Bachelorarbeit. Studiengang Bioinformatik Freie Universität Berlin. Validierung des MetaGenIndex als Konzept zur Vereinheitlichung von Gen-Datenbanken

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1 Bachelorarbeit Studiengang Bioinformatik Freie Universität Berlin Validierung des MetaGenIndex als Konzept zur Vereinheitlichung von Gen-Datenbanken Carsten Seehafer Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung GmbH Heubnerweg Berlin betreut von: Dr. Bernd Drescher und Prof. Dr. Hans Lehrach

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3 Inhalt Abbildungs- / Tabellen- / Diagrammverzeichnis 1. Einleitung 7 2. Allgemeine Grundlagen 2.1 Expressed Sequence Tag (EST) Orthologie DNA- / Protein-Datenbanken TIGR UniGene Ensembl MetaGenIndex Consensus CDS (CCDS) Programm zur Validierung des MetaGenIndex 3.1 Methoden Daten Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung und Ausblick 35 Glossar 37 Literatur 41 Anhang 43 Danksagung 47

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5 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: cdna Klonierung und EST Sequenzierung [11] 9 Abbildung 2: Ergebnisschnittmenge (Ensembl, TIGR, UniGene) 15 Abbildung 3: Beispiel Accession numbers (Ensembl, TIGR, UniGene) 16 Abbildung 4: Programmablaufplan des Validierungsprogramms 43 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Beispiel pairwise best hit 19 Tabelle 2: Mensch MetaGenIndex Tabelle 3: Maus MetaGenIndex Tabelle 4: Quelldatei 1 von Ensembl 22 Tabelle 5: Quelldatei 2 aus UniGene Daten * [#] 22 Tabelle 6: Quelldatei 3 aus Ensembl Daten* [#] 23 Tabelle 7: NCBI CCDS Gen-Index 23 Tabelle 8: Gene ID UniGene ID 23 Tabelle 9: Ensembl CCDS Gen-Index 23 Tabelle 10: Ergebnis der Validierung 25 Tabelle 11: Resultat UniGene* 27 Tabelle 12: Resultat e-values 28 Tabelle 13: Resultat Selbsttest 29 Diagrammverzeichnis Diagramm 1: Orthologie-Vorhersage Ensembl 26 Diagramm 2: Orthologie-Vorhersage auf Basis von UniGene-Daten* 26 Diagramm 3: Orthologie-Vorhersage auf Basis von Ensembl-Daten* 26 Diagramm 4: Vergleich der Orthologien von UniGene* gegen Ensembl 27 Diagramm 5: Vergleich der Orthologien von UniGene* gegen Ensembl* 28 Diagramm 6: Selbsttest (Kreisdiagramm) 29 Diagramm 7: Selbsttest, Verteilung der Rate (Balkendiagramm) 30 Diagramm 8: Vergleich CCDS Gen-Index gegen MetaGenIndex 30 * Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#]

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7 1 Einleitung 1. Einleitung Die Analyse von Genen gehört zu einem Teilgebiet der Bioinformatik. Eine Vielzahl von Informationen zu einem Gen, zum Beispiel seine Bezeichnung, chromosomale Position, Beschreibung, Intron-Exon-Struktur, Sequenz und vieles mehr, sind im Internet frei erhältlich. Die Sequenz liegt in Bruchstücken in großen DNA-Datenbanken vor. Zu den drei größten Datenbanken gehören TIGR (The Institute for Genomic Research), NCBI-UniGene (National Center for Biotechnology Information) und Ensembl (EMBL-EBI / Sanger Centre). Die Darstellung aller existierenden Gene durch diese Datenbanken ist unvollständig. Zum einen werden für gleiche Gene verschiedene Bezeichnungen verwendet und zum anderen kann ein gegebenes Gen in einer der Datenbanken repräsentiert sein, während es in einer anderen fehlt. Die Verwendung einer einzelnen Datenbank kann daher bei der Suche nach einem Gen dazu führen, dass es nur deshalb nicht gefunden wird, weil die verwendete Datenbank das Gen nicht enthält. Die Ergebnisse überlappen sich und sind im Einzelnen suboptimal. Um ein optimales Ergebnis zu schaffen, wurde der "MetaGenIndex" entwickelt. Der MetaGenIndex enthält alle Bezeichnungen eines Gens und stellt eine Verknüpfung der genannten Datenbanken dar. Er kann auf verschiedene Weisen, mit unterschiedlichen Parametereinstellungen gebildet werden. Ziel der Arbeit ist es, mit Hilfe orthologer Beziehungen, eines Selbsttestes und eines Vergleiches mit einem zweiten Gen-Index den MetaGenIndex in seinen aktuellen Einstellungen zu überprüfen. Im nachfolgenden Kapitel werden zunächst allgemeine Grundlagen zu dem Thema erläutert. Danach wird das für diese Arbeit entwickelte Validierungsprogramm vorgestellt. Unter Punkt 4 sind die Programmergebnisse zu finden, welche unter Punkt 5 ausgewertet werden. Im Anhang befindet sich ein Glossar, in dem kursiv geschriebene Wörter erklärt werden. 7

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9 2. Allgemeine Grundlagen 2 Allgemeine Grundlagen 2.1 Expressed Sequence Tag (EST) Durch den Vorgang der Transkription und anschließenden Translation entsteht aus einer DNA-Sequenz eine Protein-Sequenz. Bei der Transkription wird mit Hilfe der RNA Polymerase und der DNA als Vorlage die RNA gebildet. Als cdna (complementary DNA) bezeichnet man eine DNA-Sequenz, die durch ein experimentelles Verfahren (reverse Transkription) aus der mrna gewonnen wird. Der Begriff EST wurde erstmalig 1991 von J. Craig Venter verwendet. (Science 252: ) ESTs sind kurze, für gewöhnlich Basenpaare lange, Sequenzabschnitte der cdna. Sie repräsentieren die Genexpression in einem Gewebe oder während eines gegebenen Entwicklungsstadiums und sind für die Identifizierung von kodierenden Bereichen (CDS) in genomischen Sequenzen sowie für die Kartierung von Genomen nützlich. In Abbildung 1 ist eine Zusammenfassung der cdna Klonierung sowie der EST Sequenzierung zu sehen. Die genomische DNA, die als Vorlage der Transkription dient (a), enthält regulatorische Elemente und Signale, die den Bereich eines Gens definieren und die Transkriptionsmaschinerie initiieren. Punkt (b) zeigt das Transkriptionsprodukt in Form der pre-mrna. Diese wurde bereits durch 5' Capping und 3' Polyadenylierung modifiziert. Anschließend folgt das alternative Splicing. Dabei werden aus der premrna die Introns vollständig (c) oder teilweise (d) entfernt und die messenger RNA (mrna) gebildet. Durch einen künstlichen Vorgang (reverse Transkription) kann aus der mrna die cdna gewonnen werden (e). Die DNA-Sequenz wird von den Enden der cdnas abgelesen, woraufhin 5' und 3' ESTs entstehen (f). Durch bioinformatische Methoden wie EST clustering und sequence assembly wird versucht, die große Menge der ESTs zu ordnen und zu logischen, sich überlappenden Contigs zu vereinen (h). [11] (Abbildung 1) cdna Klonierung und EST Sequenzierung [11] 9

10 2 Allgemeine Grundlagen 2.2 Orthologie Die Orthologie ist wie EST ein häufig genutzter Begriff in dieser Arbeit. Sie beschreibt die Beziehung zwischen zwei Genen aus verschiedenen Spezies, die sich durch Spezialisierung aus einem gemeinsamen Vorgänger-Gen in der jüngsten Vorgängerspezies gebildet haben. [16] Es wird angenommen, dass sich in der Evolution alle Organismen aus einer Urform entwickelten. In Millionen von Jahren wurden die Gene von einer Generation zur nächsten weitergegeben. Gene bzw. die von ihnen kodierten Proteine, die einen gemeinsamen Ursprung besitzen, bezeichnet man als homolog. Diese Gene können entweder durch Spezialisierung (Orthologie) oder durch Gen-Duplikation innerhalb des Genoms (Paralogie) entstanden sein. Die Kenntnis über die DNA-Sequenzen aus mehreren Genomen macht es möglich, die Gene zu klassifizieren. Das Zusammenfassen (Clustern) der Gene nach bestimmten Kriterien, zum Beispiel nach der Ähnlichkeit, ermöglicht es, Studien in der Evolution durchzuführen. Die Ähnlichkeit wird hauptsächlich auf Protein-Ebene gefunden. Die DNA-Sequenz der Transkripte ist schlechter konserviert, vor allem, wenn die Spezies weit voneinander entfernt liegen. Alle heute auf der Erde lebenden Organismen können in drei Hauptgruppen unterteilt werden: Bakterien, Archaeen und Eukaryonten Die für diese Arbeit untersuchten Organismen Mensch (Homo sapiens) und Maus (Mus Musculus) gehören zu der Gruppe der Eukaryonten. Die Bestimmung orthologer Gen-Paare ist schwierig. Vereinfacht ausgedrückt ist ein Gen aus einem Genom zu einem Gen eines anderen Genoms dann ortholog, wenn die von ihnen kodierten Proteine die höchste gemeinsame Sequenzähnlichkeit besitzen. Dies funktioniert bei naher Verwandtschaft. Sind die Spezies jedoch evolutionär gesehen weit voneinander entfernt, wird es komplizierter. Wenn es zu einer Gen-Duplikation kommt, würde nur eine M:N Beziehung die Orthologie korrekt beschreiben. M zu N bedeutet, dass es zu M Genen des einen Genoms N orthologe Gene des anderen Genoms geben kann. Diese Beziehungen würden nicht gefunden werden, wenn nur der beste Treffer mit der höchsten Sequenzähnlichkeit die Orthologie definiert. Außerdem kann es vorkommen, dass der beste Treffer nicht statistisch signifikant ist, das heißt, dass das Ergebnis auch zufällig entstanden sein kann. Die Definition einer orthologen Beziehung in solchen Fällen wäre falsch. Um 1:N und M:N Beziehungen in die Definition der Orthologie aufzunehmen, werden Cluster von orthologen Gruppen gebildet (COGs). 10

11 2 Allgemeine Grundlagen Die einfachste und beste Möglichkeit, orthologe Gene zu finden, ist die Dreiecksform. [14] Das heißt, ist das Protein eines Gens aus einem Genom nicht nur zu einem Protein von einem Gen aus einem anderen Genom, sondern auch zu einem dritten Protein von einem Gen aus einem dritten Genom ähnlich, und besitzt zu diesen beste reziproke Treffer, also auch in Rückrichtung, so ist das Protein und somit das Gen zu diesen ortholog. [14] Dies durch Zufall zu beobachten, ist sehr unwahrscheinlich. Ist die Dreiecksform erfüllt, entspricht dies dem idealen Fall. Dadurch, dass es paraloge Gene gibt, kann es jedoch oft vorkommen, dass die besten Treffer nicht reziprok sind. [14] 2.3 DNA- und Protein-Datenbanken Es existieren zahlreiche DNA- und Protein-Datenbanken, aus denen soviel wie möglich Informationen gewonnen werden. Dazu werden die Daten zum Beispiel nach ihrer homologen Beziehung, biochemischen Aktivität, zellulären Funktion, dreidimensionalen Struktur und nach ihren evolutionären Ursprüngen klassifiziert. Die COG Datenbank ist der Versuch einer solchen Klassifizierung und nutzt als Basiskonzept die Orthologie. [13] Andere Datenbanken sind zum Beispiel TIGR, UniGene und Ensembl. Diese sollen in den kommenden Unterpunkten näher vorgestellt werden TIGR Bei TIGR wurde ein Verfahren zum Reinigen, Clustern und Assemblieren von EST Sequenzen entwickelt, um auf diese Weise den TIGR Gen-Index zu bilden. Dazu werden in einem ersten Schritt von GenBank EST Sequenzen heruntergeladen. Diese können kontaminiert sein, zum Beispiel mit Sequenzen aus anderen Genomen und müssen daher zunächst von diesen bereinigt werden. Anschließend folgen das Clustern und die Assemblierung. Dabei werden die verbliebenen ESTs zu Contigs zusammengefasst und aus den Contigs die Konsensus Sequenzen gebildet. Dadurch ist nahezu jedes EST in einer der Konsensus Sequenzen vertreten, welche somit repräsentierend für die Gene sind. [4] Zurzeit werden beim TIGR HGI (Human Gene Index) EST Sequenzen zu Konsensus Sequenzen und beim TIGR MGI (Mouse Gene Index) ESTs zu Konsensus Sequenzen zusammengefasst. [15] Das Ziel von TIGR ist es, eine redundanzfreie Übersicht der Gene zu schaffen und Daten über Expression, zelluläre Aufgaben, Funktionen und evolutionäre Beziehungen zu sammeln. Die Datenbank enthält außerdem Verknüpfungen zu genomischen Sequenzen, Kartierungsdaten, dreidimensionalen Strukturen und Literaturreferenzen. [15] 11

12 2 Allgemeine Grundlagen UniGene UniGene ist ein System zur automatischen Erstellung von redundanzfreien, genorientierten Clustern aus Transkriptionsdaten von GenBank. GenBank enthält DNA-Sequenzen von mehr als Organismen. [6] Jedes UniGene Cluster enthält Sequenzen, die eindeutige Gene repräsentieren und diesbezügliche Informationen, wie Zelltyp und chromosomale Position, besitzen. UniGene wird für die Genvorhersage, Genkartierungsprojekte und Hochdurchsatzexpressionsanalysen verwendet. Es liegen Sequenzen von zum Beispiel Mensch, Maus sowie von vielen weiteren Organismen vor. Diese Spezies wurden von UniGene stellvertretend für andere Organismen ausgewählt, da bei ihnen die meisten EST Daten vorhanden waren. [7] Der Hauptunterschied zu den anderen vorgestellten Datenbanken liegt darin, dass ein bestes EST stellvertretend für alle anderen innerhalb eines Clusters ausgewählt und dieses für die Gen-Indexierung verwendet wird. Diese Sequenz entspricht meist dem längsten Transkript. Cluster werden auf zwei Wegen gebildet: 1. auf Basis der Transkripte 2. auf Basis der Gene 1.) Bei der Clusterbildung auf Basis der Transkripte werden zu Beginn alle mrna Sequenzen gegen sich selbst verglichen und bilden auf diese Weise Initialcluster. Zwei Sequenzen gehören zu einem Cluster, wenn sie die größte gemeinsame Ähnlichkeit und dementsprechend den größten Score haben. Es gibt eine Schwelle bis zu der eine Sequenz einem Cluster zugeordnet wird. Das Clustern erfolgt kontrolliert in mehreren Schritten. Eine Sequenz muss mindestens 100 Basenpaare lang sein, um aufgenommen zu werden. Sind die Initialcluster gebildet, werden Verbindungen zwischen ESTs und mrna hinzugefügt. Die Ähnlichkeiten der ESTs mit den Initialclustern und der damit verbundenen Zuordnung werden mit megablast ermittelt. Verknüpfungen, die die Initialcluster miteinander verbinden würden, werden ausgeschlossen. Anschließend werden die Cluster durch EST EST Verknüpfungen erweitert. Jedes Cluster muss eine Sequenz mit einem Polyadenylierungssignal (Poly-A Schwanz) haben (Ankercluster), sonst wird es ausgeschlossen. ESTs, die nicht zu den Ankerclustern gehören, werden erneut nach weniger strengen Kriterien überprüft und dann einem Cluster zugeordnet. Cluster der Größe 1 werden gegen den Rest der UniGene Sequenzen verglichen und mit dem Cluster verbunden, welches die Sequenz mit der größten Übereinstimmung enthält. Auf alternative Splicevarianten wird nicht eingegangen. [8] 12

13 2 Allgemeine Grundlagen 2.)Bei der Clusterbildung auf Basis der Gene werden zunächst nur die besten Daten verwendet. Das heißt, bereits charakterisierte Gene werden direkt übernommen. Diese Daten beinhalten zum Beispiel experimentell ermittelte RefSeqs. RefSeqs sind referenzierte Sequenzen aus NCBI. Sie enthalten redundanzfreie Daten über Contigs, mrnas, Proteine bekannter Gene und Chromosomen. Refseqs bilden ein Grundgerüst, das durch anschließende Analysen ausgebaut werden kann. Transkribierte Sequenzen werden benutzt, um zusätzliche Intron-Exon-Bereiche anzugeben. Jede Sequenz, die gemeinsame Intron-Exon-Bereiche mit anderen Sequenzen besitzt und zu demselben Gen zugeordnet werden kann, wird in das Cluster aufgenommen. Sequenzen, bei denen kein Splicing erfolgte oder die Splicestellen unbekannt sind, werden anderen überlappenden Exons zugeordnet, soweit diese existieren. [9] Ensembl Bei Ensembl werden Gene auf Basis von Protein und Genomalignments annotiert, die sich einerseits auf Quellen wie Vega beziehen (bekannte Gene) und andererseits auf Genvorhersage beruhen ( neue Gene). Außerdem wird die Intron-Exon-Struktur betrachtet und alternative Splicevarianten werden mit einbezogen. Es existieren zahlreiche weitere Annotationen wie Gene Ontology, Gensymbole, Proteindomänen und Orthologien zu anderen Spezies. Bei Ensembl besteht die Möglichkeit, mit Hilfe von EnsMart orthologe Gen-Paare von zum Beispiel Mensch und Maus abzufragen. EnsMart ist ein data mining tool von BioMart - einem generischen Datenmanagement Projekt, welches dem Benutzer viele Abfragemasken und Administrationstools zur Verfügung stellt. [1] Mit EnsMart werden Daten von Ensembl und anderen Datenbanken abgefragt und in Form von Listen dargestellt. Es gibt zahlreiche Optionen, um die verschiedenen Informationen zu extrahieren. Die Orthologie-Vorhersage-Pipeline von Ensembl arbeitet auf Protein-Sequenzebene. Es gibt drei Schritte, in denen die orthologen Paare gebildet werden. [12] 1. alle Gene eines Genoms und ihre längsten Protein-Sequenzen werden geladen 2. BLASTP wird ausgeführt 3. die BLASTP-Ausgabe wird mit einem heuristischen Suchalgorithmus nach orthologen Gen-Paaren durchsucht 13

14 2 Allgemeine Grundlagen 1.) Laden der Genome In die Analyse gehen nur kodierende Gene ein, das heißt nur solche, zu denen ein Protein existiert. Durch den Vorgang des alternativen Splicings können aus einem Gen viele verschiedene Transkripte und damit viele Proteine entstehen. Um orthologe Gen-Paare vorhersagen zu können, muss jede Protein-Sequenz einem Gen zugeordnet werden. Dazu wird die längste Protein-Sequenz eines Gens ausgewählt. Dies wird für alle Gene wiederholt, woraufhin ein Satz von Protein-Sequenzen entsteht. Das gleiche geschieht mit dem zweiten Genom. Anschließend können beide Protein-Sequenz-Sätze nach Ähnlichkeiten untersucht werden. In Ensembl Version 3.1 können derzeit 16 Genome mit kodierenden Genen geladen werden. [12] 2.) BLASTP alle-gegen-alle Mit jeder Protein-Sequenz wird ein BLASTP Sequenzvergleich durchgeführt. Ensembl benutzt BLASTP der Washington University Version 2.0. Der Aufruf des Tools erfolgt mit verschiedenen Parametereinstellungen. Es findet eine erste Filterung statt. Nur Treffer mit 10 einem kleineren e-value als 1 10 werden in eine Tabelle geschrieben. Für die 16 Spezies ergibt sich eine Tabelle mit BLASTP Ergebnissen. [12] 3.) Orthologie-Vorhersage-Algorithmus Der Algorithmus basiert auf dem Konzept des besten reziproken Treffers. Die Analyse erfolgt auf Basis der Gen-Paare von zum Beispiel Mensch und Maus. Jeder Protein-Satz stimmt mit dem des anderen an vielen Stellen überein. Beim Vergleich der Protein-Sätze mit BLASTP wird nach bestimmten Kriterien (zum Beispiel Score, e-value, identity, positives) eine Rangliste erstellt. Um den besten Treffer zu ermitteln, muss nach diesen sortiert werden, wobei der Score das wichtigste Kriterium darstellt. Trotzdem kann es vorkommen, dass auf Grund von Gen-Duplikationen zwei Protein- Sequenzen die gleichen Werte besitzen. In solchen Fällen bekommt wahllos einer von beiden die bessere Position. Die Suche der orthologen Gen-Paare erfolgt durch verschiedene Methoden. Die Orthologie Vorhersage wird als UBRH (Unique Best Reciprocal Hit) bezeichnet, wenn es zu einer Protein-Sequenz einen eindeutigen besten Treffer zu einer Zielsequenz gibt und umgekehrt, ein eindeutig bester Treffer der Zielsequenz mit der Protein-Sequenz existiert. 14

15 2 Allgemeine Grundlagen Eine andere Bezeichnung ist MBRH (Multiple Best Reciprocal Hit). Diese wird verwendet, wenn auf Grund von Gen-Duplikation mehrere beste Treffer mit gleichen Werten vorhanden sind und es unmöglich ist, eindeutige orthologe Gen-Paare zuzuordnen. Dies tritt auf, wenn durch Gen-Duplikation, Assemblierungsfehler oder Zufall verschiedene Gene die gleichen Translationsprodukte besitzen. Durchschnittlich kommt dies in 3% aller Gene vor. [12] RHS (Reciprocal Hit based on Syntheny information) ist die Bezeichnung für einen besten Treffer, bei dem ein reziprokes Gen-Paar in einer Richtung den besten Treffer erzielt, jedoch nicht in der Rückrichtung. Synthenie bedeutet, dass die Gene in beiden Spezies in der gleichen Reihenfolge vorkommen. Durch die Tatsache, dass diese Suche auch orthologe Gen-Paare definiert, die schlechter sind als UBRH, kann es vorkommen, dass beide UBRH und RHS in der Orthologie-Vorhersage auftauchen. Zusammen mit MBRH sind dies zwei Begründungen, warum es bei der Orthologie-Vorhersage zu Mehrdeutigkeiten kommen kann. [12] 2.4 MetaGenIndex Der MetaGenIndex ist Schwerpunkt dieser Arbeit und soll im Folgenden näher erklärt werden. Es handelt sich um einen Index, der die drei Gen-Datenbanken Ensembl, TIGR und UniGene miteinander verknüpft. Jeder Index enthält zu dem jeweiligen Gen alle Bezeichnungen der drei Datenbanken. Im vorherigen Abschnitt wurden die verschiedenen Clustermethoden vorgestellt. Deren Ergebnisse werden durch den MetaGenIndex miteinander vereinigt. (Abbildung 2) (Abbildung 2) Ergebnisschnittmenge (Ensembl, TIGR, UniGene) 15

16 2 Allgemeine Grundlagen Der MetaGenIndex wurde mit einem Programm unter bestimmten Parametereinstellungen erzeugt. Zunächst wird ein gemeinsames Element gesucht, welches die Paare Ensembl-UniGene, Ensembl- TIGR und TIGR-UniGene miteinander verbindet. Dazu eignet sich zum Beispiel die Accession number. (Abbildung 3) Das Clustern der Ergebnisse erfolgt ausschließlich auf Ebene der Accession numbers. Es werden keine Sequenzen miteinander verglichen. (Abbildung 3) Beispiel Accession numbers (Ensembl, TIGR, UniGene) Anschließend wird eine spezifische Schwelle (Signifikanzschwelle) eingeführt, die entscheidet, wann zwei Datensätze miteinander verbunden werden. Bei Ensembl gegen TIGR-UniGene ist es eine gemeinsame Refseq-ID und bei TIGR gegen UniGene sind es N gemeinsame Accession numbers oder ein bestimmter Prozentsatz von TIGR Elementen, die in UniGene Clustern enthalten sind. Die Prozentzahl wird zum Beispiel eingesetzt, wenn es sich um ein Cluster handelt, das kleiner als N Accession numbers ist. Die aktuellen Einstellungen liegen bei 20 gemeinsamen Accession numbers oder 40% an TIGR Elementen in UniGene Clustern. Diese Einstellung galt es, mit Hilfe des Validierungsprogramms zu überprüfen. Im Programm gab es weiterhin bei der Erstellung des MetaGenIndex eine Cluster-Regel zu beachten. Danach werden nie zwei Ensembl-Gene miteinander vereinigt, auch wenn TIGR- UniGene sie zusammenfassen würde. Es wäre biologisch wenig sinnvoll, zwei Ensembl- Gene, die auf verschiedenen Chromosomen liegen, im MetaGenIndex zusammenzufassen. Daher wird dies dem Clustering-Algorithmus verboten. Auf diese Weise kann ein auf Ensembl ausgerichteter Index erzeugt werden. [3] 16

17 2 Allgemeine Grundlagen 2.5 Consensus CDS (CCDS) Die bioinformatische Analyse ist ein zentrales Werkzeug für die Annotation des Genoms. Die Annotation eines Gens sollte dabei eindeutig sein. Dies sieht in der Praxis anders aus. Es gibt in der biologischen Terminologie zahlreiche Mehrdeutigkeiten. [2] Zurzeit existieren in GenBank 220 virale, 152 bakterielle, 20 eukaryonte und 18 archaeische Genome. [2] Zentren wie TIGR und Joint Genome Institute (JGI) sowie Datenbanken wie FlyBase, WormBase, The Arabidopsis Information Resource (TAIR) oder die Saccharomyces Genome Database besitzen ihre eigenen Datenmodelle, um ihre Annotationen zu beschreiben. Viele Daten sind gespiegelt und tauchen an mehreren Stellen auf, was zu ortsspezifischen Versionsunterschieden führt. Zwangsläufig kommt es zu Ungenauigkeiten in der Bezeichnung, chromosomalen Position und Struktur. Das Ganze macht einen Austausch, eine Verbindung und einen Vergleich von Annotationsdaten sehr schwierig. [2] Aus diesem Grund hat sich zum Beispiel das Projekt CCDS gebildet. CCDS (Consensus CDS) ist ein Projekt von EBI, NCBI, WTSI und UCSC zur Schaffung einheitlich annotierter CDS Sequenzen beim Menschen. Ziel der Forscher ist es, einen Kerndatensatz von Proteinkodierenden Genen bereit zu stellen. Alle CCDS Mitglieder kommunizieren aktiv miteinander, um Unterschiede und Verbesserungen abzustimmen. Annotierte Gene, die in den CCDS Datensatz aufgenommen werden, erhalten eine eindeutige Identifikations- und Versionsnummer, um sie bei der Genkartierung lokalisieren zu können. Die Versionsnummer wird aktualisiert, wenn es zu Änderung der CDS-Struktur kommt oder sich die CDS-Position verändert. Außerdem werden sämtliche Änderungen von alle Mitgliedern des CCDS Projektes durchgeführt, was sehr wichtig ist, um die Eindeutigkeit zu wahren. Die Annotation der Gene erfolgt durch einerseits manuell eingefügt und geprüfte Informationen aus Vega und andererseits durch automatisierte Computerprozesse. Die automatisierten Methoden stammen von Ensembl. Es erfolgt durch UCSC eine Qualitätskontrolle. Durch dieses Verfahren soll eine hohe Genauigkeit und Stabilität der Daten erreicht werden. Das Projekt zeigt die Bemühung und den Bedarf an einer Vereinheitlichung der Daten. Nach mehr als einem Jahr Zusammenarbeit, wurden Gene sorgsam untersucht und genau charakterisiert. [10] Diese Gene entsprechen dem aktuelle CCDS Gen-Index, der bei Ensembl, UCSC und NCBI zu finden ist. 17

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19 3 Programm zur Validierung des MetaGenIndex 3.1 Methoden Die Überprüfung des MetaGenIndex erfolgte auf drei Wegen. Dazu wurden die Orthologie, ein Selbsttest und ein zweiter Gen-Index eingesetzt. Um die orthologen Beziehungen zu nutzen, wurde ein Algorithmus entwickelt, der jede Protein-Sequenz eines Gens aus einer Spezies mit jeder Protein-Sequenz aus einer anderen Spezies vergleicht. [#] Die Protein-kodierenden Gen-Paare, die gegenseitig im BLAST-Ergebnis den höchsten Score erhalten, werden als ortholog definiert. (Tabelle 1) Score Mensch Gen 1 Gen 2 Gen 3 Maus Gen 1 98 Gen 2 60 Gen (Tabelle 1) Beispiel pairwise best hit Im Folgenden werden - zur Übersichtlichkeit - die mit diesem Programm erstellten Orthologien immer mit einem * gekennzeichnet. Die Sequenzen für den Vergleich stammen von UniGene und Ensembl. Die daraus entstandenen Tabellen galt es zu überprüfen. Zur Validierung des MetaGenIndex wurde ein Perlprogramm unter den folgenden Umgebungen entwickelt: Linux Windows Intel(R) Pentium(R) 4 CPU 1.80GHz Intel(R) Pentium(R) 3 CPU 666MHz SUSE Linux 9.1 Windows MB RAM 128 MB RAM Perl v5.8.3 Perl v5.8.4 Es wurden ausschließlich Standard Perlmodule verwendet. Das Programm erledigt folgende Aufgaben: Prüfung der Übereinstimmung von UniGene Orthologien 1 gegen Ensembl Orthologien Prüfen der Werte, die nicht übereinstimmen Prüfung der Übereinstimmung von UniGene Orthologien* gegen Ensembl Orthologien* Prüfen der nicht übereinstimmenden Werte MetaGenIndex Selbsttest Prüfung der Übereinstimmung der Gen-Indexierung des CCDS Projektes mit der des MetaGenIndex Im Anhang auf Seite 43 befindet sich eine Übersicht über den Ablauf des Programms. 1 Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 19

20 3 Programm zur Validierung des MetaGenIndex Das Validierungsprogramm beginnt zunächst damit, alle zur Verfügung gestellten Daten einzulesen und dabei Filterungen durchzuführen. Nach dem die Daten im Speicher vorliegen, findet der erste Vergleich statt. Hierbei handelt es sich um den Vergleich der UniGene Orthologien 1 und den von Ensembl mit EnsMart erzeugten Orthologien. Es wird zunächst ein orthologes UniGene Gen-Paar ausgewählt (zum Beispiel Hs Mm.35413). Die Unigene ID Hs wird anschließend in der MetaGenTabelle des Menschen nachgeschlagen und die entsprechende Ensembl Gene ID herausgesucht. Index Member ID Ensembl Gene ID Quelle ENST ENSG ENSEMBL Hs ENSG UNIGENE THC ENSG TIGR THC ENSG TIGR ENST ENSG ENSEMBL (Tabelle 2) Mensch MetaGenIndex Die Ensembl Gene ID von Hs lautet ENSG Nach dem gleichen Prinzip wird anschließend die Ensembl Gene ID für Mm aus der Maus-MetaGenTabelle gesucht. Sie lautet ENSMUSG Index Member ID Ensembl Gene ID Quelle 4901 ENSMUST ENSMUSG ENSEMBL 4901 Mm ENSMUSG UNIGENE 4901 TC ENSMUSG TIGR 4901 TC ENSMUSG TIGR 4901 TC ENSMUSG TIGR 4901 TC ENSMUSG TIGR 4901 TC ENSMUSG TIGR (Tabelle 3) Maus MetaGenIndex 4901 Dem orthologen Gen-Paar Hs Mm.35413, entspricht demzufolge ENSG ENSMUSG In einem letzten Schritt wird dieses mit den von Ensembl vorhergesagten Paaren verglichen. Der Vorgang wird für alle UniGene Paare wiederholt und das Ergebnis in einer Tabelle ausgegeben. Während des Vergleiches erfolgt eine statistische Auswertung. Alle Gen-Paare, die nicht in der Orthologie-Vorhersage von Ensembl vorkamen, werden weiter untersucht. Dazu wird das UniGene Gen-Paar aus dem BLAST-Ergebnis, das der Definition des Paares diente, herausgesucht und der e-value näher betrachtet. In einer zweiten Tabelle werden anschließend alle signifikanten Gen-Paare mit 60 einem e-value kleiner als 1 10 ausgegeben. 1 Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 20

21 3 Programm zur Validierung des MetaGenIndex Beim zweiten Vergleich wird dasselbe Programm, welches die UniGene Orthologien 1 erstellte, auf Daten von Ensembl angewandt. Die daraus entstandene Orthologie-Tabelle ersetzt die von Ensembl mit EnsMart erzeugte Tabelle. Die Vorgehensweise beim zweiten Vergleich ist identisch zu der des ersten Vergleiches. Das Ergebnis wird wiederum in einer Tabelle dargestellt. Beim MetaGenIndex Selbsttest werden wahllos 1000 Indizes aus dem Mensch-MetaGenIndex genommen und die entsprechenden Mitglieder eines jeden Index mit allen anderen verglichen. Dabei wird gezählt, wie häufig die ähnlichsten zehn Sequenzen den gleichen Index besaßen. In einer weiteren Tabelle erfolgt die Darstellung aller Ergebnisse. Anschließend findet die dritte und letzte Prüfung statt. Der Mensch-MetaGenIndex wird mit dem Gen-Index des CCDS Projektes verglichen. Dazu wird über die Gene ID eine Verbindung zwischen CCDS ID und UniGene ID geschaffen. Anschließend wird aus einer von NCBI heruntergeladenen Tabelle ein Paar (Gene ID CCDS ID) ausgewählt und in einer zweiten Tabelle nach der Gene ID gesucht. Die zweite Tabelle enthält Gene ID UniGene ID Paare. Im Anschluss daran kann aus der Beziehung CCDS ID zu Ensembl Gene ID aus einer dritten Tabelle von Ensembl das Paar UniGene ID Ensembl Gene ID zusammengestellt werden. Im nächsten Schritt wird dieses Paar mit den Paaren im MetaGenIndex verglichen. Dieser Vorgang wird mit allen Gene IDs des CCDS Projektes wiederholt. Das Validierungsprogramm basiert auf einer Datenstruktur, die man als Hash bezeichnet. Hashes sind assoziative Listen, die über einen assoziierten Namen angesprochen werden und daraufhin einen Wert ausgeben. Die Datenstruktur ist in diesem Fall 47% schneller als eine andere Datenstruktur, die man als Array bezeichnet. Die Geschwindigkeit wurde mit Hilfe des Perlmoduls Benchmark ermittelt. Hierbei wird die Dauer eines Skriptdurchlaufes gemessen. Die Laufzeit des Validierungsprogramms beträgt O(n*m). Das heißt, im schlimmsten Fall müssen alle N Mitglieder eines Hashes mit allen anderen M Mitgliedern eines anderen Hashes verglichen werden. 1 Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 21

22 3 Programm zur Validierung des MetaGenIndex 3.2 Daten Die folgenden vier Tabellen werden für die Überprüfung der orthologen Beziehungen benötigt. Die erste Quelle ist eine von Ensembl erzeugte Orthologie-Tabelle von Mensch und Maus. Tabelle 4 zeigt einen Ausschnitt, in dem ersichtlich wird, dass es nicht zu jedem Mensch-Gen ein orthologes Maus-Gen gibt. Solche Fälle werden nicht betrachtet, da die Orthologie eine Bedingung für die Untersuchung darstellt. Des Weiteren kann man sehen, dass die orthologen Beziehungen nicht eindeutig sind. Die Gründe dafür sind, wie bereits unter Punkt erläutert, MBRH oder RHS. (Tabelle 4) Quelldatei 1 von Ensembl M zu N Beziehung und doppelte Einträge werden vor der Validierung herausgefiltert. Dies ist zulässig, da das Arbeiten mit Teilmengen zur Vereinfachung, ohne Beschränkung der Allgemeinheit, möglich ist. Die Tabellen 5 und 6 zeigen einen Ausschnitt des unter Punkt 3.1 erläuterten Algorithmus auf Basis der Protein-Sequenzen von Unigene 1 und Ensembl*. [#] Die Tabellen enthalten zusätzlich paraloge Gene, die ebenso nicht betrachtet und herausgefiltert werden. Die erste Spalte entspricht der ClusterID, welche durch Bindestriche voneinander getrennt sind. Die zweite Spalte macht eine Aussage über die Quelle, ob es sich um ein Gen des Menschen oder der Maus handelt. Spalte 3 sagt aus, in welcher Beziehung die Mitglieder des Clusters zueinander stehen. Spalte 4 ist die UniGene ID und Spalte 5 entspricht dem Human Ensembl Gene ID ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG ENSG Mouse Ensembl Gene ID ENSMUSG ENSMUSG ENSMUSG ENSMUSG ENSMUSG ENSMUSG ENSMUSG ENSMUSG ENSMUSG ENSMUSG Cluster ID Herkunft Beziehung UniGene ID Score MouseUNI ortho Mm HumanUNI ortho Hs MouseUNI ortho Mm HumanUNI ortho Hs MouseUNI ortho Mm HumanUNI ortho Hs HumanUNI paral Hs MouseUNI ortho Mm HumanUNI ortho Hs MouseUNI paral Mm MouseUNI paral Mm MouseUNI paral Mm Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 22

23 3 Programm zur Validierung des MetaGenIndex Score. (Tabelle 5) Quelldatei 2 aus UniGene Daten* [#] Cluster ID Herkunft Beziehung Ensembl Gene ID Score mouse ortho ENSMUSG human ortho ENSG human paral ENSG mouse ortho ENSMUSG human ortho ENSG mouse ortho ENSMUSG human ortho ENSG human paral ENSG (Tabelle 6) Quelldatei 3 aus Ensembl Daten [#] Die vierte Quelldatei enthält alle BLAST-Ergebnisse, die bei der Erstellung der orthologen UniGene 1 Gen-Paare entstanden. Diese Daten werden benötigt, um die Gen-Paare zu untersuchen, die nicht in der jeweils anderen Orthologie-Vorhersage vorkamen. (UniGene* gegen Ensembl, UniGene* gegen Ensembl*). Die fünfte Datei wird für die Auswertung des Selbsttestes benötigt. Sie enthält ebenfalls ein BLAST-Ergebnis. Alle weiteren Tabellen werden für den Vergleich des CCDS Gen-Index mit dem MetaGenIndex benötigt. Tabelle 7 zeigt einen Ausschnitt der sechsten Quelldatei. Hier werden die Gene ID und die CCDS ID herausgelesen. chromosome g_accession gene gene_id ccds_id ccds_status 1 NC_ FLJ CCDS1.1 public 1 NC_ SAMD CCDS2.1 public 1 NC_ DKFZP564C CCDS3.1 public 1 NC_ DKFZP434H CCDS4.1 public 1 NC_ HES CCDS5.1 Public 1 NC_ G1P CCDS6.1 Public (Tabelle 7) NCBI CCDS Gen-Index gene_id UniGene ID Hs Hs Hs Hs Hs Hs (Tabelle 8) Gene ID UniGene ID In der siebenten Quelldatei wird die Verbindung zwischen Gene ID und UniGene ID geschaffen. Tabelle 8 zeigt ein Beispiel. Durch diese Verbindung kann mit Hilfe der achten Quelldatei das Paar UniGene ID Ensembl Gene ID zusammengestellt und mit dem MetaGenIndex verglichen werden Ensembl Gene ID Ensembl Transcript ID CCDS ID ENSG ENST \N ENSG ENST CCDS5952 ENSG ENST CCDS5953 ENSG ENST CCDS5954 ENSG ENST \N ENSG ENST \N (Tabelle 9) Ensembl CCDS Gen-Index 1 Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] Tabelle 9 zeigt einen Ausschnitt der Beziehung zwischen Ensembl Gene ID und CCDS ID. Die Ensembl Gene IDs, die keine CCDS ID besitzen, sind für den Vergleich unwichtig und werden herausgefiltert. 23

24 3 Programm zur Validierung des MetaGenIndex Weitere eingelesene Daten sind die MetaGenTabellen von Mensch und Maus. Beispiele sind unter 3.1 zu sehen. In den vorherigen fünf Tabellen konnten, auf Grund der Verwendung von Hashes, Mehrdeutigkeiten festgestellt werden. Um dennoch eine präzise Aussage machen zu können, wurden diese aus der Betrachtung herausgenommen. Trotz der zahlreichen Filterungen bleibt eine ausreichend große Referenz, um auf die Gesamtheit schließen zu können. Mehrdeutigkeiten beim MetaGenIndex sind damit zu begründen, dass bei der Erstellung des Index ein Gen in zwei oder mehreren Clustern auftrat. Um diese Information nicht zu verlieren, gibt es Gene mit mehreren Indizes. [3] 24

25 4 Ergebnisse 4. Ergebnisse Das Validierungsprogramm lieferte beim Vergleich der unter 3.2 genannten Daten folgende Auswertung: Einlesen und Filterung der Daten Orthologe Gen-Paare von Ensembl Prozent eingelesen % gefiltert ,14% Summe ,86% Orthologe Gen-Paare aus UniGene-Daten* Prozent eingelesen % gefiltert ,86% Summe ,14% Orthologe Gen-Paare aus Ensembl-Daten* Prozent eingelesen % gefiltert ,65% Summe ,35% CCDS Indizes Prozent eingelesen % gefiltert ,21% Summe ,79% Vergleich der Daten Orthologie-Vorhersage UniGene* gegen Ensembl Prozent überprüft % gleich ,28% verschieden, aber signifikant 743 7,40% verschieden 233 2,32% Orthologie-Vorhersage UniGene* gegen Ensembl* Prozent überprüft % gleich ,29% verschieden, aber signifikant 754 7,51% verschieden 221 2,20% Vergleich CCDS Gen-Index gegen MetaGenIndex Prozent überprüft % gleich ,12% verschieden 581 6,88% Selbsttest Anzahl Member IDs aus 1000 Indizes Prozent Gesamt % Im gleichen Index ,75% In anderen Indizes ,25% Anzahl Member IDs im gleichen Index Prozent Gesamt % beste Treffer ,50% (Tabelle 10) Ergebnis der Validierung * Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 25

26 4 Ergebnisse Zunächst wurde die von Ensembl erzeugte Orthologie-Tabelle eingelesen. Sie umfasste Gene. Nicht jedes menschliche Gen besitzt ein orthologes Maus-Gen. Dies war bei 5190 Genen der Fall. Es blieben orthologe Gen- Paare aus Mensch und Maus für weitere Untersuchungen übrig. 79% Orthologie-Vorhersage Ensembl (EnsMart) 21% kein Gen-Paar orthologe Gen-Paare (Diagramm 1) Orthologie-Vorhersage Ensembl Anschließend wurde die UniGene 1 Orthologie-Tabelle eingelesen. Da der Vergleich sich nur auf orthologe Gen- Paare bezieht und paraloge Gene auf Grund der schwer zu überprüfenden Mehrdeutigkeiten herausgefiltert wurden, was in 17% der Fall war, beträgt die Anzahl der Gen-Paare % Orthologie-Vorhersage UniGene* 18% (Diagramm 2) Orthologie-Vorhersage auf Basis von UniGene-Daten* paraloge Gen- Paare orthologe Gen-Paare Die dritte eingelesene Tabelle ist die Orthologie-Tabelle auf Grundlage der Ensembl-Daten*, die beim zweiten Vergleich die Ensembl Orthologie- Tabelle ersetzen soll. Es wurden Gen-Paare eingelesen. 81% Orthologie-Vorhersage Ensembl* 19% (Diagramm 3) Orthologie-Vorhersage auf Basis von Ensembl-Daten* paraloge Gen- Paare orthologe Gen-Paare Anschließend wurden die Bezeichnungen der Gene aus dem MetaGenIndex des Menschen (17411) und aus dem MetaGenIndex der Maus (16784) in einen Hash geschrieben. 1 Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 26

27 4 Ergebnisse Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass von überprüften orthologen Gen-Paaren aus UniGene* 9069 Gen-Paare in Ensembl gefunden wurden. Das sind etwa 91%. 976 Gen- Paare waren verschieden. Die weitere Untersuchung zeigte, dass von diesen 743 Gen-Paare signifikant waren. Vergleich UniGene* gegen Ensembl (EnsMart) 91% 2% 7% (Diagramm 4) Vergleich der Orthologien von UniGene und Ensembl verschiedene Gen-Paare verschiedene Gen-Paare, aber signifikant gleiche Gen-Paare Der Vergleich der Orthologien wurde in Tabellen ausgegeben. MetaGenIndex UniGene ID MetaGenID Ensembl Gene ID 1147 Mm ENSMUSG ENSMUSG Hs ENSG ENSG Mm ENSMUSG ENSMUSG Hs ENSG ENSG Mm ENSMUSG ENSMUSG Hs ENSG ENSG Mm ENSMUSG ENSMUSG Hs ENSG ENSG Mm ENSMUSG Hs ENSG (Tabelle 11) Resultat Unigene 1 Tabelle 11 zeigt einen Ausschnitt einer solchen Ergebnistabelle. Zwei Zeilen entsprechen einem orthologen Paar. Die Ensembl Gene ID Spalte ist nur dann gefüllt, wenn es ein entsprechendes orthologes Paar in der Ensembl Tabelle gibt. Andernfalls bleiben diese zwei Zeilen leer und werden markiert. [3] 1 Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 27

28 4 Ergebnisse Die Gen-Paare, die nicht in der von Ensembl vorhergesagten Orthologie-Tabelle vorkamen, wurden näher untersucht. Es stellte sich heraus, dass 76% der Gen-Paare die verschieden 60 waren, einen kleineren e-value besaßen als1 10. MetagenIndex UniGene ID MetagenID Ensembl Gene ID e value 2409 Mm ENSMUSG Hs ENSG Mm ENSMUSG Hs ENSG Mm ENSMUSG ,00E Hs ENSG ,00E Mm ENSMUSG Hs ENSG Mm ENSMUSG ,00E Hs ENSG ,00E-152 (Tabelle 12) Resultat e-values Tabelle 12 zeigt einen Ausschnitt dieser Untersuchung. Die leere Ensembl Gene ID Spalte zeigt, dass es bei all diesen Gen-Paaren keine Übereinstimmung mit der Ensembl Orthologie- Vorhersage gab. [3] Der zweite Test zur Überprüfung des MetaGenIndex mit Hilfe der Orthologie war der Vergleich der UniGene 1 Orthologien mit den unter Punkt 3.1 erzeugten Orthologien auf Grundlage der Ensembl-Daten*. Von überprüften Gen-Paaren waren 9070 Gen- Paare identisch und 975 Gen-Paare verschieden. (Diagramm 5) Vergleich der Orthologien von UniGene* gegen Ensembl* Dies entspricht einer 90% Übereinstimmung. Von den 975 Gen-Paaren, die verschieden waren, zeigte eine weitere Untersuchung, dass 754 Gen-Paare (77%) die Signifikanzschwelle 60 von 1 10 im BLAST-Ergebnis unterschritten. Vergleich UniGene* gegen Ensembl* 90% 2% 8% verschiedene Gen-Paare verschiedene Gen-Paare, aber signifikant gleiche Gen-Paare 1 Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 28

29 Beim MetaGenIndex Selbsttest wurden, wie unter Punkt 3.1 erwähnt, 1000 Indizes gegen den gesamten Index verglichen Indizes entsprechen Member IDs. Member IDs sind die zu einem Index zugeordneten Bezeichnungen. Von diesen waren (90%) im gleichen Index, wovon (Diagramm 6) Selbsttest (Kreisdiagramm) wiederum ca. 98% beste Treffer waren. 4 Ergebnisse In Tabelle 13 ist ein Ausschnitt des Resultats des Selbsttestes zu sehen. Member ID ist das untersuchte Mitglied des MetaGenIndex. Rate zählte alle Mitglieder des BLAST- Ergebnisses, die den gleichen MetaGenIndex hatten. Stand das verglichene Mitglied im BLAST-Ergebnis an erster Position, dann hatte es die größte Ähnlichkeit und es steht bei best hit ein ja. Gab es keine Übereinstimmung des Index mit den verglichenen besten 10, so erscheint bei in top 10 ein nein. MetaGenIndex Member ID in top best 10 hit Rate 209 ENST ja Nein 3/9 (33.33%) 210 ENST ja ja 7/9 (77.78%) 199 ENST ja ja 9/9 (100.00%) 674 ENST ja ja 6/6 (100.00%) 269 Hs nein nein 0/6 (0.00%) 199 THC ja ja 9/9 (100.00%) 593 THC ja nein 5/9 (55.56%) 973 THC ja ja 9/9 (100.00%) THC ja ja 7/9 (77.78%) THC ja ja 6/9 (66.67%) THC ja ja 9/9 (100.00%) 978 THC nein nein 0/1 (0.00%) 728 THC ja ja 4/9 (44.44%) 318 THC ja ja 9/9 (100.00%) (Tabelle 13) Resultat Selbsttest 88% MetaGenIndex Selbsttest 10% 2% unterschiedlicher Index gleicher Index gleicher Index, bester Treffer 29

30 4 Ergebnisse Das nebenstehende Balkendiagramm verdeutlicht die Verteilung der Rate. Es wurde die Häufigkeit gezählt, wie oft die Rate mit einer bestimmten Prozentzahl vorkam. Jeder Balken entspricht einem prozentualen Anstieg um 10%. Man kann sehen, dass zum Beispiel in mehr als 7000 Fällen die Rate zwischen % betrug. Das heißt, in diesen Fällen waren alle oder fast alle verglichenen Mitglieder der besten zehn BLAST-Ergebnisse im selben Index. In mehr als 1000 Fällen war die Rate kleiner als 10%. (Diagramm 7) Selbsttest, Verteilung der Rate (Balkendiagramm) Der Vergleich des CCDS Gen-Index mit dem MetaGenIndex zeigte eine 93% Übereinstimmung der Indizes. Beide basieren, wie unter Punkt 2.4, 2.5 und 3.1 erläutert, auf verschieden Methoden und wurden auf unterschiedliche Weise erstellt. Trotzdem kam es auf Grund biologischer Zusammenhänge zu hohen Übereinstimmungen. Vergleich CCDS Gen-Index gegen MetaGenIndex 7% 93% (Diagramm 8) Vergleich CCDS Gen-Index gegen MetaGenIndex unterschiedliche Zuordnung gleiche Zuordnung 30

31 5 Diskussion 5. Diskussion Der MetaGenIndex verbindet die Datenbanken Ensembl, TIGR und NCBI-UniGene zu einem gemeinsamen Index. Dies ist für biomedizinische Untersuchungen von großer Bedeutung, da die Daten direkt aus einer Quelle erreichbar sind. Diese Bachelorarbeit beschäftigt sich mit der Überprüfung des MetaGenIndex. In diesem Rahmen wurde ein Validierungsprogramm entwickelt, dass auf drei verschiedenen Wegen diese Aufgabe erfüllt. 1.) Die erste Möglichkeit war die Beurteilung des MetaGenIndex durch die Orthologie. Diese wurde unter 2.2 erläutert. Das Zusammenfassen der Gene dreier Proteinsequenzen aus verschiedenen Genomen zur Bestimmung orthologer Gen-Paare ist nicht nur ein technisches Verfahren, sondern hat auf Grund der Sequenzähnlichkeit der Proteine und der damit verbundenen evolutionären Beziehungen der Gene biologische Hintergründe. Es wurden zwei Methoden mit Hilfe der Orthologie umgesetzt. Methode 1 bestand aus dem Vergleich orthologer Gen-Paare von Ensembl mit UniGene* Methode 2 bestand aus dem Vergleich orthologer Gen-Paare von Ensembl* mit UniGene* 1.1.) Beim ersten Vergleich wurden die Ensembl-Orthologien mit dem data mining tool EnsMart erzeugt, während die UniGene-Orthologien von einem für diesen Vergleich entwickelten Orthologie-Vorhersageprogramm stammen. Das Ergebnis zeigte, dass von überprüften orthologen Gen-Paaren 9069 Gen-Paare (91%) gleich waren. Dennoch waren 976 orthologe Gen-Paare verschieden. Diese wurden weiter untersucht und es stellte sich heraus, dass 743 Gen-Paare signifikant waren. Bei 743 orthologen 60 Gen-Paaren war der e-value kleiner als 1 10 und somit die Wahrscheinlichkeit, diese durch Zufall zu beobachten, sehr gering. Dennoch waren diese Gen-Paare in der von Ensembl erzeugten Orthologie-Tabelle nicht enthalten oder verschieden. Ein Beispiel ist das Paar: ENSG ENSMUSG e-value = 0, Score = 429, 175 of 194 identity (90%) Es handelt sich um eine Casein kinase I, alpha isoform, die in beiden Spezies (Mensch-Maus) ortholog ist. * Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 31

32 5 Diskussion Ein anderes Beispiel ist das Gen-Paar: ENSG ENSMUSG e-value = 0, Score = 387, 175 of 249 identity (70%) Dieses Protein heißt Epsin 1 (EPS-15 interacting protein 1) und ist in Mensch und Maus ortholog. Die Differenz zwischen den Orthologie-Tabellen kann verschiedene Gründe haben. Vermutlich liegt es bei den verschiedenen Gen-Paaren daran, dass die Algorithmen zur Erstellung der orthologen Gen-Paare ähnlich, aber nicht gleich sind. Unter und 3.1 wurden die Algorithmen vorgestellt. Ein anderer Grund könnte die Art des durchgeführten Vergleiches sein. Wenn im MetaGenIndex eine Ensembl ID einer UniGene ID falsch zugeordnet wurde, dann wurde das orthologe Gen-Paar falsch zusammengestellt und konnte in der Orthologie- Tabelle nicht gefunden werden. Eine andere mögliche Ursache, nach der ein Gen-Paar auf Grund eines vorangegangenen Filterungsschrittes entfernt wurde, konnte bereits ausgeschlossen werden. Ob die Unterschiede auf die Vermutungen zurückzuführen sind, gilt es in weiterführenden Arbeiten zu untersuchen. 1.2.) Die zweite Methode unter Verwendung der Orthologie bestand aus dem Vergleich der Ensembl Orthologien 1 mit den UniGene Orthologien*. Der Algorithmus zur Erstellung der Orthologien aus UniGene- und Ensembl-Daten war in beiden Fällen der gleiche. Bei dem Vergleich wurden von überprüften Gen-Paaren 9070 (90%) Übereinstimmungen der Gen-Paare gefunden, 975 Gen-Paare waren verschieden. Eine weitere Untersuchung der verschiedenen Gen-Paare zeigte, dass von diesen 754 Gen- Paare (77%) signifikant waren. Die Übereinstimmung der Gen-Paare lag mit 90% in einem hohen Bereich. Dennoch sind 10% der Gen-Paare verschieden. Da die Orthologie in diesem Vergleich in beiden Tabellen mit demselben Algorithmus bestimmt wurde, kann die erste Vermutung aus dem vorherigen Vergleich an dieser Stelle nicht zutreffen. Eine nähere Untersuchung der verbleibenden 10% ist Aufgabe weiterer Arbeiten. 1 Erstellt durch Orthologie-Vorhersageprogramm [#] 32

33 5 Diskussion 2.) Der zweite Weg den MetaGenIndex zu validieren bestand aus einem Selbsttest. Beim MetaGenIndex Selbsttest wurden wahllos 1000 Indizes des Mensch-MetaGenIndex ausgewählt und deren Mitglieder gegen alle anderen Indizes verglichen. Der MetaGenIndex wurde auf Basis von Accession numbers und Prozentsätzen zusammengestellt. Beim Selbsttest wurden Sequenzen miteinander verglichen und es zeigte sich, dass 90% der Sequenzen mit einem bestimmten Index die größte Sequenzähnlichkeit zu anderen Sequenzen mit dem gleichen Index besaßen. Dies ermöglicht eine Aussage über die Qualität des Clusterverfahrens beim MetaGenIndex. Dennoch gab es 10% der Sequenzen, die einen anderen Index hatten. Die Gründe dafür können wiederum verschieden sein. Eine stichprobenhafte Untersuchung zeigte, dass es sich meist um kurze Sequenzen handelte. Hier kann es also sein, dass sich diese auf Grund der Länge in Grenzbereichen der Cluster befanden. Als Ensembl, TIGR oder UniGene diese clusterten, wurden sie verschiedenen Clustern und dadurch später beim MetaGenIndex verschiedenen Indizes zugeordnet. Da Daten unterschiedlichen Ursprungs verwendet wurden, sind Ungenauigkeiten dieser Art nicht vollständig auszuschließen. 3.) Das dritte Mittel zur Auswertung des MetaGenIndex war der Vergleich mit einem zweiten Gen-Index. Hierbei handelt es sich um den Gen-Index des CCDS Projektes. Wie unter Punkt 2.5 erläutert, handelt es sich bei dem CCDS Projekt um eine Zusammenarbeit von EBI, NCBI, WTSI und UCSC zur Schaffung einheitlich annotierter CDS Sequenzen beim Menschen. Es handelt sich um wichtige überprüfte Daten, die mit dem MetaGenIndex verglichen wurden. Obwohl NCBI und Ensembl bei CCDS im selben Projekt zusammenarbeiten, existiert keine gemeinsame Übersicht der Gene, die UniGene IDs und Ensembl Gene IDs enthalten. Diese musste für den Vergleich zunächst zusammengestellt werden. Der Vergleich zeigte eine 93% Übereinstimmung der Indizes. Das heißt in 93% der Fälle war die Zuordnung UniGene ID Ensembl Gene ID die gleiche, wie im MetaGenIndex. In den anderen Fällen (7%) war die Zuordnung im MetaGenIndex eine andere. Dies spricht für die aktuellen Einstellungen des MetaGenIndex. Im CCDS Projekt ist TIGR nicht enthalten. Deshalb konnte im Rahmen der Arbeit die Verbindung CCDS TIGR nicht betrachtet werden. In weiterführenden Untersuchungen, kann dieser Vergleich durchgeführt werden, wobei zu erwarten ist, dass sich die Übereinstimmung der Indizes (CCDS Gen-Index, MetaGenIndex) erhöhen wird. Selbst wenn kein Treffer über TIGR erzielt wird, so wird die Übereinstimmung nicht schlechter als 93% sein und sich mit jedem Treffer verbessern. Dieser Vergleich könnte die verbleibenden 7% erklären. 33