Die Chemie der DNA, DNA-Synthese

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1 Die Chemie der DA, DA-Synthese Phosphoramidit-Methode (Caruthers JACS81, 3185) P III ist reaktiver (schnellere Kupplung) als P V, Aktivierung als Phosphoramidit-Bausteine Schutzgruppen 5 --Dimethoxytrityl (DMT), Isobuttersäure, Benzoesäure, Cyanoethyl für Phosoramidit Temporäre Schutzgruppen werden nach jedem Kupplungsschritt gespalten (DMT). Permanente Schutzgruppen werden erst am Ende der Synthese abgespalten (6-Benzoyladenin, 2- Isobutyrylguanin). Cyanoethyl wird nach der xidation des P entfernt. Festphasensynthese DA Modular aufgebauter Biopolymere werden über Festphasensynthese aufgebaut. Zur chemischen Synthese von Biopolymeren wie ligonukleotiden ist eine seit Jahren etablierte Methode. Zur Anknüpfung an den Träger CPG wird der Linker Succinat verwendet. Das fertige ligonucleotid wird mit H 3 (fl) vom Träger abgespalten und entschützt. Die Phosphit-Triestermethode (Phosphoramiditmethode): 1. Entschützung des 5'-H, 2. Kopplung eines Phosphoramidits, 3. Maskierung der freien H-Gruppen mit Acetanhydrid, 4. xidation der Phosphors. Um die Zahl der ebenprodukte gering zu halten, werden die nicht verlängerten DA-Stränge nach dem Kopplungsschritt zunächst acetyliert, um nicht reagierte Hydroxylfunktionen zu maskieren. Anschließend werden die bei der Kopplung entstandenen Phosphorigsäuretriester zu Phosphorsäuretriestern oxidiert. ach Abspaltung der 5'-DMT--Schutzgruppe wird dann ein neuer Zyklus eingeleitet. A Geyer C4 2011

2 Mit zunehmender Kettenlänge der DA wird die Gesamtausbeute der Synthese schlechter. Deshalb ist es notwendig, sehr gute Ausbeuten in jedem Verlängerungszyklus zu erzielen Synthese eines Gens, heute 99,8% Verknüpfungseffizienz Bei der RA-Synthese muss die 2'-H-Gruppe während der Synthese geschützt sein. Abgestufte Reaktivität von P(III)-Derivaten PCl3, P(R2)3, P(R)3, Synthese der Phosphorigsäuremonoamide (Phosphorsäureamidite) aus PCl3, Mechanismen der Esterspaltung, Hydrolyse der Phosphorsäure-mono-, di, und triester. Aufbau der ucleotide für die Synthese Dabei wird zuerst die H2-Gruppe mit der benzoyliert, dann eine 5'--DMT-Schutzgruppe eingeführt und schließlich in 3'-Position phosphinyliert Exozyklischen Aminofunktionen werden normalerweise als Amide geschützt. Diese gewährleisten ausreichende Stabilität bei den für die ligonukleotidsynthese üblichen ph-werten, lassen sich aber bei Bedarf basisch spalten. Die Benzoylschutzgruppe ist die klassische Schutzgruppe für Adenosin und dessen Derivate in der ligonukleotidsynthese. Spaltung erfolgt mit wässrigem Ammoniak innerhalb von 120 min bei 70 C quantitativ. Es wird man zunächst die freien H-Gruppen transient mit Trimethylchlorosilan geschützt mit Überschuss an TMS-Cl. Umsetzung des TMS-geschützten Zwischenproduktes mit einem Überschuss an Benzoylchlorid ergab das benzoylierte 2'--Me-Adenosin. Die TMS-Gruppen wurden mit verdünntem Ammoniak abgespalten und der Ansatz anschließend eingeengt. A Geyer C4 2011

3 Übung 4 Doppelhelix, Basenpaarung DA, Entwerfen eines Komplementärstranges, ucleotidsynthese, Depurinierung von Adenosin, Reagenzien DA-Synthese, Festphasensynthese Vorteile/achteile Fragen und Aufgaben Machen Sie einen Strukturvorschlag für ein Cyanoethyldiisopropylamino- Phosphor(III)amidit des 2 -Deoxyadenosins. Welche weiteren funktionellen Gruppen müssen geschützt werden? Schlagen Sie geeignete Schutzgruppen für die DA- Festphasensynthese vor. Vervollständigen eines des Kreisprozess der Kupplungsschritte Phosphoramidit-Methode: Anknüpfung an CPG, geschützte P(III)-Derivate, Abspaltung und Entschützung RA ist labiler gegen Hydrolyse als DA. Geben Sie eine Erklärung für diese Beobachtung. rdnen Sie die nachfolgenden Reagenzien nach steigender Acidität (Säurestärke) und schlagen Sie vor welche Schutzgruppen oder funktionellen Gruppen bei der Phorphoramiditmethode der DA- Synthese aktiviert oder gespalten werden: Dichloressigsäure. Tetrazol, Ammoniak und HCl. ennen Sie jeweils vier mögliche Vorteile sowie achteile der Festphasensynthese von DA am polymeren Träger im Vergleich zur Synthese in homogener Lösung. Vervollständigen Sie die fehlenden Reagenzien oder Zwischenprodukte einem cyclischen Reaktionsschema zur Festphasensynthese von DA. A Geyer C4 2011

4 B-DA unter physiologischen Bedingungen Basenabstand: 3.4 A Durchmesser: 20 A Watson-Crick-Basenpaarung Schnelle Basenrotation der isolierten ucleoside. In DA vollständig in anti-konformation. A Geyer C4 2011

5 H drib BzA H DA-Synthese mit der Phosphoramiditmethode drib IbG H H Schutzgruppen auf den ucleobasen drib BzC CH 3 CH 3 DMT (= 4,4'-Dimethoxytrityl) Bs (gesch.) Me C Me P H H Der geschützte Baustein für die Synthese C P (ipr) 2 Phosphoramidit (= Phosphorigsäuremonoamid) CPG M.H. Caruthers Acc. Chem. Res. 1991, 278 A Geyer C4 2011

6 Aktivierung des Phosphoramidits durch Tetrazol DMT Bs (g.) H DMT Bs (g.) C P (ipr) 2 C P DMT Bs (g.) C P Bs (g.) DMT Bs (g.) Cl H H Bs (g.) Phosphit Cl Entschützung des an CPG (graue Kugel) gebundenes ucleosids Festphasensynthese auf CPG: controlled pore glass A Geyer C4 2011

7 xidation zum Phosphorsäuretriester und nächster Kupplungsschritt C DMT P Phosphit Bs (g.) Bs (g.) via "Capping" 1) Ac 2, DMAP, 2,6-Lutidin 2) I 2, H 2 P I C DMT P Phosphat Bs (g.) Bs (g.) Cl Cl H I Finale Entschützung C H DMT H P Bs (g.) Bs (g.) H konz. H 4 H - C DMT Bs P H Bs + + H 2 H Ph + + H 2 H 2 A Geyer C4 2011

8 Die Wiederholungsschritte im Überblick A Geyer C4 2011

9 Anknüpfung des ersten Bausteins an das Trägermaterial CPG (controlled pore glass) DMT H Base Synthese des Kupplungsbausteins ausgehend vom geschützten ukleosid HBz DMAP, py DMT Base HBz H H 2 -CPG DCC DMT wird leicht durch Aminolyse gespalten Base H CPG Bz 2 ah H 2 /MeH/THF H Bz selektiv nur Bz-Verseifung H HBz DMTCI Bu 4 Cl 4 py DMT HBz Cl P C DMT selektiv primäre H H Hünig-Base, THF, DIPEA P C Cyanoethoxy-bis-(diisopropylamino)-phosphin A Geyer C4 2011

10 Synthese der ukleoside Bei Ribose hilft der achbargruppeneffekt bei der diastereoselektiven Bildung des -ucleosids Bz Bz Base Ac Lewis- Säure + -Selektivität Bz Bz Bz Fehlender achbargruppeneffekt: Bei Deoxyribose gibt es Gemische, die getrennt werden müssen Bz Bz Me 3 Si Ac,-bis(trimethylsilyl)acetamid H 3 C HBz SiMe 3 SiMe 3 BSA SnCl 4, CH 3 C (auch TMSTf) H HBz bessere Löslichkeit bevorzugt 9-ucleophilie Ph Bz Bz HBz HBz Bz Bz Bz HBz Bz Bz Bz HBz Selektivität: -9 > -7 >> -9 > -7 A Geyer C4 2011

11 Die Chemie der DA Die Doppelhelix der 2 -Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid) ist auf Histone (basische Strukturproteine) aufgewickelt, welche sich zu supramolekularen Überstrukturen organisieren, die als Chromosome im Mikroskop sichtbar sind. A Geyer C4 2011

12 Digitalisierung von Information Speicherung enormer Datenmengen mit wenigen Zeichen Computer: 0, 1 4-Bit Binärcode DA: A, T, C, G Der genetische Code: Drei Basenpaare kodieren eine Aminosäure: 64 mögliche Zeichen A Geyer C4 2011

13 Laborchemie Zellchemie Sequentielle Änderung der chemischen Umgebung Selektivität durch getrennte Reaktionskolben batch-weise Zugabe der Reagentien Variation Lösemittel, ph, Temperatur, Druck Parallele Reaktionen, etzwerke, Fließgleichgewicht Selektivität durch molekulare Erkennung Semipermeable Membranen 1 bar, RT, enger ph-bereich A Geyer C mra, trra, Ribosomen, Proteine D. S. Goodsell Sci. Am. 2000, 230

14 Blick in eine Zelle Die richtige zeitliche und räumliche Kombination von Lipiden, Aminosäuren, Kohlenhydraten und ukleinsäuren ist essentiell für das Leben. CCTGAGCCAACTATTGAT DA transcription CCUGAGCCAACUAUUGAU mra A Geyer C fache Vergrößerung Transkription DA wird abgelesen PEPTID translation Protein

15 Transkription der Erbsubstanz Desoxyribonukleinsäure (DA) 1-millionenfach 10-millionenfach 30-millionenfach vergrößerte DA DA-Doppelhelix DA-Basenpaarung DA-Einzelstrang A Geyer C4 2011

16 Translation der messanger-ra (mra) Ribosom fache Vergrößerung Translation mra wird in Proteine übersetzt A Geyer C4 2011

17 DA ist der Bauplan, Proteine führen die zellulären Funktionen aus. Synthetische Liganden (Medikamente) können auf jeder Stufe der Proteinbiosynthese eingreifen und so die Entwicklung eines unerwünschten rganismus stören (Antibiotikum) oder Krebszellen an der Vermehrung hindern (Cytostatikum) A Geyer C4 2011

18 Wie wurde aus der Kombination unabhängiger chemischer Reaktionen ein komplettes Lebewesen? Alle Lebewesen benutzen die selben vier ucleobasen in ihrem genetischen Code, die selben 20 L-Aminosäuren in ihren Proteinen, wenige meist D-konfigurierte Zucker und Adenosintriphosphat als Energieträger. Gab es einst weitere Lebensformen? Es gibt (noch) keine Erklärung. rganische Chemie Formose-Reaktion -Heterocyclen Strecker-Synthese Polyphosphate Fe, S, FeS 2 Jede Zelle ist eine komplexe Fabrik Biochemie Glycolyse, Citratcyclus DA/RA Transkription Porteinbiosynthese ATP, Energieträger Stoffwechsel A Geyer C Präbiotische Chemie Ursprung Des Lebens Zeit Letzter gemeinsamer Vorfahr

19 1953 Die supramolekulare Chemie der DA ist inzwischen so gut verstanden, dass man sie in beliebigen Formen aggregieren lassen kann: rigami Von diesem strukturellen Verständnis ist man bei Proteinen noch weit entfernt. Es gibt (noch) kein Protein-rigami A Geyer C4 2011

20 Supramolekulare Chemie der DA Molekulare Erkennung, Kooperative Strukturbildung, Schmelzkurven von Biomolekülen sind Phasenübergängen vergleichbar Die Denaturierung von Biopolymeren (DA, Proteine) durch Temperatur, Salze, ph oder organische Lösungsmittel zerstört die durch Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen aufgebaute Sekundärstruktur ohne kovalente Bindungen zu brechen. Schmelzen von DA im 1H MR oder UV (Hypochromizität) beobachtbar Fragen und Aufgaben Pyridon kann ein über Wasserstoffbrücken verknüpftes Dimer bilden. Machen Sie einen Strukturvorschlag. Zeichnen Sie die ucleoside (oder ucleotide) A, G, C, T, U. Zeichnen Sie Watson-Crick-Paare AT, GC. Warum eignen sich Purine wie Koffein oder Harnsäure nicht als Basen des genetischen Codes? Was passiert am Schmelzpunkt doppelsträngiger DA? Entwerfen Sie einen Komplementärstrang für 5 -d(tggta). A Geyer C4 2011

21 DA: Desoxyribonukleinsäure In der Erbsubstanz DA spielen Wasserstoffbrücken bei der molekularen Erkennung eine besondere Rolle Kooperative molekulare Erkennung: Sobald sich ein Paar gefunden hat, verhält sich das System wie ein Reissverschluß und die anderen Paare finden sich fast wie von selbst. A Geyer C4 2011

22 Das Schmelzen der Sekundärstruktur ist bei allen Biopolymeren ein kooperativer (sprunghafter) Prozess Groß genug für die direkte Beobachtung! Spektroskopische Charakterisierung A A Geyer C4 C

23 Spektroskopische Charakterisierung A Geyer C4 2011

24 Kooperativität Umschalten zwischen zwei Zuständen (Konformationen) oder graduelle Änderung? A Geyer C4 2011

25 Auch im 1H-MR kann man das kooperative Schmelzen des DA-Doppelstrangs beobachten. Dabei wandern alle Signale im 1H-MR innerhalb eines schmalen Temperaturbereichs. Auftragung der chemischen Verschiebung ausgesuchter Basenprotonen gegen die Temperatur zur Ermittlung der Schmelztemperatur der DA am Beispiel eines Dodecamers. (aus Patel D. J.; Pardi A.; Itakura K. Science 1982, 216, ) A Geyer C4 2011

26 B-DA rechtsgängige Doppelhelix A Geyer C4 2011

27 P P B B H H B H B Peptide-ucleic acid (PA) ist ein chemisch vereinfachtes Strukturmodell für DA Das ligoamid-rückgrat trägt die ucleobasen, die wie bei der DA-Synthese geschützt sein müssen Base = T, C Cbz, A Cbz, G Bn, PA bildet selbst keine Doppelstränge, es bindet jedoch DA-Doppelstränge zu tripelhelikalen Strukturen. Auf dieser Basis versucht man Medikamente zu entwickeln. A Geyer C4 2011

28 In einer Tripelhelix bindet der dritte Strang in die große Furche der Doppelhelix und bildet dort zusätzliche H-Brücken mit den ucleobasen. Dies wird als Hoogsteen-Basenpaarung bezeichnet. A Geyer C4 2011

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30 DA ist stabiler gegen Hydrolyse als RA. In der Zelle ist dieser Unterschied noch größer, da Rasen die Hydrolyse von mra katalysieren. A Geyer C4 2011

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32 Auf der Zelloberfläche Gram-positiver Bakterien befinden sich oligomere Glycerophosphate, sogenannte Teichonsäuren Trotz großer struktureller Ähnlichkeit mit DA ist fast nichts über die helikale Konformation von Teichonsäuren bekannt. R [Base] P _ P _ Eine Lipoteichonsäure (lipoteichoic acid LTA) ist über ein Diacylglycerol in der Membran verankert Teichonsäure R = D-Alaninester oder -Acetylglucosamin DA Lipoteichonsäuren haben nichts mit Vererbung zu tun. Sie sind für Entzündungsreaktionen bis hin zum septischem Schock verantwortlich, wenn diese Bakterien in unsern Körper gelangen. A Geyer C4 2011

33 Lebensdauer der DA Die DA ist in der Zelle Schadstoffen und Strahlung ausgesetzt und muss konstant repariert werden. Dies ist ein normaler Vorgang, wofür es zahlreiche Reparaturenzyme gibt. A Geyer C4 2011

34 Lebensdauer der DA A Geyer C4 2011

35 Medikamente zur gezielten DA-Schädigung Anti-Tumor- und Anti-Virus- Medikamente führen zu DA- Schädigungen, die durch enzymatische Reparaturmechanismen nicht korrigiert werden können: Zelltod Minor-groove bindendes Distamycin Ethidiumbromid A Geyer C4 2011

36 UV-Licht induziert die Bildung von Cyclobutan-T-T Dimeren Diese [2+2]-Cycloaddition ist eine photochemsich induzierte pericyclische Reaktion A Geyer C4 2011