Etablierung einer reversen Genetik zur Charakterisierung des Oberflächen-Glykoproteins HEF des Influenza-C-Virus

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1 Aus dem INSTITUT FÜR VIROLOGIE ZENTRUM FÜR INFEKTIONSMEDIZIN der TIERÄRZTLICHEN HOCHSCHULE HANNOVER Etablierung einer reversen Genetik zur Charakterisierung des Oberflächen-Glykoproteins HEF des Influenza-C-Virus INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Birthe Larisch aus Reinbek Hannover 2003

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Georg Herrler 1. Gutachter: Prof. Dr. Herrler 2. Gutachter: Prof. Dr. Gruber Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meinem Bruder, meinen Eltern und Torsten So eine Arbeit wird eigentlich nie fertig, man muss sie für fertig erklären, wenn man nach Zeit und Umständen das möglichste getan hat. (J. W. Goethe, Italienische Reise, 16. März 1787)

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5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Influenza-C-Virus Taxonomie Klinik und Epidemiologie Morphologie und Genomstruktur Virusproteine Replikation Reverse Genetik bei Influenza-Viren Das Virus der Vesikulären Stomatitis Zielsetzung 33 3 Material Zelllinien Zellkulturmedien Bakterienkulturmedien Viren Erythrozyten

6 3.6 Restriktionsenzyme und andere Enzyme Längenstandards Oligonukleotide/Primer Plasmide Antikörper Transfektionsreagenzien Substrate Kits Chemikalien Puffer und Lösungen Methoden Molekulare Methoden RNA-Isolierung Reverse Transkription Reverse Transkription mit anschließender Expand T M long template PCR Titan One Tube RT-PCR Polymerasekettenreaktion (PCR) Rekombinante PCR Mutagenese Reinigung der PCR-Fragmente Bestimmung der RNA-/DNA-Konzentration Spaltung der DNA mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen

7 4.1.7 Dephosphorylierung von gespaltener Vektor-DNA Analytische Agarosegel-Elektrophorese Präparative Agarosegel-Elektrophorese Ligation von DNA-Fragmenten Herstellung elektrokompetenter E.coli-Bakterien Transformation elektrokompetenter E.coli-Bakterien durch Elektroporation Hitzeschocktransformation in chemokompetente Bakterien mittels TOPO TA Cloning R Kit Kolonie-PCR Plasmidpräparation mittels Qiagen-Kits Fällung der DNA durch Alkohol Sequenzierung Sequenzierung nach Sanger Sequenzierung bei der Firma MWG Biotech-AG Zellbiologische Methoden Transfektion von eukaryotischen Zellen Transfektion mit Lipofectamine T M 2000 Reagent Transfektion mit SuperFect T M Transfection Reagent Fixieren und Permeabilisieren von Zellen Indirekter Immunfluoreszenztest Erythrozyten Hämadsorption Behandlung von Zellen mit Gangliosiden

8 4.3 Proteinchemische Methoden Biotinylierung, Zelllyse, Immunpräzipitation Oberflächenbiotinylierung von in Kulturschalen gewachsenen Zellen Biotinylierung von auf Filtern gewachsenen Zellen Bestimmung der O-Acetylesteraseaktivität Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Western Blot Detektion biotinylierter und nicht biotinylierter Proteine Biotinylierte Proteine Nicht biotinylierte Proteine Klassische virologische Methoden Zellkultur Passage von COS7-Zellen Passage von MDCK-I-Zellen Passage von MDCK-II-Zellen Passage von HeLa-Zellen Passage von BHK21-Zellen Anzucht auf Filter Viren Virusanzucht in Zellkultur Virusanzucht im embryonierten Hühnerei Hämagglutinationstest

9 Immunoplaquetest Reverse Genetik virus like particles (VLP) erzeugt von dem Matrixprotein und dem Glykoprotein HEF des Influenza-C-Virus Einbau von Fremd-Proteinen in VSV-Partikel Mini-Genomsystem mit GFP-Reportergen VLP erzeugt durch alle Influenza-C-Proteine mit GFP als Reportergen Erzeugung rekombinanter Influenza-C-Viren mit dem GFP- Reportergen als zusätzlichem Segment Erzeugung eines rekombinanten Influenza-C-Virus mit mutiertem HEF als zusätzlichem Segment Erzeugung von rekombinanten Influenza-C-Viren aus cdna Ergebnisse Versuche mit chimären HEF-Proteinen Erzeugung chimärer Proteine Nachweis der chimären Proteine Nachweis der exprimierten Proteine durch Immunfluoreszenz Nachweis der exprimierten Proteine durch Oberflächenbiotinylierung Gerichteter Transport in polarisierten Epithelzellen Hämadsorption Esteraseaktivität

10 Einbau der Chimären in VSV-Partikel Virusähnliche Partikel (VLP) aus HEF und M Versuche zur Erstellung einer reversen Genetik des Influenza-C-Virus Klonieren der einzelnen Segmente in das Expressionsplasmid pcdna Beispielhafte Beschreibung der Klonierung von Segment 1 in den Vektor pcdna Klonieren und Umklonieren der Segmente in ppolisapirib Beispielhafte Beschreibung der Umklonierung von Segment 1 in den Vektor ppolisapirib Klonieren von Reporter- und Markergenen GFP MutaHEF NPHEF Nachweis der Proteine und weiterführende Untersuchungen Immunfluoreszenz-Test Nachweis des Matrixproteins im Western Blot Mini-Genomsystem Expression von Virusproteinen mit dem Mini-Genomsystem Erzeugung von VLP mit einem Segment Erzeugung rekombinanter Influenza-C-Viren mit dem GFP-Reportergen als zusätzlichem Segment Erzeugung eines rekombinanten Influenza-C-Virus mit mutiertem HEF als zusätzlichem Gen

11 Erzeugung von rekombinanten Influenza-C-Viren aus cdna Diskussion Zusammenfassung Summary 127 Literaturverzeichnis 129 A Sequenzen der Primer 145 A.1 Primer zum Klonieren A.2 Primer zum Sequenzieren B Sequenzen der Konstrukte 153 B.1 Sequenzen der Chimären B.2 Sequenzen der Segmente C Klonieren 177 C.1 Klonieren der Chimären C.1.1 HEF-G-CT C.1.2 HEF-G-TM C.1.3 HEF-G-ST C.2 Klonieren der einzelnen Segmente in das Expressionsplasmid pcdna C.2.1 Segment C.2.2 Segment C.2.3 Segment

12 C.2.4 Segment C.2.5 Segment C.2.6 Segment C.2.7 Segment C.2.8 Klonierung der translatierten Bereiche von NS1 und NS2 in pcdna C.3 Klonieren und Umklonieren der Segmente in ppolisapirib C.3.1 Segment C.3.2 Segment C.3.3 Segment C.3.4 Segment C.3.5 Segment C.3.6 Segment C.3.7 Segment Abbildungsverzeichnis 189 Tabellenverzeichnis 191

13 Abkürzungsverzeichnis A a AB ACE APS Aqua bidest. AS as bp BSA C c CAT cdna CMV CT D datp DEPC DFP DMEM DMF DMSO DNA Alanin Adenin, eine der vier Basen der DNA Antibiotikum 3-amino-9-ethylcarbazol Ammoniumpersulfat Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser Aminosäure Antisense Basenpaare Bovines Serumalbumin Cystein Cytosin, eine der vier Basen der DNA Chloramphenicol-Acetyltransferase copy DNA, komplemantäre DNA Cytomegalievirus Cytoplasmatischer Anteil Asparaginsäure Desoxyadenosintriphosphat Diethylpyrocarbonat Diisopropylfluorophosphat Dulbecco s modified Eagle medium Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure

14 dntp Desoxynucleotidtriphosphat DTT Dithiothreitol E Glutamin EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EMEM Eagle s Minimum Essential Medium ER endoplasmatisches Retikulum ECL Enzym-Chemolumineszenz E. coli Escherichia coli F Phenylalanin FITC Fluoresceinisothiocyanat FKS Fetales Kälberserum G Glycin g Guanin, eine der vier Basen der DNA g Erdbeschleunigung GFP green fluorescent protein, grün fluoreszierendes Protein G-Protein Glykoprotein von VSV H Histidin HA Hämagglutinin HAU hämagglutinierende Einheiten HEF-Protein Hämagglutination-Esterase-Fusions-Protein HRP Peroxidase aus Meerrettich H 2 O Reinstwasser I Isoleucin ICTV International Committee of the Taxonomy of Viruses IF Immunfluoreszenz IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid K Lysin kb Kilobasen kda Kilodalton JHB Johannesburg L Leucin LB Luria Broth, Bakterienmedium

15 M MM MDCK MKS m.o.i. M-Protein mrna N NA Neu5Ac Neu5,9Ac 2 NEP NP NS-Protein NTB OD ORF P PAGE PBS PBSM PCR PFA PFU p.i. poli polii P-Protein Q R rer RNA Methionin Master-Mix-Ansätze Madin-Darby canine kidney cells Maul- und Klauenseuche multiplicity of infection Matrixprotein messenger RNA, Boten-RNA Asparagin Neuraminidase N-Acetylneuraminsäure N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure nuclear export protein Nukleoprotein Nichtstruktur-Protein nicht-translatierter Bereich optische Dichte open reading frame, offener Leserahmen Prolin Polyacrylamidgel-Elektrophorese Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung PBS ohne Calcium und Magnesium polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion Paraformaldehyd Plaque-bildende Einheiten post infectionem Polymerase-I Polymerase-II Polymerase-Protein Glutamin Arginin raues endoplasmatisches Retikulum Ribonukleinsäure

16 RNase Ribonuclease RNP Ribonukleoprotein RT Reverse Transkriptase S Serin s sense SDS Natriumdodecylsulfat Seg. Segment ST Teil der Stielregion SV40 Simianvirus Typ 40 T Threonin t Thymin, eine der vier Basen der DNA TAE TRIS-Acetat-Puffer TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer TBS TRIS-gepufferte Kochsalzlösung TEMED N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin TiHo Tierärztliche Hochschule TM Transmembrananker TRIS Tris-Hydroxymethylaminomethan U unit, Einheit V Valine VLP virus like particles, virusähnliche Partikel vrna virale RNA VSV Virus der Vesikulären Stomatitis W Tryptophan X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl- β-d-galactosid Y Tyrosin

17 1. Einleitung 1.1 Influenza-C-Virus Taxonomie Bei den Vertretern der Familie der Orthomyxoviridae handelt es sich, wie bei denen der Familien der Arenaviridae und Bunyaviridae, um behüllte Viren mit einem segmentierten Genom, dessen einzelsträngige RNA von negativer Polarität ist. Solche negativsträngigen RNA-Viren können die genomische RNA nicht als mrna nutzen. Sie besitzen eine RNA-abhängige RNA-Polymerase im Viruspartikel, die das Genom in mrna-moleküle umschreibt. Die Familie der Orthomyxoviridae erhielt ihren Namen (orthos, griech.: standard, korrekt; myxa, griech.: Schleim) aufgrund der Fähigkeit ihrer Vertreter, an Mucus zu binden bzw. wegen ihrer Affinität zu Schleimhäuten. Sie ist im 6. Report des internationalen Komitees für Virus-Taxonomie (ICTV) basierend auf verschiedenen molekularen und serologischen Charakteristika der NP- und M-Proteine in 4 Genera eingeteilt worden: Influenza- A-Virus, Influenza-B-Virus, Influenza-C-Virus und Thogotovirus (Leahy et al., 1997; Pringle, 1998). Einen Überblick geben die Tabellen 1.1 und 1.2. Das Virus der infektiösen Anämie der Lachse zeigt einige Gemeinsamkeiten zu den anderen Vertretern der Familie der Orthomyxoviridae, das Genus Isavirus ist allerdings vom internationalen Komitee für Virus-Taxonomie (ICTV) noch nicht offiziell der Familie der Orthomyxoviridae zugeordnet worden. Das Wort Influenza wurde im 15. Jahrhundert in Italien geprägt und bedeutet Einfluss (ital.: influenza). Dem Volksglauben nach stand die gleich lautende Seuche unter dem 17

18 18 1. Einleitung Tabelle 1.1: Übersicht über die Vertreter der Familie der Orthomyxoviridae. Familie Orthomyxoviridae Genus Influenza-A- Influenza- Influenza- Thogoto- Isavirus Virus B-Virus C-Virus virus Vertreter Humanes Influenza- Influenza- Thogoto- Virus der Influenzavirus B-Virus C-Virus virus infektiösen Anämie der Lachse Equines Influenza- Dhorivirus virus Porzines Influenzavirus Aviäres Influenzavirus (Klassische Geflügelpest) Einfluss der Sterne. Die Zuordnung des Influenza-C-Virus zur Familie der Orthomyxoviridae (damals Myxoviridae) war zunächst umstritten, da die Enzymaktivität ( Rezeptor-zerstörendes Enzym ) andere Charakteristika aufwies als bei den damals bekannten Influenza-A-Viren (Hirst, 1950). Tabelle 1.2: Übersicht über die Familie der Orthomyxoviridae. Genus Wirte Segmentanzahl Oberflächenproteine Influenza-A-Virus Mensch, Schwein, Pferd, 8 HA, NA Robben, Vögel Influenza-B-Virus Mensch, Robben 8 HA, NA Influenza-C-Virus Mensch, Schwein, Hund 7 HEF Thogotovirus Zecken, Rinder, Schafe, Ziegen, Nagetiere 6 1 Glykoprotein

19 1.1. Influenza-C-Virus Klinik und Epidemiologie Erste Hinweise darauf, dass es sich bei dem Erreger der so genannten Schweineinfluenza um ein Virus handelt, lieferte Shope (1931) gelang es Smith et al. (1933) erstmalig, ein Influenza-A-Virus aus einem Menschen zu isolieren. Erst im nächsten Jahrzehnt, im Jahre 1940, entdeckte Francis das Influenza-B-Virus und 7 Jahre später konnte Taylor (1949) ein Virus isolieren, dessen antigene Eigenschaften nicht mit den zuvor entdeckten Influenza-A- und -B-Viren übereinstimmten. Nachdem Francis et al. (1950) ein ähnliches Virus fand, wurde es aufgrund der klinischen, epidemiologischen und serologischen Daten Influenza-C-Virus getauft (Francis et al., 1950; Taylor, 1951). In China wurde das Virus aus Schweinen isoliert (Guo et al., 1983; Yuanji und Desselberger, 1984), während in verschiedenen Studien Antikörper bei Hunden entdeckt wurden (Yamaoka et al., 1991; Manuguerra und Hannoun, 1992; Manuguerra et al., 1993). Das Virus wird wie alle Influenza-Viren aerogen übertragen (Tröpfcheninfektion) und infiziert die Epithelien des oberen Respirationstraktes (Taylor, 1951). Die Erkrankung tritt vor allem bei Kindern auf und äußert sich in milden respiratorischen, grippeähnlichen Symptomen, wie Fieber, Kopf- und Gliederschmerzen, Husten und Schnupfen (Francis et al., 1950; Minuse et al., 1954; Styk, 1955; Dykes et al., 1980; Katagiri et al., 1983). Häufig kommt es zu einem inapparenten Verlauf der Erkrankung, nur selten zu schweren Verlaufsformen (Gerber et al., 1952; Grist, 1955; Darke et al., 1957). Das Influenza-C-Virus ist, wie serologische Studien ergaben, weltweit verbreitet (Andrews und McDonald, 1955; Jennings, 1968; Gerth et al., 1975; El-Rai et al., 1977; Dykes et al., 1980; Homma et al., 1982). Ein Großteil der adulten Bevölkerung zeigt eine hohe Seroprävalenz (besitzt Antikörper gegen Influenza-C-Viren) (O Callaghan et al., 1980; Homma et al., 1982). Seroepidemiologische Studien zeigen, dass Influenza-C-Viren eine größere genetische Stabilität aufweisen als Influenza-A- und -B-Viren (Chakraverty, 1978; Meier-Ewert et al., 1981; Guo et al., 1983; Kawamura et al., 1986), so dass weder antigenetic shifts (Neukombination der Segmente durch Doppelinfektionen mit Viren verschiedener Spezies) noch Pandemien wie bei Influenza-A-Viren zu beobachten sind.

20 20 1. Einleitung Morphologie und Genomstruktur Morphologie Influenza-Viren treten in elektronenmikroskopischen Aufnahmen als pleomorphe, meist sphärische, aber auch filamentöse Partikel mit einem Durchmesser von nm auf. Die umhüllende Lipiddoppelschicht entstammt der jeweiligen Wirtszelle, in der die Viren repliziert haben (Compans und Choppin, 1975). In die Lipidhülle sind viruskodierte, glykosylierte Oberflächenproteine (spikes) eingelagert (Abb 1.1). Das Influenza-C-Virus besitzt im Gegensatz zu Influenza-A- und -B-Viren, die über das HA- und NA-Protein verfügen, das Oberflächenglykoprotein HEF (Herrler et al., 1979, 1981; Pfeifer und Compans, 1984; Nakada et al., 1984a; Herrler et al., 1988). Die Virusspikes von Influenza-C-Viren haben eine Länge von 8-10 nm und einen Durchmesser von 4-5 nm (Herrler et al., 1981; Hewat et al., 1984). Das HEF-Protein liegt als trimerer Komplex vor und verleiht dem Virus durch eine regelmäßige hexagonale Anordnung ein charakteristisches Aussehen (Waterson et al., 1963; Flewett und Apostolov, 1967; Compans und Choppin, 1975; Compans et al., 1977; Herrler et al., 1981; Hewat et al., 1984; Formanowski und Meier-Ewert, 1988). Dieses eine Glykoprotein vereinigt die drei biologischen Aktivitäten Hämagglutination, Esterase und Fusion, die bei Influenza-A- und -B-Viren auf zwei Glykoproteine aufgeteilt sind. Ein anderes integrales Membranprotein ist das CM2, das nur in wenigen Kopien in den Virionen vorhanden ist. Das virale Matrixprotein (M-Protein) ist an der Innenseite der Hülle lokalisiert (Kendal, 1975) und über hydrophobe Wechselwirkungen mit den Lipiden und durch elektrostatische Anziehungskräfte mit den Nukleokapsiden assoziiert (Zhirnov und Grigoriev, 1994). Bezogen auf die Zahl der Moleküle ist M das häufigste Protein im Viruspartikel. Innerhalb des Virions befindet sich das helikale Nukleokapsid, das aus vier Proteinen (P1, P2, P3, NP) und der RNA besteht. Die sieben einzelsträngigen Nukleinsäuresegmente sind über ihre gesamte Länge mit dem NP komplexiert. Zusätzlich ist jedes Segment mit dem Polymerasekomplex assoziiert, der aus drei Proteinen besteht (P1, P2, P3) (Cox und Kendal, 1976; Compans et al., 1977; Petri et al., 1979b, 1980).

21 1.1. Influenza-C-Virus 21 CM2 Lipidhülle M HEF P1 P2 NP P3 RNA Abbildung 1.1: Schematische Darstellung eines Influenza-C-Virus-Partikels. P1 = P1-Protein, P2 = P2-Protein, P3 = P3-Protein, NP = Nukleoprotein, HEF = HEF-Protein, M = Matrixprotein, CM2 = CM2-Protein. Genomstruktur Die genetische Information, die bei Influenza-A- und -B-Viren auf acht Segmente verteilt ist, liegt bei Influenza-C-Viren auf sieben Segmenten kodiert (Cox und Kendal, 1976; Ritchey et al., 1976; Air und Compans, 1983; Lamb, 1983). Alle sieben Segmente, die insgesamt Nukleotide umfassen, wurden bereits vollständig sequenziert (Pfeifer

22 22 1. Einleitung und Compans, 1984; Nakada et al., 1984b, 1985, 1986; Yamashita et al., 1988, 1989). An ihren 3 - und 5 -Enden weisen sie hochkonservierte Sequenzen von Nukleotiden auf, die zudem eine große Homologie zu den entsprechenden Segmenten von Influenza-Aund -B-Viren zeigen (Desselberger et al., 1980; Clerx-van Haaster und Meier- Ewert, 1984). Diese konservierten Bereiche sind komplementär zueinander und können Doppelstränge ausbilden, so dass die Segmente eine quasizirkuläre, Pfannenstiel ähnliche Form annehmen (sog. panhandle). Des Weiteren enthalten diese nicht kodierenden Bereiche Signalsequenzen für die Initiation von Transkription und Genomreplikation. Jedes der Segmente kodiert für nur ein Protein, mit Ausnahme der Segmente 6 und 7, die für zwei bzw. drei Polypeptide kodieren, die z.t. durch Spleißvorgänge entstehen (s. Tabelle 1.3). Die Segmente 1, 2 und 3 (ca Nukleotide) kodieren für die drei Proteine des Polymerasekomplexes (Racaniello und Palese, 1979; Yamashita et al., 1989), das Segment 4 (ca Nukleotide) für das HEF-Protein und das Segment 5 (ca Nukleotide) für das Nukleoprotein. Das 6. Segment (ca Nukleotide) kodiert für das M-Protein, welches von einer gespleißten mrna translatiert wird, sowie für die beiden Proteine p31 und CM2 (Yamashita et al., 1988; Hongo et al., 1999; Pekosz und Lamb, 2000). Das Segment 7 (ca. 975 Nukleotide) kodiert für die beiden Nichtstrukturproteine (NS1, NS2), wobei die mrna für das kleinere durch einen Spleißvorgang entsteht (Nakada et al., 1985, 1986; Marschall et al., 1999). Tabelle 1.3: Übersicht über die Genomsegmente und die Proteine, für die sie kodieren. Segment Nukleotidgröße Protein 1 ca P1 2 ca P2 3 ca P3 4 ca HEF 5 ca NP 6 ca M, CM2, p31 7 ca. 975 NS1, NS2

23 1.1. Influenza-C-Virus Virusproteine P1, P2, P3 Die Proteine P1, P2 und P3 des Polymerasekomplexes bilden zusammen mit dem NP das Nukleokapsid. Sie werden nach ihrer Synthese im Zytoplasma in den Kern transportiert und als analoge Proteine zu denen des Transkriptionsapparates des Influenza-A-Virus betrachtet. Eine wesentliche Funktion ist die RNA-abhängige RNA-Polymerase (P2 bzw. PB2) und das Binden der Cap-Struktur an die synthetisierte RNA mit positiver Polarität (cap-binding, P1 bzw. PB1) (Bishop et al., 1971a,b; Petri et al., 1980; Nagele und Meier-Ewert, 1984; Yamashita et al., 1989). NP Das 565 AS lange Nukleoprotein (Stamm California/78) gehört ebenfalls zu den Komponenten des Nukleokapsides und weist für jedes der drei Influenza-Viren unterschiedliche molekulare Charakteristika auf. Es wurden zwei Regionen mit hoher Homologie zu den Nukleoproteinen von Influenza-A- und -B-Viren gefunden (Nakada et al., 1984a; Lamb, 1989). Eine davon ist die Karyophilie-Sequenz von Influenza-A- und -B-Viren (Davey et al., 1985). Das an basischen Argininresten reiche Nukleoprotein ist während des Replikationszyklus für den korrekten Ablauf der Genomreplikation wichtig. HEF Die komplette Nukleotidsequenz von Segment 4 wurde aus verschiedenen Isolaten bereits entschlüsselt. Die HEF-Sequenz wurde zum einen an klonierter cdna (Nakada et al., 1984b; Pfeifer und Compans, 1984), zum anderen durch Direktsequenzierung von vrna ermittelt (Buonagurio et al., 1985; Adachi et al., 1989). Das HEF-Protein wird als ein Polypeptid von 88 kda synthetisiert (HEF 0 ) und durch zelluläre Trypsin ähnliche Proteasen in die beiden Untereinheiten HEF 1 (432 AS, 57 kda) und HEF 2 (209 AS, 25 kda) gespalten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden bleiben (Herrler et al., 1979; Rosenthal et al., 1998). HEF ist ein typisches Klasse- I-Membranprotein mit einer N-terminalen Signalsequenz, einem Fusionspeptid (Position

24 24 1. Einleitung ) und einem Membrananker (Position ) (Herrler et al., 1981; Meier- Ewert et al., 1981; Formanowski und Meier-Ewert, 1988; Herrler und Klenk, 1991). Der sehr kurze cytoplasmatische Anteil besteht aus drei AS (Arginin, Threonin und Lysin) (Krystal et al., 1982). Im Gegensatz zum Influenza-A-HA-Protein wird die HEF 2 -Untereinheit nicht mit Palmitinsäure modifiziert, sondern am Cystein in der Nähe des C-Terminus mit Stearinsäure acyliert (Veit et al., 1990, 1996). Von den acht potenziellen N-Glykosylierungsstellen werden sieben genutzt (Herrler und Klenk, 1991). Für das HEF-Protein sind drei Funktionen - Rezeptorbindung, Rezeptorinaktivierung und Fusionsaktivität - bekannt (Vlasak et al., 1987; Herrler et al., 1988): 1. Rezeptorbindung: Als Rezeptordeterminante wurde N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure (Neu5,9Ac 2 ) identifiziert. Neu5,9Ac 2 kann seine Funktion als Bestandteil sowohl von Glykoproteinen als auch von Glykolipiden (Ganglioside) wahrnehmen (Herrler et al., 1985b,c; Rogers et al., 1986; Herrler und Klenk, 1987; Herrler et al., 1987a,b). Durch Selektion auf MDCK-II-Zellen konnte eine Virusmutante identifiziert werden, die aufgrund einer Punktmutation an Nukleotid-Position 872 (an AS-Position 284 wurde ein Threonin (T) gegen ein Isoleucin (I) ausgetauscht) eine signifikante Veränderung der Rezeptorbindungsaktivität aufwies (Szepanski et al., 1992). Diese Virusmutante hatte eine höhere Affinität zu Neu5,9Ac 2 als das parentale Virus vom Stamm JHB/1/66 und somit einen erweiterten Zelltropismus. Das Threonin (284) befindet sich in unmittelbarer Nähe der Sequenz G 279 -Q-S-G 282, die auch in der Rezeptorbindungstasche von Influenza-A-HA-Proteinen gefunden wurde (Weis et al., 1988). Dieses Motiv G 279 -Q-S-G-D-T 284 ist auch ein wesentlicher Bestandteil der Rezeptorbindungsstelle des HEF-Proteins (Herrler und Klenk, 1991). Die Rezeptordomäne des HEF-Proteins reicht von AS-Position (Rosenthal et al., 1998). 2. Rezeptorinaktivierung: Anders als Influenza-A- und -B-Viren haben Influenza-C-Viren keine Neuraminidase als rezeptorinaktivierendes Enzym, sondern eine O-Acetylesterase, die N-Acetyl- 9-O-Acetylneuraminsäure als Substrat erkennt und die hydrolytische Freisetzung des Essigsäurerestes an Position 9 katalysiert (Herrler et al., 1985a,c, 1987b).

25 1.1. Influenza-C-Virus 25 Allerdings werden eine Reihe synthetischer Verbindungen, wie z.b. α-naphthylacetat oder p-nitrophenylacetat, schneller umgesetzt als das physiologische Substrat (Schauer et al., 1988). Die O-Acetylesterase wird der Familie der Serin-Proteasen zugeordnet und kann durch Diisopropylfluorophosphat (DFP) irreversibel gehemmt werden (Muchmore und Varki, 1987). Die Serin-Proteasen sind durch die katalytische Triade S-H-D charakterisiert. Bei HEF konnte das Serin im aktiven Zentrum an Position 57 lokalisiert werden, so dass sich die Triade aus S 57, H 355 und D 352 zusammensetzt (Rosenthal et al., 1998). Die Esterasedomäne ist auf dem HEF-Protein auf zwei Stellen verteilt, AS-Position sowie Sie flankieren damit die Rezeptordomäne (Rosenthal et al., 1998). 3. Fusion: Für die Fusionsaktivität des HEF-Proteins ist die Spaltung in die beiden Untereinheiten HEF 1 und HEF 2 essenziell. Die Spaltung erfolgt durch zelluläre Proteasen und bewirkt die Freilegung des Fusionspeptids am neu entstandenen N-Terminus der HEF 2 -Untereinheit (Kitame et al., 1982; Ohuchi et al., 1982). Eine weitere wichtige Voraussetzung für die Fusionsaktivität ist ein ph-wert zwischen 5 und 6 (Formanowski et al., 1990). Bei niedrigen ph-werten kommt es zum Auflösen der hexagonalen Anordnung der Virusspikes, also zur Konformationsänderung (Hewat et al., 1984; Formanowski et al., 1990). Diese Merkmale zeigen deutliche Parallelen zum Fusionsweg der Influenza-A-Viren, so dass die Fusion der viralen mit der endosomalen Membran auch für Influenza-C-Viren wahrscheinlich ist (Wiley und Skehel, 1987; Formanowski et al., 1990). Die Fusionsdomäne ist auf dem HEF-Protein dreigeteilt. Sie reicht von AS-Position 1-40 über AS-Position bis hin zu der kompletten HEF 2 -Untereinheit (Rosenthal et al., 1998). Gegen das HEF-Protein werden neutralisierende Antikörper gebildet. Matrixprotein, CM2, p31 Das Nukleotide große Segment 6 (Yamashita et al., 1988) wird in eine mrna transkribiert, die in einem einzelnen offenen Leserahmen (ORF) für ein Polypeptid (p42-

26 26 1. Einleitung Vorläufer-Protein) von 374 AS Länge und einem Molekulargewicht von 41,7 kda kodiert (Yamashita et al., 1988; Hongo et al., 1998; Pekosz und Lamb, 1998). Das p42 Vorläufer-Protein wird proteolytisch in das p31 (N-terminales Spaltprodukt) und CM2 (C-terminales Spaltprodukt) gespalten (Hongo et al., 1994, 1999; Pekosz und Lamb, 1997, 1998). Das C-terminale Spaltprodukt CM2 ist ein kleines glykosyliertes integrales Membranprotein. Das 139 AS lange Polypeptid verkürzt sich nach Abspaltung des N-terminalen Signalpeptids auf 115 AS. Es teilt einige Strukturmerkmale mit dem M2-Protein von Influenza-A-Viren. Die Dimere und Tetramere, die von dem CM2 gebildet werden, sind über Disulfidbrücken miteinander verbunden. Das CM2-Protein verfügt über eine Transmembranregion sowie eine potenzielle N-Glykosylierungsstelle und wird an der Zelloberfläche von virusinfizierten wie von transfizierten Zellen exprimiert und in Influenza-C- Virionen inkorporiert (Hongo et al., 1997; Pekosz und Lamb, 1997). Die Funktion des CM2-Proteins ist noch nicht geklärt. Möglicherweise handelt es sich um ein Ionenkanalprotein analog zum M2-Protein der Influenza-A-Viren. Das p31-protein ist mit der AS-Sequenz des M-Proteins identisch, enthält aber zusätzlich 17 AS am C-terminalen Ende. Es bindet an Lipidmembranen und hat eher die Eigenschaften eines integralen Membranproteins wie das CM2-Protein als die eines peripheren wie das M-Protein. In virusinfizierten Zellen wird es schnell abgebaut (Pekosz und Lamb, 1998, 2000). Anders als bei Influenza-A- und -B-Viren, die das Matrixprotein direkt von einer ungespleißten mrna translatieren, wird das M-Protein der Influenza-C-Viren von einer gespleißten mrna abgelesen. Das 242 AS lange Protein hat eine Molekularmasse von 27 kda. Beim Spleißvorgang entsteht aus dem potenziellen Tryptophan-Kodon an AS- Position 243 (Nukleotid T 752, G 753, G 754 ) ein Stoppkodon. Die Nukleotide T 752 und G 753 bilden die 5 -Spleißstelle und das Nukleotid A 982 die 3 -Spleißstelle (Yamashita et al., 1988). Die Sequenzhomologie zwischen den Matrixproteinen von Influenza-A- und -C-Viren beträgt ca. 20 %. Ein Kernlokalisationssignal, wie es bei Influenza-A-Viren gefunden wurde (Eister et al., 1997), konnte bei Influenza-C-Viren noch nicht identifiziert werden. Trotzdem wird ein Transport in den Zellkern (Patterson et al., 1988; Bucher et al., 1989)

27 1.1. Influenza-C-Virus 27 und sogar eine spezifische Assoziation mit demselben vermutet (Sugawara et al., 1991). Die genaue Funktion des M-Proteins bei Influenza-C-Viren ist noch wenig untersucht. Es spielt vermutlich analog zu M1 von Influenza-A- und -B-Viren eine wichtige Rolle bei der Verpackung neusynthetisierter Nukleokapside (Yamashita et al., 1988). Nichtstrukturproteine NS1, NS2 Bei Influenza-C-Viren wurden zwei Nichtstrukturproteine mit einem Molekulargewicht von 27 und 14 kda gefunden (Nakada et al., 1985; Marschall et al., 1999). Die ungespleißte mrna enthält einen einzelnen ORF, der in ein 246 AS langes Protein translatiert wird (Marschall et al., 1999). Ein Teil der mrna wird gespleißt, wobei ein 314 Nukleotid großes Fragment (Nukleotid ) herausgeschnitten wird. Die Translation beginnt am selben Startkodon (aug) wie bei NS1. Beim NS1- und NS2-Protein sind die ersten 62 AS identisch. Nach der Spleißstelle (Nukleotidposition 527) folgen noch 120 AS, so dass das NS2-Protein insgesamt 182 AS lang ist (Hongo et al., 1992). Es wird vermutet, dass das NS2 analog zu Influenza-A-Viren eine wichtige Rolle beim Ausschleusen des neu gebildeten Nukleokapsids aus dem Kern spielt (Paragas et al., 2001), und es deshalb NEP (nuclear export protein) genannt werden sollte (O Neill et al., 1998) Replikation Die Influenzaviren dringen wie alle behüllten Viren durch spezifische Bindung an Zellmembran-assoziierte Rezeptormoleküle und anschließende Fusion mit der Membran in die Wirtszelle ein (Zimmer et al., 1995). Die Erkennung erfolgt bei Influenza-C-Viren über die Rezeptordeterminante N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure (Herrler und Klenk, 1991). Das Oberflächenglykoprotein HEF bindet an Neu5,9Ac 2 (Adsorption), und durch Endozytose wird das Virus internalisiert. Durch Ansäuerung der Endosomen kommt es wie beim HA-Protein der Influenza-A- und -B-Viren zur Konformationsänderung des HEF- Proteins und somit zur Aktivierung der fusogenen Domäne. Es folgt die Verschmelzung der viralen Membran mit der Endosomenmembran, wodurch der Vorgang der Penetration

28 28 1. Einleitung abgeschlossen wird (Kitame et al., 1982; Ohuchi et al., 1982). Anders als bei Influenza- A- und -B-Viren verläuft die Auflösung der M-Proteinmatrix nicht im sauren, sondern im neutralen bis alkalischen Milieu (Zhirnov und Grigoriev, 1994). Wie bei Influenza-A- und -B-Viren werden bei den Influenza-C-Viren nach der Fusion die internen Ribonukleoproteinanteile in den Zellkern transportiert. Gleichfalls folgt ein Actinomycin D-empfindlicher Replikationsprozess, da die Orthomyxoviren für die Transkription ihrer Genomsegmente die zelluläre DNA-abhängige RNA-Polymerase-II benötigen (Lamb und Choppin, 1977; Petri et al., 1979a; Plotch et al., 1979). Die viruseigene RNA-abhängige RNA-Polymerase kann weder Cap-Strukturen synthetisieren noch 5 -Methylierungen durchführen (Nagele und Meier-Ewert, 1984). Sie bedient sich eines Mechanismus, der als 5 -Cap-Stehlen bezeichnet wird (Yamashita et al., 1989). Modifizierte zelluläre mrna-fragmente mit freien 3 -OH-Enden werden als Primer für die Initiation der Transkription verwendet. An der Elongation der mrna sind alle drei Proteine des Polymerasekomplexes (P1, P2, P3) beteiligt. Die virale mrna wird mit Hilfe zellulärer sowie viraler Komponenten (NS1) aus dem Kern ausgeschleust. Die Translation des Glykoproteins HEF erfolgt an der Membran des rauen endoplasmatischen Retikulums (rer), wo die Trimerisierung erfolgt und die Glykosylierung beginnt. Nach der weiteren Prozessierung im Golgi-Apparat kommt es zum Transport an die Zellmembran. Die anderen viralen Proteine werden an den freien Ribosomen des Zytoplasmas translatiert und in den Zellkern transportiert. Die Anreicherung des Nukleoproteins hat die Umschaltung von Transkription zu Replikation zur Folge. Jetzt assoziieren neusynthetisierte RNA-Stränge mit den Proteinen des Polymerasekomplexes sowie dem NP zu neuen Nukleokapsiden und werden nach Anlagerung des Matrixproteins ins Zytoplasma transportiert. Von hier gelangen sie zu Domänen der Zellmembran, in denen das HEF- Protein vermehrt eingelagert ist. Dort entstehen sich nach außen wölbende Areale. Es kommt zur Knospung reifer Virionen. Als Besonderheit unter den Influenza-Viren werden bei Influenza-C-Viren freie Viruspartikel ohne Nukleokapsid beobachtet. Bei Influenza-C- Viren scheint die Interaktion der Hüllkomponenten für die Knospung und Partikelfreisetzung auszureichen (Herrler et al., 1981).

29 1.2. Reverse Genetik bei Influenza-Viren Reverse Genetik bei Influenza-Viren Die reverse Genetik, eine Technik, mit der man gezielt spezifische Mutationen in das virale Genom einbringen kann, hat das Wissen über Viren und ihre Interaktionen mit dem Wirtsorganismus enorm vergrößert (Weissmann et al., 1979). Bei den Negativstrang-RNA-Viren gestaltete sich die reverse Genetik zuerst schwierig, weil die RNA mit dem Polymerasekomplex assoziiert ist. Bei den Influenza-Viren kam der segmentierte Genomaufbau noch erschwerend hinzu. Nachdem allerdings die Isolierung eines aktiven Polymerasekomplexes vom Influenza-A- Nukleokapsid durch CsCl-Glycerol-Zentrifugation gelungen war (Honda et al., 1988), eröffneten sich neue Möglichkeiten. Es konnten in vitro kurze synthetische RNA-Moleküle, die die 3 - und 5 -terminalen Nukleotidsequenzen enthielten, erzeugt werden (Parvin et al., 1989). Es wurde gezeigt, dass ein Genkonstrukt, bestehend aus dem kodierenden Bereich des Chloramphenicolacetyltransferase-Gens (CAT) sowie den 3 - und 5 -terminalen Sequenzen von Influenza-A-Viren, in vivo in Zellen, die mit einem Helfervirus infiziert waren, vermehrt werden konnte. Das CAT-Gen wurde repliziert, in Virionen verpackt und konnte dann über eine gewisse Zeit in Zellen passagiert werden (Luytjes et al., 1989; Neumann et al., 1994; Mena et al., 1996). Analog dazu konnten Virus ähnliche Partikel (VLP) mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) als Reportergen erzeugt werden (Neumann et al., 2000). Wagner et al. (2000) konnte solche VLP für das Thogotovirus erzeugen. Dieses wichtige Experiment machte es möglich, gezielt Mutationen im Genom von Influenza-A-Viren zu erzeugen (Enami et al., 1990). Diese Technologie wurde später verbessert. Die Effizienz der Isolierung von Viren, die Fremdgene trugen, wurde vergrößert, indem die Transkription der synthetischen RNA in Anwesenheit des Polymerasekomplexes durchgeführt wurde (Enami und Palese, 1991). Für die Isolierung von Viren mit künstlichen RNA-Segmenten benötigte man ein gutes Selektionssystem, das großen Selektionsdruck auf das Helfervirus ausübte. Aus diesem Grund konzentrierten sich die frühen Studien auf die Untersuchung der Oberflächenproteine, bei denen man einen Antikörper abhängigen Selektionsdruck ausüben konnte. Viele wichtige Entdeckungen, welche die individuellen Influenza-Virus-Proteine betreffen, konnten durch die Anwendung der reversen Genetik gemacht werden. Auch die Nutzung

30 30 1. Einleitung von Influenza-A-Viren als viraler Expressionsvektor wurde dadurch möglich (Neumann und Kawaoka, 1999; Pekosz et al., 1999). Es wurden zwei Systeme etabliert, die die Manipulation jedes einzelnen Genes des Influenza-A-Genomes ohne Benutzung eines Helfervirus ermöglichte. 1. Die Promotor- und Terminator-Sequenzen der zellulären DNA-abhängigen RNA- Polymerase-I (poli) flankieren die Gene, die in Antisense-Orientierung vorliegen und auch die 3 - und 5 -terminalen nicht-kodierenden Bereiche enthalten. Auf diese Art und Weise werden künstliche RNA-Segmente erzeugt. Es werden acht Plasmide, die für die acht RNA-Segmente kodieren und unter der Kontrolle der Promotorund Terminator-Sequenzen der RNA-Polymerase-I stehen, zusammen mit den vier Plasmiden, die für den Polymerasekomplex und das NP kodieren und unter der Kontrolle von RNA-Polymerase-II (polii) stehen, in die Zelle transfiziert (Neumann et al., 1999). 2. Im anderen System werden die Promotor-Sequenz der RNA-Polymerase-I und ein Ribozym benutzt (Pleschka et al., 1996; Fodor et al., 1999). Später wurde ein System etabliert, in dem infektiöse Viruspartikel durch die Transfektion von insgesamt nur acht Plasmiden gewonnen wurden. Diese Plasmide beinhalten die RNA-Polymerase-I Promotor- und Terminator-Sequenzen sowie den Promotor der RNA-Polymerase-II und eine Polyadanylierungsstelle. Die Orientierung der beiden Transkriptionseinheiten war so gewählt, dass sie die Synthese von negativsträngiger vrna und positivsträngiger mrna von ein und demselben viralen cdna-abschnitt ermöglichte (Hoffmann et al., 2000, 2002). 1.3 Das Virus der Vesikulären Stomatitis Das Virus der Vesikulären Stomatitis wird an dieser Stelle verkürzt dargestellt, da es im Rahmen eines Versuches verwendet wurde, für die Arbeit an sich aber eine untergeordnete Rolle spielt.

31 1.3. Das Virus der Vesikulären Stomatitis 31 Taxonomie Das Virus der Vesikulären Stomatitis gehört der Familie der Rhabdoviridae an und ist dem Genus Vesiculovirus zugeordnet. Die Familie der Rhabdoviridae wird wie die Familie der Bornaviridae, Filoviridae und Paramyxoviridae der Ordnung der Mononegavirales zugeordnet. In die Familie der Rhabdoviridae sind ebenfalls die Genera Lyssavirus, Ephemerovirus, Nukleorhabdovirus, Novirhabdovirus und Cytorhabdovirus eingeordnet. Morphologie und Genomstruktur Das unsegmentierte virale Genom besteht aus einer einzelsträngigen RNA von negativer Polarität. Die RNA umfasst insgesamt Nukleotide, wobei es fünf offene Leserahmen (ORF) besitzt. Die Leserahmen sind in folgender Reihenfolge angeordnet: N-P-M-G-L. Die Virionen der Vesikulären Stomatitis haben ein geschossförmiges Aussehen mit einer Größe von 70 x 180 nm. Das helikale Nukleokapsid besteht aus den Proteinen N, P und L sowie dem viralen Genom. Das Matrixprotein M ist mit dem Nukleokapsid assoziiert und liegt der Membranhülle des Virions von innen an. Des Weiteren spielt es bei der Regulation der viralen Transkription sowie beim Buddingprozess eine Rolle. Das Oberflächenglykoprotein G ist als trimerer Komplex mit der hydrophoben Transmembrandomäne in der Lipidhülle verankert. Es besitzt eine 28 AS lange cytoplasmatische Domäne. Das G-Protein spielt beim Eindringen des Virions in die Zelle sowie beim Buddingprozess eine zentrale Rolle. Nach der Prozessierung und Glykosylierung im Endoplasmatischen Retikulum erfolgt der Transport an die Zellmembran. Das M-Protein verbindet das G-Protein mit dem Nukleokapsid und induziert das Ausstülpen der Membran. Es kommt zur Freisetzung neuer Virionen (Rodriguez und Nichol, 1999; Rose und Whitt, 2001). Nachdem die Klonierung der vollständigen VSV-Sequenz gelungen war, wurde das System rekombinanter VS-Viren als viraler Vektor für die Expression von Fremdgenen benutzt. Das Hämagglutinin-Gen des Influenza-A-Virus (Roberts et al., 1998, 1999) und andere Gene viraler Glykoproteine wurden in das Genom von VSV eingesetzt und exprimiert (Kahn et al., 1999; Grigera et al., 2000; Schlereth et al., 2000; Rose et al., 2000, 2001; Ezelle et al., 2002; Haglund et al., 2002).

32 32 1. Einleitung Die große Toleranz gegenüber genetischen Veränderungen, der einfache Genomaufbau (fünf Gene) und die hochtitrige Vermehrung zeichnen das VSV-Vektorsystem aus. Infektion, Klinik, Epidemiologie und Bedeutung Das Virus der Vesikulären Stomatitis infiziert Pferde, Rinder, Schweine und in seltenen Fällen auch Menschen. Die Übertragung erfolgt durch den Biss oder Stich infizierter Insekten. In der Regel verlaufen die Infektionen mit VSV subklinisch. Beim Ausbruch der Erkrankung kommt es zu charakteristischen bläschenartigen Hautläsionen im Bereich von Zunge, Lippen, Maulschleimhaut, Zitzen und am Kronsaum (Rodriguez und Nichol, 1999). Die Verbreitung von VSV ist zur Zeit auf Nord-, Mittel- und Südamerika beschränkt. Die klinischen Ausbrüche liegen zum Teil weit auseinander, so können mitunter 10 Jahre zwischen zwei Ausbrüchen liegen. In endemischen Gebieten werden Ratten, Mäuse, Fledermäuse, Brüllaffen, Hirsche und Wildschweine als Wildtierreservoir betrachtet. Insekten gelten als Reservoir und Überträger von VSV (Rodriguez und Nichol, 1999). Obwohl VSV-Ausbrüche verhältnismäßig selten vorkommen, führen diese in endemischen Gebieten durch den Leistungsrückgang der Tiere zu wirtschaftlichen Verlusten. Wegen der hohen Ähnlichkeit der Symptome der Vesikulären Stomatitis mit denen der Maulund Klauenseuche (MKS) (klinisch nicht voneinander zu unterscheiden) ist die Vesikuläre Stomatitis differentialdiagnostisch von sehr großer Bedeutung und in Deutschland eine anzeigepflichtige Tierseuche.

33 2. Zielsetzung Das Influenza-C-Virus gehört zur Familie der Orthomyxoviridae und infiziert effektiv den oberen Respirationstrakt. Das Virus trägt das sog. HEF-Protein (Hämagglutination- Esterase-Fusion) in seiner Hülle, das die drei verschiedenen biologischen Aktivitäten - Rezeptorbindung, Rezeptorinaktivierung und Fusionsaktivität - besitzt, die bei Influenza- A- und -B-Viren auf die beiden Proteine HA (Hämagglutinin) und NA (Neuraminidase) verteilt sind. Das HEF-Protein ist im Hinblick auf Gentherapie am Respirationstrakt interessant. Bisherige Versuche einer Gentherapie mit Hilfe von Adenoviren und adenoassoziierten Viren sowie retroviralen Vektoren lieferten nur unbefriedigende Ergebnisse. Bei diesen Erregern ist die Effizienz der Infektion des Respirationstraktes sehr gering, weil die Rezeptoren auf der basolateralen Seite der respiratorischen Epithelzellen lokalisiert und somit für von außen applizierte Viren schwer zugänglich sind. Respiratorische Viren stellen hierzu eine Alternative dar, weil sie die Epithelzellen des Respirationstraktes effektiv von der apikalen Seite infizieren. Diese Viren kamen bisher in der Gentherapie nicht zum Einsatz. Aufgrund der negativsträngigen Genomstruktur ist die Erzeugung rekombinanter Viren aus cdna schwieriger als bei anderen Viren. Bei Influenza- A-Viren steht erst seit kurzem ein effektives System zur genetischen Manipulation zur Verfügung (Neumann et al., 1999). Sowohl Influenza-A- und B- als auch Sendaiviren erkennen N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) als Rezeptordeterminante, die auf dem respiratorischen Epithel weit verbreitet ist. Influenza-C-Viren erkennen dagegen die viel seltenere N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure (Neu5,9Ac 2 ) als Rezeptordeterminante und haben damit einen viel engeren Tropismus. Mit der Veröffentlichung der Röntgenstruktur (3-D-Struktur) des HEF-Proteins (Rosenthal et al., 1998; Zhang et al., 1999) wurde die Voraussetzung geschaffen, die Affinität des Proteins zu Neu5,9Ac 2 durch gezielte ortsgerichtete Mutationen in der Rezeptorbindungstasche zu verändern und auf diese Weise 33

34 34 2. Zielsetzung den Tropismus des Virus einzuengen oder zu erweitern. Im Hinblick auf eine spätere gezielte Änderung des Tropismus von Influenza-C-Viren sollte in der vorliegenden Arbeit ein System entwickelt werden, um die Wirkung gezielter Mutationen auf die Rezeptorbindung zu untersuchen. Im ersten Schritt sollte die Eignung des Virus der Vesikulären Stomatitis als System zur Charakterisierung des HEF-Proteins geprüft werden. Im Hinblick auf den späteren Einbau in das VSV erschien es sinvoll, chimäre Proteine zwischen dem G-Protein des VS-Virus und dem HEF-Protein des Influenza-C-Virus herzustellen und diese auf Funktionalität unter besonderer Berücksichtigung der Bindungseigenschaften des HEF-Proteins zu untersuchen. Im Weiteren sollte mit Hilfe der reversen Genetik, wie sie schon bei Influenza-A-Viren erfolgreich angewendet wurde (Neumann et al., 1999), ein rekombinantes Influenza-C- Virus erstellt werden. Dabei wird letztlich infektiöses Virus aus cdna erzeugt.

35 3. Material 3.1 Zelllinien COS7: Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (african green monkey), die mit dem SV40-T7-large-Antigen transformiert wurden, stammen aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo) und der Medizinischen Hochschule Hannover. MDCK-I: Hundenierenepithelzellen (Madin-Darby canine kidney cells) MDCK-II: Hundenierenepithelzellen MDCK-I- und MDCK-II-Zellen unterscheiden sich in Morphologie und Physiologie voneinander (Richardson et al., 1981; Simmons, 1981; Valentich, 1981; Hansson et al., 1986; Zimmer et al., 1997). HeLa: humane, epitheliale Zervixkarzinomzellen BHK21: Nierengewebe des Syrischen Goldhamsters Mesocricetus auratus (baby hamster kidney cells). Die MDCK-I-, MDCK-II-, HeLa-, und BHK21-Zellen stammen aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. 35

36 36 3. Material 3.2 Zellkulturmedien Dulbecco s Minimum Essential Medium (DMEM): DEMEM-Pulvermedium 13,53 g GIBCO, Invitrogen NaHCO 3 2,20 g Aqua bidest. ad 1,00 l Der ph-wert wurde durch CO 2 -Begasung auf 6,9 eingestellt. Eagle s Minimum Essential Medium (EMEM): EMEM-Fertigpulver 9,6 g GIBCO, Invitrogen NaHCO 3 2,2 g Aqua bidest. ad 1,0 l Der ph-wert wurde durch CO 2 -Begasung auf 7,0 eingestellt. Beide Medien wurden jeweils auch mit Antibiotikazusatz verwendet, je Liter: Penicillin G 0,06 g Sigma Streptomycin-Sulfat 0,05 g Sigma Phosphatgepufferte Salzlösung ph 7,0-7,2 (PBS) nach DULBECCO u. VOGT (1954): NaCl 8,00 g KCl 0,20 g Na 2 HPO 4 12 H 2 O 2,37 g KH 2 PO 4 2 H 2 O 0,20 g CaCl 2 0,13 g MgCl 2 6 H 2 O 0,10 g Aqua bidest. ad 1,00 l

37 3.2. Zellkulturmedien 37 Phosphatgepufferte Salzlösung ohne Calcium und Magnesium(PBSM): NaCl 8,00 g KCl 0,20 g Na 2 HPO 4 12 H 2 O 2,37 g KH 2 PO 4 2 H 2 O 0,20 g Glucose 1,00 g Phenolrot (1 %) 1,50 ml Aqua bidest. ad 1,00 l Versen-Trypsin 0,125%: NaCl 8,00 g KCl 0,20 g Na 2 HPO 4 12 H 2 O 2,31 g KH 2 PO 4 2 H 2 O 0,20 g CaCl 2 0,13 g MgSO 4 7 H 2 O 0,10 g Trypsin 1,25 g Versen (Titriplex III)(EDTA) 1,25 g Streptomycin 0,05 g Penicillin 0,06 g Aqua bidest. ad 1,00 l Der ph-wert wurde mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellt. Alle o.g. Zellkulturkomponenten wurden sterilfiltriert. Fetales Kälberserum (FKS) Nicht essenzielle Aminosäuren GIBCO, Invitrogen Biochrom AG

38 38 3. Material 3.3 Bakterienkulturmedien LB-Medium: Bacto-Trypton 10,0 g NaCl 10,0 g Hefe-Extrakt 5,0 g Reinstwasser ad 1,0 l Der ph-wert wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt. Das Medium wurde dann autoklaviert bei Raumtemperatur gelagert. LB-Medium mit Agar-Agar für Agarplatten: Zu o.g. Rezept wurden zusätzlich 20 g Agar-Agar/l zugefügt und anschließend autoklaviert. Zur Herstellung von Agarplatten musste das Medium in der Mikrowelle erhitzt, im Wasserbad auf ca. 48 C abgekühlt und dann in entsprechende Petrischalen gegossen werden. Bei Bedarf wurden dem Medium kurz vor dem Gießen der Schalen 50 µg/ml Ampicillin zugefügt. 3.4 Viren Das Influenza-C-Virus vom Stamm Johannesburg/1/66 sowie die von diesem Stamm abgeleitete Mutante T284I wurden von Prof. Herrler, Institut für Virologie, TiHo, zur Verfügung gestellt. Sie dienten als Ausgangsmaterial für die Virus-Anzucht sowie für Infektionsversuche. Das Virus der Vesikulären Stomatitis (VSV) vom Stamm Indiana wurde von Dr. Zimmer, Institut für Virologie, TiHo, zur Verfügung gestellt. 3.5 Erythrozyten Vollblut von Hühnern sowie 10 %ige Hühnererythrozyten-Lösungen wurden von der Geflügelklinik der TiHo zur Verfügung gestellt.