DNA-Reparatur. Skript: Kapitel 4

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1 J. Jiricny Medizin 1. Studienjahr Bachelor Molekulare Zellbiologie FS März 2013 DA-Reparatur Skript: Kapitel 4 Ursachen von DA-Schäden und ihre Konsequenzen DA-Reparaturmechanismen Chromosomale Translokationen und Krebs Karzinogene und ihre Wirkungsweise Bsp: Rauchen und Lungenkrebs 1

2 DA-Schäden: Ursachen endogen (Schäden entstehen im Inneren der Zelle durch metabolische Prozesse): o spontane Veränderungen der DA-Basen (z.b. Desaminierung) o oxidativer Stress: Sauerstoffradikale entstehen durch normale Zellatmung o Fehlpaarungen während der Replikation o ca DA-Schäden/Zelle/Tag! exogen (umweltbedingt): o Strahlung (UV, Röntgenstrahlung, Radioaktive Strahlung) o chemische Substanzen (z.b. Tabakrauch) Source DA lesions Estimated number of lesions/cell Peak hr sunlight DA crosslinks (Sonnenbrand) Cigarette smoke DA adducts up to (> 40 different carcinogens) è Benzo(a)pyren Radiotherapy* DA Double-strand breaks 80 2

3 DA-Schäden: Ursachen und Konsequenzen Tabakrauch UV-Strahlung Sauerstoffradikale Mutationen (Genveränderungen) 3

4 UV-Licht kann benachbarte Pyrimidinreste im gleichen Strang crosslinken UltraViolette Strahlung im Sonnenlicht ( nm) UVA, UVB und UVC UVB und v.a. UVC werden grösstenteils durch O 3 -Schicht absorbiert UVA ( nm, langwellig) dringt bis in die Dermis ein UVA und UVB erhöhen Melanomrisiko UVA induziert direkt Thymindimere: o blockiert DA-Replikation o kann zu Mutationen führen o verschiedene DA-Reparaturmechanismen 4

5 Direkte Reparatur I: Photolyase Bakterien, Hefen, Pflanzen, Taufliegen, Frösche und Beuteltiere können mithilfe eines lichtabhängigen Enzyms (Photolyase) UV-induzierte Pyrimidin-Dimere (Thymin oder Cytosin) photochemisch spalten und somit Mutationen verhindern T Cyclobutan 6-4 Photoprodukt (kovalente Bindungen) T Thymindimere Blockiert Replikation und Transkription Mutagen während Replikation blockiert Transkription 5

6 Photolyasen: Flavin-bindende Proteine, die Photodimere mit Hilfe von Elektronentransfer spalten Menschen besitzen keine Photolyase sie benutzen ein anderes DA-Reparatursystem: ukleotidexzisionsreparatur (ER) MTHF=Methylentetrahydrofolat FADH=Flavin-Adenin-Dinukleotid 6

7 Direkte Reparatur II: O(6)-Methylguanin-DA-Methyltransferase (MGMT) Das Kamikaze -Protein MGMT macht die Methylierung (-CH3) von Guaninresten rückgängig und verhindert somit Mutationen: O(6)meG paart mit T (statt C) 6 Manche Krebstherapien basieren auf der Wirkung von alkylierenden Chemotherapeutika (z.b. Temozolomid für Glioblastome = bösartiger Hirntumor) Die Effizienz dieser Therapien kann durch irreversible Hemmung von MGMT [z.b. durch O(6)-Benzylguanin] erhöht werden. 7

8 Basenexzisionsreparatur (BER) U U Abasische-Stelle (sog. AP-site) AP = apurinic bzw. apyrimidinic 8

9 Wichtige DA-Glykosylasen und ihre Substrate Substrat DA-Glykosylase Substrat DA-Glykosylase H 3 C O + H O 7-Methylguanin 3-Methyladenin H H H 2 + CH 3 O H Methyplurin-DA-Glykosylasen (TAG, AlkA, MAG, AAG) Uracil F 5-Fluorouracil H O H H O H O Uracil-DA-Glykosylase (UDG) Hypoxanthin O 8-Oxoguanin H H H O H H 2 Oxoguanin-DA-Glykosylasen (MutM, OGG1, OGG2) Thymin-DA-Glykosylase (TDG) (Erkennt T nur gegenüber von G) H 2 Adenin H MutY (MYH) (Erkennt A nur gegenüber von 8-oxoG) H 3 C Thymin O H H O 9

10 Spontane Desaminierung von Basen Hydrolyse Cytosin Uracil Desaminierung von Cytosin: ca. 100/Zelle/Tag Ursache für Punktmutationen, sog. G:C è A:T Transitions-Mutation (Py-Py) G:C Desaminierung Uracil Reparatur G:U Replikation G:C A:U Replikation Uracil Reparatur A:T G:C 10

11 Spontane Desaminierung von 5-Methylcytosin TDG: Thymine DA-Glykosylase (BER ersetzt me C mit C) 11

12 Oxidation von Guanin Oxidation von Guanin zu 8-Oxoguanin durch Sauerstoffradikale: ca. 2000/Zelle/Tag 8-oxoG entsteht gegenüber von C, aber paart mit A während der Replikation Ursache für Punktmutationen: G:C è T:A Transversions-Mutation (Pu-Py) O Rd H O H H H H O H dr H 2 Rd H O O H H H dr 8-oxoG:C (Substrat für OGG1) 8-oxoG:A (Substrat für MYH) 12

13 ukleotidexzisionsreparatur (ER) - I erkennt und repariert UV-induzierte Schäden (hauptsächlich Pyrimidin-Dimere) ER in E. coli: Pyrimidin-Dimer UvrA, UvrB, UvrC ( UV-Exzinuklease ) DA-Polymerase I DA-Ligase 13

14 Xeroderma pigmentosum (XP) klinisch und genetisch heterogene Erbkrankheit (autosomal rezessiv) sehr selten, 1: Symptome: o Extreme Sensitivität gegenüber UV Strahlung ( Mondscheinkinder ) o 2000-fach erhöhtes Hautkrebsrisiko o Schwere Haut- und Augenanomalien o eurologische Defekte (20% der Patienten) o Lebenserwartung um 30 Jahre verkürzt Die Entdeckung der in XP-Patienten mutierten Gene (XPA-XPG, XPV) führte zur Aufklärung der Wirkungsweise der ukleotidexzisionsreparatur im Menschen 14

15 ukleotidexzisionsreparatur (ER) - II ER in H. sapiens 4. Bildung des Reparaturkomplexes 1. UV-Licht XPB TFIIH XPA XPD XPG RPA 2. Schadenerkennung durch XPC 23B XPC 3. Rekrutierung der Helikasen XPB, XPD (TFIIH) TFIIH 23B XPC 5. Inzision durch XPF und XPG Endonukleasen ERCC1 XPA XPG XPF RPA ca. 30 nt 6. Reparatursynthese (Pol δ) und Ligase 15

16 XPV ist nicht an der ER beteiligt! Das XP-V (variant) Gen kodiert für eine DA-Polymerase: Pol eta (DA-Pol η) Pol eta toleriert UV-induzierte Pyrimidindimere und kann diese fehlerfrei übergehen ( By-pass ) Pol eta gehört zur Familie der Transläsionssynthese (TLS)-DA-Polymerasen Eukaryonten DA-Pol α Primase, kurze DA-Fragmente DA-Pol β BER DA-Pol γ Replikation des Mitochondriengenoms DA-Pol δ Replikation Folgestrangs DA-Pol ε Replikation Leitstrangs DA-Pol κ TLS Polymerase DA-Pol λ DA-Pol ι DA-Pol θ DA-Pol µ DA-Pol ζ DA-Pol η (XP-V) 16

17 Fehler bei der DA-Replikation sind sehr selten! Replikative DA-Polymerasen sind nicht fehlerlos (Faktor: 10-5 ): 1 falsche Base per 10 5 eingebaute ukleotide Mechanismus: DA-Polymerase (Fingers ) prüft konstant die Geometrie des Basenpaares Die Korrekturlese-Funktion der DA-Polymerase erhöht die Genauigkeit (Faktor: 10-2 ): 1 Fehler in 10 7 Mechanismus: Ein falsch eingebautes ukleotid wird erkannt und durch die 3-5 Exonuklease (Exo)-Aktivität entfernt Die Fehlpaarungsreparatur ( Mismatch Repair ) reduziert die Fehlerrate (Faktor: 10-3 ) 1 Fehler in Mechanismus: Das falsche ukleotid wird erkannt und durch das Richtige ersetzt 1 Basenaustausch auf eingebaute ukleotide d.h. weniger als 1 Fehler pro Genom-Duplikation ( 6.4 x 10 9 bp) 17

18 Fehlpaarungsreparatur (MMR) - I Mismatch repair (MMR) in E. coli: erkennt und repariert fehlgepaarte ukleotide kurz nach der Replikation Fehlpaar Replikative Polymerase inkorporiert fälschlicherweise ein T (statt C) gegebüber von G (G:T mismatch) MutS erkennt die Fehlpaarung und rekrutiert MutL Exonukleasen (5-3 oder 3-5 ) MutL rekrutiert die Endonuklease MutH, die den neu-synthetisierten (noch nicht-methylierten) Tochterstrang (blau) spaltet. (Der Matrizenstrang ist durch Methylgruppen an Adeninresten (G me ATC Sequenz) markiert.) Exonukleasen (mit Hilfe von UvrD Helikase) bauen den Teil des Stranges ab, der das falsche T enthält DA-Polymerase III DA-Ligase DA-Polymerase III fülllt die enstandene Lücke auf DA-Ligase verknüpft die DA-Stränge 18

19 MMR in E. coli 19

20 Fehlpaarungsreparatur (MMR) - I 5' 3' 3' G T 5' 5' 3' 3' G T MLH1 hpms2 EXO1 5' ATP ADP MSH6 G 5' 3' 3' MSH2 T ADP ATP 5' 3' 3' MLH1 PMS2 MLH1 hpms2 5' 3' 3' G T 5' 5' 5' MMR im Menschen: MutSα, MutLα Exo1, PCA RPA 5' 3' 3' DA-Polymerase δ / PCA DA-Ligase 5' G 3' 3' C 5' Der Mismatch-Erkennungskomplex aus MSH2/6 bindet am Fehlpaar und rekrutiert MLH1/PMS2. Der Komplex wandert dann an der DA entlang, bis er auf eine Strangdiskontinuität im neu-synthetisierten Tochterstrang (z.b. Lücke zwischen Okazaki-Stücken) trifft. Dort wird Exo1 rekrutiert, das den Tochterstrang bis nach dem falsch-eingebautem ukleotid abbaut. DA-Polymerase δ fülllt die enstandene Lücke auf und DA-Ligase I verknüpft die DA-Stränge. 5' 20

21 Defekte in der Fehlpaarungsreparatur können zu Darmkrebs führen Das hereditäre nichtpolypöse Kolonkarzinom (HPCC) oder Lynch-Syndrom ist eine erbliche Darmkrebsform ohne Polyposis, d. h. ohne Auftreten von vielen Polypen im Darm, die autosomal-dominant vererbt wird. HPCC ist die häufigste erbliche Darmkrebsform und betrifft etwa 4 % der Darmkrebsfälle. Bei etwa 80 % der Genträger tritt ein Kolonkarzinom auf. Das durchschnittliche Alter bei Diagnose liegt bei 45 Jahren. Die am häufigsten mutierten Gene in HPCC Patienten sind MSH2 und MLH1 21

22 Ionisierende Strahlung induziert Doppelstrangbrüche (DSBs) Hochenergetische, ionisierende Strahlung (engl. ionizing radiation, IR): Röntgenstrahlung (engl. X-rays): in der Krebstherapie eingesetzt Gamma-Strahlung (γ-rays): Tschernobyl Unfall (1986) DSB source Estimated number of DSBs/cell Dental X-rays Mammography Body CT scan 0.28 Chernobyl accident 12 (300 msv) Fukushima accident 0.5 (12 msv) Radiotherapy* 80 * 2 Gy = typical single dose administered per day in the treatment of cancer (1 Gy IR è 40 DSBs/cell) 1 Sievert (Sv) corresponds to 1 Gy Unreparierte DSBs sind tödlich für die Zelle - Prinzip der Radiotherapie! ABER: Falschreparierte DSBs können auch zu Krebs führen! 22

23 Zwei DSB Reparaturwege 1. icht-homologes End-Joining (HEJ) ist fehleranfällig 2. Homologe Rekombination (HR) ist fehlerfrei HEJ HR (Kap. 6.3) DSB Erkennung (Ku70/Ku80) DSB Erkennung (MRE11 Komplex) limitierte Endprozessierung: - Exonukleasen - TLS Polymerasen Folge: Verlust genetischer Information Wiederverbindung der DA-Enden (Ligase IV) direkte Verknüpfung beider DSB Enden benötigt intaktes Schwesterchromatid als Matrize exzessive Endprozessierung (ukleasen) Paarung und 1. Invasion (RAD51 Filament) 2. Invasion (Holliday Struktur) Der Bruch und die Wiederverbindung der DA- Moleküle erfolgt durch spezifische Enzyme, die sog. Rekombinasen, so präzise, dass kein ukleotid verloren geht oder dazukommt. 23

24 BRCA1 und BRCA2 sind wichtige Faktoren in der DSB Reparatur durch Homologe Rekombination BRCA1 CtIP BRCA2 RAD51 24

25 Fehlerhafte Reparatur von DSBs kann zu chromosomalen Translokationen und Krebs führen The karyotype of a normal human cell (46 paired chromosomes). The aneuploid karyotype of a breast cancer cell includes inappropriate numbers of some chromosomes and translocations (= exchange of segments between chromosomes). 25

26 Der achweis von chromosomalen Translokationen erfolgt über FISH (Bsp: Philadelphia Chromosom) FISH: Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung wird die Sonde mit Hilfe eines fluoreszierenden Farbstoffes nachgewiesen Metaphasechromosomen (blau), bei denen eine Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22 durch den Einsatz zweier genspezifischer Sonden (grün und rot) nachgewiesen wurde. Karyogramm eines Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) verursacht durch die Translokation t(9;22) 26

27 Fehlerhaftes End-Joining von zwei DSBs kann zu Krebs führen Bsp: Chronisch myeloische Leukämie (CML) t(9;22) Translokation führt zu einem verkürzten Chromosom 22 (sog. Philadelphia Chromosom) 95% der CML Patienten weisen ein Philadelphia Chromosom auf der Chromosomenbruch liegt im Bereich von 2 Genen, BCR und ABL (Tyrosinkinase) das Fusionsprodukt BCR-ABL besitzt dauerhafte Kinase-Aktivität (onkogene Wirkung) die Zelle vermehrt sich unkontrolliert (unabhängig von Wachstumsfaktoren) und entartet 27

28 Imatinib (Glivec ) blockiert die BCR-ABL Kinase Imatinib Der Wirkmechanismus von Imatinib besteht in der kompetitiven und selektiven Blockade der ATP- Bindungsstelle der BCR-ABL Kinase. Damit wird die Übertragung eines Phosphatrestes auf das Substrat (Kinasierung) wird verhindert. Imatinib ist das Paradebeispiel für die gezielte Krebstherapie, die speziell auf die biologische Eigenarten der Krebszellen gerichtet ist (im Unterschied zu Chemo- oder Strahlentherapie). 28

29 Interstrang Cross-link (ICL) Reparatur Kovalente verknüpfung der DA-Stränge blockiert Transkription und Replikation Reparatur wird mit Hilfe der FA Proteine (FAC A-P) erledigt Mechanismus noch nicht vollständig verstanden 29

30 Fanconi Anämie Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine äußerst seltene autosomal rezessive Erbkrankheit. Sie führt über verschiedene Wege sowohl zur verringerten Synthese von roten und weißen Blutkörperchen, als auch zum übermäßigen Abbau dieser Zellen. Die Fanconi-Anämie ist primär ein Chromosomenbruchsyndrom. Die Zellen der FA Patienten sind extrem empfindlich auf ICL-induzierende Substanzen (z.b. Cisplatin, Mitomycin C usw.)

31 Erbkrankheiten aufgrund von DA-Reparatur-Defekten HPCC XP SCID FA erblicher Brustkrebs 30

32 Karzinogene sind häufig Mutagene Bsp: Tabakrauch und Lungenkrebs Epidemiologischer Zusammenhang zwischen Rauchen und Lungenkrebs 95% aller Lungenkrebspatienten sind Raucher! Jahren nach Beginn des Rauchens besteht ein 60x erhöhtes Lungenkrebsrisiko! 31

33 Benzo(a)pyren in Lungenkrebs Tabakrauch enthält u.a. polyzyklische, aromatische Kohlenwasserstoffe (z.b. Benzo(a)pyren) Benzo(a)pyren selbst ist nicht giftig, aber wird im Körper durch Cytochrom-P450 aktiviert nach weiterer Prozessierung entsteht das hochgradig krebserzeugende BPDE die Epoxid-Gruppe von BPDE reagiert mit DA und modifiziert Guanin (DA-Addukt) ohne DA-Reparatur kommt es zu G:C è T:A Transversions-Mutationen (u.a. im p53 Gen) Cyt-P450 Monooxygenasen BPDE Kausaler Zusammenhang zwischen Rauchen und Lungenkrebs 32

34 Chemotherapie und DA-Reparatur Viele effektive Chemotherapeutika sind DA-Schadstoffe DA-Reparatur kann ihre Effizienz verringern, verhindert aber gleichzeitig die ebenwirkungen im gesunden Gewebe Temozolomid, Ifosfamid (reparieret durch MGMT/MMR) 5-Fluorouracil (repariert durch BER) Cisplatin, Oxaliplatin, Carboplatin (Addukte repariert durch ER, FA) Ionisierende Strahlen, Anthracycline, Etoposid, Irinotecan (DSBs repariert durch HEJ, HR) 33