Thrombozytäre Antikörperdiagnostik

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1 Thrombozytäre Antikörperdiagnostik Susanne Macher Thrombozytenlabor, UBT Graz 45. Jahreskongreß der DGTI September 2012 Graz

2 Übersicht Bildung und Funktion der Thrombozyten Thrombozytopenie immunologische Ursachen Nachweismethoden für thombozytäre Antikörper Beispiele für Krankheitsbilder bedingt durch thrombozytäre Antikörper Refraktärzustand auf Thrombozytentransfusionen Fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie

3 Thrombozyten - Blutplättchen Durchmesser 2 4 µm (kleinster zellulärer Blutbestandteil) Normbereich für Thrombozyten / µl Bildung im Knochenmark aus Megakaryozyten ( Plättchen / Megakaryozyt) Physiologische Lebenszeit ~ 7-10 Tage Abbau im RES (Milz, Leber)

4 Wichtigste Funktion physiologische Blutstillung Thrombozyten sind der zelluläre Bestandteil des Hämostasesystems Plättchenaggregation Aktivierung der plasmatischen Gerinnungskaskade Vasokonstriktion Aufrechterhaltung der Gefäßwandintegrität

5 Thrombozytopenie Störung der Hämostase Definition Thrombozytopenie: Thrombozyten < /µl Auftreten von petechialen Haut und Schleimhautblutungen bei Werten < /µl Cines DB, N Engl J Med 2002

6 Übersicht Bildung und Funktion der Thrombozyten Thrombozytopenie immunologische Ursachen Nachweismethoden für thombozytäre Antikörper Beispiele für Krankheitsbilder bedingt durch thrombozytäre Antikörper Refraktärzustand auf Thrombozytentransfusionen Fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie

7 ÄTIOLOGIE DER THROMBOZYTOPENIE Verbrauch Synthese Bildungsstörungen Kongenital Erworben Primär kongenital Fanconi-Syndrom Sekundär bei Erkrankungen des Wiskott-Aldrich-Syndrom May-Hegglin-Anomalie Knochenmarks mit Verdrängung der Amegakaryozytäre Thrombozytopenie (TAR-Syndrom) Hereditäre Thrombozytopenien mit Nierenerkrankungen Megakaryo- Alport-Syndrom und Thrombopoiese Epstein.Syndrom Amegakaryozytäre Thrombozytopenie Knochenmarksinfiltration (Leukämien, Karzinome, Maligne Lymphome) Knochenmarksschädigung (Medik., Ionisierende Strahlen, Toxine, Alkohol) Virale Infektion der Megakaryozyten Verdrängungsmyelopathie (Lipidspeicherkrankheiten, Osteomyelofibrose Osteomyelosklerose) Megakaryozytäre Thrombozytopenie (ineffektive Megakaryozytopoese) Fechtner-Syndrom Mangelzustände (Folsäure-, Eisen-, Vitamin B12-Mangel) Hereditäre Thrombozytopenien ohne Organanomalien Akuter u. chronischer Alkoholabusus Montreal-Platelet-Syndrom Zyklische Thrombozytopenie Sebastian-Platelet-Syndrom bei chron. Niereninsuffizienz Mediterrane Makrozytopenie bei paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie Courtesy of Katharina Schallmoser

8 ÄTIOLOGIE DER THROMBOZYTOPENIE Verbrauch Synthese Erworben Kongenital Nicht immunologisch bedingt bei Mb. hämolyticus neonatorum Unreife des Neugeborenen Nierenvenenthrombose bei liegendem Umbilikalvenenkatheter Infektionen (Röteln, Zytomegalie, HIV der Mutter) Kasabach-Meritt-Syndrom Immunologisch bedingt Mütterliche ITP Fetale/Neonatale Alloimmunthrombozytopenie (F/NAIT) Nicht immunologisch bedingt Splenomegalie Hämorrhagie mit massiver Bluttransfusion Infektionen bei DIC und Verbrauchskoagulopathie mechanisch (künstl. Herzklappen, extrakorporaler Kreislauf) Erhöhter ausgedehnte Verbrauch operative Eingriffe bei Blutungen Heparin-assoziierte Thrombozytopenie Hämangiome, arteriovenöse Anastomosen Immunmediierte Aktivierung und Abbau Hypothermie Weichteiltrauma Verteilungsstörung bei Splenomegalie Venöse Stase Thrombotische Mikroangiopathien (TTP, HUS, HELLP-Syndrom) Immunologisch bedingt Akute postinfektiöse oder chronische ITP Medikamentös-allergisch Heparin-induzierte Thrombozytopenie Refraktärzustand bei Thrombozytentransfusionen TP nach Antilymphozytenglobulintherapie Posttransfusionelle Purpura Evans-Syndrom (Autoimmun-Bizytopenie) Infektionsassoziierte Immunthrombozytopenie (HIV, HCV, H. pylori) Courtesy of Katharina Schallmoser

9 Thrombozyten - Antigene Typ I Antigene (auf Thrombozyten, anderen Blutzellen und auf Gewebezellen nachweisbar): ABH-Blutgruppenantigene HLA-Antigene der Klasse I Typ II Antigene = plättchenspezifische Antigene = Human Platelet Antigens (HPA) (typisch für Thrombozyten und Megakaryozyten, genetisch determinierte molekulare Varianten von Glykoproteinen auf der Plättchenmembran)

10 Human Platelet Antigens (HPA) Adaptiert von Arnold DM et al., Transf Med Rev 2008 HPA Antigene genetisch determinierte molekulare Varianten von Glykoproteinen auf der Plättchenoberfläche

11 Human Platelet Antigens (HPA) bisher publizierte HPAs: 6 diallele Antigensysteme (HPA 1-5, HPA 15) : a für das hochfrequente Allel, b für das antithetische niedrigfrequente Allel Niedrigfrequente Antigene

12 Thrombozyten - Antikörper HLA Klasse I Antigene Human Platelet Antigens (HPA) Bei Inkompatibiltäten im Rahmen von Transfusionen Transplantationen Schwangerschaften Bildung von thrombozytären Alloantikörperbildung mit ev. immunologischen Thrombozytopenien

13 Übersicht Bildung und Funktion der Thrombozyten Thrombozytopenie immunologische Ursachen Nachweismethoden für thombozytäre Antikörper Beispiele für Krankheitsbilder bedingt durch thrombozytäre Antikörper Refraktärzustand auf Thrombozytentransfusionen Fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie

14 Nachweismethoden für thrombozytäre Antikörper ELISA Serum wird gegen rekombinante Plättchen Antigene (GPIIb/IIIa HPA 1a/b, HPA 2a/b, HPA 3a/b, GPIa/IIa, HPA 4a/b, HPA 5a/b, GPIb/IX, GPIV) und gegen HLA I Antigene aufgetragen, Sichtbarmachen ev. gebundener Antikörper durch enzymatisch ausgelöste Farbreaktion Festphasen Immunoassay Serum wird gegen Plättchenmembranen der BG O mit bekannten HLA - A, und - B Antigenen und HPA Antigenen aufgetragen, Sichtbarmachen ev. gebundener Antikörper durch Aufbringen von mit Anti-IgG gecoateten Indikatorerythrozyten Thrombozyten - Crossmatch als Kreuzprobe Festphasen- Immunoassay, Thrombozyten der zu testenden Konzentrate werden vorgelegt

15 Nachweismethoden für thrombozytäre Antikörper MAIPA (Monoclonal Antibody-specific Immobilisation of Platelet Antigens) Durchflußzytometrische Testverfahren zum Nachweis von Anti- HLA und plättchenspezifischer Antikörper Lymphozytotoxischer Test (LCT) für HLA-Klasse-I-Antikörper ELISA (Screening und Differenzierung v. HLA-Klasse-I-Antikörper)

16 Übersicht Bildung und Funktion der Thrombozyten Thrombozytopenie immunologische Ursachen Nachweismethoden für thombozytäre Antikörper Beispiele für Krankheitsbilder bedingt durch thrombozytäre Antikörper Refraktärzustand auf Thrombozytentransfusionen Fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie

17 Auswirkungen von thrombozytären Antikörpern Refraktärität auf Thrombozytenkonzentrate Definition der Refraktärität: mindestens zweimaliges Ausbleiben eines adäquaten Thrombozytenanstieges nach Transfusion einer ausreichenden Menge ABO-kompatibler, möglichst frischer Thrombozyten. Beurteilung des Transfusionserfolges mittels Inkrement (Plättchenanstieg nach Transfusion) bzw. Berechnung des korrigierten Inkrements (CCI): CCI = Inkrement (x109 /l) x Körperoberfläche (m 2 ) Anzahl der transf. Plt (x10 11 )

18 Refraktärität auf Thrombozytentransfusionen Welche CCI Werte sind unzureichend? CCI < 7.500/µl CCI < 5.000/µl 1 Stunde posttransfusionell 24 Stunde posttransfusionell Pavenski K et al., Tissue Antigens 2012

19 Ursachen für Refraktärität auf Pättchentransfusionen Pavenski K et al., Tissue Antigens 2012

20 Wie häufig findet man thrombozytäre Antikörper bei refraktären Patienten Nachweis thrombozytärer Ak bei 113/252 (44.8%) der refraktären Patienten: 108/252 (42.9%) HLA Klasse I Antikörper 20/252 (8%) HPA Antikörper Eigene Anforderung mit Zuweisung Refraktärität n = 13 (Zeitraum ) 7/13 keine thrombozytären Antikörper nachweisbar 6/13 (46%) HLA Klasse I Antikörper nachweisbar (davon 1 Patient zusätzlich Antikörper gegen thrombozytäre Glykoproteinkomplexe)

21 Versorgung von Thrombozytenrefraktären Patienten Behandlung der nicht immunologischen Ursachen Wenn Immunisierung nachgewiesen ist, dann Versorgung mit kompatiblen Thrombozytenkonzentraten: 3 Strategien: HLA-matching (HLA - A und - B) Crossmatching Vermeidung der Antigene gegen die der Patient sensibilisiert ist Hod et al., British Journal of Haematology, 2008

22 Übereinstimmungsgrade des HLA - matches bei Thrombozytentransfusionen 1. A match: alle 4 A und B Loci sind ident 2. BU match: der Spender hat keine Allele die dem Empfänger fehlen aufgrund von homozygoten Allelen beim Spender 3. BX match: eine kreuzreaktive HLA-A oder -B Inkompatibilität 4. C match: der Spender hat eine nicht kreuzreaktive Inkompatibiltät 5. D match: der Spender hat zwei oder mehr kreuzreaktive Inkompatibiltäten Korrelation zwischen Match Grad und CCI Moroff et al., 1992

23 Versorgung von Thrombozytenrefraktären Patienten Crossmatching: Der Pool an Spendern kann enorm erweitert werden da auch HLA match Grad C oder D Spender im Crossmatch negativ sein können und damit für die Versorgung in Frage kommen Suche nach Antigen - negativen Spendern: Wenn beim Patienten spezifische Antikörper identifiziert wurden, sucht man solche Spender denen die korrespondierenden Antigene fehlen weitere Erhöhung der Spenderanzahl Kooperation zwischen behandelndem Arzt und Transfusionsmediziner

24 Thrombozytenrefratärität und Beeinträchtigung der Thrombopoese durch Anti-HPA-1a nach allogener HSCT 52 jähriger männl. Patient Diagnose: Multiples Myelom hämatopoetische Stammzellen vom HLA-A,-B,- C,-DR identen Bruder nach nicht myeloablativer Chemotherapie Engraftment der Erythrozyten und Leukozyten am Tag 12 Figure (Fig) 1. Clinical course of the patient, showing plt counts, plt concentrates (continuous arrows) and erythrocyte transfusions, plt platelet kontinuierlichen Abfall der Plättchen

25 Anti-HPA-1a nach allogener Stammzell-Transplantation Nachweis von HPA-1a Antikörpern und HLA I Antikörpern zum Zeitpunkt der Thrombozytopenie

26 Anti-HPA-1a nach allogener Stammzell-Transplantation Control (Contr.) bands Specific (Spec.) bands HPA -1bb, -2aa, -3ab, -5aa HPA Genotypisierung des Patienten vor der Transplantation Contr. bands Spec. bands HPA -1ab, -2aa, -3aa, -5aa HPA Genotypisierung des Spenders Contr. bands Spec. bands HPA -1ab, -2aa, -3aa, -5aa HPA Genotypisierung des Patienten 14 Tage nach der Transplantation HPA-1a Antikörper wurden von Empfänger-Zellen gebildet und beeinträchtigte die HPA-1a positive Spenderthrombopoese

27 Übersicht Bildung und Funktion der Thrombozyten Thrombozytopenie immunologische Ursachen Nachweismethoden für thombozytäre Antikörper Beispiele für Krankheitsbilder bedingt durch thrombozytäre Antikörper Refraktärzustand auf Thrombozytentransfusionen Fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie

28 Fetale / Neonatale Alloimmunthrombozytopenien (F/NAIT) Isolierte Antikörperbedingte Thrombozytopenie des Fetus oder Neugeborenen mit petechialen Blutungen Milde Verlaufsformen bleiben oft unentdeckt Häufigkeit 1 : : 5000 aller Neugeborenen In 50% ist bereits die erste Schwangerschaft betroffen Wenn ein Kind betroffen ist, dann beinahe 100% Risiko für eine NAIT beim nächsten inkompatiblen Kind Komplikation: Auftreten von intrazerebralen Blutungen bei 10% der betroffenen Kinder (davon 10% mit letalem Ausgang und 20% mit neurologischen Folgeerkrankungen)

29 Pathogenese der F/NAIT Ab der 16. SSW sind fetale Thrombozytenantigene nachweisbar fetaler Plättchen treten in den mütterlichen Kreislauf über Bei Inkompatibilität der mütterlichen HPAs und der vom Vater vererbten fetalen HPAs kann es zu einer Alloimmunisierung der Mutter kommen Mütterliche IgG Antikörper gegen HPA Antigene des Feten gelangen in den fetalen Kreislauf Fc-mediierter Thrombozytenabbau im fetalen RES Fetale / neonatale Immunthrombozytopenie

30 SPEKTRUM HPA-SPEZIFISCHER AK BEI F/NAIT HPA-spezifische Ak bei 1162 (31%) von 3743 Müttern mit Verdacht auf NAIT nachgewiesen ( ). Courtesy of Katharina Schallmoser Davoren A. et al., Transfusion 2004

31 DIAGNOSE DER NAIT Klinische Verdachtsdiagnose Ev. positive Anamnese früherer SS Testung auf thrombozytäre Alloantikörper der Mutter HPA-Genotypisierung der Eltern und des Kindes Courtesy of Katharina Schallmoser

32 SCREENING FÜR F/NAIT Zwei mögliche Ansätze: Screening in der Schwangerschaft für HPA-1bb Genotypus und konsekutiv für Anti-HPA-1a Antikörper nur in ~ 80% kausal für F/NAIT Screening der Neugeborenen für Thrombozytopenie (Blutbild aus NS-Blut) nur postnatale Diagnose Courtesy of Katharina Schallmoser

33 Evaluierung der F/NAIT Frequenz in Graz Thrombozytenbestimmung von 1929 EDTA - Nabelschnurblutproben innerhalb 24 Stunden nach der Geburt am automatischen Blutbildautomat (Sysmex) (Oktober 2003 bis Februar 2005) 744 Proben ausgeschlossen aufgrund von Koagel n = 146 Plättchenaggregate n = 596 zu geringes Probenvolumen n = 10

34 Evaluierung der F/NAIT Frequenz in Graz 1185 Proben wurden ausgewertet 1130 Proben mit Plt > über /µl 40 Proben mit Plt /µl Anamnese: keine Blutungssymptomatik > 15 Proben mit Plt < /µl: Leuco (x10e3/µl) Hb (g/dl) Plt (x10e3/µl) MPV (fl) Median (range) 6,4 (2,2-21,3) 15,4 (11,8-18,3) 62,0 (5,0-92,0) 11,6 (10,0-12,8) 12 NG: Kapilläre BB-Kontrolle o.b., keine Blutungsneigung. 1 NG: Sepsis, daher thrombozytopenisch 1 NG: Thrombozytopenie, Antikörperscreening negativ, kein Genotypenmismatch

35 Neugeborenes D.J., geb Männl., 3250g, 51cm Plt Zahl im NS-Blut /µl, kapilläre Kontrolle /µl, Petechien Anamnese: Mutter D.M., 39a, 4 Gravida, Spontangeburt in 40.SSW Frühere SS komplikationslos, Autoimmunthyreoiditis, normale Plt-Werte, keine Medikamente Testung auf mütterliche thrombozytäre Alloantikörper Anti-HPA-1a im mütterlichen Serum nachweisbar Genotypus: Mutter HPA-1bb Vater HPA-1ab NAIT in 1 von 1185 NS-Proben 0,08% Plt-Wert des NG am Tag 3: ~ /µl; Milder selbst limitierender Verlauf ohne Therapie, aber erhöhtes Risiko in weiterer SS!

36 NAIT durch Anti-HPA-3a NG, männl., 38.SSW, I Gravid Petechien, Plt 9.000/µl, keine Entzündungs- od. Infektionsmarker, Verdacht auf NAIT Thrombozytenkonzentrat HPA-1bb transfundiert + IVIG Plt /µl Genotypisierung Mutter HPA-1ab,-2aa,-3bb,-4aa,-5aa,-15bb Neugeb. HPA-1ab,-2aa,-3ab,-4aa,-5aa,-15bb Tag 2: Plt /µl Thrombozytenkonzentrat HPA-3bb transfundiert Plt /µl

37 NAIT durch Anti-HPA-3a Serologische HPA- Antikörperabklärung: Anti-HPA-3a nur in Assays mit intakten Plt-Membranen (Solid-Phase-Assays) direkt post partum und bis 6 Monate danach nachweisbar, ELISA und MAIPA negativ.

38 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit