Strukturelle Untersuchungen von SCO3201, einem Repressor aus der TetR-Familie

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1 Strukturelle Untersuchungen von SCO3201, einem Repressor aus der TetR-Familie Inauguraldissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald Vorgelegt von Paul Waack geboren am 22. Januar 1986 in Greifswald

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3 Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Klaus Fesser 1. Gutachter : Prof. Dr. rer. nat. Winfried Hinrichs 2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Norbert Sträter Tag der Promotion:

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5 1 Zusammenfassung... VII 1.1 Streptomyces coelicolor, ein Modellorganismus für die Ordnung der ActinomycetalesVII 1.2 Ein-Komponenten-Systeme als regulatorische Schalter... VII 1.3 SCO3201, ein Vertreter der TetR-Familie mit unbekanntem Liganden... VIII 1.4 Streptomyces coelicolor, a Model Organism for the Order of Actinomycetales... X 1.5 One Component Systems as Regulatory Switches... X 1.6 SCO3201, a member of the TetR Family with an unknown ligand... XI 2 Einleitung Streptomyces coelicolor Der Differenzierungsprozess von Streptomyces coelicolor Das Wachstum des Substratmyzels Ausbildung des Luftmyzels und Sporulation Ein-Komponenten-Systeme (EKS) als regulatorische Schalter Die Familie der TetR-Transkriptionsregulatoren Der Regulator SCO Röntgenkristallographische Grundlagen Kristallisation von Proteinen Röntgenbeugung an Proteinkristallen Lösung des Phasenproblems Temperaturfaktoren von Atomen im Kristallgitter Kriterien zur Überprüfung der Modellqualität Ergebnisse Expression und Reinigung von SCO3201 in E. coli C Expression und Reinigung des Wildtyps Herstellung und Reinigung der Varianten von SCO Bestimmung des Oligomerisierungszustands von SCO Kristallisation von SCO Kristallisation des Wildtyps Kristallisation von SCO3201-H Kristallisation von SCO3201-H20 bei ph 8, Kristallstrukturanalyse von SCO3201 in der Raumgruppe P Aufnahme eines Datensatzes mit kristallisiertem SCO3201-H Austausch von Methionin gegen Selenomethionin Strukturlösung mittels Single Anomalous Dispersion (SAD) Kristallstrukturanalyse von SCO3201 in der Raumgruppe P Beschreibung der Struktur von SCO Die Struktur des teilweise induziertem Dimers Die Struktur der Apo-Form I

6 3.6.3 Teilweise Komplexierung von SCO3201 mit einem unbekannten Induktor Vergleich der B-Faktoren der beiden Monomere in 4cgr Auswertung des Small-Angle-X-Ray-Scattering-Experiments Untersuchung der DNA-Bindung von SCO Einfluss des N-Terminus auf die Operator-Erkennung Nachweis der Bindung mehrerer Dimere in der Operatorsequenz Versuch der Identifikation des Liganden Diskussion Qualität der Strukturlösungen von SCO Das teilweise induzierte SCO3201-Dimer 4cgr Die Apo-Form von SCO Vergleich der Struktur von SCO3201 mit homologen Regulatoren Die DNA-bindende Domäne Die regulatorische Domäne Diskussion der Consensus-Sequenz Konformationsänderungen von SCO3201 bei Ligandenbindung DNA-Interaktion von SCO Versuche zur Identifikation des SCO3201-Induktors Mögliche Herkunft des Liganden Einordnung von SCO3201 im Genom von S. coelicolor Mögliche zukünftige Techniken zur Ligandenidentifizierung Materialien und Methoden Materialien Chemikalien Kommerzielle Kits Vektoren und Zellstämme Lösungen, Puffer und Medien Stammlösungen Medien Pufferlösungen Lösungen für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese Verbrauchsmaterialien PAGE-Gele Kommerzielle Produkte Kristallisationslösungen Geräte und Software Methoden Molekular- und mikrobiologische Methoden II

7 Primer-Erstellung für die PCR Polymerase-Kettenreaktion und Ligation mit Expressionsvektoren Plasmidisolation Sequenzierung Transformation mittels Hitzeschock Agarose-Gelelektrophorese Herstellung von chemokompetenten Zellen Vereinzelungsausstriche Übernachtkultur (ÜN) Glycerolstocks Proteinexpression im LB-Medium Einbau von Selenomethionin in SCO Proteinreinigung Zellaufschluss Verdau mittels DNase Metallionen-Affinitätschromatographie Gelfiltration Elektrophoretische Untersuchungsmethoden von Proteinen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese Electrophoretic Mobility Shift Assay Kristallisation von Proteinen Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Spektrophotometrie Proteinkristallisation Röntgenstrukturanalyse Sammlung und Prozessierung von Röntgenbeugungsdaten Ab-initio-Phasenbestimmung mit SHELX Strukturbestimmung über molekularen Ersatz mit Phaser MR Verfeinerung mittels refmac5 und WinCoot Literaturverzeichnis... I 7 Danksagung... I III

8 Abkürzungen Abb. Abbildung MES 2-(N-Morpholino)- Ethansulfonsäure ad Adjust/auffüllen MW Molecular weight a. dest. aqua destillata, destilliertes Wasser OD 600 Optische Dichte, gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm BSA Bovines Serumalbumin PAGE polyacrylamid gel electrophoresis DNA desoxyribonucleic acid, PCR polymerase chain reaction Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli PEG Polyethylenglycol EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay ph Potentia hydrogenii, negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität. GF Gelfiltration rmsd root-mean-square deviation GFP Grün fluoreszierendes rpm rounds per Minute Protein HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)- SAD Single wavelength anomalous dispersion Ethansulfonsäure IMAC immobilized metal ion affinity chromatography SDS sodium dodecyl sulfate IPTG Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid TEMED N,N,N,N - Tetramethylethylendiamin LB Lysogeny broth TEV Tobacco Etch Virus mau Tris milli- Tris-(hydroxylmethyl)- Absorptionseinheiten aminomethan IV

9 Die Aminosäure-Nomenklatur folgt den IUPAC-IUB-Vereinbarungen von Einheiten Bogengrad C Grad Celsius Å Angström, m Da Dalton g Erdbeschleunigung g h L m M Gramm Stunde Liter Meter Molar (mol/l) min Minute s V Sekunde Volt PDB-Codes der in der Arbeit verwendeten Strukturen. PDB-Code 1jt0 1qpi 2rae 3lsp 4cgr 4i6z 4jyk 4x1e 5efy Struktur QacR-DNA-Komplex Tetracyclin-Repressor-DNA-Komplex TetR/AcrR-Regulator DesT, gebunden an seinen Promotor und Oleoyl-Coa SCO3201 in teilweise induzierter Form Transkriptionsregulator TM1030 im Komplex mit DNA Transkriptionsregulator RutR, gebunden an Uracil RutR W167A-Mutante, Apo-Form Apo-Form von SCO3201 V

10 Zusammenfassung VI

11 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung 1.1 Streptomyces coelicolor, ein Modellorganismus für die Ordnung der Actinomycetales Streptomyces coelicolor ist ein im Boden lebendes, gram-positives Bakterium und Vertreter der Gattung Streptomyces, welche große industrielle Bedeutung hat, da ein Großteil der in der Human- und Veterinärmedizin zur Anwendung kommenden Antibiotika von ihr produziert werden kann. Auch eine Vielzahl anderer bioaktiver Substanzen wurde in Streptomyceten gefunden, deren Funktion ein weites Spektrum abdeckt 1,2. Daneben finden Streptomyceten immer häufiger Anwendung als Expressionsstamm. Eine Besonderheit der Gattung ist der komplexe Differenzierungsprozess, der sowohl metabolische, als auch drastische morphologische Änderungen bewirkt. Der Ablauf dieses Prozesses wird sowohl durch extrazelluläre Signale, als auch durch intrazelluläre Signale bewirkt, wobei letztere durch Transkriptionsfaktoren verwertet werden, die Ein-Komponenten-Systeme (EKS) darstellen und niedermolekulare Stoffe binden können. 1.2 Ein-Komponenten-Systeme als regulatorische Schalter Extrazelluläre Signale werden häufig durch Zwei-Komponenten-Systeme (ZKS) verarbeitet, die aus zwei Proteinen bestehen. Eine Histidinkinase, die typischerweise aus einer extrazellulären Sensordomäne und einer cytosolischen katalytischen Domäne besteht, empfängt dabei ein Signal, oft ein niedermolekularer Ligand, und überträgt dieses als Phosphorylierung auf einen cytosolischen Response-Regulator. Dieser interagiert dann meist direkt mit der DNA und löst die Reaktion auf das Signal aus. Allerdings sind sowohl bei den ZKS als auch bei den Ein-Komponentensystemen Fälle bekannt, bei denen weitere Zwischenschritte vermittelt werden. Im Gegensatz dazu werden bei EKS die Signalerkennung und die regulatorische Antwort vom selben Protein durchgeführt. Diese Proteine verfügen deshalb meist sowohl über eine DNA-bindende Domäne, als auch über eine Liganden-Bindungsstelle. Sie besitzen im Gegensatz zu Zwei-Komponenten-Systemen eine hohe Varianz in ihren VII

12 Zusammenfassung Domänen und sind in allen bekannten prokaryotischen Organismen zu finden, wohingegen ZKS in vielen Spezies, hauptsächlich Archaeen, nicht zu finden sind. Bei Archaea-Vertretern, die über ZKS verfügen, wird ein horizontaler Gentransfer zwischen Bakterien und Archaeen vermutet. Aus diesen Gründen wird angenommen, dass die Signaltransduktion mittels Ein-Komponenten-System evolutionär älter ist, als ihr komplexeres Gegenstück 3. Weiterhin besitzen nur sehr wenige Vertreter der über ein Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH-Motiv) verfügenden EKS eine Transmembrandomäne. Da diese zwingend für die Reizerkennung extrazellulärer Signale erforderlich ist, kann angenommen werden, dass EKS im Allgemeinen für die Erkennung intrazellulärer Signale verantwortlich sind. Der evolutionäre Sprung zu ZKS, die in der Lage sind, extrazelluläre Signale zu verarbeiten, erscheint zusammen mit deren geringerem Alter daher plausibel 3. Derzeitig sind mehr als 20 Klassen von EKS bekannt, die Familie der TetR-Regulatoren stellt dabei hinsichtlich der Anzahl ihrer Vertreter und der Varianz ihrer Funktionen eine besonders bedeutsame dar. Nach dem zuerst entdeckten Vertreter benannt, spielen TetR-Regulatoren verschiedenste Rollen im Metabolismus SCO3201, ein Vertreter der TetR-Familie mit unbekanntem Liganden Diese Arbeit widmet sich der funktionellen und strukturellen Untersuchung von SCO3201, einem Protein aus der Klasse der TetR-Repressoren, dessen Struktur bisher unbekannt war und das eine geringe sequenzielle Ähnlichkeit zu anderen Mitgliedern seiner Familie besitzt. SCO3201 wurde als Repressorprotein identifiziert, das durch Überexpression sowohl die Antibiotikaproduktion, als auch die morphologische Differenzierung von Streptomyces coelicolor unterdrückt. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass SCO3201 an mindestens 16 verschiedene Promotor-Sequenzen binden kann 5. Das Protein konnte in E. coli exprimiert und anschließend isoliert werden. Wegen des Fehlens geeigneter Strukturmodelle gelang eine Strukturlösung mittels Molekularem Ersatz nach erfolgreicher Kristallisation zunächst nicht. Mittels Single- Wavelength-Anomalous-Dispersion-Methode konnte die Struktur des teilweise induzierten Proteins jedoch aufgeklärt werden. Zudem wurde eine Apo-Form des VIII

13 Zusammenfassung Proteins kristallisiert und ebenfalls strukturell aufgeklärt. Dies erlaubte die Lokalisation der Ligandenbindungstasche und ließ Rückschlüsse auf die Domänenbewegungen zu, die durch den Prozess der Induktion ausgelöst werden. Daneben wurde mittels Röntgenkleinwinkelstreuung die Struktur von SCO3201 in Lösung untersucht, um eventuelle Kristallisationsartefakte auszuschließen. Durch den Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wurde außerdem die Interaktion zwischen dem Regulator SCO3201 zu seinen Operatoren untersucht. IX

14 Zusammenfassung 1.4 Streptomyces coelicolor, a Model Organism for the Order of Actinomycetales Streptomyces coelicolor is a gram-positive bacterium found in the soil. It belongs to the genus of Streptomyces, which is of great industrial importance, since the majority of relevant antibiotics can be produced with it. Many other bioactive molecules which cover a wide range of functions were found in Streptomyces as well. They also gained relevance as a host for heterologous protein expression. A characteristic feature of the genus is the complex differentiation process it undergoes, during which both metabolic and morphologic changes take place. This process is mediated by extracellular and intracellular signals where the latter are sensed by transcriptional factors that belong to the class of one component systems (OCS) which are able to bind ligands of low molecular weight. 1.5 One Component Systems as Regulatory Switches Extracellular signals are often processed by two component systems (TCS) which consist of two proteins. A Histidine kinase, which typically consists of an extracellular sensing domain and a cytosolic catalytic domain, receives a signal, often a small molecule, and subsequently phosphorylates a cytosolic response regulator. The response regulator interacts directly with the DNA and induces the answer to the signal in most cases. However, examples of both OCS and TCS are known that are part of a longer signal transduction chain and react with other molecules rather than the DNA. Contrary to the TCS, one component systems consist only of one protein for both the signal recognition and the response regulation. These proteins usually consist of a DNA binding domain and a ligand binding site. In contrast to their two component counterparts, they employ a great variety of domains and are found in all known prokaryotic organisms, whereas TCS are absent in many species, in particular archaea. In many cases, existing TCS in archaea are thought to be the result of horizontal gene transfer from bacteria. For these reasons, signal transduction with one component systems is thought to be genetically older than their more complex counterpart 3. Furthermore, only few OCS possess a membrane spanning domain. It is therefore X

15 Zusammenfassung assumed that in general they are limited to sensing intracellular signals, which make the necessary evolutionary leap to two component systems plausible 3. As of now, there are more than 20 classes of OCS known. The TetR family of transcription regulators is an extraordinary large and diverse one. Named after the function of the first discovered member, these regulators play many different roles in the metabolism SCO3201, a member of the TetR Family with an unknown ligand This work examines the structural properties of SCO3201, a member of the TetR-like family of regulators, whose 3D structure was unknown until now and which shows low sequential identity to other members of its family. SCO3201 has been identified to be a repressor protein which, when overexpressed, supresses antibiotics production as well as the morphological differentiation process. In earlier work it has been shown that this regulator can bind to at least 16 different promotor regions. The protein was cloned and overexpressed in E. coli and subsequently purified. Due to the absence of a suitable homology model, the solution of the structure was unobtainable at first, in spite of a successful crystallisation of the protein. However, a successful Single Anomalous Dispersion experiment enabled the acquisition of phases and delivered the structure of the partly induced repressor. Furthermore, the structure of the apo-form of SCO3201 was acquired as well. This allowed the localisation of the ligand binding site as well as tracking the domain movement of the induction process. Also, a Small Angle X-Ray Scattering experiment was conducted to investigate the structure of SCO3201 in solution, which allowed checking for crystallisation artefacts. Subsequently, the Electrophoretic Mobility Shift Assay was employed to analyse the regulator-operator-interactions of SCO3201 with its operator. XI

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17 Einleitung 2 Einleitung 2.1 Streptomyces coelicolor Streptomyces coelicolor ist Teil der Gattung Streptomyces, die im Boden, ihrem Lebensraum, zu den häufigsten Bakterien gehören. Die fast ubiquitäre Verbreitung lässt sich schon durch den charakteristischen Geruch von Erde erahnen: Dieser wird durch das hauptsächlich durch Streptomyceten gebildete Geosmin bewirkt 6. Die ersten Vertreter der Gattung Streptomyces entstanden wahrscheinlich vor etwa 450 Millionen Jahren, nachdem grüne Pflanzen das Land besiedelt hatten und eine potenziell ergiebige Nährstoffquelle darstellten. Die ökologische Nische, die schwerverdaulichen Pflanzenbausteine zu nutzen, konnte erst jetzt von Organismen besetzt werden. Frühe Streptomyceten erschlossen diese, indem sie die Fähigkeit ausbildeten, Hydrolasen zu sekretieren und die Biopolymere in nutzbare niedermolekulare Substanzen zu zerlegen. Möglicherweise wurden die ebenfalls sekretierten Chitinasen nicht nur zur Gewinnung von Nährstoffen aus dem entsprechenden Biopolymer verwendet, sondern auch zur Abwehr von Pilzen, die mit Streptomyces um die Pflanzenbestandteile im Boden konkurrierten. Erst 1675 gelang die Beobachtung von Bakterien durch Antoni van Leeuwenhoek, der dazu lichtmikroskopische Techniken benutzte, und von der britischen Royal Society ob seiner Entdeckung zunächst verlacht wurde. Nach Kontrolle seiner Ergebnisse revidierte diese ihre Meinung und van Leeuwenhoek ist heute als Entdecker der Bakterien anerkannt. 200 weitere Jahre vergingen, bevor Ferdinand Julius Cohn 1875 als erster ein Bakterium charakterisierte, das der Gattung Streptomyces angehörte 7. Der Name Streptomyces wurde allerdings erst im 20. Jahrhundert von Selman Abraham Waksman und Arthur Trautwein Henrici geprägt, der den von Cohn verwendeten Namen Streptothrix ersetzte. Waksman erhielt 1952 den Nobelpreis für Medizin für die Entdeckung des Streptomycins, das er zusammen mit Albert Schatz aus Streptomyces griseus isolierte. Dieses Aminoglycosid-Antibiotikum wird auch von vielen anderen Vertretern der Gattung gebildet und besitzt ein breites Wirkspektrum, vor allem aber wegen seiner Wirksamkeit gegen Tuberkulose war es bahnbrechend. Streptomyceten werden inzwischen zur Produktion vieler weiterer Antibiotika, Antimykotika und antiparasitärer Präparate verwendet 8. 1

18 Einleitung 2.2 Der Differenzierungsprozess von Streptomyces coelicolor Das Wachstum des Substratmyzels Das gram-positive Bakterium S. coelicolor gehört zu den am weitesten differenzierten prokaryotischen Organismen, die bisher entdeckt wurden 9,10. Es durchläuft einen komplexen Lebenszyklus, der sich grob in zwei Phasen einteilen lässt: die vegetative Phase, in der das Bakterium ein Substrat-Myzel ausbildet, das zur Nährstoffgewinnung dient, und die Reprodukionsphase, bei der ein Luftmyzel ausgebildet wird, welches aus dem Medium heraustritt, sich aufrichtet und so die Verteilung der sich dort bildenden Sporen erleichtert. Zudem korreliert diese Phase mit der Synthese von Sekundärmetaboliten 11. Im Gegensatz zu anderen bodenbewohnenden Organismen wie Pseudomonas, die durch ihre Begeißelung mobil sind, erlaubt die Myzelbildung von Streptomyces keine freie Beweglichkeit von Zellen und somit keine Migration, wenn lokale Nährstoffquellen erschöpft sind. Der Mechanismus der Differenzierung umgeht dieses Problem durch die Fähigkeit, Sporen über die Luft zu verteilen und so neue Nährstoffquellen zu erschließen 12. Finden diese Sporen von S. coelicolor günstige Bedingungen im Boden vor, kommt es zur Ausbildung eines Tubulus, der in das Substrat hineinwächst. Bei der Zellteilung schnüren sich neue Zellen von diesem Tubulus ab und wachsen durch ausgeprägtes apikales Wachstum weiter in das Medium hinein. Hier zeigt sich ein deutlicher Unterschied zu anderen stäbchenförmigen Bakterien wie E. coli und B. subtilis, bei denen das Actin-Homolog mreb die Form der Zelle vermittelt 13. Die Form der Streptomyceten entsteht durch auf die Zellspitze beschränktes Längenwachstum, da sich die erforderlichen Enzym-Systeme, vorrangig hier konzentrieren 14, während der laterale Teil der Zelle in Bezug auf die Mureinsynthese relativ inert ist. Als Folge dieses Prozesses bilden sich pilzartige Hyphen aus, in der sich Streptomyces-Zellen hintereinander reihen. Replizierte DNA wandert dabei in den vorderen Teil der apikalen Zelle, um nach dem Abschnüren ein weiteres Wachstum zu ermöglichen. Obwohl im Genom von S. coelicolor zwei mreb-gene identifiziert wurden, ist das apikale Wachstum unabhängig von diesen Genen, sie spielen aber eine Rolle für Integrität der Zellen des Luftmyzels 15. Neben dem beschriebenen Längenwachstum am vorderen Ende der primären Hyphe sind Zellen zu keinem weiteren Wachstum fähig, bis sie einen lateralen Spitzenkörper ausbilden. Die Position dieses Ausgangspunktes einer 2

19 Einleitung Verzweigung steht in Zusammenhang mit dem Vorhandensein des Tropomyosin-artigen coiled-coil Proteins DivIVA in der Peptidoglycan-Schicht, welches sich zunächst am apikalen Spitzenkörper konzentriert und im Verlauf des Längenwachstums in bestimmten Punkten der seitlichen Zellwand zurückbleibt 16,17. Nur an diesen Punkten werden die für die Peptidoglycan-Synthese nötigen Enzyme rekrutiert und neue Wachstumspole erzeugt. Diese Änderung der Polarität einer Zelle in der Hyphe führt zu einer Verzweigung, bei der die entstehenden sekundären Hyphen anschließend analog zur primären Hyphe verlängert und wiederum verzweigt werden. Bislang ist unklar, inwieweit andere Faktoren neben DivIVA in die Verzweigung des Myzels involviert sind. Das so entstehende Myzel besitzt eine große Oberfläche für die Aufnahme von Nährstoffen. Die Ähnlichkeit der Lebensweise der Streptomyceten zu derjenigen der Pilze stellt dabei keine homologe Evolution dar, sondern ist wahrscheinlich eine Folge der Besiedlung der gleichen ökologischen Nische, die zur Entwicklung ähnlicher Überlebensstrategien führte 18. Das erste Substratmyzel durchläuft nach der initialen Ausbreitung eine Phase des programmierten Zelltodes, durch die in den Hyphen alternierende Abschnitte aus toten und lebenden Zellen entstehen 19,20. Im weiteren Verlauf werden die toten Bestandteile des Myzels aufgelöst, während sich die aktiven Zellen erneut zu einem dichten Myzel ausbreiten. Dies führt bei Streptomyces-Kolonien zwischenzeitlich zu inselartigen Strukturen, bei denen die Zonen aktiven Wachstums durch Zonen des aufgelösten ersten Substratmyzels voneinander getrennt sind. Mit fortlaufender Zellteilung verbinden sich die aktiven Bereiche wieder zu einem homogenen zweiten Myzel, das sich in dieser Phase besonders stark ausbreitet und so das Volumen der Kolonie stark erhöht Ausbildung des Luftmyzels und Sporulation In dieser Phase des Lebenszyklus beginnt die Ausbildung des Luftmyzels, das sich als dünne Schicht an der Oberfläche der Kolonie aus dem Substrat heraushebt. Im späteren Verlauf schnüren sich Zellen im Luftmyzel ab und es kommt zur Sporulation. Um die Oberflächenspannung des wässrigen Milieus zu überwinden und ein Ablösen vom Substrat zu erreichen, bildet sich auf der an sich hydrophilen Oberfläche der 3

20 Einleitung wachsenden Lufthyphen eine hydrophobe Ummantelung. Sie stellt einen deutlichen morphologischen Unterschied zu den Hyphen des Substratmyzels dar, denen diese Ummantelung fehlt. Bislang wurden zwei Molekül-Klassen von sogenannten Surfactants identifiziert, die in S. coelicolor an der Ausbildung der hydrophoben Oberfläche des Luftmycels beteiligt sind: das Polypeptid SapB und die Proteinklasse der Chapline 21. Beide Moleküle wirken an Wasser-Luft-Grenzflächen wie Tenside und verringern die Oberflächenspannung von Wasser in vitro auf etwa ein Drittel 18. SapB, dessen Gen rams ein 42-Aminosäurereste-langes Polypeptid kodiert, reift durch posttranslationales Prozessieren zu einem 21-Aminosäurereste-langen, reifen Polypeptid, das zudem zwei Lanthionin-Bindungen aufweist. Diese werden wahrscheinlich über Dehydration zweier Serin-Seitenketten durch das von ramc kodierte Protein erzeugt 22. Trotz der Ähnlichkeit zu den in Streptomyces produzierten Lantibiotika zeigt SapB keine antibiotische Wirkung und hat sich möglicherweise paralog zu einem amphiphilen Oberflächenprotein entwickelt 22. Es konnte gezeigt werden, dass SapB essentiell für die Ausbildung des Luftmycels bei Wachstum in Vollmedium ist 23. Mutanten, die durch Veränderung des ram-operons nicht zu Synthese des Peptids in der Lage sind, zeigen keine Entwicklung des Luftmycels. Eine externe Zugabe von SapB führt allerdings auch hier zu normalen Phänotypen, die sowohl zur vollständigen Differenzierung des Myzels, als auch zur Sporulation fähig sind. Bei Wachstum von S. coelicolor auf Minimalmedium wird für die Ausbildung des Luftmycels ein alternativer Weg eingeschlagen. Unter diesen Bedingungen kommt es nicht zu einer Synthese von SapB, sondern es wird eine hydrophobe Ummantelung durch Chapline und Rodline gebildet. Bislang wurden 8 Chapline in S. coelicolor identifiziert, Chaplin A bis H, die durch die Gene chpa bis chph kodiert werden. Sie sind gekennzeichnet durch eine hochkonservierte, 40-Aminosäurereste-lange hydrophobe Domäne. Diese kommt in den kurzen Chaplinen D bis E einmal vor, in den langen Chaplinen A, B und C zweimal. Letztere besitzen zudem ein C-terminales Sortase-Erkennungsmotiv. Allen Chaplinen gemein ist ein N-terminales Signalpeptid, das die Exkretion des naszenten Polypeptids über das Sec-System ermöglicht, der Vorgang ist in untenstehender Abbildung schematisch dargestellt 24. 4

21 Einleitung Abb. 2.1: Modell des Mechanismus zur Bildung der Chaplin-Schicht Chaplin A, B und C werden nach Sekretion kovalent durch eine oder mehrere Sortasen an den Pentaglycin-Rest eines Lipid-II-Moleküls gebunden und so in der Peptidoglycan-Schicht verankert 25. Durch eine vermutete Heteropolymerisation der kurzen und langen verankerten Chapline entstehen so amyloide Filamente, die die Oberfläche der bakteriellen Zellwand bedecken und eine hydrophobe Oberfläche erzeugen 25. Die Deletion von chpc, chpe und chph führt zur verspäteten Ausbildung des Luftmycels, das zudem weit weniger Hyphen besitzt. Die anschließende Sporulation ist von diesen Mutationen nicht beeinflusst und die gebildeten Sporen bleiben aktiv 25. Eine Deletion aller chp-gene führt zum Ausbleiben des Lufthyphen-Wachstums in Minimalmedien und schränkt das Wachstum unter Vollmedium-Bedingungen stark ein. Wird auch die Synthese von SapB verhindert, findet unter keinen Wachstumsbedingungen eine Differenzierung statt 21. Die Überexpression der ram-gene und damit die Synthese von SapB bei Wachstum im Minimalmedium, bei dem die ram- Gene normalerweise nicht abgelesen werden, führt zur teilweisen Wiederherstellung der Differenzierungsfähigkeit 21. Einen weiteren Bestandteil der hydrophoben Ummantelung von S. coelicolor bilden die Rodlin-Proteine RdlA und RdlB. Im Gegensatz zu den zuvor erwähnten Molekülen führt eine Abwesenheit dieser Proteine nicht zu einer verzögerten oder verhinderten Ausbildung von Lufthyphen 26. Auch die Sporulation ist nicht beeinflusst, obwohl RdlA und RdlB auch auf der Oberfläche der reifen Sporen zu finden sind. Bei elektronenmikroskopischer Betrachtung der Lufthyphen zeigt sich jedoch ein deutlicher Unterschied in ihrer Oberflächenstruktur. Während der Wildtyp ein charakteristisches, korbgeflechtartiges Muster der Chaplin-Proteine aufweist, zeigen Mutanten, die nicht 5

22 Einleitung zur Expression von RdlA und RdlB fähig sind eine glatte Oberfläche, bei denen die Chapline als ein feines, ungeordnetes Geflecht aus Fasern vorliegen (siehe Abb. 2.2) 26. Abb. 2.2: Elektronenmikroskopische Aufnahmen der Sporen von S. coelicolor. A: Wildtyp, B: rdla- und rdlb-defiziente Mutante, Maßstab in der Abbildung angegeben 26. Die Regulation der für die SapB-Synthese zuständigen ram-gene, sowie die Regulation der Chaplin-Synthese in S. coelicolor sind bisher nur schlecht verstanden, wenngleich die Mechanismen, die zur Zelldifferenzierung führen, in S. griseus besser erforscht sind 18. In späten Phasen der Differenzierung, mit Beginn der Ausbildung des Luftmycels, kommt es zu einer zweiten Phase des programmierten Zelltodes, bei dem das zweite Myzel beginnend mit der basalen Seite der Kolonie lysiert. Parallel zum weiteren Wachstum des Luftmycels schreitet der Zelltod in Richtung der Oberfläche fort und betrifft schließlich das ganze Substratmyzel. Nur das Luftmycel als dünne Schicht an der Oberfläche ist zu diesem Zeitpunkt noch aktiv und beginnt mit der Sporulation 19. Zunächst beginnt in den apikalen Zellen der Lufthyphen eine starke Replikation der chromosomalen DNA, sodass in diesen sporenbildenden Zellen über 50 Kopien des Bakterienchromosoms vorliegen können 27. Die endständigen Zellen stoppen ihr Längenwachstum und leiten mehrere synchron ablaufende Zellteilungen ein. Der Wechsel zwischen diesen Modi ist abhängig vom Vorhandensein der Gene whia und whib, der zugrunde liegende Mechanismus ist allerdings unklar 28. Die Zellteilung beginnt mit der Septierung der Mutterzelle, die durch das Tubulin-Homolog FtsZ gesteuert wird. Wie in allen bekannten Bakterien bildet FtsZ durch 6

23 Einleitung Homopolymerisierung auch in S. coelicolor zunächst Helices, die zu einer ringförmigen Struktur, dem Z-Ring, umgebaut werden. Dieser bestimmt die Position des späteren Septums 29. Nach Bildung des Z-Ringes werden andere, für die Zellteilung notwendige Proteine rekrutiert. Die dabei ablaufenden Prozesse unterscheiden sich deutlich von anderen gut erforschten Mikroorganismen wie E. coli und B. subtilis. Proteine, die in diesen Organismen anscheinend zwischen Z-Ring und Enzymen zur Peptidoglycan- Synthese vermitteln, wurden auch in S. coelicolor gefunden. Es scheinen aber in letzterem keine der aus E. coli und B. subtilis bekannten Proteine vorhanden zu sein, die zur Organisation und Verankerung des Z-Ringes selbst dienen 30. Trotzdem gelingt es S. coelicolor auf bislang unbekanntem Wege, eine regelmäßige Anordnung von Z-Ringen im Abstand von etwa 1,3 µm über etwa 75 µm zu gewährleisten 31. Vor der kompletten Abschnürung werden die Kopien des Bakterienchromosoms auf die sich bildenden Sporen verteilt, indem Homologe des ParAB-Systems eine regelmäßige Anordnung der DNA bewirken 32,33. ParB erkennt und bindet dabei pars-sequenzen der DNA und formt so Nukleoprotein-Komplexe, ParA bildet ein helikales Filament, das die Zelle der Länge nach durchspannt und für die Bewegung und Positionierung der ParB-DNA- Komplexe essentiell zu sein scheint 34. In den sich schließenden Septen ist zudem die DNA-Translocase FtsK lokalisiert, die unter ATP-Verbrauch das Bakterienchromosom aus dem Bereich der Septen transportiert 35. Das Zentrum der DNA wird zwar durch das ParAB-System in seiner korrekten Position gehalten, die Enden des Bakterienchromosoms, das elongiert mal länger als die Spore ist, sind aber frei beweglich und müssen durch die Translocase aus den sich schließenden Septen entfernt werden. FtsK-defiziente Mutanten von S. coelicolor weisen zum Teil Deletionen an den Termini des Bakterienchromosoms auf, was darauf hindeutet, dass das Septum ohne die Translokation der DNA diese bei seiner Bildung einschließt und abschneidet 36. Nach der vollständigen Septierung beginnt die Zelle mit der Bildung einer bis zu 50-nm-dicken Sporenwand unter der Peptidoglycan-Schicht der Hyphe, dies geht auch mit der Entstehung der ovoiden Form der reifen Spore einher 37. Das Actin-Homolog MreB, das auf in anderen Stäbchenbakterien formgebend ist, scheint dabei wesentlichen Anteil an der typischen Stabilität, Hitzeresistenz und Form der Sporen zu haben. Bisher wurde angenommen, dass MreB durch Bildung langer Filamente direkt zur Stabilisierung der Zellform beiträgt. Ein Mechanismus, der jüngst infrage gestellt wurde, weil diese Filamente in vivo nicht beobachtet werden konnten 38. Es wird 7

24 Einleitung vermutet, dass das Protein in S. coelicolor mit Beginn der Septierung in der Zellmembran verankert wird und an der Rekrutierung anderer, für die Sporenwandbildung nötiger Proteine beteiligt ist Ein-Komponenten-Systeme (EKS) als regulatorische Schalter Der Großteil der Signaltransduktionssysteme in Prokaryoten wird durch cytosolische Proteine gebildet, die gleichzeitig sowohl Signalempfang, als auch Verarbeitung des Signals durch Regulation der Transkription oder, weitaus seltener, einer Enzymaktivität bewerkstelligen. Im Unterschied dazu sind Zwei-Komponenten-Systeme (ZKS) in meist membranständige Sensor-Kinase als Reiz-erkennende Domäne und durch Phosphatgruppenübertragung aktivierten Responseregulator als regulatorische Domäne unterteilt. Im Repertoire der Domänen beider Signaltransduktionssysteme gibt es zahlreiche Überschneidungen, weshalb vermutet wird, dass beide für die Erkennung und Verarbeitung ähnlicher Reize zuständig sind. Allerdings ist die Varianz und die Vielfalt der Domänen von Ein-Komponenten-Systemen bedeutend größer 3. So gibt es viele Domänen, die ausschließlich in EKS vorkommen, wohingegen keine ZKS-exklusiven Domänen bekannt sind. Zudem sind EKS deutlich häufiger als ZKS in prokaryotischen Genomen vertreten, eine Analyse von 145 Genomen durch Ulrich et al. auf Basis bekannter Domänensequenzen fand etwa EKS und nur ZKS 3. Der bei weitem häufigste Mechanismus beider Schaltersysteme beruht auf der Regulation der ihnen unterstellten Gene als Folge der Reaktion auf ein Signal. Die Interaktion zwischen DNA und Protein wird dabei meist durch ein HTH-Motiv vermittelt 39. Das Signal ist für gewöhnlich das Vorhandensein eines kleinen Moleküls und damit chemischer Natur. Hier ist das Regulatorprotein LacI und sein Induktor Allolaktose als Beweis des von François Jacob und Jaques Monod 1961 vorgeschlagenen Mechanismus der Genregulation zu nennen 40,41. Obwohl auch LacI letztendlich auf die extrazellulär vorhandene Lactose reagiert, wird die Regulation ohne die typische Phosphatgruppenübertragung bewerkstelligt, die erst 1986 von Nixon et al. mit dem NtrBC-System postuliert wurde 42. Viele Organismen verfügen außerdem über die Möglichkeit, auch physikalische Reize wie Oxidationsstress wahrzunehmen. Das 8

25 Einleitung Redox-sensitive EKS HypR aus B. subtilis ist ein Beispiel dafür, wie Organismen intrazellulär auf oxidativen Stress reagieren. Der Kontakt mit oxidierenden Agenzien führt dabei zu einer intramolekularen Disulfid-Bildung, die eine Konformationsänderung des Proteins bewirkt 43. Die gegenteilige Funktion hat das ZKS ArcAB in E. coli, bei dem reduktive Bedingungen die Autophosphorylierung der Sensorkinase aktiveren und die Signaltransduktion in Gang setzen 44. Eine weitere Variante der Signaltransduktion bei Zwei-Komponenten-Systemen ist die Übertragung der Phosphatgruppe auf ein Enzym, statt auf einen Regulator. Es findet dabei keine direkte Interaktion mit der DNA statt, sondern die Synthese eines sekundären Botenstoffes. Cyclisches di-gmp ist ein solcher sekundärer Botenstoff, der von Responseregulatoren gebildet wird, die über eine GGDEF-Domäne verfügen. Diese katalysiert nach Aktivierung die Cyclisierung von zwei GTP-Molekülen und ist in Bakterien weit verbreitet, bislang aber nicht in Archaeen beobachtet worden 45,46. Der sekundäre Botenstoff kann wiederum mit anderen Enzymen interagieren und so eine Reizverarbeitung ohne Proteom-Änderungen bewirken. Wie bereits erwähnt, wurden bisher keine ZKS-exklusiven Domänen gefunden, daher überrascht es nicht, dass die GGDEF-Domäne und der mit ihr verbundene Regulationsmechanismus auch in EKS gefunden wurden 47. Die Anzahl der EKS und ZKS in einem prokaryotischen Organismus korreliert mit der Größe seines Genoms. Dabei ist der Anstieg der Anzahl der Signaltransduktionsysteme nicht linear, sondern exponentiell: mit steigender Genom-Größe werden überproportional viele Gene für die Signaltransduktion benötigt, was letztendlich der maximalen Genomgröße von Prokaryoten Grenzen setzten könnte 48. Vieles deutet darauf hin, dass Ein-Komponenten-Systeme gegenüber Zwei- Komponenten-Systemen einen evolutionär älteren Mechanismus der Signalverarbeitung darstellen. Die Abwesenheit von ZKS in vielen Archaea-Spezies könnte darin begründet sein, dass dieser Mechanismus der Signaltransduktion erst nach Abspaltung der Domäne der Bacteriae von diesen entwickelt wurde. Zudem scheinen die ZKS in Archaeen durch horizontalen Gentransfer aus Bakterien zu stammen 49. Das ubiquitäre Vorkommen des einfacheren Signaltransduktionsweges mittels EKS lässt die Vermutung zu, dass dieser schon von den gemeinsamen Vorfahren aller heutigen Lebewesen verwendet wurde und daher mehr Zeit für die Entwicklung der hohen Domänenvielfalt zur Verfügung stand. Üblicherweise wird durch ZKS ein 9

26 Einleitung extrazellulärer Reiz aufgenommen und intrazellulär verarbeitet. In EKS hingegen erfolgen sowohl Reizaufnahme als auch dessen Verarbeitung intrazellulär. Mit letzteren können also nur externe Stimuli verarbeitet werden, wenn diese die Zellmembran von sich aus passieren können, oder die vom Organismus selbst aufgenommen werden. Die Fähigkeit, auch extrazelluläre Signalerkennung durchzuführen, stellt demnach insbesondere im Hinblick auf die Reaktion auf Stressoren einen eindeutigen Vorteil dar, der als Weiterentwicklung interpretiert werden kann und so ein weiteres Indiz für die unterschiedlichen Entstehungszeitpunkte liefert. 2.4 Die Familie der TetR-Transkriptionsregulatoren Die TetR-Familie stellt eine große Gruppe innerhalb der Ein-Komponenten-Systeme dar. Mehr als Proteine in nicht-redundanten Datenbanken sind als Mitglieder dieser Familien annotiert und in S. coelicolor wurden bisher weit über 100 TetR- Regulatoren identifiziert 50. Ihr Name geht auf den am besten erforschten Vertreter zurück: der Tetracyclin-Repressor kontrolliert die Expression des teta-gens, welches die Resistenz gegen Tetracyclin durch Expression eines Antiporter-Proteins vermittelt. Dieser Mechanismus stellt eine Derepression dar, bei dem die Anbindung eines niedermolekularen Liganden die Affinität zur erkannten DNA-Sequenz senkt, und zur Ablösung des Protein-Komplexes führt 51. Vertreter der TetR-Familie sind in der Lage, verschiedenste Liganden zu erkennen und dementsprechend an einer Vielzahl von Regulationsprozessen beteiligt. Allen Vertretern gemein ist die Protein-DNA-Interaktion mittels sequenzspezifischer DNA-Bindungsdomäne, die durch ein HTH-Motiv gekennzeichnet ist. Dieses Strukturmotiv besteht in seiner einfachsten Form aus zwei α-helices, die durch eine kurze Aminosäuresequenz miteinander verbunden sind. Eine Helix lagert sich dabei in die große Furche der DNA ein und geht mithilfe ihrer Aminosäure-Seitenketten Interaktionen mit der Operator-Sequenz ein. Die zweite Helix liegt im rechten Winkel auf der anderen und stabilisiert so die Bindung letzterer in der großen Furche 52,53. In folgender Abbildung ist die Bindung der großen Furche der DNA durch das HTH- Motiv im Bändermodell dargestellt. 10

27 Einleitung Abb. 2.3: Helix-Turn-Helix-Motiv des Tetracyclin-Repressors gebunden in der großen Furche (PDB- Code 1qpi) Die Komplexbildung zwischen Protein und DNA beruht sowohl auf unspezifischen Wasserstoff-Brücken und van-der-waals-wechselwirkungen, als auch auf spezifischen Wechselwirkungen mit dem Phosphodiester-Rückgrat und den Nucleotid-Basen der DNA, welche die korrekte Sequenz der Operator-Sequenz voraussetzen 54. Obwohl bestimmte Aminosäure-Nucleotid-Kombinationen häufiger als andere sind, wie zum Beispiel die Wasserstoffbrücken zwischen der Guanidinogruppe des Arginins und Guanin, ist es bislang nicht möglich, auf Basis der Nucleotid-Sequenz die korrespondierende Peptid-Sequenz vorherzusagen 4,55. Mitglieder der TetR-Familie besitzen statt des einfachen Drei-Helix-Bündels eine tetra-helikale DNA-bindende Domäne, bei der eine vierte Helix an die hydrophoben Bereiche des HTH-Motivs angelagert ist und die Verbindung zur regulatorischen Domäne herstellt 56. Die Erkennungs-Domäne ist hierbei hochkonserviert und weist eine hohe Sequenzidentität auf, während die regulatorische Domäne weit variabler ist (siehe Abb. 2.4) 57. Dies ist konsistent mit der bereits erwähnten Eigenschaft der TetR-Familie, verschiedenste Liganden binden zu können. Während der Mechanismus der DNA-Bindung identisch bleibt und nur wenige zur Sequenz-Erkennung nötige Aminosäuren ausgetauscht werden, hat sich die regulatorische Domäne im Laufe der Evolution an verschiedenste Stimuli angepasst. 11

28 Einleitung Prozent Identität Position des Aminosäurerests Abb. 2.4: Identitätsvergleich von 18 verschiedenen TetR-Proteinen. Die DNA-bindenden Domänen (blau) und insbesondere das HTH-Motiv zeigen hohe Sequenzidentitäten, während die regulatorische Domäne (rot) mehr Varianz aufweist. Die geringste Identität in der DNA-bindenden Domäne beträgt hier 78 %, die geringste Identität in der regulatorischen Domäne dagegen nur 52 %. Horizontale Linien bilden den Mittelwert der Identität der entsprechenden Domäne ab. Die Bindung an die Operatorsequenz erfolgt bei Mitgliedern der TetR-Familie stets durch ein Protein-Dimer. Dabei erzeugen die beiden DNA-Bindedomänen eine zweizählige Symmetrieachse, die meist von der Operatorsequenz ebenfalls verlangt wird. Es verwundert deshalb nicht, dass TetR-Proteine für gewöhnlich palindromische oder fast-palindromische Nucleotid-Sequenzen erkennen 58. In der Regel bindet jedes Protein-Dimer dementsprechend zwei Moleküle des Induktors, eines in jedem Monomer. Die Tasche, in der der Ligand bindet, wird dabei zum größten Teil durch Seitenketten des jeweiligen Monomers gebildet. Allerdings können auch Reste des anderen Monomers beteiligt sein 4. Diese allosterische Anbindung führt zu einer Änderung in der Position der DNA-bindenden Domäne relativ zur regulatorischen Domäne. Wegen der Dimerisierung an dieser Rumpfdomäne werden die HTH- Domänen bei Ligandenbindung aus der großen Furche herausgewinkelt. Deren Abstand zueinander ist im Protein-DNA-Komplex der Ganghöhe der DNA meist sehr ähnlich und ermöglicht die bereits erwähnten Interaktionen in der großen Furche. Das Herauswinkeln vergrößert den Abstand der HTH-Motive und senkt so die Bindungsaffinität des Proteindimers zu seiner Operatorsequenz, wodurch sich der Repressor von der DNA löst. Im Falle des Tetracyclin-Repressors sind zwei Dimere an der Regulation der ihnen unterstellten Gene beteiligt, wobei jedes Dimer an eine eigene Operatorsequenz bindet 59. Die Operatoren befinden sich in unmittelbarer Nachbarschaft und kontrollieren uptream und downstream die Gene tetr, das TetR selbst kodiert und teta, welches eine 12

29 Einleitung Tetracyclin-Efflux-Pumpe kodiert, die letztendlich die Resistenz gegen das Antibiotikum vermittelt 51,60. Dies stellt einen deutlichen Unterschied zum nah verwandten Regulator QacR dar, der die Genrepression ebenfalls durch ein HTH-Motiv erreicht und ebenfalls an der Bildung von Resistenzen, hier hauptsächlich lipophile Kationen, beteiligt ist 61. Wie im Falle des Tetracyclin-Repressors sind auch bei der Regulation seines unterstellten Gens qaca zwei Monomere beteiligt, allerdings binden beide Dimere an denselben Operator. Es bildet sich ein Protein-DNA-Komplex, bei dem der Operator proximal und distal von den beiden Protein-Dimeren umgeben ist, die gegeneinander um eine halbe DNA-Windung versetzt sind und durch Aufwinden der DNA kooperativ binden (siehe Abb. 2.5) 62. Die Anbindung der QacR-Moleküle führt nur zu einer minimalen Biegung der Operatorsequenz von etwa 3, wohingegen die Biegung bei der Komplexbildung von TetR mit 17 deutlich stärker ist 57. Dies liegt an dem eigentlich zu hohen Abstand der HTH-Domänen zueinander, der mit 36,6 Å größer als die Ganghöhe der B-DNA ist. Das Biegen der DNA vergrößert den Ganghöhenabstand soweit, dass trotzdem eine Bindung stattfinden kann, ein Effekt, der im Falle der nah beieinander liegenden Bindungsstellen von QacR die Affinität wohl eher senken würde. QacR umgeht die Biegung der DNA zur Optimierung der Ganghöhe durch das deutliche Aufwinden derselben. Die DNA bleibt also trotz vergrößerter Ganghöhe gestreckt 57,63. Es zeigt sich, dass trotz der nahen Verwandtschaft der beiden homologen Regulatoren die sequenzspezifische Bindung und die Genregulation von beiden auf unterschiedliche Art und Weise bewerkstelligt werden. Abb. 2.5: Schematische Darstellung der Operatorbindung der Regulatoren TetR und QacR. Links zwei TetR-Dimere, die die beiden Operatoren (blau) für die Gene tetr und teta kontrollieren. Rechts zwei QacR-Dimere, die kooperativ an den blauen Operator für qaca binden. 13

30 Einleitung Wie zuvor erwähnt, zeichnet sich die TetR-Familie durch die Vielfältigkeit der durch sie regulierten Prozesse aus. Obwohl eine der häufigsten Funktionen die Vermittlung von verschiedensten Resistenzen durch Efflux-Pumpen und die Regulation ihrer eigenen Expression zu sein scheint, spielen TetR-Transkriptionsregulatoren auch in der Biosynthese von Aminosäuren, Nucleotiden und Sekundärmetaboliten eine Rolle 57,64. Des Weiteren sind sie auch an Reaktionen auf osmotischen Stress, der Virulenz, der Regulation der Stickstoff-Aufnahme der Antibiotika-Produktion und dem Quorum Sensing beteiligt Insbesondere letztere Funktionen überraschen nicht, da heute davon ausgegangen wird, dass die Produktion von Antibiotika eine evolutionäre Weiterentwicklung des Quorum Sensing im Sinne des reinen Erfassens der Population darstellt 71. Die Fähigkeit, das Proteom anhand der eigenen Zelldichte zu steuern und gleichzeitig potenzielle Konkurrenten auszuschalten, stellt für Einzeller einerseits einen eindeutigen Vorteil dar, setzt allerdings gleichzeitig die eigene Resistenz voraus. Tab. 1.1: Beispiele ausgewählter TetR-Transkriptionsregulatoren. Proteinname Ursprungsorganismus Funktion AmtR C. glutamicum Reguliert die Ammonium-Aufnahme BarB S. virginiae Reguliert die Virginiamycin-Biosynthese BetI E. coli Regulator im bet-operon, das zur Synthese osmoprotektiver Substanzen dient Ef0113 E. faecalis Lokalisiert in einer Pathogenitäts-Insel von E. faecalis IcaR LuxT S. aureus V. harveyi Regulator des ica-operons, das an der Biofilmbildung beteiligt ist Reguliert die Expression von LuxO, das an der Lumineszenz beteiligt ist McbR C. glutamicum Reguliert die Biosynthese schwefelhaltiger Aminosäuren PsrA P. putida Beteiligt an der Kontrolle des σ-faktors rpos, der das Proteom in der stationären Phase reguliert Den bei weitem größten Teil der bislang bekannten TetR-Regulatoren stellen Repressoren dar, die in der bereits beschriebenen Weise durch allosterisches Binden 14

31 Einleitung eines Liganden von ihrem Operator abgelöst werden. Allerdings sind auch Beispiele bekannt, die von diesem Mechanismus abweichen und stattdessen bei Ligandenbindung ihre Affinität zur erkannten Sequenz erhöhen oder als Aktivator wirken. LuxR, das wie das in Tabelle 1.1 genannte LuxT Teil des lux-operons ist, kann sowohl als Repressor als auch als Aktivator wirken 72. Mehrere Gene des Quorum Sensing in Vibrio harveyi stehen unter Kontrolle dieses Regulators, die Genexpression wird von LuxR dabei als direkter Aktivator gesteuert. Ebenso wie im homologen HapR, der Aktivator der Vibrio cholerae HA/Protease ist der genaue Mechanismus bisher unbekannt. Möglich wäre eine klassische Aktivierung durch Erhöhung der Affinität der RNA-Polymerase zur Promotor-Sequenz oder das Erzwingen einer Konformationsänderung der DNA. Auch durch Wechselwirkungen mit anderen Regulatoren könnte die Genexpression eingeleitet werden 67,72,73. Einen weiteren Sonderfall eines TetR-Regulators, zumindest im Hinblick auf bisher charakterisierte TetR-Regulatoren, stellt DesT aus Pseudomonas aeroginosa dar. Dieser Regulator kontrolliert die Expression einer Sauerstoff-abhängigen Acyl-Coenzym-A-Desaturase und kann mehrere strukturell ähnliche Moleküle binden und darauf mit unterschiedlicher Bindungsaffinität zur DNA reagieren. Während die allosterische Interaktion mit Palmityl-Coenzym A, dem Thioester von Coenzym A und der gesättigten Fettsäure Palmitinsäure, eine Derepression ähnlich der des Tetracyclin- Repressors bewirkt, führt die Bindung des entsprechenden Thioesters mit der ungesättigten Ölsäure zu einer erhöhten Affinität zum Operator. Die beiden Moleküle binden dabei in der gleichen Tasche in entgegengesetzten Orientierungen. DesT ist ein Beispiel dafür, dass Ein-Komponenten-Systeme nicht nur durch die Erkennung eines Liganden die zugehörige An-Aus-Reaktion ausführen können, sondern wie in diesem Fall indirekt auch in der Lage sind, die Konzentrationsverhältnisse der beiden Liganden zu messen Der Regulator SCO3201 Das Regulatorprotein SCO3201 aus Streptomyces coelicolor wurde als der TetR- Familie zugehörig identifiziert 75. In Streptomyces lividans existiert ein sehr nah verwandtes Protein, welches sich in nur drei Aminosäureresten unterscheidet. Eine Überexpression von SCO3201 führt in beiden Organismen zu einer stark verringerten 15

32 Einleitung Undecylprodigiosin- und Actinorhodin-Produktion. Der Effekt ist in S. coelicolor stärker zu beobachten, weil dieser Stamm eine generell höhere Syntheserate der Antibiotika aufweist, als sein Verwandter. Sowohl das aus Streptomyces coelicolor als auch das aus S. lividans stammende Protein unterdrücken zudem bei Überexpression die morphologische und metabolische Differenzierung in S. coelicolor, nicht aber die in S. lividans. Wie für viele regulatorische Systeme üblich, wurde auch für SCO3201 gezeigt, dass es mit der eigenen Promotorsequenz interagiert und seine eigene Expression herunterregelt. Auf Basis des sco3201-promotors wurde eine biotinylierte DNA-Sonde erstellt, die für Electrophoretic-Mobility-Shift-Assays (EMSA) verwendet wurde 5. Neben dem Beweis für die Anbindung des Proteins an seinen Promotor ergaben diese Experimente auch Hinweise auf eine Anbindung mehrerer SCO3201-Dimere an die Promotorregion. Die durch Formaldehyde Crosslinking vor DNase-Verdau geschützten Bereiche in der Promotorregion zeigen mehrere Palindrome auf, die weitere Bindungsstellen für SCO3201-Dimere darstellen könnten Dies ist, wie bereits erwähnt, auch beim TetR-Regulator QacR der Fall, bei dem eine Kokristallisation mit DNA-Fragmenten die kooperative Anbindung zweier Dimere des Regulators an der DNA bestätigte, deren Interaktionsflächen nur um eine halbe DNA-Windung verschoben sind (PDB-Code 1jt0). Das Formaldehyde Crosslinking erlaubte außerdem die Suche nach weiteren Bindungssequenzen, wodurch die Promotorregion von scba identifiziert wurde. Dieses Gen spielt eine Rolle in der Synthese von γ-butyrolacton und wird durch den Regulator ScbR positiv reguliert. Auch hier zeigten EMSA- Experimente die Bindungsfähigkeit von SCO3201, anschließende In-vivo-Experimente bestätigten die Interaktion mit dem scbr durch Herunterregeln der Expression nach 24 h, nicht aber nach 48 h. Schon hier zeigt sich, dass SCO3201 die Fähigkeit zur Bindung verschiedener DNA-Sequenzen besitzt, spätere Experimente der Arbeitsgruppe Virolle bestätigten insgesamt 16 verschiedene Zielsequenzen in S. coelicolor 5. Obwohl bei Überexpression deutliche Veränderungen auftreten, bewirkt eine Knock- Out-Mutante keine offensichtlichen phänotypischen Änderungen in Streptomyces coelicolor. Weil in Abwesenheit von SCO3201 auch keine erhöhte Actinorhodin- Produktion in S. lividans beobachtet wurde, scheint das Protein keinen übergeordneten Regulator für die Actinorhodin-Produktion darzustellen, auch wenn die Überexpression die Synthese unterdrückt. Die tatsächliche Funktion von SCO3201 ist also unbekannt, 16

33 Einleitung diese Arbeit soll durch die Charakterisierung und Strukturlösung ein besseres Verständnis des Repressors liefern. 2.6 Röntgenkristallographische Grundlagen Zur Aufklärung makromolekularer Strukturen stehen mehrere Methoden mit unterschiedlichen Anwendungsgebieten zur Verfügung. In dieser Arbeit wurden Strukturen mittels Kristallstrukturanalyse unter Verwendung von Röntgenstrahlen gelöst, bei der eine hochgeordnete dreidimensionale Anordnung von Proteinmolekülen zur Erzeugung von Röntgenbeugungsbildern verwendet wird, aus denen die Struktur der Proteinmoleküle bestimmt werden kann. Diese Methode kann Strukturen mit hoher Auflösung liefern und wird für den weitaus größten Teil der Strukturbestimmungen verwendet Kristallisation von Proteinen Die Herstellung von Proteinkristallen ist grundlegende Voraussetzung für die Durchführung der Kristallstrukturanalyse. Weil im Gegensatz zu niedermolekularen Substanzen die native Struktur durch Proteinaggregation und die dabei stattfindende Denaturierung des Proteins verloren gehen kann, müssen Bedingungen gefunden werden, in denen die spezifischen Interaktionen zwischen Proteinmolekülen gegenüber der unspezifischen Aggregation überwiegen 79. Das Protein wird dafür langsam soweit über seine Sättigungskonzentration gebracht, bis eine Kristallkeimbildung erfolgen kann, eine Aggregation jedoch noch nicht eintritt 80. Die Dampfdiffusion, bei der einer mit Fällungsmitteln versetzten Proteinlösung langsam das Lösungsmittel entzogen wird, ist hierfür eine elegante und bewährte Methode. Durch das Entfernen des Lösungsmittels steigt einerseits die Proteinkonzentration, andererseits sinkt seine Löslichkeit, weil auch die Konzentration der Fällungsmittel steigt. Kommt es dann zu einer Kristallkeimbildung anschließendem Kristallwachstum, sinkt durch diesen Prozess die Proteinkonzentration wieder, sodass selbst weiteres Konzentrieren des Fällungsmittels keine Aggregation hervorruft und die Proteinkonzentration stattdessen in einer metastabilen Zone verbleibt. Das Kristallwachstum erfolgt solange, bis die 17

34 Proteinkonzentration Einleitung Reaktionsgeschwindigkeiten des Kristallwachstums und der Auflösung des Kristalls identisch sind. Anschaulich kann der Prozess der Kristallisation aus untenstehender Abbildung entnommen werden. Präzipitandenkonzentration Abb. 2.6: Schematische Darstellung des Kristallisationsprozesses. Die Pfeile markieren die Änderung der Protein- und Präzipitanden-Konzentration im Laufe der Dampfdiffusion. Die Bedingungen, unter denen Proteinkristallisation eintritt sind für jedes Protein unterschiedlich und nicht jedes Protein lässt sich überhaupt als Wildtyp kristallisieren. Im Bereich der Structural Genomics können so nur etwa 10% der exprimierten Proteine zur Kristallisation in ausreichender Qualität gebracht werden 81. Die Suche nach geeigneten Bedingungen geschieht empirisch meist mit sogenanntem Sparse Matrix Sampling, bei denen mehrere Faktoren wie ph-wert, Art des Fällungsmittels, Art und Konzentration von Salzen und anderer Additive getestet werden, um initiale Kristallisationsbedingungen zu erhalten 82. Kommerzielle Kits sind erhältlich und erlauben dass Durchmustern einer Vielzahl von Kristallisationsbedingungen, welches auch automatisiert erfolgen kann 83. Anschließend können erfolgversprechende Bedingungen optimiert werden, um Verwachsungen der Kristalle zu vermeiden und ihr Volumen zu vergrößern. 18

35 Einleitung Röntgenbeugung an Proteinkristallen Die Verwendung von Röntgenlicht, bzw. Strahlung mit geringer Wellenlänge erlaubt die Aufklärung von Strukturen, deren Größe weit unter der Wellenlänge des sichtbaren Lichts liegt. Bei Einstrahlung von Röntgenlicht können die Photonen durch Interaktion mit der Elektronenhülle gebeugt werden. Wegen der Wahrscheinlichkeitsverteilung für den Aufenthaltsort eines Elektrons in der Elektronenhülle ist die Interaktion zwischen Elektron und Photon und die dadurch auftretende Streuung des Photons ein zufälliges Ereignis, das durch Atomgröße und Elektronenanzahl beeinflusst wird. Seinen mathematischen Ausdruck findet dieser Zusammenhang im atomaren Formfaktor fj. Dieser erklärt, warum leichte Atome und geringe Unterschiede in der Elektronenanzahl von Atomen erst bei hoher Auflösung sichtbar werden. Basierend auf der mittels Hartree-Fock-Methode näherungsweise berechneten Wellenfunktion kann der atomare Formfaktor durch die 9-Parameter-Gleichung von Cromer und Mann sehr genau für jeden Streuwinkel berechnet werden Kommt es zu einer Streuung an Atomen im Kristallgitter, interferieren die resultierenden Wellen gemäß dem Superpositionsprinzip miteinander. Die Art der Interferenz wird dabei durch den Atomabstand und durch die Wellenlänge des eingestrahlten Licht beeinflusst. Konstruktive Interferenz, die auf einem Detektor messbar ist, tritt nur bei Erfüllung der Bragg-Bedingung auf, die mit folgender Formel beschrieben werden kann und elastische Streuung voraussetzt. n λ = 2d sin (θ) Dabei steht n für eine natürliche Zahl, λ für die Wellenlänge des einfallenden und austretenden Lichts, d für den Gitterebenenabstand und θ für den Komplementärwinkel zwischen dem Lot auf die Gitterebenenschar und dem Röntgenlichtstrahl. Aus der Gleichung ergibt sich, dass konstruktive Interferenz des austretenden Lichts nur möglich ist, wenn der Einfallwinkel zu einer Wegdifferenz der Photonen führt, die genau einem ganzzahligen Vielfachen der Wellenlänge führt. Wegen der hohen Anzahl der Netzebenen entsteht statistisch bei jedem Einfallwinkel, der die Bragg-Bedingung nicht erfüllt, für jedes gebeugte Photon ein Photon, dessen Phase um 1/ λ verschoben ist und somit zu destruktiver Interferenz führt. Zudem wird bei Drehung des Kristalls die Bragg-Bedingung jeder Gitterebenschar auch für -θ erfüllt, sodass jeder Reflex ein 19

36 Einleitung zentrosymmetrisches Pendant hat, auch wenn die Einheitszelle des Kristallsystems diese Symmetrie nicht besitzt. Die beiden Reflexe haben dementsprechend die gleiche Intensität und werden als Friedelpaare bezeichnet 87. Durch diesen Zusammenhang lässt sich die Position der Reflexe auf dem Beugungsbild erklären, die Intensität der resultierenden gebeugten Welle ergibt sich aus der Addition aller beitragenden Partialwellen. Es ergibt sich für jeden beobachteten Reflex ein Strukturfaktor F hkl, der durch den zuvor erwähnten atomaren Formfaktor modifiziert wird: n F hkl = f j e 2πi(hx j+ky j +lz j ) j=1 Jedem beugenden Atom j wird also sein atomarer Formfaktor fj, seine durch die Miller- Indizes h, k und l definierte Gitterebene und seine fraktionellen Koordinaten in der Einheitszelle zugeordnet. Das Betragsquadrat des Strukturfaktors eines Reflexes entspricht dabei näherungsweise der Intensität dieses Reflexes, wenn experimentell bedingte Korrekturfaktoren außer Acht gelassen werden. Der Strukturfaktor kann als mathematischer Ausdruck der Röntgenbeugung betrachtet werden, bei dem der reale Raum der Struktur als reziproker Raum des Beugungsbildes abgebildet wird. Eine Fouriertransformation, die reziproken Raum in realen Raum umwandelt, erlaubt folglich die Berechnung der Elektronendichte an einem Punkt (x, y, z) aus dem Strukturfaktor. Dargestellt als Fourierreihe ergibt sich: ρ(xyz) = 1 V F hkl exp ( 2πi(hx j + ky j + lz j ) + iφ hkl h k l V beschreibt hier das Volumen der Elementarzelle. Als nicht experimentell bestimmbare Variable bleibt der Phasenwinkel φ der durch die Beugung erzeugten Partialwellen in der Gleichung, weil derzeitige Detektoren nur die Amplitude auftreffender Wellen messen können. Die erhaltenen Bildinformationen sind daher unvollständig, ein Umstand, der gemeinhin als das Phasenproblem bezeichnet wird. Aus den Beugungsbildern können ohne Phaseninformationen mit der Patterson- Methode direkt die Abstandsvektoren von Atomen erhalten werden, was die 20

37 Einleitung Berechnung von Patterson-Karten zulässt 88. In obenstehende Gleichung gehen die Strukturfaktoren dabei im Quadrat ein, der Phasenanteil entfällt. Atomabstände werden von einem gemeinsamen Ursprung aus dargestellt und die Karten sind, weil die Atome A und B zwei Vektoren, A-B und B-A erzeugen, immer zentrosymmetrisch. Wegen der großen Anzahl von Atomabständen in Makromolekülen ist eine Auswertung einer Patterson-Karte eines Makromoleküls nur begrenzt sinnvoll, allerdings ist sie sowohl für die ab-initio-strukturlösung, als auch für die Lösung per molekularem Ersatz von unschätzbarem Wert, da hier die Richtigkeit der Orientierung eines Modells in der Einheitszelle ohne Kenntnis von Phasenwinkeln überprüft werden kann Lösung des Phasenproblems Das Erhalten der Phasenwinkel für die Berechnung der Röntgendichte stellt eine der größten Hürden der derzeitigen Röntgenstrukturanalyse bei Makromolekülen dar. Während für kleine Moleküle Phasenwinkel über direkte Methoden berechnet werden können, steigt der Rechenaufwand mit zunehmender Molekülgröße exponentiell an, sodass direkte Berechnungen selbst mit modernen Rechnern für gewöhnlich nur bis zu einer Atomanzahl von ca. 200 durchführbar sind 89. Hohe Datenqualität und Auflösung verschieben diese Grenze etwas. Die Problematik fehlender oder fehlerhafter Phasen wird auch dadurch verstärkt, dass ihr Anteil an der Strukturinformation größer als der der Amplituden ist. So bleiben Elektronendichten in Datensätzen mit fehlerhaften Intensitäten zumindest interpretierbar, wohingegen dies bei fehlerhaften Phasen nicht der Fall ist. Die älteste Methode, Phasen von Makromolekül-Kristallen zu erhalten, stellt der Isomorphe Ersatz dar, der bereits für die Aufklärung von Myoglobin, der ersten Struktur eines Proteins, genutzt wurde 90. Der Zusatz von Schweratomen führt dabei zu einer Intensitätsdifferenz bei der Aufnahme eines Röntgenbeugungsdatensatzes zwischen Kristallen aus nativem Protein und Schwermetall-behandeltem Protein. Aus der Differenz kann eine Patterson-Karte berechnet werden, die nur die Schweratome in der Einheitszelle widerspiegelt. Weil die Anzahl dieser Atome überschaubar ist, kann die Position der Schweratome direkt bestimmt werden und somit der Strukturfaktorbeitrag 21

38 Einleitung der Schweratome errechnet werden. Grundvoraussetzung ist dabei, dass beide Kristallsysteme isomorph sind. Geht man von der Annahme aus, dass sich der Strukturfaktor des Schweratom-Derivates aus den Teilbeiträgen von Protein (P) und Schweratomen (H) zusammensetzt, gilt: F PH = F P + F H Die Bedeutung dieses Zusammenhangs für die Phasenbestimmung lässt sich mit der sogenannten Harker-Konstruktion veranschaulichen, die auf der Darstellung der Strukturfaktoren mit Argand-Diagrammen beruht (siehe Abb. 2.7) 91. I F P F PH F H α 1 α 2 R Abb. 2.7: Harker-Konstruktion aus den Argand-Diagrammen des F PH -Strukturfaktors (schwarz) und des F P -Strukturfaktors (blau). Der Strukturfaktorbeitrag F H der Schwermetalle ist in rot gekennzeichnet. Nur die zwei Phasenwinkel α 1 und α 2 des Strukturfaktors F P erfüllen die Konstruktion. Imaginäre Achse mit I, reale Achse mit R beschriftet. Wie aus der Abbildung ersichtlich, wird die obenstehende Gleichung, dass der Gesamt- Strukturfaktor die Summe des Proteinstrukturfaktors und des Schweratom- Strukturfaktors ist, nur unter Verwendung von zwei bestimmten Phasenwinkeln erfüllt. Die Unbestimmtheit der Phasenwinkel lässt sich so auf einen Bruchteil verringern, ist bei Einheitszellen, die mehrere tausend Atomen beinhalten allerdings immer noch groß. Erst der isomorphe Ersatz durch ein anderes Schweratom mit anderem Beitrag zum Gesamt-Strukturfaktor ergibt eindeutige Phasenwinkel und damit eine Strukturlösung. 22

39 Einleitung Das größte Hindernis dieser Methode ist der denaturierende Effekt vieler Schwermetalle, weshalb sie häufig nicht für die Strukturlösung unbekannter Proteine angewendet werden kann. Alternativ kann die anomale Streuung von Atomen zur Lösung des Phasenproblems genutzt werden. Dabei wird der Umstand ausgenutzt, dass Röntgenlicht bestimmter Wellenlängen durch die Anregung ihrer Elektronen von Atomen absorbiert wird. Der Anstieg des absorbierten Röntgenlichts in Abhängigkeit von der Wellenlänge ist dabei nicht kontinuierlich, sondern sprunghaft. Weil die Absorption eine Änderung des Phasenwinkels von +90 zur Folge hat, unabhängig in welchem Reflex eines Friedel- Paares, ändert sich der Beitrag der anomalen Streuer zum Strukturfaktor beider Reflexe dieses Friedel-Paares unterschiedlich. Die Folge ist eine Aufhebung von Friedels Gesetz und ein resultierender Unterschied in der Intensität der Reflexe. Aus dieser Differenz kann mit direkten Methoden die Position und der Phasenwinkel der anomal streuenden Atome ermittelt werden. Mithilfe dieser gelösten Substruktur können dann anlog zum isomorphen Ersatz die Phasenwinkel der anderen Strukturfaktoren bestimmt werden. Im Falle der in dieser Arbeit verwendeten single-wavelength anomalous diffraction können Phasenwinkel allerdings nur auf Basis der 90 -Phasen-Verschiebung der Teilstrukturfaktoren abgeschätzt werden, was für gewöhnlich noch keine interpretierbaren Elektronendichte-Karten erzeugt. Mit verschiedenen Methoden der density modification und der Extrapolation von Daten höherer als tatsächlich gemessener Auflösung, dem free lunch algorithm, können die Phaseninformationen allerdings soweit verbessert werden, dass die initiale Elektronendichtekarte für die Lösung der Struktur ausreicht Weil der anomale Anteil an der Streuung mit der Elektronenzahl der Atome zunimmt, werden üblicherweise möglichst schwere Atome als anomale Streuer verwendet. Eine einfache Methode, Schweratome an einer definierten Position im Kristall zu erhalten, ist der Einbau von Selenomethionin statt Methionin in die Polypeptidkette 95. Obwohl sich die chemischen Eigenschaften der Seitenketten unterscheiden und dies zu Problemen bei der Proteinexpression führen kann, kann so die Behandlung mit Schweratom-Salzen vermieden werden. Dies setzt natürlich voraus, dass die Primärstruktur des Proteins genügend Methionin-Reste enthält und diese in wohlgeordneten Bereichen der Struktur liegen. 23

40 Einleitung Die erhaltenen initialen Phasen können, wenn ihre Qualität ausreicht, für einen automatisierten Modellbau verwendet werden, um die Strukturlösung zu erleichtern. Gelingt dies nicht, ist das manuelle Erstellen des Modells ein genauerer, wenn auch langwierigerer Weg. Das Modell kann dann weiter verfeinert werden, um es besser an die experimentellen Daten anzupassen. Durch Überlegungen bezüglich realistischer Bindungslängen und -winkel, sowie das Einbeziehen von elektrostatischen Wechselwirkungen können dabei chemische Informationen ergänzt werden, die sich nicht aus den Beugungsbildern ableiten. Durch wiederholtes Abgleichen des Modells mit den experimentellen Daten und anschließendes Verbessern der Strukturparameter kann die in silico erzeugte Struktur iterativ verbessert und an die Realität der experimentellen Daten angenähert werden Temperaturfaktoren von Atomen im Kristallgitter Der Temperaturfaktor von Atomen, nach Peter Debye und Ivar Waller auch Debye- Waller-Faktor (DWF) genannt, beschreibt die Abhängigkeit der Intensität der am Kristallgitter gestreuten Strahlung von der Temperatur. Die Intensität der gestreuten Strahlung nimmt dabei mit zunehmender Temperatur ab, da dies mit einer stärkeren Auslenkung der Atome aus ihrer Ruhelage einhergeht. Der Debye-Waller-Faktor kann Werte zwischen 1, was dem theoretischen Fall von nicht-schwingenden Atomen entspricht, und 0 einnehmen, was einer unendlichen Auslenkung aus der Ruhelage entspricht. Für isotrope Auslenkungen gilt: DWF = e ( q2 u 2 ) 3 Die Variable q steht dabei für den Streuvektor an diesem Atom und u 2 für die mittlere quadratische Verschiebung des Atoms aus seiner Ruhelage 96,97. Da die Schwingungen in Molekülen durch kovalente Bindungen meist bestimmte Vorzugsrichtungen haben und Domänenbewegungen in Proteinen ebenfalls einen Effekt auf die resultierenden Schwingungen haben, ist die Annahme isotroper Temperaturfaktoren eine Vereinfachung. Hohe Auflösungen erlauben das Bestimmen von anisotropen Temperaturfaktoren, bei denen Schwingungen in den Raumdimensionen unabhängig voneinander berechnet werden. In Proteinen wird der Ausdruck B-Faktor verwendet, weil dieser hier stärker von Unterschieden in der Position einzelner Atome beeinflusst 24

41 Einleitung wird, und nicht nur das Resultat thermischer Schwingungen ist. Seine Höhe korreliert direkt mit der Auslenkung eines Atoms. Es gilt: B = 8π 2 u 2 Dementsprechend bedeutet ein B-Faktor von 80 Å 2 eine mittlere Auslenkung von 1 Å um seine Ruheposition. Weil er nicht nur durch die thermische Schwingung definiert ist, sondern gerade in Makromolekülen der Effekt der Auslenkung durch unterschiedliche Konformationen in verschiedenen Elementarzellen stark beiträgt, kann er als Referenz dafür dienen, wie flexibel die Struktur des Moleküls an dieser Position ist Kriterien zur Überprüfung der Modellqualität Die wichtigsten Faktoren, um die Kohärenz zwischen Modell und experimentellen Daten abschätzen zu können, sind dabei der R-Faktor und der freie R-Faktor. Für den R-Faktor gilt dabei folgender Zusammenhang: R = F obs F calc F obs Dabei Steht F obs für experimentell erhaltene Strukturfaktoren und F calc für die errechneten Strukturfaktoren des verwendeten Modells. Aus der Gleichung folgt, dass der R-Faktor zwischen 0 und 1 liegt. Das theoretische, in der Praxis niemals erreichte Minimum beträgt 0, wenn F obs und F calc identisch sind. Um falsche Modelle durch Überparametrisierung zu erkennen und zu vermeiden, wird zudem der freie R-Faktor berechnet. Die Formel ist dabei identisch, jedoch werden aus jedem Datensatz etwa 5 % der Reflexe von der Verfeinerung des Modells ausgenommen und zur Kontrolle verwendet. Dabei ist die absolute Anzahl der Reflexe möglichst so hoch zu wählen, dass der Einfluss zufälliger schlechter Reflexe minimiert wird. Der Vergleich von angepassten Daten zu unveränderten Daten lässt dann Rückschlüsse auf die Qualität des Modells zu. Üblicherweise wird für makromolekulare Strukturen nach Abschluss des Verfeinerungsprozesses ein freier R-Faktor von unter 0,3 erreicht. 25

42 Einleitung Ein weiteres Kriterium für die Übereinstimmung von experimentellen Daten und Modell ist die Figure of Merit m, bei der für jeden Reflex die Abweichung vom erwarteten Phasenwinkel berechnet wird. Dabei gilt: m = cos(α α best ) Wobei α für den verwendeten Phasenwinkel und α best für den erwarteten Phasenwinkel steht. Das Ergebnis kann Werte zwischen 0 und 1 annehmen, wobei ein Wert von 1 bedeutet, dass der Phasenwinkel des Strukturfaktors dem erwarteten Phasenwinkel entspricht. Die Figure of Merit wird als Gewichtungsfaktor für Strukturfaktoren verwendet, da dies das Rauschen in Elektronendichtekarten minimieren kann 98. Neben diesen Kriterien, die direkt die Konvergenz des erstellten Modells mit den gemessenen Daten überprüfen, kann die Struktur auch anhand empirisch ermittelter Optima bezüglich der Molekülgeometrie überprüft werden. Dabei wird die root mean square deviation (rmsd) als Maß der Abweichung von optimalen Bindungslängen und -winkeln verwendet. Die automatisierte Überprüfung von Strukturmodellen bezieht üblicherweise auch die Ramachandran-Winkel und die Nähe von Atomen zueinander mit ein 99,100. Hierbei ist zu beachten, dass die Optima, bzw. erlaubten Bindungsparameter anhand bereits bekannter Strukturen ermittelt wurden und daher ungewöhnliche Geometrien zwar selten, aber keinesfalls verboten sind. Im Gegenteil, sind diese Abweichungen durch die experimentellen Daten belegt, haben sie oft biologische Relevanz und ein Erzwingen idealisierter Parameter würde diese Information durch falsche Interpretation verloren gehen lassen. 26

43 Ergebnisse 3 Ergebnisse Als Voraussetzung für die Charakterisierung der Struktur und Funktion von SCO3201 war es zunächst nötig, das Protein in größeren Mengen und großer Reinheit zu gewinnen. In früheren Arbeiten der Arbeitsgruppe um Marie Joelle Virolle gelang es bereits, das für SCO3201 kodierende Gen aus dem Genom von S. coelicolor zu isolieren. Dieses Gen wurde auf einem pet22b-vektor bereitgestellt und von Stefan Schindler im Rahmen einer Diplomarbeit in E. coli C41 transformiert und erfolgreich überexprimiert, ein Protokoll für Expressionskulturen stand deshalb bereits zur Verfügung. Der offene Leserahmen des Gens wurde durch eine C-terminale Hexa- Histidin-Sequenz ergänzt, die die spätere Reinigung des Proteins erleichtern sollte. Eine einmalige Kristallisation des mittels Metallionen-Affinitätschromatographie gereinigten Wildtyps von SCO3201 in 96-Well-Platten gelang ebenfalls, ließ sich jedoch zu diesem Zeitpunkt nicht reproduzieren. Zur Verbesserung der Proteinreinheit sollte deshalb zu Beginn dieser Arbeit ein weiterer Reinigungsschritt etabliert werden. Dies führte in der Tat zur erfolgreichen Kristallisation, die jedoch keinerlei auswertbare Röntgenbeugungsexperimente zuließ. Nach einem Klonierungsexperiment, das zur Expression eines N-terminal um 20 Aminosäurereste verkürzten Proteins führte, konnten schließlich ausreichend gute Kristalle erzeugt werden. Durch die gering ausgeprägte Verwandtschaft zu anderen, bekannten TetR-Regulatoren gelang eine Strukturaufklärung mittels molekularen Ersatzes jedoch nicht. Erst mithilfe einer Substruktur aus eingebauten Schweratomen konnte das Phasenproblem gelöst werden. Es gelang die Aufklärung von Strukturen des teilinduziertem Proteins und seiner Apo- Form. SCO3201 besteht wie seine Verwandten aus einer regulatorischen Domäne und einer DNA-bindenden Domäne, die durch das charakteristische HTH-Motiv gekennzeichnet ist. Die teilinduzierte Struktur (In der PDB als 4cgr abgelegt) besteht dabei aus einem Heterodimer, in dem ein Monomer ein unbekanntes Molekül gebunden hat und im Vergleich mit dem anderen Monomer eine deutlich veränderte Konformation seiner DNA-bindenden Domäne aufweist. Die Apo-Form, die als 5efy in der PDB abgelegt wurde, bildet dagegen ein Homodimer, in dem das Herausbiegen der DNAbindenden Domäne nicht beobachtbar ist. 27

44 Ergebnisse DNA-bindende Domäne Regulatorische Domäne Abb. 3.1: Überlagerung der Strukturen 4cgr (blau) und 5efy (rot). Die regulatorischen Rumpfdomänen sind in beiden Strukturen sehr ähnlich, während die DNA-bindenden Motive abhängig vom Induktionszustand unterschiedliche Konformationen einnehmen können. Weiterhin wurde mit einer von Dr. Martha Brennich (European Synchrotron Radiation Facility, ESRF) durchgeführte Kleinwinkel-Streuung die Struktur von SCO3201 in Lösung bestimmt. Zudem konnte aus der Struktur von 4cgr entnommen werden, dass SCO3201 ein ungewöhnliches HTH-Motiv besitzt, dessen N-terminale Helix länger als bei verwandten Regulatoren ist. Der Einfluss dieser Helix auf die Operatorerkennung wurde mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay untersucht und es konnte gezeigt werden, dass SCO3201 zur Bindung zweier benachbarter Sequenzmotive fähig ist. Zwei Dimere von SCO3201 können wegen ihrer N-terminalen Helix dieses Operatorenpaar binden, auch wenn eine der palindromischen Sequenzen nur zur Hälfte vorhanden ist. 28

45 3.2 Expression und Reinigung von SCO3201 in E. coli C Expression und Reinigung des Wildtyps Ergebnisse Die Expression erfolgte wie im Methodenteil beschrieben. Unter Standardbedingungen ließen sich Ausbeuten von mg Protein je Liter Kulturlösung erzielen. Weil außerdem keine Inclusion-Body-Bildung beobachtet sichtbar war, wurden sie nicht weiter optimiert. Die Reinigung erfolgte im ersten Schritt mittels Metallionen- Affinitätschromatographie, die durch die gute Überexpression bereits große Mengen des Proteins lieferte (siehe Abb. 3.2). Allerdings eluierten mehrere Fremdproteine zusammen mit dem Zielprotein, was sich durch Variation des Protokolls nicht verhindern ließ und einen zweiten Reinigungsschritt nötig machte. M kda 45 kda 27 kda 14 kda Abb. 3.2: SDS-Polyacrylamidgel von SCO3201 nach IMAC-Reinigung; M: Marker mit beschrifteten Größen in kda, 1: SCO3201; 2: SCO3201 in zehnfacher Verd.; 3: SCO3201 in 100-facher Verdünnung. Da die Gelfiltration zunächst durch Aggregation des Proteins nicht erfolgreich war, wurden verschiedene Puffer getestet, indem 1 mg/ml Protein zugesetzt und die Proteinkonzentration am Anfang und nach 24 h kontrolliert wurde. Vor beiden Messungen wurden die Proben 15 min bei g zentrifugiert, um ausgefallenes Protein vor der anschließenden Konzentrationsbestimmung abzutrennen. Beim letztlich verwendeten GF-Puffer 1 (Zusammensetzung siehe Materialienteil) nahm die Proteinkonzentration nicht ab. 29

46 Ergebnisse Die Gelfiltration wurde wie im Methodenteil beschrieben mittels ÄKTAprime FPLC- Anlage durchgeführt. Es kam eine Superdex75-Säule zum Einsatz, deren Trennleistung mit 3 70 kda der Größe des Proteins angemessen war. Bei der Etablierung der Reinigungsprozedur wurden die Fraktionen mittels SDS-PAGE auf ihre Proteinzusammensetzung kontrolliert, in späteren Durchführungen wurde darauf verzichtet und die verwendeten Fraktionen anhand der Absorption bei 280 nm ausgewählt. M A12 B12 B11 B10 B9 B8 B7 B6 B5 65 kda 45 kda 27 kda SCO kda Abb. 3.3: SDS-Polyacrylamidgel der Fraktionen der Gelfiltrationen von SCO3201, M: Marker; Fraktionen entsprechend der Benennung in der log-datei der ÄKTAprime. Wie aus Abbildung 3.3 ersichtlich, konnten die großen Proteine durch die Gelfiltration abgetrennt werden und somit alle Fremdproteine bis auf Spuren von SCO3201 entfernt werden. Das Protein eluierte mit einem kleinen Retentionsvolumen von ca. 50 ml (siehe Abb. 3.4). Dies deutet auf eine Dimerisierung von SCO3201 in Lösung hin, was hinsichtlich der Eigenschaft, an einer palindromischen DNA-Sequenz zu binden, plausibel erscheint. Der Oligomerisierungszustand wurde in späteren Experimenten überprüft. 30

47 Ergebnisse Abb. 3.4: Chromatogramm der Gelfiltration. Der blaue Graph stellt die Absorption bei 280 nm dar. Fraktionen sind in rot auf der X-Achse beschriftet. Die Fraktionen B8 bis einschließlich B5 wurden gesammelt und mittels Ultrafiltrationseinheit auf eine Proteinkonzentration von mg/ml gebracht. Nachdem überprüft wurde, dass keine Proteinaggregation durch einmaliges Einfrieren und Auftauen stattfand, wurden Aliquots zu je 50 µl bei -80 C gelagert Herstellung und Reinigung der Varianten von SCO3201 Die ersten 20 Aminosäurereste von SCO3201 bestehen aus einer Prolin- und Glycinreichen Sequenz, von der angenommen werden kann, dass sie keine geordnete Sekundärstruktur ausbildet. Um die Kristallisationseigenschaften zu verbessern, wurde diese Sequenz deshalb mittels Klonierung auf DNA-Ebene entfernt. Der verwendete Vektor kodierte außerdem einen Hexa-His-Tag am Anfang des offenen Leserahmens. Da dieser ohne gebundenes Metallion ebenfalls ungeordnet vorliegt und die Kristallisation in ähnlicher Weise wie die natürliche Prolin-reiche Sequenz gestört hätte, wurde nach ihm eine TEV-Protease-Schnittstelle eingefügt, mit der bei der Reinigung die Histidin-Reste abgeschnitten werden konnten und das Protein somit um 20 Aminosäurereste verkürzt wurde. Der am C-Terminus befindliche Hexa-His-Tag war für die Reinigung des Proteins nicht mehr nötig, daher wurde der offene Leserahmen von sco3201 an derselben Stelle beendet, wie im von S. coelicolor exprimierten 31

48 Ergebnisse Wildtyp. Untenstehend sind beide Sequenzen dargestellt, Prolin-Reste sind rot markiert, die TEV-Protease-Schnittstelle in blau (Peptidspaltung bei Schrägstrich). (M)VSSTIPALPGPEPGPGPGPAGPVSLTERRKAETR (M)GSSHHHHHHENLYFQG/HMVSLTERRKAETR Mit entsprechenden Primer-Oligonukleotiden und dem isolierten Plasmid als Template- DNA wurde entsprechend der im Methodenteil beschriebenen Protokolle die SCO3201- Variante erzeugt, die nachfolgend als SCO3201-H20 bezeichnet wird. Weil die Expression des Wildtyps von SCO3201 in E. coli C41 problemlos ablief und gute Ausbeuten lieferte, wurde auch die H20-Variante in diesen Expressionsstamm transformiert. Die Expression geschah nach dem gleichen Protokoll wie zuvor und lieferte wieder eine sehr gute Überexpression und eine Proteinausbeute von etwa 100 mg/l Zellkulturlösung. M bp bp bp bp Abb.3.5: Kontrolle der Transformation mittels Agarose-Gelelektrophorese; alle getesteten Kolonien trugen das SCO3201-Gen, abgebildet sind nur Proben der ersten vier Kolonien, bei denen Banden der entsprechenden Größe (660 bp) sichtbar waren. 32

49 Ergebnisse Die später für den EMSA benötigte H33-Variante, bei der die ersten 33 Aminosäurereste entfernt wurden, wurde nach den gleichen Protokollen mit entsprechenden Primern erzeugt. Da auch hier eine TEV-Protease-Schnittstelle zur Entfernung des His-Tags eingebaut wurde, besitzt auch diese Variante nach der Reinigung einen N-terminalen Histidinrest. Für den ersten Schritt der Reinigung, der Metallionen-Affinitätschromatographie, wurde das Protokoll des unveränderten Proteins übernommen. Nach der Affinitätschromatographie wurde die Proteinlösung mit 1 ml einer TEV-Protease- Lösung versetzt (1,5 mg/ml) und die Probe anschließend bei 4 C gelagert, bis eine zufriedenstellende Peptidspaltung erfolgt war. Die damit verbundene verringerte Hydrolyse-Rate der Protease wurde in Kauf genommen, um Aggregation von SCO3201 minimal zu halten. M kda 45 kda 27 kda SCO His-Tag SCO3201 geschnitten 14 kda Abb.3.6: Auftragung von SCO3201-Proben nach IMAC und 48 h Verdau durch die TEV-Protease; M: Marker; 1 u. 2: Proteinproben mit deutlich sichtbaren Doppelbanden Nach der Proteolyse wurde ebenfalls eine Gelfiltration durchgeführt, die nun auch zur Abtrennung der Oligopeptide und der TEV-Protease diente. Da die Veränderung des N- Terminus größere Auswirkungen auf die Proteineigenschaften als gedacht hatte und es bei der Gelfiltration zur Aggregation kam, musste der zuvor verwendete GF-Puffer 33

50 mau (280 nm) mau (471 nm) Ergebnisse verändert werden. Nach erneuter Optimierung des Puffers in gleicher Weise wie zuvor, gelang die Reinigung des Proteins mit dem GF-Puffer 2 (siehe Material u. Methoden), bei dem der ph-wert um eine Einheit von 7 auf 8 erhöht und auf den Zusatz von Imidazol verzichtet wurde. 3.3 Bestimmung des Oligomerisierungszustands von SCO3201 Das mittels IMAC gereinigte Protein wurde auch für die Bestimmung des Oligomerisierungszustands verwendet. Wegen der Zugehörigkeit zur TetR-Familie und seiner Fähigkeit, an palindromische Sequenzen zu binden, konnte eine stabile Dimerisierung vermutet werden, die unabhängig von der Anbindung an die DNA auch in Lösung besteht. Dies ließ sich mittels Gelfiltration bestätigen. 1 ml einer verdünnte Proteinlösung (Proteinkonzentration ca. 200 nmol/ml) wurde für den Versuch mit 40 µl GFP-Lösung (Proteinkonzentration ca. 100 nmol/ml) versetzt. Anschließend wurde eine Gelfiltration mit der Superdex 75 Gelfiltrationssäule bei einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt (siehe Abb. 3.7). Die Trennleistung lag wie zuvor bei der präparativen Gelfiltration zwischen 3 kda und 70 kda. In der Gelfiltration liegt GFP (27 kda) als Monomer vor und sollte die gleiche Retentionszeit wie SCO3201 (26,5 kda mit C-terminalem Hexa-His-Tag) in monomerisierter Form besitzen. Die schnellere Elution von SCO3201 (B in Abb. 3.7) zeigte die erwartete Dimerisierung an, da eine höhere Oligomerisierung die Trennleistung der gewählten Säule überschritten hätte und SCO3201 in diesem Fall ohne Retention zusammen mit den schweren Proteinen (A in Abb. 3.7) eluiert wäre C B A ml A(280 nm) A (471 nm) Abb.3.7: Chromatogramm der Gelfiltration zur Bestimmung des Oligomerisierungszustands von SCO3201; blau: Absorption bei 280 nm; rot: Absorption bei 471 nm. A: unbekannte Fremdproteine, siehe Abb. 3.3; B: SCO3201; C: GFP. 34

51 lg (MW) Ergebnisse Wie in Abbildung 3.7 zu erkennen, hat GFP ein deutlich erhöhtes Retentionsvolumen (C in Abb. 3.7). Die Emission von Fluoreszenzstrahlung mit 510 nm Wellenlänge wird durch ein Absorptionsmaximum bei 471 nm bewirkt, welches vorher photometrisch bestimmt wurde. Durch die gleichzeitige Detektion der Absorption bei 280 nm und 471 nm konnten die Peaks dem entsprechenden Protein zugeordnet werden, wobei die vordere Schulter des 280-nm-Graphen den Proteinverunreinigungen entspricht, die in präparativen Gelfiltrationen (siehe Abb. 3.4) abgetrennt wurden. Hier erfolgte wegen der höheren Flussrate keine saubere Trennung. Dass diese Proteine einen höheren Oligomerisierungszustand darstellen, konnte durch die SDS-PAGE ausgeschlossen werden, in der ihre Masse mit ca. 60 kda und 70 kda bestimmt wurden (siehe Abb. 3.3) Eine Kalibrierkurve (siehe Abb. 3.8) mit den Proteinen BSA (als Dimer und als Monomer), Ovalbumin, GFP und Lysozym erlaubt zusätzlich die Berechnung der molekularen Masse aus der Retentionszeit und führt zu einer berechneten Masse von 50 kda, was den tatsächlichen 53 kda des Dimers sehr nahe kommt und im Genauigkeitsbereich der Kalibrierkurve liegt. 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 BSA-Dimer BSA-Monomer Ovalbumin GFP y = -0,0187x + 2,8964 R² = 0,9309 Lysozym Volumen [ml] Abb. 3.8: Kalibriergerade für das Retentionsvolumen in Abhängigkeit von der Molekülmasse. Proteine aus laboreigener Herstellung. BSA-Monomer: 66 kda, Ovalbumin: 43 kda, GFP: 27 kda, Lysozym: 14 kda. 35

52 Ergebnisse 3.4 Kristallisation von SCO Kristallisation des Wildtyps Mittels Sitting-Drop-Methode wurden Kristallisationsbedingungen in Tropfen von je 0,6 µl getestet. Wegen der großen Zahl der Bedingungen sind 96-Well-Platten nicht manuell, sondern mit Pipettierroboter und vorgefertigten Kristallisationslösungen angefertigt worden. Nach etwa einer Woche wuchsen nadelförmige Kristalle in einer der Kammern bei 13 % PEG 8.000, 200 mm LiCl, 50 mm MgSO 4 und 100 mm HEPES (ph 7,5). Diese Bedingung wurde in 24-Well-Platten übertragen und das Kristallwachstum ließ sich mit 4 µl Tropfenvolumen reproduzierbar durchführen (s. Abb. 3.9). Diese Bedingungen sollten optimiert werden, um statt der dünnen Nadeln Kristalle mit größerem Volumen zu erhalten, die für Röntgenbeugungsexperimente geeigneter sind. Dies gelang allerdings nicht und Beugungsexperimente mit den Kristallen waren ebenfalls erfolglos. Die Arbeit am Wildtyp des Proteins mit dem Ziel der Strukturaufklärung wurde deshalb aufgegeben. Abb.3.9: SCO3201-Kristalle aus Hanging-Drop-Platten. Die Nadeln sind etwa 100 µm lang und wenige µm dick. 36

53 Ergebnisse Kristallisation von SCO3201-H20 Wie zuvor wurden initiale Screenings der verkürzten SCO3201-Variante mittels Pipettierroboter auf 96-Well-Platten durchgeführt. Innerhalb von 48 h konnten in mehreren Bedingungen Kristallwachstum beobachtet werden. Den Bedingungen war ein leicht saurer ph-wert von 5 5,5 gemein und die meisten enthielten 0,2 M bis 1 M (NH 4 )H 2 PO 4. Im Gegensatz zum unmodifizierten Protein war das Volumen der Kristalle weitaus größer, sodass diese Erfolg bei Röntgenbeugungsexperimenten versprachen. Wie zuvor wurden 24-Well-Platten für die Optimierung der Kristallisation verwendet und letztendlich ergaben sich optimale Kristallisationsbedingungen unter Verwendung von 0,1 M (NH 4 )H 2 PO 4 und 0,1 M 0,5 M Natriumcitrat bei einem ph- Wert von 5. Dabei wurde die Kristallisationslösung im Verhältnis 1:2 mit der Proteinlösung vermischt und in Tropfen zu je 4 µl im Hanging-Drop-Verfahren inkubiert. Nach 48 h waren die Kristalle zu akzeptabler Größe herangewachsen. Die Kristalle erreichten bei abgeschlossenem Wachstum ein weitaus größeres Volumen als vor der Modifikation, allerdings zeigten sich deutliche trichterförmige Vertiefungen (siehe Abb. 3.10) an gegenüberliegenden Enden der Kristalle, sodass für Beugungsexperimente der Kristall möglichst in der Mitte bestrahlt wurde. Die Vertiefungen könnten auch der Grund für Eisringe auf den späteren Beugungsbildern sein, da sie sich nur sehr schwer von der Mutterlauge befreien ließen, ohne den Kristall zu beschädigen. Generell waren die Kristalle selbst für Proteinkristalle sehr fragil, da die Spitzen sehr dünn waren und damit leicht brachen. Abb.3.10: SCO3201-Kristalle. Die trichterförmigen Einmündungen weisen auf unterschiedliche Wachstumsgeschwindigkeiten der Kristallflächen hin. 37

54 Ergebnisse Kristallisation von SCO3201-H20 bei ph 8,5 Im Laufe der Arbeit mit dem Protein gelang ebenfalls eine Kristallisation von SCO3201 in 10 % bis 15 % Ethanol und 0,1 M Tris/HCl bei einem ph-wert von 8,5. Neben den deutlich veränderten Bedingungen und weitaus längerem Kristallwachstum im Vergleich zu vorher verwendeten Kristallen war auch ihre Form verändert, was erste Hinweise auf eine Kristallisation in einer anderen Raumgruppe lieferte. Die Kristalle hatten zudem ein deutlich kleineres Volumen als die Kristalle in sauren Bedingungen. Auch sie wurden für Röntgenbeugungsexperimente verwendet und lieferten schließlich die Struktur der Apo-Form von SCO3201. Abb. 3.11: SCO3201-Kristalle bei ph 8, Kristallstrukturanalyse von SCO3201 in der Raumgruppe P Aufnahme eines Datensatzes mit kristallisiertem SCO3201-H20 Für die Röntgenstrukturanalyse wurden Kristalle auf 100 K gekühlt, um die Reaktivität von Radikalen zu verringern, die durch die Röntgenstrahlung erzeugt wurden. Um starke Eisringe auf den Beugungsbildern zu verhindern, wurde der Kristall in einer Kryolösung gewaschen, die neben den Bestandteilen der Kristallisationslösung auch 30 % PEG 400 enthielt. In späteren Beugungsexperimenten wurde stattdessen Paraffinöl verwendet, da der Kristall so augenscheinlich weniger Schaden nahm. Andererseits 38

55 Ergebnisse ergaben sich besonders bei der Verwendung des hydrophoben Paraffinöls Probleme mit den Vertiefungen des Kristalls, da die wässrige Kristallisationslösung dort nur schwer zu entfernen war und einige Kristalle verworfen werden mussten, weil die Erlangung von verwertbaren Beugungsbildern ohne Eisringe schier unmöglich war. Der Kristall wurde mit Cu-K α -Strahlung (1,5418 Å Wellenlänge) bestrahlt und Beugungsbilder auf einem Rigaku-Saturn-92-Detektor aufgenommen. Eine Zusammenfassung der Datensammlung ist in Tabelle 3.1 zu finden. Tabellen 3.1: Zusammenfassung der Datensammlung von 32831D4, Werte im Klammern für die höchste Auflösungsschale. Die Raumgruppe konnte erst nach der Strukturlösung durch SAD bestimmt werden. Vm und Lösungsmittelanteil sind für 2 Monomere in der asymmetrischen Einheit angegeben. Name des Datensatzes 2831D4 Kristallisationsbedingungen 0,1 M (NH 4 )H 2 PO 4 ; 0,1 M Natriumcitrat; ph 5 Röntgenquelle MicroMax 007 (Cu-K α ) Wellenlänge in Å 1,5418 Detektor Lauegruppe Saturn92 CCD, Rigaku mmm Raumgruppe P Zellparameter in Å, a; b; c 53,25; 79,09; 94,35 Auflösungsbereich in Å 94,62 2,64 (2,78 2,64) Unabhängige Reflexe (1.744) Redundanz 6,3 Vollständigkeit 99,3 I /σ(i) 10 (2,3) Vm in Å 3 /Da 2,26 Lösungsmittelanteil in % 44,7 % Mosaizität in 0,9 Die Berechnung des Matthews-Koeffizienten, mit dem die Wahrscheinlichkeit für die Anzahl an Monomeren pro asymmetrischer Einheit auf Basis des Lösungsmittelanteils bereits gelöster Strukturen abgeschätzt werden kann, legt deutlich das Vorhandensein von zwei Monomeren in der asymmetrischen Einheit nahe. Weniger oder mehr 39

56 Ergebnisse Monomere führen zu unrealistischen Lösungsmittelanteilen 101,102. Dies war einerseits eine wichtige Information für die verschiedenen Methoden zur Lösung des Phasenproblems, andererseits vor dem Hintergrund der Heterodimer-Bildung nicht überraschend. Zunächst sollte die Struktur von SCO3201 mithilfe der Molecular-Replacement- Methode (MR-Methode) gelöst werden. Dazu wurden die NCBI GenBank nach Proteinen durchsucht, deren Gensequenz der von SCO3201 möglichst ähnlich ist. Obwohl sich dabei zeigte, dass viele offene Leserahmen eine sehr hohe Identität von 70 bis 90 % zum Gen von SCO3201 aufweisen, waren keine Strukturen mit wenigstens 30 % Identität verfügbar. Von dem ebenfalls zur TetR-Klasse gehörenden Protein SCO0332 war bereits eine Struktur bekannt und es besitzt eine Identität von 33 % im Bereich der DNA-bindenden Domäne 103. Da die Faltung dieser Domäne innerhalb der Proteinklasse zudem hochkonserviert ist, wurden mangels Alternativen MR- Berechnungen mit diesem Modell durchgeführt. Dies war nicht erfolgreich und auch das schrittweise Verkürzen des Modells, um falsche Informationen zu entfernen, brachte keine verwendbaren Phaseninformationen. Der Versuch, die Struktur von SCO3201 mittels MR zu lösen, wurde deshalb aufgegeben. Da die Verwendung von bereits bekannten Phasen keine Option war, sollten nun Phasen ab initio generiert werden. Für den isomorphen Ersatz mit Iodid (SIRAS, single isomorphous replacement with anomalous scattering) stand die geeignete Strahlenquelle bereits zur Verfügung. Die Methode erfordert keine Modifikation des Proteins und sollte deshalb zuerst angewendet werden. Dabei wird ausgenutzt, dass der imaginäre Anteil f des anomalen Streufaktors von Iodid-Ionen bei einer Wellenlänge von 1,54 Å bereits sehr groß ist und deshalb zur Gewinnung initialer Phaseninformation über die Position der Iodid-Ionen benutzt werden kann. Es wurde ein Proteinkristall mit einigen µl der Kryoschutz-Lösung gewaschen, in der zuvor ein kleiner Kaliumiodid-Kristall aufgelöst wurde. Der so behandelte Proteinkristall sollte für die Aufnahme eines Datensatzes verwendet werden. Da der Zusatz von Iodid-Ionen den Kristall zusätzlich zu schädigen schien, ließen sich keine Beugungsbilder aufnehmen, die eine Auflösung von unter 3,5 Å besaßen. Weil der anomale Streuanteil mit steigender Auflösung durch den schnelleren Abfall der Intensität der klassischen Streuung relativ zunimmt, wird eine Auswertung mit 40

57 Ergebnisse schlechterer Auflösung schwerer. Obwohl eine Strukturanalyse mit SIRAS bei einer Auflösung von 3,5 Å prinzipiell möglich ist und erfolgreiche Experimente dokumentiert sind, gelang sie in diesem Fall nicht 104. Eine Verbesserung der Kristallqualität und der Beugungsbilder ließ sich auch mit Veränderung von Iodid-Menge, Inkubationszeit und Zusammensetzung der Kryo-Lösung nicht erreichen, daher wurde auch dieser Ansatz aufgegeben. Statt nach geeigneten anderen Schweratomzusätzen zu suchen, sollte der schonendere Einbau von Selenomethionin verwendet werden, da hier auf den Zusatz von potenziell denaturierenden Agenzien verzichtet werden konnte Austausch von Methionin gegen Selenomethionin Mittels Single Anomalous Dispersion, dem Ausnutzen der anomalen Streuung von Atomen, sollte die Struktur von SCO3201 über die Substruktur von eingebauten Schweratomen in die Aminosäurereste M22, M35 und M166 gelöst werden. Dies wurde direkt im Methionin-prototrophen C41-Stamm durch die Inhibierung der Aspartokinase und die Zugabe von Selenomethionin durchgeführt (siehe Materialen und Methoden) 105. Die Reinigung musste nicht angepasst werden. Alle Puffer wurden lediglich mit 1 mm DTT versetzt, um die Oxidation der Methylselenyl-Gruppe zu minimieren. Höhere DTT-Konzentrationen wurden vermieden, um die Kapazität der IMAC-Säule und damit die Proteinausbeute durch die Inkompatibilität der Nickel-NTA-Matrix mit DTT nicht zu verringern. Die Gelfiltration wurde unverändert durchgeführt. Auch die Kristallisationsbedingungen änderten sich wegen der geringen Änderung der chemischen Eigenschaften des Proteins nicht Strukturlösung mittels Single Anomalous Dispersion (SAD) Wegen des in der Einleitung beschriebenen Zusammenhangs zwischen eingestrahlter Wellenlänge und der Erfüllung des Friedelschem Gesetzes mussten die Proteinkristalle mit Röntgenlicht bestrahlt werden, dessen Wellenlänge der Absorptionskante von Selen-Atomen entspricht. Messungen wurden deswegen am Elektronenspeicherring BESSY II in Berlin durchgeführt, weil dort Synchrotronstrahlung mit gewünschter Wellenlänge und hoher Intensität genutzt werden kann. Oftmals führt die hohe Intensität 41

58 Ergebnisse auch zu einer Verbesserung der Auflösung, was bei Ausnutzung anomaler Streuung besonders nützlich ist. Nachdem die Strahlenquelle auf 0,97957 Å eingestellt und optimiert wurde, konnte ein Datensatz mit einem geeigneten Kristall bis zu einer Auflösung von 2,1 Å aufgenommen werden (2894D3 Peak). Zusätzlich wurde ein Datensatz bei einer Wellenlänge von 0,97549 Å aufgenommen, mit dem später die Verfeinerung durchgeführt wurde (2894D3 hrem). Die Daten wurden vor Ort mit XDSAPP prozessiert und mit SHELXC/D/E konnte die Substruktur der Selen-Atome bestimmt werden Eine Zusammenfassung der Datenaufnahme ist Tabelle 3.2 zu entnehmen. Tab. 3.2: Zusammenfassung der Datensammlungen von 2894D3 Peak und 2894D3 hrem. Werte im Klammern für die höchste Auflösungsschale. Durch die gelöste Struktur konnte der Matthews-Koeffizient genauer berechnet werden und liefert hier genauere Werte, die für 2 Monomere in der asymmetrischen Einheit angegeben sind. Name des Datensatzes 2894D3 Peak 2894D3 hrem Kristallisationsbedingungen 0,1 M (NH 4 )H 2 PO 4 ; 0,3 M Natriumcitrat; ph 5 0,1 M (NH 4 )H 2 PO 4 ; 0,3 M Natriumcitrat; ph 5 Röntgenquelle BESSY II, BL14.1 BESSY II, BL14.1 Wellenlänge in Å 0, ,97957 Detektor PILATUS 6M PILATUS 6M Lauegruppe mmm mmm Raumgruppe P P Zellparameter in Å, a; b; c 54,68; 79,63; 95,98 54,68; 79,63; 95,98 Auflösungsbereich in Å 61,3 2,2 (2,21 2,2) 61,3 2,1 (2,21 2,1) Unabhängige Reflexe (3.135) (3.607) Redundanz 5,5 5,5 Vollständigkeit 99,9 99,8 I /σ(i ) 10,4 (2,2) 12,1 (2) Wilson B-Faktor in Å 2 49,2 52,2 Vm in Å3/Da 2,49 2,49 Lösungsmittelanteil in % 50,7 % 50,7 % Mosaizität in 1,2 1,2 42

59 Ergebnisse Wie sich zeigte, konnten sinnvolle Phasen unter Verwendung von 5 Selen-Atomen pro asymmetrischer Einheit erzeugt werden, was bei der Annahme von zwei Monomeren in der asymmetrischen Einheit die Vermutung nahelegte, dass eines dieser Monomere einen kristallographisch sichtbaren M22-Aminosäurerest, und damit einen sichtbaren N- Terminus besaß. In der 2Fo-Fc-Karte des korrekten Enantiomorphs waren neben den sphärischen Elektronendichten der Selen-Atome, deren Position mittels Superposition mit einer anomalen Fo-Karte-Elektronendichtekarte zweifelsfrei festgelegt werden konnte, auch helixartige Elektronendichten zu erkennen, die für erste Modeling-Schritte verwendet werden konnten. In Abb sind ein Ausschnitt der Elektronendichte einer helikalen Struktur und die Position des Selen-Atoms von SeMet35 erkennbar. Abb.3.12: Ausschnitt aus der initialen 2F o -Fc-Elektronendichte (blau, 2,5 σ) und der anomalen Elektronendichte der Schweratome (orange, 4,2 σ); erste helikale Strukturen im Bereich von Aminosäurerest 31 bis ca. 40 sind bereits erkennbar, ebenso wie die Selen-Position von SeMet35 (stereoskopische Abbildung). Mit WinCoot wurden idealisierte α-helices eingebaut, bei denen wegen der zu diesem Zeitpunkt schlechten Phasen auf eine Spezifizierung der Seitenketten verzichtet wurde und stattdessen Polyalanin-Modelle verwendet wurden. Mit dem unvollständigen Modell gelang eine Lösung mit Phaser MR und die Erstellung einer verbesserten 2F o -F c -Karte, bei der weitere Teile des Modells ergänzt und einige erste Aminosäureseitenketten eingebaut werden konnten. Da dies meist die aromatischen Seitenketten mit großem Volumen waren, konnten nun durch den Abgleich mit der 43

60 Ergebnisse Sequenz von SCO3201 erste Schlüsse über den Verlauf des Polypeptids gezogen werden. Das so weit wie möglich ergänzte Modell wurde nun für Verfeinerungsrechnungen mit refmac5 verwendet, wodurch sich die Elektronendichtekarte abermals deutlich verbesserte. Letztlich konnte das Modell mit Ausnahme der flexiblen Loop-Regionen zwischen den Positionen und (Monomer A), sowie und (Monomer B) vervollständigt werden. Die Verfeinerungsrechnungen wurden im späteren Verlauf durch TLS-Parameter ergänzt 109. Wegen der Zugehörigkeit zur TetR-Klasse wurde eine Beweglichkeit der DNA-bindenden Domäne gegenüber der Rumpfdomäne angenommen und die TLS- Gruppen entsprechend dieser Motive definiert (siehe Abb. 3.13). Abb.3.13: Farbliche Darstellung der TLS-Gruppen in der SCO3201-Struktur 4cgr. DNA-bindende Domäne in orange, Rumpfdomäne in blau. Die DNA-bindende Domäne wird hier vom N-Terminus bis zum Abknicken der Helix 4 definiert und um Helix 6 ergänzt. Links Monomer A, rechts Monomer B. Mit diesen Verfeinerungsstrategien konnte das Modell und die Phaseninformationen verbessert und niedermolekulare Bestandteile zum Modell hinzugefügt werden. Tabelle 3.3 enthält eine Übersicht über die Parameter der verfeinerten Struktur. Abschließend wurde die Struktur und die zugehörigen Strukturfaktoren in der Protein Data Bank unter dem PDB-Code 4cgr abgelegt 110,

61 Ergebnisse Tabelle 3.3: Zusammenfassung der Verfeinerung von 4cgr. Verfeinerung Rcryst in % 22,7 Rfree in %, 5 % der Reflexe 26,9 Figure of Merit 0,8 Mittlerer B-Faktor in Å 2 67,9 Zahl der Atome (ohne Wasserstoff) Protein Phosphat-Ionen 1 Wassermoleküle 31 rmsd von den Idealwerten Bindungslängen in Å 0,0144 Bindungswinkel in 1,6853 Torsionswinkel, Periode 1 in 5,575 Ramachandran Diagramm Reste in bevorzugten Positionen (%) 372 (98,9) Reste in verbotenen Bereichen (%) 0 (0) 3.6 Kristallstrukturanalyse von SCO3201 in der Raumgruppe P2 1 Wie unter beschrieben, kristallisierte das Protein auch bei einem ph-wert von 8,5 und dem Zusatz von Ethanol. Auch die so erzeugten Kristalle wurden für Röntgenbeugungsexperimente verwendet, vor Ort gelang lediglich das Erzeugen eines Datensatzes mit einer Auflösung von 3,9 Å. Deshalb wurden Kristalle abermals am BESSY II Elektronenspeicherring in Berlin vermessen. Hier gelang die Aufnahme eines Datensatzes mit einer akzeptablen Auflösung von 2,7 Å. In Tabelle 3.4 sind wie zuvor die Parameter und Ergebnisse der Datenaufnahme des Datensatzes 3409A3 zusammengefasst. 45

62 Ergebnisse Tab. 3.4: Auswertung der Datensammlung von 3409A3, Werte im Klammern für die höchste Auflösungsschale. Vm und Lösungsmittelanteil sind für 2 Monomere in der asymmetrischen Einheit angegeben. Name des Datensatzes 3409A3 Kristallisationsbedingungen 12 % Ethanol; 0,1 M Tris/HCl; ph 5 Röntgenquelle Wellenlänge in Å 0,91841 Detektor Lauegruppe 2/m Raumgruppe P2 1 BESSY II, BL14.2 MX-225 Zellparameter in Å und, a, b, c, β 51,79; 98,43; 89,611; 100,78 Auflösungsbereich in Å 94,62 2,7 (2,85 2,7) Unabhängige Reflexe (3.727) Redundanz 3 Vollständigkeit 96,6 I /σ(i ) 14,4 (1,4) Wilson B-Faktor in Å 2 79,1 Vm in Å 3 /Da 2,22 Lösungsmittelanteil in % 44,7 % Mosaizität in 0,25 Eine Strukturlösung konnte diesmal mittels molekularen Ersatzes unter Verwendung der bereits gelösten Struktur erfolgen. Allerdings ergab das Verwenden des Modells 4cgr, dem teilinduzierten Dimer, keine verwertbaren Phasenwinkel. Eine korrekte Lösung konnte nur durch Generierung eines Dimers aus zwei nicht-induzierten Monomeren erlangt werden, die Verwendung des Dimers aus beiden induzierten Monomeren misslang. Bei den veränderten Kristallisationsbedingungen konnte also die Struktur der Apo-Form von SCO3201 erzeugt werden. Äquivalent zu vorherigen Verfeinerungsrechnungen wurde auch diese Struktur bearbeitet. Die TLS-Gruppen wurden übernommen und für die zusätzlich in der asymmetrischen Einheit vorhandenen Monomere ergänzt. In Tab. 3.5 sind Details der Verfeinerungsrechnungen zusammengefasst. 46

63 Ergebnisse Tab. 3.5: Auswertung der Verfeinerung von 5efy. Verfeinerung Rcryst in % 25,5 Rfree in %, 5 % der Reflexe 29,6 Figure of Merit 0,75 Mittlerer B-Faktor in Å 2 75,5 Zahl der Atome (ohne Wasserstoff) Protein Wassermoleküle 39 rmsd von den Idealwerten Bindungslängen in Å 0,012 Bindungswinkel in 1,5 Torsionswinkel, Periode 1 in 4,9 Ramachandran Diagramm Reste in bevorzugten Positionen (%) 733 (99,5) Reste in verbotenen Bereichen (%) 0 (0) 3.7 Beschreibung der Struktur von SCO Die Struktur des teilweise induziertem Dimers Die Strukturlösung bestätigte die Annahme, dass SCO3201 zur TetR-Familie gehört. Wie bereits erwähnt, bildet das Protein in der Struktur 4cgr ein Heterodimer, weil sich beide Monomere hinsichtlich der Konformation ihrer DNA-bindenden Monomere sowie der Anbindung eines kleinen Moleküls im Inneren der regulatorischen Domäne unterscheiden. Jedes Monomer besitzt eine N-terminale, bewegliche HTH-Domäne, die aus einem Vier-Helix-Bündel besteht und für die Anbindung an die DNA verantwortlich ist. Die Dimerisierung wird durch die regulatorische Domäne vermittelt, sodass ein SCO3201-Dimer wie die meisten seiner DNA-bindenden Verwandten an eine palindromische Sequenz binden kann. Weil schon in Lösung eine Dimerisierung erfolgt, verwundert es nicht, dass die Kontaktfläche zwischen beiden Monomeren auch 47

64 Ergebnisse im Proteinkristall besteht 112. Die Loop-Regionen und (Monomer A), sowie und (Monomer B) liegen relativ nah beieinander und sind in der Struktur nicht sichtbar. Aus Abb können ihre Positionen im Protein und Abstand der fehlenden Bereiche entnommen werden. Das modifizierte SCO3201 hat einen Arginin-Gehalt von 11,6 %, was deutlich über dem Durchschnittswert von etwa 6,8 % für cytosolische Proteine von Prokaryoten liegt 113. Die meisten dieser Reste liegen auf der Oberfläche des Proteins und sind damit Solvens-exponiert. Wie aufgrund ihrer hohen Beweglichkeit zu erwarten, sind die Seitenketten der Arginin-Reste hinsichtlich der Elektronendichte meist schlecht definiert oder zeigen sehr hohe B- Faktoren. Von den 50 in der asymmetrischen Einheit vorliegenden Arginin-Resten sind 15 in der Elektronendichtekarte nicht sichtbar. Insgesamt sind 26 Seitenketten wegen mangelnder Sichtbarkeit aus dem Strukturmodell entfernt worden. Außerdem fehlen in der Struktur mit den erwähnten Loop-Regionen und den N- und C-terminalen Resten insgesamt 42 Aminosäurereste, weil ihre Elektronendichte nicht sichtbar war. Das Protein hat einen theoretischen pi von 9,4, zu dem die vielen Arginin-Reste auf der Oberfläche stark beitragen. In den verwendeten Puffern erzeugen sie eine positive Netto-Ladung, die in späteren Native-PAGE-Experimenten zu einer schlechten Migration zur Anode führte. Außerdem könnten sie die hohe Löslichkeit von SCO3201 erklären. Ein hoher pi ist zudem typisch für DNA-bindende Proteine, da die positive Netto-Ladung ionische Wechselwirkungen mit dem negativ geladenen Rückgrat der DNA ermöglicht. Die Rumpfdomäne enthält die Bindungstasche für den Liganden, dessen Anbindung die Affinität zu DNA verändert. Experimente, die von Xu et al. durchgeführt wurden, legen eine Derepression nahe 75. Ein Monomer des Proteins besteht aus 10 Helices und besitzt keine β-strang-strukturen (siehe Abb. 3.14). 48

65 Ergebnisse DNA-bindende Domäne Abb. 3.14: Links: Heterodimer von SCO3201, Monomer A in rot, Monomer B in blau. Rechts die fehlenden Loop-Regionen nahe dem HTH-Motiv. Zur besseren Veranschaulichung sind Aminosäurereste zwischen den fehlenden Loop-Regionen durch rote Linien verbunden. Der schwarze Kasten kennzeichnet nur die gleiche Region, keine direkte Ausschnittsvergrößerung. Der Bruch einer zweizähligen Symmetrie zwischen den beiden Monomeren wurde durch Bindung eines Moleküls beim Aminosäurerest Glu155 in Monomer A verursacht, der höchstwahrscheinlich eine Biegung der Helix 4 und eine daraus resultierende Bewegung der DNA-bindenden Domäne bewirkt. In der Ligandenbindungstasche befindet sich auch der einzige Arginin-Rest, der nicht auf der Proteinoberfläche angesiedelt ist. Die Seitenkette des Arginins Arg195 bildet eine Wasserstoffbrücke mit dem Rest Glu155 des jeweils anderen Monomers, der Abstand zwischen Stickstoffatomen der Guanidinogruppe und den Sauerstoffatomen der Carboxylgruppe beträgt 3 Å. Diese Interaktion scheint unabhängig vom Induktions-Zustand zu sein, da sie in beiden Monomeren besteht. Eine Abweichung von anderen Proteinen mit vergleichbarer Tertiärstruktur ist das Vorhandensein der aus 2,5 Windungen bestehenden Helix 8 in SCO3201. Diese befindet sich auf der vom HTH-Motiv abgewandten Seite des Proteins und ist in anderen Proteinen durch einen Loop mit ähnlicher Länge ersetzt, als Beispiel sei der TetR/AcrR-Regulator RHA1 aus Rhodococcus sp. genannt (PDB-ID 2rae). Wie in Abb zu erkennen ist, erfolgt die Ligandenbindung nicht in einer Mulde, sondern in einem Kanalnetzwerk, das durch die Dimerisierungsfläche der Monomere gebildet wird. Drei Öffnungen (C 1, C 2 und B) werden ebenfalls durch beide Monomere gebildet. Zwei weitere (A 1 und A 2 ) werden durch jeweils ein Monomer gebildet und sind mit dem größeren Kanal verbunden. Wegen der Lage des induzierenden Moleküls 49

66 Ergebnisse kann angenommen werden, dass die Anbindung über die Öffnungen A 1 und A 2 erfolgt. Die anderen Öffnungen könnten für den Efflux des bei der Ligandenbindung verdrängten Wassers aus der Bindungstasche eine Rolle spielen. Ein ähnlicher Mechanismus wurde bereits beim Tetracyclin-Repressor vermutet, bei dem der sterische Anspruch von Tetracyclin beim Eintritt in die Bindungstasche kein Passieren der Wassermoleküle durch dieselbe Öffnung erlaubt und Wassermoleküle ebenfalls durch eine andere Öffnung entfernt werden 114. Bei näherer Betrachtung der Öffnungen A1 und A2 fällt auf, dass die trichterförmigen Öffnungen mit zunehmender Weitung in Richtung Solvens auch hydrophober werden. Abb. 3.15: Stereoskopische Abbildung des Kanalnetzwerks durch SCO3201, Monomer A in hellblau, Monomer B in cyan (Kanalnetzwerk mit Caver berechnet) Die Struktur der Apo-Form Die vier Monomere des in der Raumgruppe P2 1 kristallisierten Proteins sind einander ähnlicher als in der zuvor gelösten, teilinduzierten Struktur und bilden zwei Homodimere in der asymmetrischen Einheit. Wie in untenstehender Abbildung erkennbar, weisen alle Monomere das Abknicken von Helix 4 auf, das zuvor mit der Abwesenheit eines Induktor-Moleküls in Zusammenhang gebracht wurde. In der Tat ist die zuvor beobachtete Elektronendichte in keinem der Monomere zu erkennen, weswegen die Struktur von 5efy die Apo-Form von SCO3201 darstellt. Jedes einzelne 50

67 Ergebnisse Monomer aus 5efy lässt sich perfekt mit dem nicht-induzierten Monomer aus 4cgr überlagern, das Dimer hingegen zeigt deutliche Abweichungen vom theoretischen Monomer-B-Homodimer, das aus 4cgr erstellt wurde. Durch eine Streckung von Helix 4 und Helix 7 sinkt der Pro66-Abstand auf nur etwa 28 Å (gemessen zwischen den Stickstoffatomen), also deutlich unter dem vermuteten von 35 Å. Auf der auf die DNAbindende Seite bezogen dorsalen Seite des Proteins sind nur geringe Helixbewegungen sichtbar, hier lassen sich Apo-Form und teilweise Induzierte Form weiterhin gut überlagern. Abb. 3.16: Überlagerung der vier Monomere in der asymmetrischen Einheit von 5efy. Das Abknicken der Helix 4 in allen Monomeren ist deutlich sichtbar. Stereoskopische Abbildung. Die Monomere von 5efy unterscheiden sich untereinander kaum in der Struktur ihrer Rumpfdomänen, die gebogene Helix 4 eingeschlossen (siehe Abb. 3.16). Wie ebenfalls in Abb erkennbar, ist die Helix 1 der DNA-bindenden Domäne nicht in allen Monomeren gleichermaßen ausgebildet und im Gegensatz zur Struktur von 4cgr sind die ersten 6 bis 10 N-terminalen Reste nicht sichtbar. Die Ähnlichkeit der Helix 1 zwischen einzelnen Monomeren der Struktur nimmt ab dem Rest M35 wieder zu. Wie in Abbildung 3.17 erkennbar, scheint auch der Aminosäurerest His152 von der Ligandenbindung beeinflusst zu werden. Dieser Rest weist in der nicht-induzierten Struktur die gleiche Position auf wie in Monomer B der teilinduzierten Struktur. Eine Superposition der vier Monomere von 5efy sowie des induzierten Monomers A aus 4cgr zeigt für His152 sehr ähnliche Torsionswinkel in allen nicht-induzierten Monomeren, 51

68 Ergebnisse wohingegen die Seitenkette im induzierten Monomer deutlich veränderte Torsionswinkel aufweist. Aus den vorliegenden Strukturen kann geschlussfolgert werden, dass die Position der Seitenkette His152 mit dem Induktionszustand korreliert. Abb. 3.17: Strukturvergleich der Aminosäurereste der vier Monomere aus 5efy (rot) sowie des induzierten Monomers aus 4cgr (blau). Die Kristallisation des nicht-induzierten Regulators unter den angegebenen Bedingungen legt die Vermutung nahe, dass die Bindungskonstante durch den veränderten ph-wert oder die relativ hohe Ethanolkonzentration soweit abgesenkt wurde, dass der Ligand aus dem Protein herausgelöst wurde. Eine Überprüfung erfolgte, indem bei der Proteinreinigung das Protein an die IMAC-Säulenmatrix gebunden, und mit 15 ml einer 1:1-Mischung des GF-Puffers und den beschriebenen Kristallisationsbedingungen gewaschen wurde. Das Mischen erzeugt die gleichen Bedingungen wie in den Hanging-Drop-Kristallisationsplatten und sollte, wenn der Ligand in dieser Waschlösung löslich ist, diesen vom immobilisierten Protein trennen. In der Folge wurde die Reinigungsprozedur wie zuvor durchgeführt und in den Kristallisationsbedingungen von 2894D3 kristallisiert. Die erfolgreiche Kristallisation erlaubte die Aufnahme eines Röntgenbeugungsdatensatzes, welcher mittels Molekularem Ersatz gelöst werden konnte. Die Struktur glich der von 4cgr hinsichtlich der Konformation der DNA-bindenden Domäne sowie der Existenz der Elektronendichte in der Ligandenbindungstasche, sodass angenommen werden kann, dass der Ligand nicht entfernt wurde. Die Abwesenheit des Liganden in 5efy beruht deshalb vermutlich auf der Tatsache, dass die Kristallisationsbedingungen nicht die Anbindung des Liganden an den Regulator 52

69 Ergebnisse beeinflussen, sondern eine Kristallpackung erzwingen, an der nur nicht-induzierte Proteinmoleküle beteiligt sind Teilweise Komplexierung von SCO3201 mit einem unbekannten Induktor Wie sich in der Struktur von 4cgr zeigt, ist die Konformation der Monomere in der asymmetrischen Einheit nicht identisch. Die Symmetrie zwischen beiden Monomeren wird durch die Bindung eines kleinen Moleküls in einem Monomer gestört. Dies geht mit einer Biegung der Helix 4 an der Position Gly87 einher, wodurch die DNAbindende Domäne um ca. 10 Å verschoben wird (Abb. 3.19). Wegen der Änderung der Konformation bei Bindung des Moleküls kann höchstwahrscheinlich von einem induzierten Zustand ausgegangen werden. Die Elektronendichte des unbekannten Moleküls befindet sich in unmittelbarer Nähe zum Glu155-Rest und zeigt in Richtung des Ausgangs A2, der sich trichterförmig weitet (siehe Abb. 3.20). Dabei ist das sichtbare Ende der Elektronendichte nur etwa 5 Å von Gly87 entfernt. Aus der Form der Elektronendichte kann auf ein lineares Molekül geschlossen werden, die Nähe zur Glutamat-Seitenkette legt das Vorhandensein einer polaren Gruppe nahe. Wegen der Beschaffenheit der Bindungstasche kann die Größe des Moleküls nicht aus der Form der Elektronendichte abgeschätzt werden, da das Weiten des Trichters dem Molekül große sterische Freiheit liefert, was eine eindeutige Position und damit eine vollständig sichtbare Elektronendichte verhindert. Weiterhin deutet die Elektronendichte darauf hin, dass die Interaktion mit Glu155 nicht über eine endständige polare Gruppe geschieht, sondern über eine sekundäre. Das Molekül scheint sich weiter in Richtung der Öffnung B1 zu erstrecken, worauf ebenfalls der Aminosäurerest His152 hindeutet, der in beiden Monomeren unterschiedliche Konformationen einnimmt. So hat der π-stickstoff von His152 im nicht-induzierten Monomer einen Abstand von 4 Å zum Sauerstoffatom der freien Carboxylgruppe von, während der Abstand im induzierten Monomer auf 6 Å vergrößert ist (siehe Abb.3.18). Ob dieses Abknicken mit der Ausbildung von Wasserstoffbrücken einhergeht oder lediglich den sterischen Anspruch des Liganden widerspiegelt, lässt sich wegen seiner erwähnten, nur teilweisen Sichtbarkeit aus der Struktur nicht ableiten. 53

70 Ergebnisse 4,0 Å 6,1 Å Abb. 3.18: Strukturvergleich von Monomer A (blau) und Monomer B (rot) im Bereich der Aminosäurereste 145 bis 160 mit F o -F c -Elektronendichte (Kontur-Level: 2 σ) des Induktormoleküls und Abständen zwischen π-stickstoff von His152 und Carboxyl-Sauerstoff von Glu155. Es kann angenommen werden, dass die Anbindung des Ligandenmoleküls für ein Ablösen von der DNA verantwortlich ist. Dies ergibt sich beim Erzeugen der Symmetrieverwandten beider Monomere und der Überlagerung mit dem jeweils anderen Monomer. So haben die HTH-Motive eines aus dem Monomer B erzeugten Homodimers den erwarteten Abstand von ca. 35 Å (gemessen zwischen Pro66- Stickstoff beider Monomere), welcher der Ganghöhe der DNA ähnlich ist, wohingegen die HTH-Motive des Monomer-A-Monomer-A-Dimers durch das Abknicken einen deutlich höheren Abstand von ca. 55 Å haben (siehe Abb. 3.19). Obwohl plausibel, ist diese Annahme nicht trivial. Die Familie der TetR-Regulatoren ist nur durch ihr DNAbindendes HTH-Motiv charakterisiert und weist, wie eingangs erörtert, neben einer Vielzahl verschiedener Induktoren auch unterschiedliche Regulationsmechanismen auf. Daher ist eine induzierte Derepression, wie sie bei SCO3201 vermutet wird, keinesfalls selbstverständlich. 54

71 Ergebnisse 10 Å Abb. 3.19: Überlagerung von Monomer A (blau) und Monomer B (rot) von SCO3201. Position der Liganden-Elektronendichte als grüne Kugel markiert. Die Verschiebung wurde bei P66 gemessen. Abb. 3.20: F o -F c -Elektronendichte des Liganden und E155 in Monomer A (Kontur-Level: 2 σ) Vergleich der B-Faktoren der beiden Monomere in 4cgr Wie am Vergleich der beiden Monomere ersichtlich, gehen die Anbindung des Moleküls und die resultierende Bewegung der DNA-bindenden Domäne mit deutlichen Änderungen der B-Faktoren einher. Diese beschreiben die Temperaturabhängigkeit der gestreuten Strahlung im Kristallgitter 97. Die Unterschiede sind dabei innerhalb der DNA-bindenden Domäne gering und hohe B-Faktoren sind nur in der Nähe des N- Terminus zu finden. Dies geht mit der Annahme konform, dass die DNA-bindende Domäne in sich stabil ist und Konformationsänderungen bei Induktion auf Zentren in der Rumpfdomäne beschränkt sind. Wie in Abbildung 3.21 erkennbar, sind die B- Faktoren im induzierten Molekül allgemein niedriger und drastische Unterschiede 55

72 Ergebnisse finden sich besonders im Bereich A85 bis R115, dem Bereich hinter dem Angelpunkt der HTH-Domänenbewegung und im Bereich von C151 bis S180, dem Bereich, in dem sich auch E155 befindet und der zudem die in anderen TetR-Proteinen nicht vorhandene Helix einschließt. Eine Korrelation zwischen Zentren besonders hoher Änderungen der B-Faktoren und den für die Ligandenbindung interessanten Bereichen ist also erkennbar, ebenso wie ein starkes Absinken der B-Faktoren im induzierten Monomer. Gleichzeitig lässt sich keine offensichtliche Konformationsänderung von Helix 8 beobachten und Helix 9 liefert genau dort ähnliche Konformationen, wo die B-Faktor- Unterschiede am größten sind. Niedrigere B-Faktoren korrelieren häufig mit weniger flexiblen Bereichen, in Helix 4 können sie als Streckung und Erstarren dieser Helix interpretiert werden, die die HTH-Domänen in einen größeren Abstand zueinander zwingt. B-Faktor in Å 2 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H Nummer des Aminosäurerestes Abb. 3.21: Diagramm der B-Faktoren. Blauer Graph: Monomer A, roter Graph: Monomer B. Die Helix 1 in SCO3201 ist im Vergleich zu anderen TetR-Regulatoren ungewöhnlich lang. Die Superposition mit den Proteinen QacR (PDB-Eintrag 1jt0) und TM1030 (PDB-Eintrag 4i6z) zeigt, dass die Helix um ca. 2 Windungen länger als die Helix in Strukturverwandten (siehe Abb. 3.22) ist. Der N-Terminus der Strukturverwandten befindet sich in SCO3201 an der Position M35. Mit Blick auf die Höhe der B-Faktoren fällt auf, dass diese ab diesem Aminosäurerest signifikant kleiner sind als die der vorhergehenden, jedoch nur im nicht-induzierten Monomer B, welches die zur DNA- 56

73 Ergebnisse Bindung fähige Form widerspiegelt. Im induzierten Monomer ist Helix 1 deutlich geordneter und nur die ersten vier N-terminalen Aminosäurereste weisen höhere B- Faktoren als der Rest der Helix auf. Ähnlich wie in Helix 4 könnte dies als Erstarren der Helix bei Ligandenbindung interpretiert werden. N-Terminus N-Terminus Abb. 3.22: Stereoskopische Abbildung des Strukturvergleiches der HTH-Domänen von SCO3201 (blau) und den TetR-Regulatoren TM1030, Tetracyclin Repressor und QacR in Graustufen, N-Terminus beschriftet. Ein Strukturvergleich der HTH-Domäne von SCO3201 mit der von QacR im DNA- Komplex zeigt, dass die Helix 1 von SCO3201 durch ihre Länge bis in die kleine Furche der DNA hineinragt. Geht man von einem ähnlichen Anbindungsmechanismus aus, was die Zugehörigkeit zur TetR-Klasse und die dementsprechende hohe Ähnlichkeit des HTH-Motivs nahe legt, kann durch Superposition der beiden DNA- Bindungsdomänen gezeigt werden, dass die Helix einige polare, langkettige Aminosäureseitenketten in unmittelbare Nähe zu den in der kleinen Furche befindlichen Basenpaaren bringt. Die Reste Arg28, Arg29, Lys30 und Arg34 könnten so eine Rolle für eine Sequenzerkennung über die kleine Furche der DNA spielen. Des Weiteren könnte die höhere Flexibilität dieses Teils der Helix in der nicht-induzierten Form bedeutsam für Anlagerung an die kleine Furche sein. 57

74 Ergebnisse 3.8 Auswertung des Small-Angle-X-Ray-Scattering-Experiments Um die Struktur von SCO3201 in der Kristallpackung mit der Struktur in Lösung abzugleichen, wurde ein Kleinwinkel-Beugungsexperiment durchgeführt. Außerdem sollte ausgeschlossen werden, dass die Faltung des HTH-Motivs ein Kristallisationsartefakt darstellt. Zuvor wurde vermutet, dass die DNA-bindende Domäne des Tetracyclin-Repressors und der TetR-Familie im Allgemeinen in Abwesenheit des Induktors hochflexibel ist und die stabile Faltung eine Folge der DNA-Bindung ist 115. Diese Annahme lässt sich nicht mit den deutlich niedrigeren B- Faktoren der HTH-Motive bezüglich des Rests der Struktur von 4cgr in Einklang bringen, die eine eher rigide Faltung implizieren. Da die Kleinwinkelbeugung in Lösung durchgeführt wird, können mit dieser Methode Effekte der Kristallpackung ausgeschlossen und der Faltungszustand der HTH-Motive überprüft werden. Zu beachten ist allerdings, dass eine Kleinwinkelbeugung mit einer Proteinlösung keinesfalls unkritisch als das Beobachten des natürlichen Zustands des Proteins interpretiert werden kann, weil die verwendete Proteinlösung weder die Proteinkonzentration noch die intermolekularen Wechselwirkungen des Proteoms nachahmt, die in der Zelle herrschen 116. Diese werden vermutlich durch den Zustand im Kristall besser beschrieben, auch wenn die Protein-Protein-Wechselwirkungen anders als in vivo in jedem Molekül identisch sind. Insofern sind sowohl Proteinlösungen, als auch Proteinkristalle nur als Näherungen der Bedingungen in vivo zu betrachten. Das Experiment wurde von Dr. Martha Brennich am ESRF in Grenoble durchgeführt. Unter Ergänzung der Loop-Regionen zwischen A120 und A130 gelang die Interpretation der Daten und das Erstellen eines Strukturmodells, eine Kongruenz von experimentellen Daten und Modell ließ sich dabei mit intakter HTH-Domäne erzeugen. Das Vorhandensein dieses DNA-bindenden Strukturmotivs in Abwesenheit der erkannten DNA-Sequenz deckt sich mit den Beobachtungen aus der Kristallstruktur des Heterodimers, dass die HTH-Motive von SCO3201 unabhängig vom Induktionszustand eine stabile Faltung haben und durch die Rumpfdomänen entsprechend der Induktion bewegt werden. 58

75 Ergebnisse 3.9 Untersuchung der DNA-Bindung von SCO Einfluss des N-Terminus auf die Operator-Erkennung Durch einen Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) sollte der Einfluss auf die Affinität von SCO3201 zur Operatorsequenz untersucht werden. Dabei wurde der Wildtyp mit der zur Kristallisation verwendeten H20-Variante und einer H33-Variante verglichen. Bei letzterer wurde die N-terminale Helix verkürzt, bis sie der Länge homologer TetR-Regulatoren entsprach. Alle Proben wurden auf die gleiche Ausgangskonzentration von 1 mg/ml eingestellt. Als DNA-Sonde wurde zunächst die von Xu et al. mittels DNase Footprinting Assay als geschützter Bereich des Promotors identifizierte Sequenz verwendet, hier Operator genannt 5,117. Wie dort ebenfalls beschrieben, zeigten sich mehrere Banden, die auf die Bindung mehrerer Dimere an die DNA-Sonde hindeuten könnten (siehe Abb.3.23). Hier konnte außerdem eine dritte Bande beobachtet werden, die allerdings deutlich schwächer als die anderen ausgeprägt ist. Die erste, obere Bande ist im Wildtyp am deutlichsten erkennbar, in der H20- Variante nur noch schwach und fehlt in der H33-Variante komplett. Im Gegensatz dazu nimmt die untere Bande in ihrer Intensität vom Wildtyp über die Mutanten H20 und H33 zu. WT H20 H33 K Abb. 3.23: EMSA der SCO3201-DNA-Komplexe. Die Banden zeigen jeweils 4, 2 und 1 µg Proteinlösung des Wildtyps, der H20-Variante, sowie der H33-Variante. K: Freie DNA. Kontrast optimiert. 59

76 Ergebnisse Die multiplen Banden auf Höhe der freien DNA-Sonde könnten durch die Ausbildung von Sekundärstrukturen entstehen, da die Sonde wie erwähnt mehrere Palindrome enthält, die zur Bildung von Hairpin-Strukturen neigen und üblicherweise erhöhte Mobilität in Polyacrylamid-Gelen zeigen 118. Wegen der hohen Sensitivität der Methode werden zudem auch fehlerhafte DNA-Moleküle nachgewiesen, die bei üblichen Reinigungsverfahren nach der Synthese bei kommerziellen Herstellern nicht entfernt werden. In den folgenden Tabellen wurden die Intensitäten der Banden miteinander verglichen. Mit dem Programm GelAnalyzer wurde zunächst die Fläche jeder Bande bestimmt und anschließend deren Gesamtintensität berechnet (Tab.3.6 und 3.7). Der Hintergrund, der als Schmier auf dem Blot erkennbar ist, wurde subtrahiert und fließt nicht in die Berechnung ein. Durch das unterschiedliche Laufverhalten und den unterschiedlich starken Hintergrund ist eine genaue Quantifizierung nicht möglich, das Experiment erlaubt aber eine qualitative Einschätzung der Intensitätsverhältnisse von Banden der gleichen Probe. Tab. 3.6: Übersicht über die integrierten Intensitäten der Banden. Wegen des schlechten Laufverhaltens der Bande mit 4 µg der H20-Variante fehlt sie in der Tabelle WT H20 H33 Prot-Menge in nmol 0,24 0,12 0,06 0,24 0,12 0,06 0,24 0,12 0,06 Gesamtintensität Bande 1: Bande 2: Bande 3: Tab. 3.7: Relative Intensität der Banden, jeweils bezogen auf die Intensität der oberste Bande WT H20 H33 Prot-Menge in nmol 0,24 0,12 0,06 0,24 0,12 0,06 0,24 0,12 0,06 Relative Bande 1: Intensität Bande 2: 0,21 0,15 0,45-0,59 0,98 11, Bande 3: 0,36 0,32 1,45-1,30 2, ,50 152,06 60

77 Ergebnisse In früheren Arbeiten von Xu et al. wurde spekuliert, dass das Auftreten der Doppelbanden auf die Bindung mehrerer Dimere in der Promotorsequenz hindeuten könnte 75. Drei palindromische Abschnitte konnten in der Promotorsequenz identifiziert werden, bs L, BS C und bs R. Die Benennung wurde von Delin Xu in früheren Arbeiten eingeführt und soll auch hier zum Zwecke der Konsistenz verwendet werden 75. Die Vermutung liegt nahe, dass die Banden der Bindung von SCO3201-Dimeren an eine, zwei oder alle drei Palindrome entsprechen. In diesem Fall wäre die geringere Stärke der obersten Bande in SCO3201-H20 und deren Abwesenheit in SCO3201-H33 ein Hinweis auf eine verringerte Affinität dieser Proteine zu einer, bzw. zwei der Bindungsstellen, wenn auch die mittlere, schwache Bande durch einen Protein-DNA- Komplex erzeugt wird. Weiterhin könnte die Zunahme der Intensität der untersten Bande mit abnehmender Proteinkonzentration im Wildtyp darauf hindeuten, dass eine der Sequenzen bevorzugt gebunden wird. Die höhere Verfügbarkeit dieser DNA- Sequenz bei geringerer Proteinkonzentration könnte die Bindung der weniger bevorzugten DNA-Sequenzen erschweren. Zur Überprüfung sollte das Experiment mit DNA-Sonden mit der Sequenz der einzelnen identifizierten Palindrome wiederholt werden. Abbildung 3.21 verdeutlicht sowohl die Sequenz des vor DNase-Verdau geschützten Bereichs, die im ersten Experiment zu Einsatz kam, als auch die Position der verwendeten Sonden der einzelnen Bindungsstellen. Operator bs L GAACCCCGGGGTGGCCCGCCGAATGGCAGATTCTGCCACAGCGGCATA GAACCCCGGGGTGGCCCGCCG BS C CGAATGGCAGATTCTGCCACA bs R CACAGCGGCATAGCCTGCCGAA Abb. 3.24: Sequenz des vor DNase-Verdau geschützten Bereichs (oben) sowie der einzelnen vermuteten Bindungssequenzen. Palindrome in rot und mit Pfeilen gekennzeichnet. Die Benennung der Sequenzen folgt der von Xu et al. Wie in Abbildung 3.25 zu erkennen, konnte sowohl für die BS C -Sonde, als auch für die bs R -Sonde eine Retention mit allen Varianten des Proteins nachgewiesen werden. 61

78 Ergebnisse In bs L war keine Retention erkennbar, was bemerkenswert ist, da bs L und BS C in der ersten DNA-Sonde komplett enthalten waren, bs R aber nur zur Hälfte. Obwohl eine quantitative Bestimmung der Affinität zu den einzelnen Sequenzen schwierig ist, konnte das Experiment zeigen, dass zwei der drei Sequenzen auch isoliert zur Bindung von SCO3201 fähig sind. Die nicht beobachtete Komplexbildung mit bs L überrascht allerdings vor dem Hintergrund der zuvor von Xu et al. durchgeführten DNase- Fußabdruck-Untersuchung, in der dieser Bereich vor dem DNase-Verdau geschützt war Abb. 3.25: EMSA der Einzelsonden, jeweils 2 pmol DNA und 4, 2, 1 µg Protein. 1, 2, 3: Wildtyp mit bs L, BS C und bs R. 4, 5, 6: H20 mit bs L, BS C und bs R. 7, 8, 9: H33 mit bs L, BS C und bs R. 10: Kontrolle mit 5 pmol der BS C -Sonde. Kontrast optimiert. Da eine rein qualitative Aussage über das Bindungsverhalten getroffen werden sollte, wurde keine Verdünnungsreihe der DNA-Regulator-Kombinationen angefertigt. Eine Aussage über die jeweiligen Affinitäten zur verwendeten DNA-Sonde kann deswegen auf Basis dieses Experiments nicht getroffen werden. Anschließend wurde das Experiment mit einer Sonde wiederholt, die alle Palindrome vollständig enthält (fulllength-sonde, siehe Abbildung 3.26). Abermals zeigt sich, dass die H20-Variante nur schlecht durch das Gel migriert, daher ist die Auswertung bezüglich des Bindungsverhaltens schwierig. Deutlich sichtbar ist hingegen, dass nun auch die M35-Mutante die zuvor beobachtete Doppelbande enthält. Mit Blick auf den 62

79 Ergebnisse zuvor durchgeführten Test auf die Erkennung der drei potenziellen Operatorsequenzen kann angenommen werden, dass hier nun ebenfalls eine stabile Bindung zu bs R ausgebildet werden kann, da nun das komplette Palindrom von bs R von einem SCO3201-H33-Dimer erkannt werden kann. WT H20 H33 K Abb.3.26: EMSA mit den SCO3201-Mutanten im Komplex mit der fulllength-sonde. Proteinvolumen jeweils 4, 2, 1 µg Protein. Auch hier ist eine Abschwächung der unteren Bande bei höherer Proteinkonzentration der Probe sichtbar, was abermals den Verdacht weckt, dass eines der Palindrome mit höherer Präferenz gebunden wird. Es zeigt sich außerdem, dass die mittlere, schwächer ausgeprägte Bande des ersten Experiments hier nicht beobachtbar ist. Da in dieser Sonde ebenfalls die komplette Sequenz von bs L enthalten ist und die Tests mit den Einzelsonden eine Bindung nicht bestätigten, erscheint es wenig wahrscheinlich, dass im ersten Experiment die drei Banden durch die Bindung von jeweils einem, zwei, oder drei Monomeren erzeugt werden. Vielmehr scheint die mittlere Bande durch Eigenschaften der DNA-Sonde selbst erzeugt zu werden. Um auszuschließen, dass die bs L -Sequenz nicht als isolierte Sequenz, aber bei Vorhandensein der BS C in unmittelbarer Nachbarschaft gebunden wird, wurde ein weiterer EMSA unter Verwendung einer bs L BS C -Sonde angefertigt, der nur diese Schnittstellen enthielt. Obwohl hier ebenfalls Doppelbanden erkennbar waren, ist die 63

80 Ergebnisse Aussagekraft dieses Chromatogramms gering, da auch in der Kontrollbande mehrere Banden erkennbar waren und zudem der Wildtyp keine Retention zeigte (siehe Abb. 3.26). Das Bindungsverhalten an die bs L BS C -Sonde wurde deshalb mittels nativer PAGE untersucht, die anschließend mit Coomassie gefärbt wurde. WT H20 H33 K Abb. 3.26: EMSA der SCO3201-Mutanten unter Verwendung der bs L BS C -Sonde. Jeweils 2 pmol DNA und 4, 2, 1 µg Protein Nachweis der Bindung mehrerer Dimere in der Operatorsequenz Die Bindung mehrerer Dimere wurde mittels nativer PAGE überprüft. Proben des Protein-DNA-Komplexes wurden dazu wie für die EMSA-Experimente hergestellt, jedoch wegen der geringeren Sensitivität der Coomassie-Färbung größere Mengen verwendet. Die Gelelektrophorese erfolgte wie zuvor bei den EMSA-Experimenten. Die Komplexierung erfolgte mit nicht-biotinylierten DNA-Molekülen. Wie in Abbildung 3.27 im linken Gel erkennbar, lassen sich auch hier Doppelbanden nachweisen, wobei die untere bei geringerer Verfügbarkeit der DNA verschwindet. Da die Färbung nur Protein detektiert und mit gereinigtem Protein gearbeitet wurde, müssen beide Banden von SCO3201 erzeugt werden. Es kann davon ausgegangen werden, dass die untere Bande einem SCO3201-Dimer im Komplex mit der DNA entspricht, die obere zwei Dimeren im DNA-Komplex. Mit abnehmender DNA-Menge binden die 64

81 Ergebnisse Proteinmoleküle verstärkt die weniger bevorzugte DNA-Bindungsstelle. Bei sehr wenig DNA wandern die meisten Proteinmoleküle als freies Dimer oder bleiben wegen ihrer Ladung in der Gel-Tasche zurück. Da die Doppelbande im rechten Gel, in dem die bs L BS C -Sequenz verwendet wurde, nicht erkennbar ist, kann davon ausgegangen werden, dass die bs L -Schnittstelle weder als isolierte Sequenz, noch synergistisch bei Vorhandensein der benachbarten BS C -Sequenz gebunden wird Abb. 3.27: Native PAGE des Wildtyps von SCO3201 im Komplex mit der kompletten Operatorsequenz (links) und der bs L BS C -Sequenz (rechts). Es wurden jeweils 10, 8, 6, 4, 2, 1 und 0 pmol der DNA-Sonde verwendet und 35 µg Protein. Wegen des hohen pi von SCO3201 migriert das freie Protein sehr schlecht in das Gel, die Kontrollbande ohne DNA ist daher deutlich schwächer, als die aufgetragene Proteinmenge erwarten ließe Versuch der Identifikation des Liganden Um die Identität des Liganden zu bestimmen, wurden mehrere Ansätze verfolgt. Weil keinerlei chemische Eigenschaften bekannt waren und auch die Funktion von SCO3201 unbekannt ist, gestaltete sich die Suche nach dem Induktor schwierig und war letztendlich nicht erfolgreich. Zunächst wurde auf Basis der experimentellen Daten der Versuch unternommen, den Liganden als Modell in die Bindungstasche einzubauen. Weil die Struktur des Induktormoleküls nicht zweifelsfrei durch die Elektronendichte geklärt werden konnte, 65

82 Ergebnisse wurde in der abgelegten Struktur auf einen Einbau verzichtet. Der Einbau von Ligandenmodellen führte zur Verbesserung der R-Faktoren, weil die Elektronendichte in der Bindungstasche erklärt wurde. Es wurden dazu allerdings zunächst nur Modelle aus Kohlenstoffatomen verwendet, da die Auflösung der Beugungsbilder die Unterscheidung zwischen den häufigen Atomsorten Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff nicht zuließ. Auch Hybridisierungszustände lassen sich nicht mit Sicherheit zuordnen, daher kommen für die Füllung der Elektronendichte Moleküle mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen in Frage. Insofern kann das erstellte Modell des Liganden keinen Aufschluss über die chemischen Eigenschaften des Moleküls liefern, sondern lediglich Hinweise auf Ausdehnung und Torsionswinkel geben. So ist die längliche Elektronendichte, die in Richtung der Öffnung A1 zeigt, gut zu erkennen und lässt sich durch eine aliphatische Kohlenstoffkette mit einer Länge von 7 bis 8 Atomen erklären. Auch die Vermutung, dass die Interaktion des Liganden mit der Seitenkette von Glu155 nicht über eine endständige Gruppe vermittelt wird, lässt sich aus den Experimenten ableiten, da eine Restdichte bei Verwendung von z. B. Oktan zurückbleibt, die sich zwischen dem Liganden und His152 erkennen lässt. Dies kann als weiterer Hinweis gewertet werden, dass dieser Rest eine Rolle in der Ligandenbindung spielt. Ohne dass dies als Beweis für die tatsächliche Anbindung dieses Stoffes gewertet werden könnte, lässt sich die Elektronendichte komplett durch den Einbau von β-keto- Nonansäure oder β-hydroxy-dekansäure erklären (siehe Abb. 3.28). Dies erlaubt auch die Ausbildung realistischer Wasserstoffbrücken zu Arg195 des gleichen Monomers über ein Wassermolekül. Zudem sind diese Moleküle Intermediate der Fettsäuresynthese im Stoffwechsel von Bakterien, daher erscheint das Vorhandensein einer solchen Verbindung in den für die Expression verwendeten E. coli-zellen plausibel 119. Auch dass SCO3201 in den Differenzierungsprozess von S. coelicolor involviert ist, könnte ein Hinweis auf die Anbindung von Fettsäure-Vorläufermolekülen sein, da diese Bestandteil der Zellmembran sind. Tab. 3.8: Vergleich der R-Faktoren und der figure of merit bei Einbau der vermuteten Liganden. Ohne Ligand β-hydroxy-dekansäure β-keto-nonansäure R/R-free in % 23,0/26,9 22,0/26 22,1/26,1 FOM 0,78 0,79 0,78 66

83 Ergebnisse Obwohl der Einbau der Moleküle bei ansonsten identischen Verfeinerungsparametern bessere R-Faktoren durch das Füllen der Restdichte lieferte (siehe Tab. 3.8), wurde in der fertigen Struktur darauf verzichtet, da keine Beweise für eine tatsächliche Anbindung zur Verfügung standen. Abb. 3.28: F o -F c -Elektronendichte (Kontur-Level: 2 σ) bei Einbau von β-hydroxy-dekansäure (A) und β- Keto-Nonansäure (B). Glu155 in blau, Helices der Monomere in blau (Monomer A) und rot (Monomer B) Neben der direkten Auswertung der Elektronendichte sollte die gelöste Struktur auch als Basis für Modeling-Methoden dienen. Die Arbeit wurde von Juliette Coignard an der École Polytechnique in der Arbeitsgruppe von Thomas Simonson (Paris, Frankreich) ausgeführt. Dazu wurde mittels Docking-Experimenten unter Verwendung von Autodock Vina und der Molekülbibliothek Chimiothèque Nationale die Freie Enthalpie der Anbindung der Liganden an die Bindungstasche berechnet 120. In der Tat wurden mehrere Kandidaten ermittelt, deren Bindungsenthalpie negative Werte aufweist. Die Moleküle weisen allerdings drastische Unterschiede zur vermuteten aliphatischen Form des Liganden auf, da alle polyzyklische Aromaten darstellen und keiner der Kandidaten Ähnlichkeiten zur Elektronendichte des Liganden zeigt. Allerdings kamen auch die Dockingexperimente zu dem Schluss, dass der Ligand zumindest hydrophobe Bereiche aufweisen muss. Es konnte daher keine kohärente Erkenntnis über die Struktur des Liganden gewonnen werden, die sowohl die Modeling-Ergebnisse, als auch die experimentellen Daten berücksichtigt. Ein experimentelles Überprüfen der Anbindung in vitro war aus mangelnder Verfügbarkeit der Stoffe nicht möglich. 67

84 Ergebnisse Der Ligand sollte neben in-silico-methoden auch über experimentelle Herangehensweisen identifiziert werden. So wurde zunächst Protein aus 4 L Zellkultur gereinigt, und anschließend eingeengt. Wegen der vermuteten aliphatischen Struktur wurde die Proteinlösung anschließend mit einer 1:1-Chloroform-Methanol-Mischung ausgeschüttelt, bei der das Protein denaturiert und vorhandene Lipide in die organische Phase wandern 121. Durch Zentrifugation ließ sich das aggregierte Protein an der Phasengrenze sedimentieren. Das Chloroform wurde mit einer Kanüle entfernt und anschließend in einem neuen Reaktionsgefäß verdampft. Der Rückstand wurde anschließend in deuteriertem DMSO gelöst und für die Aufnahme eines 300-MHz-NMR-Spektrums verwendet. Das Spektrum enthielt allerdings nur einen starken Chloroform-Peak. Anscheinend ließ sich das organische Molekül mit dieser Methode nicht oder nicht ausreichend extrahieren. Auch die Analyse über GC/MS erwies sich als wenig erfolgreich, was abermals an der mangelhaften Extraktion des Liganden gelegen haben dürfte, da keine ausreichenden Mengen des Moleküls zur Verfügung standen. Niedrige ph-werte, die vielleicht die Löslichkeit in Chloroform durch Protonierung von Carboxylgruppen verbessert hätten, führten ebenfalls nicht zum Erfolg. Daher konnte die vermutete Anbindung von β-keto-nonansäure, oder, bedenkt man die Möglichkeit einer ungeordneten Alkankette, die in den weiteren Bereichen der unpolaren Bindungstasche liegt, eines homologen Moleküls, nicht über die Extraktion aus dem Protein bestätigt werden. Stattdessen sollte nun durch Zugabe des vermuteten Liganden eine Anbindung bewiesen werden. Weil keine freien β-keto-säuren zur Verfügung standen, wurde als Ligand der Methyl-Ester Methyl-3-oxo-Heptanoat verwendet. Ein Aliquot von SCO3201 wurde mit dem Ester vermischt, bis eine Konzentration von 20 mm erreicht wurde. Wegen der schlechten Löslichkeit des Esters wurde die Probe bei Raumtemperatur 30 min im Ultraschallbad inkubiert und mittels Kleinwinkelbeugung untersucht. Es konnte allerdings keine Änderung gegenüber dem Apo-Protein festgestellt werden, sodass davon ausgegangen werden kann, dass zumindest der Methylester keine Induktion bewirkt. 68

85 Diskussion 4 Diskussion Im Folgenden sollen die Ergebnisse dieser Arbeit ausgewertet werden. Es soll dazu die Qualität der Röntgenbeugungsdaten sowie der Einfluss der N-terminalen Veränderungen an SCO3201 auf Kristallisationsverhalten und DNA-Bindung betrachtet werden. Zudem sollen der Vergleich mit anderen TetR-Regulatoren und die Auswertung der EMSA-Experimente die Komplexbildung mit der erkannten Operatorsequenz beleuchten. Abschließend soll dieses Kapitel für einen möglichen Ausblick auf die weitere Charakterisierung des Proteins liefern. 4.1 Qualität der Strukturlösungen von SCO Das teilweise induzierte SCO3201-Dimer 4cgr Das Strukturmodell 4cgr stellt die erste Strukturlösung des TetR-Regulators SCO3201 dar. Gleichzeitig gibt es durch die Bindung des bislang unbekannten Moleküls in einem Monomer des Heterodimers Einblick in den Induktionsmechanismus des Regulators. Weil bei der Kristallisation des Wildtyps nur dünne Nadeln entstanden, die für Röntgenbeugungsexperimente nicht geeignet waren, wurde das Protein ohne einen N- terminalen Bereich exprimiert, der wegen seines hohen Prolin- und Glycin-Anteils wahrscheinlich ohne feste Sekundärstruktur vorliegt. Die Strukturaufklärung gelang mit dem verkürzten Protein bis zu einer Auflösung von 2,1 Å. Besonders auffällig ist die in verschiedenen Bereichen unterschiedliche Starrheit des Proteins. Während einige Bereiche, besonders weite Teile des HTH-Motivs und bestimmte Stellen in der regulatorischen Domäne, sehr rigide und gut definiert sind, sind andere Teile deutlich flexibler und weisen daher sehr hohe B-Faktoren auf. Wie aus untenstehender Grafik, in der 4cgr mit anderen Strukturmodellen ähnlicher Auflösung verglichen wird, erkennbar ist, bewegen sich die meisten Qualitätsparameter durchaus im Rahmen. Nur der mittlere B-Faktor ist überdurchschnittlich hoch und liegt mit 70,3 Å 2 deutlich über dem für Strukturen dieser Auflösung erwarteten Wert. Auffällig ist dabei, dass das Monomer, das ein kleines Molekül in seiner Rumpfdomäne gebunden hat, deutlich geringere B-Faktoren aufweist. 69

86 Diskussion Abb. 4.1: Vergleich von Strukturparametern zwischen 4cgr und Strukturen vergleichbarer Auflösung. Die Farbe der Skala spiegelt die Anzahl der Vergleichsstrukturen. Rot: viele vergleichbare Strukturen, blau: wenige vergleichbare Strukturen. Rote Zahlen zeigen Maximal- und Minimalwert der Vergleichsstrukturen, Werte von 4cgr in schwarz. Die Grafik wurde mit POLYGON erzeugt 122. Es wurde bereits auf die Möglichkeit hingewiesen, dass das Absinken der B-Faktoren durch die Ligandenbindung bewirkt wird, allerdings lässt sich auch ein Kristallpackungseffekt nicht ausschließen. Es sei darauf hingewiesen, dass kein absolutes Absinken über die gesamte Länge des Polypeptids erkennbar ist, sondern nur in bestimmten Bereichen deutlich kleinere Werte auftreten. Diese Bereiche sind entweder wie Helix 1 in die DNA-Bindung oder wie Helix 7 in die Ligandenbindung involviert. Im Falle von Helix 4 scheinen keine direkten Interaktionen mit der DNA oder dem Liganden vermittelt zu werden, stattdessen ist diese Helix durch ein Abknicken an der Position Gly87 für die Domänenbewegung des induzierten Monomers verantwortlich. Sie ist also ebenso direkt in die Funktion von SCO3201 eingebunden. Hier können hohe B-Faktoren als große Beweglichkeit der DNAbindenden Domäne interpretiert werden, weil diese Zone den Angelpunkt ihrer scharnierartigen Bewegung darstellt (siehe Abb. 4.2). Mit der Erkennung des Liganden sinken die B-Faktoren auf die Hälfte ab, die Helix streckt sich und fixiert die komplette DNA-bindende Domäne. Daraus resultiert eine Vergrößerung des HTH-Abstands beider Monomere auf 55 Å, also weit über dem Ganghöhenabstand der B-DNA. 70

87 Diskussion B-Faktor in Å 2 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H Nummer des Aminosäurerestes Abb. 4.2: Höhe der B-Faktoren in den Helices. Blauer Graph: Monomer A, blauer Graph: Monomer B. Helix mit Nummerierung über den Graphen. Das Erzeugen der Symmetrieverwandten des Protein-Dimers in 4cgr erlaubt die Abschätzung der Kristallkontakte, sowie ihres Einflusses auf die B-Faktoren. Geht man davon aus, dass kleine Abstände zu symmetrieverwandten Molekülen die Beweglichkeit der jeweiligen Reste durch sterische Ansprüche und die Ausbildung von Interaktionen einschränken, sollte sich dies in niedrigeren B-Faktoren ausdrücken. Interessanterweise sind die Segmente der Reste und , bei denen sich die deutlichsten Unterschiede in den Temperaturfaktoren zeigen, in beiden Monomeren in ähnlicher Weise Solvens-exponiert. Die Unterschiede scheinen deshalb nicht auf einen Packungseffekt zurückzugehen. Es ist zu vermuten, dass eine vollständige Induktion von SCO3201 sowohl den mittleren Temperaturfaktor senken, als auch höhere Auflösungen bei Röntgenbeugungsexperimenten liefern würde, so wie dies etwa beim TetR-Regulator RutR der Fall ist. Die Apo-Form dieses Proteins (PDB-Code 4x1e) konnte dabei mit einer Auflösung von 2,4 Å gelöst werden, während die Auflösung der Struktur des Protein-Liganden-Komplexes 1,7 Å beträgt (PDB-Code 4jyk) 123. Es kann also festgestellt werden, dass die Temperaturfaktoren der gelösten Strukturen zwar überdurchschnittlich hoch, wegen der distinkten Verteilung und dem Absinken bei Ligandenbindung aber wohl biologisch relevant sind. Die Zonen hoher Beweglichkeit scheinen sowohl für den Mechanismus der der Derepression, als auch für die Affinität des Apoproteins zur DNA bedeutsam zu sein. 71

88 Diskussion Die Apo-Form von SCO3201 Die Struktur der Apo-Form von SCO3201 ließ sich mittels Synchrotronstrahlung bis zu einer Auflösung von 2,7 Å lösen, eine deutliche Verbesserung gegenüber einem Datensatz, der mit 3,9 Å Auflösung an der Drehanoden-Röntgenquelle bei gleichen Kristallisationsbedingungen aufgenommen wurde. Wie erwartet, konnte die Auflösung von 4cgr nicht erreicht werden, auch der durchschnittliche B-Faktor ist höher. Trotzdem ist die Qualität der Struktur hinsichtlich ihrer Geometrie und R-Faktoren ähnlich der von Strukturen vergleichbarer Auflösung (siehe untenstehende Abbildung). Deutlich mehr Seitenketten als bei 4cgr, gerade auf der Oberfläche des Proteins, zeigten keine Elektronendichte und wurden deswegen nicht in das Strukturmodell eingebaut. Hier diskutierte Seitenketten waren aber in allen Monomeren der Struktur sichtbar und die Auflösung ist hoch genug, um Domänenbewegungen sinnvoll zu diskutieren. Abb. 4.3: POLYGON-generiertes Diagramm der Qualitätsparameter von 5efy. Abermals weichen nur die B-Faktoren stark vom Referenzbereich ähnlicher Strukturen ab. In der Struktur der Apo-Form ist der mittlere B-Faktor nochmals deutlich erhöht. Die Struktur des Apo-Proteins scheint insgesamt weniger starr als die induzierte zu sein, ein Effekt, der in der Vergangenheit bereits für TetR-Regulatoren beschrieben wurde und bei vielen dieser Proteine eine Kristallisation der Apo-Form verhindert 50,115. Die Verteilung von Zonen hoher B-Faktoren ist der aus dem nicht-induzierten Monomer 72

89 Diskussion von 4cgr sehr ähnlich, mit den dort ebenfalls vorhandenen Maxima zwischen Helix 4 und 5, 5 und 6, sowie bei Helix 8 und dem Ende von Helix 9. Dass dasselbe Profil der B-Faktoren bei Kristallisation in unterschiedlichen Kristallsystemen erzeugt wird, ist ein weiterer Hinweis darauf, dass diese Verteilung ein intrinsisches Merkmal von SCO3201 und kein Packungseffekt ist. Auch die N-terminale Helix 1 aller Monomere in der asymmetrischen Einheit ist deutlich schlechter geordnet und der Helix 1 des nichtinduzierten Monomers aus 4cgr ähnlich. Es kann daher vermutet werden, dass die hohe Flexibilität dieser Helix kein kristallographisches Artefakt darstellt, sondern relevant für die Funktion von SCO3201 als DNA-bindender Regulator ist. Wie im Ergebnisteil schon erwähnt, sind die Monomere der Struktur dem Monomer B aus 4cgr sehr ähnlich. Deshalb konnte unter Verwendung dieses Modells das Molecular Replacement erfolgreich angewendet werden. Auffällig ist die Anordnung der Monomere zueinander, die deutlich von der des theoretischen Monomer-B-Homodimers abweicht, bei dem das nicht-induzierte Monomer aus 4cgr mit dem induzierten Monomer A überlagert wurde. In der Apo-Form ist der Abstand zwischen den N- Terminalen Enden der Helices 7 beider Monomere und zwischen den Helices 9 beider Monomere gegenüber diesem theoretischen Modell deutlich verringert. 73

90 Diskussion N Abb. 4.4: Überlagerung des erwarteten, aus zwei nicht-induzierten Monomeren von 4cgr erstellten Modells (grau) und der Struktur eines Dimers aus 5efy (rot). Relativ zum perfekt überlagerten Monomeren-Paar rechts ist das linke Monomer aus 5efy gegenüber dem aus dem theoretischen Modell verdreht, hier durch die Bewegung der Helix 7 (N- und C-Terminus beschriftet) kenntlich gemacht. Da diese Helices die Dimerisierungsfläche bilden, liegen beide Monomere an der DNAzugewandten Seite des Proteins enger beieinander und sind zudem stärker als erwartet gegeneinander verdreht (siehe Abb. 4.4). Weil sich der Angelpunkt der Drehung an der bezüglich der DNA-Bindung dorsalen Seite des Dimers befindet, werden ventrale Reste des Proteins stärker verschoben, was zu einer deutlichen Verlagerung des HTH-Motivs führt und den Abstand der HTH-Motive beider Monomere zueinander auf etwa 28 Å (gemessen zwischen den Pro66-Stickstoffatomen) verringert. Dies ist deutlich geringer als die Ganghöhe einer gestreckten B-DNA, die durch den HTH-Abstand des theoretischen Dimers von etwa 35 Å ohne starke Biegung gebunden werden könnte. In der unmittelbaren Umgebung von Glu155 und Arg195 waren keine Elektronendichten eines potenziellen Induktors sichtbar, deshalb kann von einem nichtinduzierten Zustand ausgegangen werden. Trotzdem waren in der trichterförmigen, hydrophoben Öffnung, die zu diesen Resten führt (Öffnung A, siehe 3.6.1), einige längliche Elektronendichten erkennbar (siehe Abb. 4.5). 74

91 Diskussion Abb. 4.5: Elektronendichten am Eingang zum Kanalnetzwerk von SCO3201. Links als Bändermodell mit Glu155 und Arg195 im Hintergrund. Rechts als Oberflächenmodell, polare Reste in rot, unpolare in weiß. Wegen der geringen Auflösung können diese Elektronendichten keinem Molekül zugeordnet werden. Die längliche Form und unrealistisch hohe Wasserstoffbrücken- Abstände zum Peptidrückgrat und den Seitenketten machen Wassermoleküle unwahrscheinlich. Die Dichten könnten aber von hydrophoben Alkanen aus dem Paraffinöl stammen, das als Kryoschutz-Lösung verwendet wurde. Auch das in der Kristallisationslösung enthaltene Ethanol und DTT könnten diese Dichten verursachen. 4.2 Vergleich der Struktur von SCO3201 mit homologen Regulatoren Die DNA-bindende Domäne Wie bereits im Ergebnisteil beschrieben, unterscheidet sich die Struktur von SCO3201 trotz der Vielzahl an bereits bekannten Strukturen von TetR-Regulatoren zu stark von diesen, um einen erfolgreichen molekularen Ersatz durchzuführen. Interessanterweise ist der bemerkenswerteste strukturelle Unterschied nicht in der regulatorischen, sondern in der DNA-bindenden Domäne zu finden. Helix 1 ist in SCO3201 im Vergleich zum Großteil der TetR-Regulatoren sehr lang. Ein Strukturvergleich brachte mit dem in der Einleitung beschriebenen DesT einen ähnlichen Regulator hervor, der eine ebenso lange N-terminale Helix besitzt. Auch wenn dieser nur eine geringe globale Sequenzidentität von 22,7 % mit SCO3201 besitzt, lohnt der Vergleich beider HTH-Motive, da auch hier die Ähnlichkeit mit 36 % wieder höher ist, als im Rest des Proteins. Zudem steht mit 75

92 Diskussion 3lsp ein Strukturmodell von DesT im Komplex mit seiner Operatorsequenz zur Verfügung. Wie von Miller et al. beschrieben, vermittelt der N-Terminus über mehrere Reste Interaktionen zwischen Protein und der kleinen Furche der DNA 74. Wegen der großen Ähnlichkeit dieser N-terminalen Helix in beiden Proteinen kann angenommen werden, dass auch in SCO3201 die Sequenzerkennung mithilfe der kleinen Furche erfolgt. Nahe dem N-Terminus befinden sich mehrere polare Reste, die Interaktionen mit dem Phosphatrückgrat oder den Nucleotid-Basen ausbilden könnten. Die Abbildung 4.6 zeigt eine Strukturüberlagerung der HTH-Motive von DesT mit SCO3201. Abb. 4.6: Überlagerung des HTH-Motivs von SCO3201 (PDB-Code 4cgr) in blau mit dem von DesT im Komplex mit einer Hälfte seiner Operatorsequenz (PDB-Code 3lsp) in rot. Als von Miller et al. relevante Reste in Helix 1 in rot dargestellt und beschriftet, für DNA-Interaktion infrage kommende Reste in SCO3201 in blau. Weil die Strukturanalyse des DNA-Komplexes nicht Teil der vorliegenden Arbeit war, bleibt der strukturelle Beweis für tatsächliche Interaktionen durch die N-terminale Helix mit der DNA aus, ebenso wie die Funktion der ungeordneten N-terminalen Peptidsequenz. Vor dem Hintergrund der 16 verschiedenen DNA-Sequenzen, die von SCO3201 erkannt werden, ist eine Bindung außerhalb der großen Furche, mit der spezifische oder unspezifische Interaktionen zur Erhöhung der Bindungskonstante vermittelt werden, aber plausibel und rechtfertigte letztlich die Durchführung des Electrophoretic Mobility Shift Assays. Unklar ist weiterhin die Funktion der N- 76

93 M M S S T V P A P P A P G P E+G P G P G P G P+S G A P S L T E R R Diskussion terminalen Sequenz, die für die Strukturlösung von SCO3201 durch Klonierung entfernt werden musste. Eine Datenbanksuche der Sequenz der ersten 75 Aminosäurereste, die in SCO3201 der gesamten DNA-bindende Domäne entsprechen, lieferte 31 Regulatorproteine mit ähnlicher Peptidsequenz in der Nähe des N-Terminus (siehe Abb.4.7). Beachtenswert ist dabei, dass vor allem die Prolinreste stärker konserviert sind und dem Muster einer repetitiven P-x-Sequenz zu folgen scheinen, bei dem die x- Position für ein oder zwei Aminosäurereste steht, die eine höhere Varianz aufweisen. Werden nur Regulatoren berücksichtigt, deren N-Terminus höchstens 6 Aminosäurereste kürzer ist als der von SCO3201, steigt die Konservierung der Prolinreste auf über 60 %. Allerdings ist wegen der Seltenheit dieser ähnlichen Regulatoren die Probengröße mit 10 Proteinen sehr klein. Zudem stammen bis auf einzelne Ausnahmen, die in anderen Actinomycetales gefunden wurden, alle Treffer aus Vertretern der Gattung Streptomyces Abb. 4.7: Konsensus-Sequenz von 31 HTH-Motiven mit ähnlicher N-terminaler Länge wie SCO3201. Auf der Y-Achse ist die prozentuale Häufigkeit der Aminosäure an dieser Position angegeben, auf der X- Achse der häufigste Aminosäurerest dieser Position. Bei Angabe zweier Reste sind beide mit gleicher Häufigkeit vertreten. In rot der Beginn der Helix 1 in 4cgr. Gerade die selektive Konservierung bestimmter Reste spricht dafür, dass der N- Terminus in SCO3201 und Regulatoren mit ähnlichen Merkmalen kein evolutionäres Relikt darstellt, sondern in die Funktion der Proteine involviert ist. So konnte mittels EMSA festgestellt werden, dass isolierte Operatorsequenzen zwar unabhängig von der N-terminalen Modifikation erkannt werden, es aber Unterschiede im Bindungsverhalten gegenüber der Gesamt-Promotorsequenz gibt. Es ist deshalb möglich, dass der ungeordnete Teil des N-Terminus keine Protein-DNA-Wechselwirkungen vermittelt, sondern, wegen der unmittelbaren Nähe mehrerer Operatorsequenzen zueinander, stattdessen mit dem Nachbar-Dimer interagiert. 77

94 Diskussion Die regulatorische Domäne Die regulatorische Domäne zeigt wie erwartet deutliche Unterschiede zu anderen TetR- Regulatoren, deren Struktur bereits aufgeklärt wurde. Homologe Proteine lassen sich nur schlecht mit SCO3201 überlagern, insofern kann auch der postulierte oder bekannte Induktionsmechanismus dieser Proteine keine Hinweise auf den von SCO3201 liefern. Die hohe Diversität der regulatorischen Domäne innerhalb der TetR-Regulator-Familie resultiert nicht nur in hoher Varianz bezüglich ihrer Liganden, sondern auch bezüglich der Art und Weise, wie die Affinität des strukturell hochkonservierten HTH-Motivs zur Operatorsequenz gesenkt wird. Ein sinnvoller Vergleich zu homologen Proteinen mit dem Ziel der Identifikation wichtiger Reste bleibt daher auf die Peptidsequenz der oben erwähnten Homologen aus anderen Streptomyces-Arten beschränkt, da deren Strukturen bislang nicht aufgeklärt wurden. Es zeigt sich, dass besonders die Reste in unmittelbarer Nähe zum unbekannten Liganden hochkonserviert sind. So ist Glu155 unter 100 Homologen zu 94 % konserviert, Mutationen an dieser Position tragen stattdessen einen Aspartat-Rest. Arg195 ist zu 93 % konserviert, allerdings beruht dies darauf, dass auch theoretische Leserahmen in die Datenbanksuche einflossen, bei denen nur die HTH- Domäne annotiert war. Bei diesen Sequenzvergleichen verfälschte die Interpretation der Abwesenheit eines Aminosäurerestes als Fehlpaarung das Ergebnis. Unter den 100 Treffern besaß keine Peptidsequenz einen anderen Aminosäurerest an dieser Position. Da das beschriebene Seitenkettenpaar eine Interaktion zwischen den Monomeren an ihren Kontaktflächen darstellt, ist es an der Dimerisierung von SCO3021 beteiligt. Bemerkenswerterweise ist auch die Position Cys151 mit 80 % hoch konserviert. Obwohl ebenfalls dicht neben dem Liganden gelegen, ist in der Struktur keine direkte Interaktion erkennbar. Vielmehr zeigt die Sulfhydrylgruppe auf den Rest Trp147, der seinerseits zu 100 % konserviert ist und über das Stickstoffatom seines Indol-Ringes eine 3,1 Å lange Wasserstoffbrücke zur Carboxylat-Gruppe des zu 90 % konservierten Glu199 ausbildet. Die Triade Trp147-Glu199-Arg195 scheint daher essentiell für die Funktion von SCO3201 und seinen Homologen zu sein, sei es durch Ligandenerkennung, Dimerisierung oder beides. Auch der Rest Glu87 ist zu 100 % konserviert, was auf phylogenetischer Ebene einen weiteren Hinweis auf seine Schlüsselposition als Angelpunkt der HTH-Bewegung darstellt. Eine ähnliche Bewegung der DNA-bindenden Domäne in anderen Homologen scheint daher 78

95 Diskussion wahrscheinlich, ebenso wie die Erkennung ähnlicher oder identischer Ligandenmoleküle. Im Ergebnisteil wurde bereits auf die Beschaffenheit der Ligandentasche hingewiesen. Sie formt ein Kanalnetzwerk mit mehreren Zugängen zum Inneren des Proteins. Auch hier zeigen sich Parallelen zu anderen Vertretern der TetR-Regulatoren, insbesondere zum namensgebenden Tetracyclin-Repressor. Wie dort vermutet, werden durch sterische Ansprüche des Liganden die bei Induktion verdrängten Wassermoleküle nicht an diesem vorbei in das Solvens entlassen, sondern durch eine zusätzliche Öffnung 114. Die ähnliche Struktur der Bindungstasche könnte ein Hinweis darauf sein, dass bei Komplexbildung ein ähnlicher Mechanismus verwendet wird, bei dem Wassermoleküle durch die orthogonal zur DNA verlaufenden Öffnungen B 1, B 2 und C (siehe Abb. 3.13) entweichen. Zudem könnte man vermuten, dass der unbekannte Ligand ebenfalls weitaus größer ist, als die sichtbare Elektronendichte im Strukturmodell 4cgr dies erahnen lässt. Das Kanalnetzwerk durchdringt beide Monomere des biologisch aktiven Dimers. Der für die Ligandenbindung verantwortliche Teil des Proteins wird also von beiden Monomeren gebildet, was auch an der unmittelbaren Nähe der Elektronendichte des Liganden zur Dimerisierungsfläche und dem Aminosäurepaar Glu155 und Arg195 deutlich wird. Auch das Lauryl-CoA-bindende FadR, das interessanterweise relativ hohe strukturelle Ähnlichkeit zu SCO3201 hat, besitzt Bindungstaschen, bei denen Interaktionen zwischen Ligand und Protein von beiden Monomeren gebildet werden Diskussion der Consensus-Sequenz Die von SCO3201 erkannten Operatorsequenzen sind nicht identisch und zeigen nur wenige stark konservierte Nucleotide. Untersuchungen bezüglich der Affinität von SCO3201 zu Promotorregionen der reprimierten Gene bestätigten die hohe Promiskuitivität des Regulators (siehe Abb. 4.8). Wie bereits in der Einleitung beschrieben, konnte der Beweis erbracht werden, dass SCO3201 in den Promotoren von fünf Genen mit verschiedener Funktion binden kann und zu einer Repression der entsprechenden Genexpression führt. Allerdings ist unklar, ob dieser Eigenschaft biologische Notwendigkeiten zugrunde liegen, oder ob lediglich der Effekt der 79

96 Diskussion Überexpression beobachtet wurde, da sich in einer Knock-out-Mutante kein veränderter Phänotyp feststellen ließ 5. Der Versuch der Erstellung einer Consensus-Sequenz dieser Gene und dem zentralen Palindrom im sco3201-promotor durch Dr. Delin Xu lässt kaum Schlüsse auf die nötigen Eigenschaften der Operatoren zu, einzig ein Adenin-Thymin-Basenpaar im Zentrum ist konserviert 5. Abb. 4.8: Mittels MEME erstelltes Konsensus-Motiv für die erkannte Sequenz von SCO3201 basierend auf den vermuteten Promotorsequenzen der von SCO3201 reprimierten Gene 125. Hohe Buchstaben zeigen hohe Konservierung. Nur wenige Nucleotide sind konserviert, darüber die BS C -Sequenz zum Vergleich. Es ist unklar, wie SCO3201 die Erkennung der sehr verschiedenen Operatoren bewerkstelligt, hier könnten gerade unspezifische Wechselwirkungen zwischen N-terminaler Helix und Basenpaaren oder Ribosephosphat-Rückgrat der kleinen Furche eine Erklärung für das untypische Verhalten von SCO3201 liefern, da TetR-Regulatoren zum weitaus größten Teil eine hohe Bindungsspezifität aufweisen. Ein Sequenzvergleich der vor DNase-Verdau geschützten Bereiche mit den vermuteten Promotorbereichen der reprimierten Gene zeigt auch außerhalb der palindromischen Sequenzen BS C keine starken Ähnlichkeiten, daher erscheint eine Erkennung spezifischer Reste durch den N-terminalen Bereich von SCO3201 unwahrscheinlich Konformationsänderungen von SCO3201 bei Ligandenbindung Durch die Verfügbarkeit eines Strukturmodells der Apo-Form des Regulators konnte eine Überlagerung mit der Heterodimer-Struktur durchgeführt werden. Obwohl in der 80

97 Diskussion Struktur 4cgr nur ein Monomer den unbekannten Liganden gebunden hat, ist davon auszugehen, dass eine Derepression durch Ligandenbindung in beiden Monomeren von SCO3201 erfolgt, da dies der typische Mechanismus bei TetR-Regulatoren ist. Wie bereits beschrieben, bildet das Kanalnetzwerk durch das SCO3201-Dimer in beiden Monomeren eine trichterförmige, mit hydrophoben Resten ausgekleidete Öffnung (Öffnung A, siehe 3.6.1). Diese ist in beiden Monomeren identisch und erlaubt bezüglich ihres Volumens die Bindung von Liganden in beiden Monomeren. Relativ zur regulatorischen Domäne ist die DNA-bindende Domäne bei Ligandenbindung um etwa 10 Å herausgewinkelt, im Dimer würde der HTH-Motiv-Abstand also um 20 Å vergrößert werden, wodurch die Affinität zur Operatorsequenz drastisch gesenkt wird, weil das SCO3201-Dimer nicht mehr beide Hälften seiner palindromischen Promotorsequenz binden kann. Auch wenn die Ergebnisse der Strukturanalyse dem vermuteten Mechanismus der Vergrößerung des HTH-Abstandes bei Induktion folgen, ist der Abstand im Dimer der Apo-Form mit ca. 28 Å wie erwähnt deutlich kleiner als die Ganghöhe der B-DNA (gemessen beim Stickstoff in Pro66). Sollte dies tatsächlich die biologisch aktive Konformation des DNA-bindenden SCO3201 sein, könnte das darauf hindeuten, dass das Protein eine Biegung der DNA erzwingt, um die große Furche optimal binden zu können. Da Apo-Formen von TetR-Regulatoren aber meist flexibler als ihre induzierten Gegenstücke sind, kann der stark verringerte Abstand auch eine Folge der Kristallisation sein. Die Kristallpackung könnte dabei eine Konformation erzwingen, die wegen der Flexibilität der Apo-Form zwar möglich, aber nicht biologisch relevant ist. Dass der Pro66-N-Abstand in beiden Homodimeren der asymmetrischen Einheit um ca. 1 Å unterschiedlich ist, kann als weiter Hinweis für die große Bewegungsfreiheit der DNA-bindenden Domänen der Apo-Form von SCO3201 interpretiert werden. Nichtsdestotrotz ist das Biegen der Operatorsequenz bei Komplexbildung ein gängiger Mechanismus unter den TetR-Regulatoren, die einen HTH-Abstand weit unter der Ganghöhe der erkannten Sequenz besitzen. Der TetR-Regulator TtgV sei hier als Beispiel genannt. Er hat zwar wenig strukturelle Ähnlichkeit mit SCO3201 bezüglich seiner regulatorischen Domäne, aber besitzt in seinem DNA-Komplex einen HTH- Abstand von weniger als 25 Å (Thr49-Thr49-Abstand). Besonders bemerkenswert bei letzterem ist die kooperative Erkennung einer überdurchschnittlich langen Operatorsequenz durch zwei Dimere, bei der in der DNA starke Biegungen erzwungen 81

98 Diskussion werden 63,126. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente lassen einen ähnlichen Mechanismus auch für SCO3201 möglich erscheinen. Letztendlich würde nur die Strukturlösung des Protein-DNA-Komplexes, die im Rahmen dieser Arbeit noch nicht durchgeführt wurde, endgültige Klarheit über die Art und Weise der DNA-Erkennung liefern. Insbesondere die Bedeutung der beiden unmittelbar nebeneinander liegenden Operatorsequenzen BS C und bs R im Promotor von sco3201 auf dessen Struktur wäre interessant. Außerdem könnte die Komplexierung mit der Promotorsequenz die Kristallisation und damit die Verwendung des Wildtyps für Röntgenbeugungsexperimente ermöglichen, wodurch Erkenntnisse über die Prolinreiche Sequenz des N-Terminus gewonnen werden könnten. Es stellt sich die Frage, wie die Konformationsänderung bei Ligandenbindung, deren Resultat letztlich eine Streckung von Helix 4 an der Position Gly87 ist, von SCO3201 bewerkstelligt wird. Der Abstand des höchstwahrscheinlich mit dem Liganden wechselwirkenden Restes Glu155 zu Gly87 beträgt etwa 12 Å, der Ligand, der sich von Glu155 in Richtung Solvens erstreckt, passiert die Helix 4 dabei genau an der Position von Gly87. Trotz des relativ großen Abstands von Glu155 zu Gly87 erscheint eine direkte Interaktion des Liganden mit dem Angelpunkt der Helix-4-Streckung daher denkbar. Bei genauerer Betrachtung erfolgt bei Ligandenbindung eine konzertierte Bewegung der Helices 4, 6 und 7 (siehe Abb. 4.9). Helix 4 G87 Helix 6 E149 Y84 Helix 7 E155 H152 Abb. 4.9: Helixbewegungen bei Ligandenbindung. In rot das nicht-induzierte Monomer, in blau das induzierte. Seitenketten von Tyr84, das der Bewegung von Helix 6 folgt, sowie von Glu149 und His152, deren Bewegung mit dem Abknicken von Helix 7 korreliert, in der Abbildung gekennzeichnet. Ligandenbindender Rest Glu155 und Angelpunkt der Helix-4-Bewegung Gly87 als schwarzer Punkt sind ebenfalls eingezeichnet. 82