Scores on Comp 3 (37.63%) Thymin? Wellenlänge /nm Sample
20 Enzymatische Reaktion mit Laccasen O 2 H 2 O Laccase Laccase ox Lignin Lignin ox O 2 Laccase Mediator ox Lignin H 2 O Laccase ox Mediator Lignin ox COOH H 3 C-O O-CH 3 OH Syringic Acid O 2, Laccase Decarboxylation, Ring Opening, Formation of Quinons etc. 20
21 Absorbtion Concentration [arbitrary units] Concentration [arbitrary units] Concentration [arbitrary units] Kinetik und Intermediate von Laccase Abbauprodukten ph 4 A B C Time after Addition of Laccase [min] Online UV/VIS/NIR Online HPLC Time after Addition of Laccase [min] 6, cm Time (min) 5,0 4,0 3,0 A B ph 7 Online FTIR/Raman Online Fluoreszenz 2,0 1,0 0,0-0, Time after Addition of Laccase [min]
22 Relative Intensity Insitu Ramanspektroskopie Produkt 1403 Start 1582 (1) SO 3 O N H H N O SO 3 Initial Oxidation (2) Ox.- Intermediate Hydrolysis Rearrangement Time (minutes) Product (1206 cm -1 ) Starting Product (1582 cm -1 ) SO 3 O O N H? SO 3 O SO 3 Oxidative H (3) Cleavage (4) N O N H 22
23 Agenda Toolbox Spektroskopie und Chemometrie Beispiel Farbstoffgemisch und Kristallisation Beispiele aus der Biotechnologie Beispiel spektrales Imaging Photonendiffusion und Multipoint Spektroskopie
24 Chemical/ Spectral Imaging Chemische Charakterisierung CHEMICAL IMAGING Physikalische/ Morphologische Charakterisierung IMAGING
25 Micro Chemical Imaging von UV bis NIR, x, y, z Koordinate inklusive 2D-Fluoreszenz, Raman und FLIM, Whiskbroom-, Staring- und Pushbroom-Imaging vereint
26 Whiskbroom Chemical Imaging an Chromosomen Staring Beispiele x 550 nm y x y x y Giemsa gefärbt Messung in Absorption FISH gefärbt Messung in Fluoreszenz Ohne Markierung Messung in Reflexion
27 Informationsebenen Messungen + Intensität vs. Wellenlänge Größe + Interferenzmuster (global) Schichtdicke + Interferenzmuster (Verschiebung) Morphologie + Interferenzmuster (lokal) Topologie (Bänderung) + Absorption im UV Bereich DNA & Protein Anteil
28 Bestimmung von S & K in Chemical Imaging K 1660 nm 280 nm [1cm -1 ] S [1cm -1 ] nm 280 nm
29 Agenda Toolbox Spektroskopie und Chemometrie Beispiel Farbstoffgemisch und Kristallisation Beispiele aus der Biotechnologie Beispiel spektrales Imaging Photonendiffusion und Multipoint Spektroskopie
30 Beleuchtung Beleuchtung Photonendiffusion Tablette Beschichtete Tablette 2mm dick I 0 2mm dick plus Beschichtung I 0! = 80 cm -1 = 5 cm -1 = 180 cm -1 = 2 cm -1
31 Pushbroom Imaging Technology (e.g. Specim) Target Imaging Spectrograph Matrix Detector Objective Lens Entrance slit Prism-Grating-Prism
32 Pushbroom Imager as a Multiplexing System Imaging Spectrograph matrix detecor optical fibre bunch Optical fibre bunch Slit Prism-Grating-Prism
33 Multipoint Spektroskoie in Pharma Prozessen Dispensing Granulator Holst Blending / Mixing Fluid Bed Dryer 2 3 Dry Mill Tablet Press Hicoflex Charge Bag Dry Mill Direct compression Tablet Coater 4
34 log 1/R wavelength [nm] ASA 100 ASA 150 ASA 200 ASA 250 ASA 300 Zusammenfassung Multi-Information Spectroscopy A B C Fluorescence UV VIS NIR IR Raman A + Setup geometry A + B + 2D-scan Reutlingen Research Institute (RRI) - Process Analysis Technology - Kubelka-Munk Radiative Transfer (Maxwell Equations) Science Based Analysis K + S µ a + µ s + g Theory Models Approximations Raw Spectra Data Pretreatmen t Derivatives Normalizations SNV, EMSC... Data Analysis PCA, PCR, PLS, SIMCA Reduced Number of calibration Samples Data Matrix Concentration Pure spectra Residuals Matrix (noise, errors) Chemometrics / Multivariate Data Analysis Pure Statistics?! Mixed spectra = Concentration profiles Pure component spectra Multivariate Curve Resolution (MCR)
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