Stellenwert des Hevylite -Assay in der Diagnose sowie der Rezidiv- bzw. Verlaufsbeurteilung beim Multiplen Myelom

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1 I Aus dem Department Innere Medizin und dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin, Klinik für Innere Medizin I, Schwerpunkt Hämatologie, Onkologie und Stammzelltransplantation der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau - Ärztl. Direktor: Prof. Dr. K. Winkler - - Ärztl. Direktor: Prof. Dr. J. Duyster - Stellenwert des Hevylite -Assay in der Diagnose sowie der Rezidiv- bzw. Verlaufsbeurteilung beim Multiplen Myelom INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt 2014 von Felix Alexander Gaiser geboren in Freiburg im Breisgau

2 II Dekanin der Medizinischen Fakultät: Prof. Dr. K. Kriegelstein Erstgutachter: Prof. Dr. E. Bissé Zweitgutachter: Prof. Dr. M. Engelhardt Jahr der Promotion: 2014

3 III Meiner Familie

4 Inhaltsverzeichnis IV INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... IV Abkürzungen... VI 1. Einleitung Das Multiple Myelom Definition Epidemiologie Ätiologie und Risikofaktoren Pathogenese Klassifikation Stadieneinteilung Klinik Diagnostik Prognose Therapie Remissionskriterien Hintergrund zu Freelite und Hevylite Ziel der Arbeit Patienten, Material und Methoden Patientenkollektiv Datenerhebung Labordiagnostische Untersuchung Klinische Chemie und Hämatologie Serumproteine Freie Leichtketten Hevylite Statistik Ergebnisse Charakteristika des Patientenkollektives Deskriptive Auswertungen Sensitivität von Hevylite gegenüber anderen Methoden (Immunfixation, Freelite-Assay) Sensitivität im Vergleich zur Immunfixation Sensitivität im Vergleich zum Freelite-Assay Serum HLC Konzentrationen bei Patienten mit monoklonalem Paraprotein Zusammenhang zwischen Hevylite und dem Stadium nach D&S bzw. nach ISS Vergleich zwischen Hevylite und Stadium bei IgG-MM Patienten Vergleich zwischen Hevylite und Stadium bei IgA-MM Patienten Zusammenhang von Hevylite und dem Remissionsstand nach EBMT Vergleich zwischen Hevylite und Remissionsstand bei IgG-MM Patienten Vergleich zwischen Hevylite und Remissionsstand bei IgA-MM Patienten Analyse des Zusammenhanges zwischen Hevylite und Standard MM- Remissionsparametern (Gesamteiweiß, Y-Globulinfraktion, M-Paraprotein, Gesamt-Ig Paraproteinwerte) Progressionsfreies- und Gesamtüberleben Gruppe 1.1: Mediane HLC-Ratio bei allen Patienten Gruppe 2.1: HLC-Ratio 0, bei allen Patienten... 59

5 V Gruppe 3.1: HLC-Ratio 0,5-50 bei allen Patienten Gruppe 1.2: Mediane HLC-Ratio bei IgG- und IgA-MM Patienten Gruppe 2.2: HLC-Ratio 0, bei IgG- und IgA-MM Patienten Gruppe 3.2: HLC-Ratio 0,5-50 bei IgG- und IgA-MM Patienten Morbus Waldenström, IgM-MGUS Patienten und Hevylite Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf Veröffentlichungen... 82

6 Abkürzungen VI ABKÜRZUNGEN α alpha β beta β 2 -MG β 2 -Microglobulin BSG Blutsenkungsgeschwindigkeit bzw beziehungsweise CLL Chronisch lymphatische Leukämie CR Complete Remission CRAB Hypercalcemia, renal impairment, anemia, bone disease CRP C-reaktives Protein CT Computertomographie DGHO Deutsche Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie dl Deziliter EBMT European Group for Blood and Marrow Transplantation ED Erstdiagnose FDG-PET Positronen Emissionstomographie FGFR3 Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 3 FISH Fluoreszenz in-situ Hybridisierung FLC Freelite -Assay γ gamma g Gramm h Stunde HLC Hevylite -Assay HR Hazard Ratio IFE Immunfixations Elektrophorese Ig Immunglobulin(e) IL Interleukin IMWG International Myeloma Working Group ISS International Staging System Κ Kappa KM Knochenmark λ Lambda l Liter LCDD light chain deposition disease LCMM light chain Multiples Myelom LDH Laktatdehydrogenase mg Milligramm MGRS Monoklonale Gammopathie renaler Signifikanz MGUS Monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz ml Milliliter MM Multiples Myelom MRT Magnet-Resonanz-Tomographie MW Morbus Waldenström OS overall survival PD Progressive Disease PFS Progression-free survival PR Partial Response RANKL Receptor Activator of NF-κB Ligand scr Stringent complete Response SD Stable Disease SMGUS Sympthomatisches MGUS SMM Smoldering Multiples Myelom TNF Tumornekrosefaktor vgpr very good Partial Response

7 1. Einleitung 1 1. EINLEITUNG 1.1 DAS MULTIPLE MYELOM DEFINITION Beim Multiplen Myelom (Plasmozytom) handelt es sich um die zweithäufigste B-Zell- Neoplasien in Deutschland beim Erwachsenen, nach der CLL. Es gehört zu der Gruppe der niedrig malignen Non-Hodgkin Lymphome, bei der es zu einer unkontrollierten monoklonalen Expansion terminal differenzierter B-Lymphozyten (Plasmazellen) kommt. Charakteristisch für das Multiple Myelom ist eine übermäßige Bildung funktionsunfähiger Immunglobuline oder Immunglobulinbruchstücke, sogenannten Leichtketten. Diese sind im Serum und/oder im Urin als monoklonales Paraproteinen oder M-Proteine nachweisbar (Berger et al. 2013; Kortüm et al. 2013) EPIDEMIOLOGIE Die Inzidenz in Europa und Nordamerika liegt bei ca. 5,6 Fälle/ /Jahr mit steigender Tendenz im zunehmenden Lebensalter. Dabei macht das Multiple Myelom ca. 1% aller malignen Neoplasien und 13% der malignen hämatologischen Erkrankungen aus. Das mediane Erkrankungsalter liegt zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bei 70 Jahren; 35% der Patienten sind jünger als 65 Jahre, 28% zwischen 65 und 74 Jahre alt und 37% älter als 75 Jahre. Männer sind häufiger betroffen als Frauen (Berger et al. 2013; Kortüm et al. 2013) ÄTIOLOGIE UND RISIKOFAKTOREN Die Ätiologie des Multiplen Myeloms ist unbekannt. Allerdings werden verschiedene Risikofaktoren, wie ionisierende Strahlung, die Verwendung von Pestiziden in der Landwirtschaft, der Kontakt mit Schwermetallen, Benzolen und organischen Lösungsmitteln sowie chronische Antigenexposition und Viren (Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus) sowie eine familiäre Disposition diskutiert, welche für die Entstehung des Multiplen Myeloms mitverantwortlich sein könnten bzw. dieses begünstigen können (Berger et al. 2013; Kortüm et al. 2013) PATHOGENESE Nach bisherigem Kenntnisstand und auf der Grundlage von klinischen und genetischen Daten geht man heute davon aus, dass jeder MM-Erkrankung eine monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz vorausgeht (Landgren et al. 2009; Harousseau und Moreau 2009).

8 1. Einleitung 2 Im Verlauf dieser komplexen Reifung der Plasmazellen kann es zu verschiedenen primären chromosomalen Aberrationen kommen, welche bereits bei der Monoklonalen Gammopathie unklarer Signifikanz zu finden sind und eine entscheidende Rolle bei der Myelomentstehung zu spielen scheinen. Dabei werden verschiedene pathogenetische Veränderungen unterschieden: bei nicht-hyperdiploiden Veränderungen (50%), liegen häufig primäre Translokationen des IgH-Lokus auf Chromosom 14q32 (t(11;14), t(4;14)) vor und werden bereits früh in der Myelompathogenese detektiert. Bei hyperdiploiden Veränderungen liegen zusätzliche Chromosomen, wie der Trisomie der Chromosomen 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 und 21 vor und werden in wesentlich geringerer Prävalenz IgH-Translokationen und Monosomien von Chromosom 13, im Vergleich zu nicht-hyperdiploiden Tumoren, beobachtet. Zusätzlich konnten weitere molekulare Abweichungen, wie eine erhöhte Expression der Onkogene Cyclin D1, D2 und D3 gezeigt werden (Harousseau und Moreau 2009; Bergsagel 2005; Ngo et al. 2010). Im weiteren Verlauf der Erkrankung kommen sekundäre Translokationen, Mutationen in den Onkogenen NRAS, KRAS, FGFR3 und im Tumorsuppressorgen TP53 und MYC-Dysregulationen vor, welche zur Progression der Krankheit beitragen. In Abbildung 1.1 ist dieser Prozess schematisch dargestellt (Palumbo und Anderson 2011). Erklärungen und Abkürzungen: Cycline= Proteine, welche die phasenspezifische Genexpression während des Zellzyklus steuern; RAS= Protoonkogen; FGFR3= Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 3; Myc= Protoonkogens, das für das Protein C-Myc kodiert, welches die Expression anderer Gene verstärkt; TP53= Tumorprotein 53, welches bei Mutation zur unkontrollierten Tumorbildung führt. Abbildung 1.1. Mehrstufenprozess der Myelomentstehung. Modifiziert nach Palumbo und Anderson 2011.

9 1. Einleitung KLASSIFIKATION Neben dem Multiplen Myelom gibt es eine Reihe anderer Erkrankungen, welche zum Formenkreis der monoklonalen Gammopathien gezählt werden. Eine Zusammenfassung der Klassifikation der Plasmazellerkrankungen anhand der Diagnosekriterien der International Myeloma Working Group ist in Abbildung 1.2 dargestellt (Criteria for the classification of monoclonal gammopathies, multiple myeloma and related disorders: a report of the International Myeloma Working Group 2003). Die monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz ist charakterisiert durch ein monoklonales Paraprotein im Serum von < 30 g/l, einer klonalen Plasmazellinfiltration des Knochenmarks von <10% sowie fehlenden myelomassoziierten Organfunktionsstörungen und Osteolysen. Das Risiko eines MGUS in ein MM überzugehen liegt bei ca. 1% pro Jahr (Landgren et al. 2009; Harousseau und Moreau 2009; Rajkumar 2013). Bei manchen Patienten kann ein ebenfalls asymptomatisches, aber weiter fortgeschrittenes prämalignes Stadium, das sogenannte Smoldering Multiples Myelom, beobachtet werden. Dies ist durch ein monoklonales Paraprotein im Serum von > 30 g/l, mehr als 10% Plasmazellen im Knochenmark, aber keinen End-Organschäden charakterisiert. Beim Smoldering Multiplen Myelom selbst liegt das Risiko in ein MM überzugehen bei ca. 10%/Jahr, wobei dieses in den ersten 5 Jahren bei 10%/Jahr liegt, für die nachfolgenden 5 Jahre bei 3%/Jahr und für die letzten 10 Jahre bei 1,5%/Jahr abnimmt (Rajkumar 2013). Das symptomatische Multiple Myelom ist durch den Nachweis eines monoklonalen Immunglobulins im Serum und/oder im Urin (Immunglobulin-Leichtketten eines Typs auch Bence-Jones-Proteine genannt) charakterisiert, einer Plasmazellinfiltration des Knochenmarks von 10% und dem Nachweis einer Endorganschädigung in Form der CRAB-Kriterien = C: Hyperkalzämie, R: Niereninsuffizienz (Kreatinin > 1,4 mg/dl), A: Anämie (Hb < 10 g/dl oder 2 g/dl < Norm), B: Osteolyse(n) oder Osteoporose (Berger et al. 2013). Des Weiteren bestehen bestimmte Sonderformen, wie das solitäre Plasmozytom, bei dem singuläre oder multiple ossäre oder extraossäre Plasmazelltumore, ohne systemische Beteiligung, auftreten können und die Plasmazellleukämie, die durch die Ausschwemmung der Myelomzellen ins periphere Blut charakterisiert ist.

10 1. Einleitung 4 Erklärungen und Abkürzungen: MGUS= Monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz, CRAB-Kriterien: Hyperkalzämie ( hypercalcemia ), Niereninsuffizienz ( renal insufficiency ), Anämie ( anemia ), Knochendestruktion ( bone lesions ) Abbildung 1.2. Klassifikation der Plasmazellerkrankungen anhand der Diagnosekriterien modifiziert nach der International Myeloma Working Group (Criteria for the classification of monoclonal gammopathies, multiple myeloma and related disorders: a report of the International Myeloma Working Group 2003). Nach ihrer Paraproteinbildung lassen sich sekretorische Myelome (IgG-, IgA-, IgD-, IgE-, IgM-MM), κ-/λ-leichtketten-mm (Bence-Jones-Myelom) und asekretorisch Myelome unterscheiden (Tabelle 1.1). Tabelle 1.1. Einteilung der Häufigkeiten nach Paraproteinbildung Myelomtyp Häufigkeit IgG-MM 55 % IgA-MM 25 % IgD-, IgE-, IgM-MM 1 % κ-/λ-leichtketten-mm (Bence-Jones-MM) 20 % Asekretorisches MM 1-2 % STADIENEINTEILUNG Bereits im Jahre 1975 wurde von Brian G. M. Durie, M.D. und Sydney E. Salmon, M.D. das bis heute verwendete Staging System nach Durie & Salmon eingeführt, welches das Multiple Myelom in 3 Stadien einteilt und eine grobe Abschätzung der Tumorzellmasse erlaubt (Tabelle 1.2; (Durie und Salmon 1975).

11 1. Einleitung 5 Tabelle 1.2. Stadieneinteilung nach Durie & Salmon (1975) Stadium I (alle Kriterien müssen erfüllt sein) Stadium II Stadium III (mind. 1 Kriterium muss erfüllt sein) Hämoglobin > 10 g/dl < 8,5 g/dl Serumkalzium < 12 mg/dl (normal) > 12 mg/dl Knochen 1 Osteolyse 2 Osteolysen Paraproteinsynthese (M-Gradient) IgG < 5 g/dl IgA < 3 g/dl Bence-Jones-Protein im Urin < 4 g/24 h Weder Stadium I noch III IgG > 7 g/dl IgA > 5 g/dl Bence-Jones-Protein im Urin > 12 g/24 h Zusatzbezeichnung A B Nierenfunktion Normal Eingeschränkt (Kreatinin > 2 mg/dl) Dadurch, dass heutzutage häufig eine genauere Knochenbildgebung mittels CT, MRT oder FDG-PET erfolgt, ist zur richtigen Einschätzung nach Durie & Salmon bzw. für den früheren Therapiebeginn die Durie/Salmon-Plus-Klassifikation nach Durie et al. vorgeschlagen worden (Tabelle 1.3; (Durie et al. 2003). Tabelle 1.3. Durie/Salmon-plus-Klassifikation nach Durie et al Klassifikation Plus Neuere Bildgebung: MRT und/oder FDG PET MGUS Negativ I A Maximal einzelner Myelomherd I B < 5 fokale Läsionen; geringe diffuse Infiltration II A/B 5-20 fokale Läsionen; moderate diffuse Infiltration III A/B > 20 fokale Läsionen; schwerer diffuser Befall Zusatzbezeichnung A B Nierenfunktion Kreatinin < 2 mg/dl, keine extramedulläre Erkrankung Kreatinin 2 mg/dl, extramedullärer Befall Greipp P. R. et al. konnte im Jahr 2005 zeigen, dass die Kombination aus Serum-β2-MG und Serum-Albumin als prognostische Marker genutzt werden können und entwickelte daraus die Internationale Staging System (ISS) Klassifikation, welche das Multiple Myelom, ähnlich dem Staging System nach Durie & Salmon, in 3 verschiedene Stadien einteilt, wobei ausschließlich das Serum-β2-Mikroglobulin und das Serum Albumin verwendet werden (Tabelle 1.4) (Greipp 2005). Im Gegensatz zum Staging System nach Durie & Salmon, welches die Myelomlast wiederspiegelt, ist das ISS eine eher prognostische Klassifikation. Aus diesem Grund werden heutzutage beide Klassifikationssysteme parallel angewendet.

12 1. Einleitung 6 Tabelle 1.4. Stadieneinteilung nach Internationale Staging System (ISS 2005) Stadium Definition Medianes Überleben (Monaten) I β 2 -Mikroglobulin < 3,5 mg/l und Albumin 3,5 g/l 62 II weder Stadium I noch Stadium III 44 III β 2 -Mikroglobulin 5,5 mg/l KLINIK Bei den meisten Myelom-Patienten ist die Erkrankung initial eher asymptomatisch bzw. äußert sich mit unspezifischen Symptomen wie Müdigkeit und Knochen- / Rückenschmerzen. Im weiteren Krankheitsverlauf treten zum Teil sehr unterschiedliche Symptome auf. Mit bis zu 70% zählen Knochen- und Rückenschmerzen der Wirbelsäule und den Rippen, sowie Spontanfrakturen zu den häufigsten Symptomen, welche auf eine Expression von Osteoklasten aktivierenden Faktoren (IL-1β, TNF-β, IL-6, RANKL) und somit auf eine erhöhte Osteoklastenaktivität zurückzuführen sind (Sirohi und Powles 2004). Bedingt durch die hohe Osteoklastenaktivität kann es zur Hyperkalzämie kommen. Weitere Symptome sind durch Anämie bedingte Blässe, Müdigkeit und Leistungsminderung, welche bei 40 60% der Patienten zu beobachten sind. Durch die Infiltration der Plasmazellen ins Knochenmark kommt es zur Verdrängung der Hämatopoese. Hierdurch können neben der Anämie auch Thrombopenien und Leukopenien auftreten. Durch die Leukopenie bzw. Immunglobulinmangel kann es zu vermehrt rezidivierenden bakteriellen Infekten kommen. Weitere klinische Manifestationen und ihre Häufigkeit sind in Tabelle 1.5 dargestellt. Tabelle 1.5. Symptomatik des Multiplen Myeloms (Berger et al. 2013) Klinische Manifestation Häufigkeit Osteolysen, Knochenschmerzen, Spontanfrakturen 70% Anämie, Blässe, Müdigkeit, Leistungsminderung 40-60% Nierenfunktionsstörungen, Oligurie, Anurie 20-50% Thrombozytopenie, Blutungen (petechialer Blutungstyp) 15% Granulozytopenie, Antikörpermangel, Infektneigung 15% Herzinsuffizienz (Amyloidose) 10% Sehstörungen, Krampfanfälle, periphere Neuropathie 5-10% Hyperviskositäts-Syndrom, Perfusionsstörungen < 5% Gewichtsverlust, selten Fieber, Nachtschweiß < 5%

13 1. Einleitung DIAGNOSTIK Nach den Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie (DGHO) wird bei einem Verdacht auf ein Multiples Myelom als erster Schritt eine ausführliche Anamnese sowie eine körperliche Untersuchung erhoben. Die folgenden diagnostischen Schritte beinhalten neben einigen Laboruntersuchungen auch eine Knochenmarksdiagnostik sowie bildgebende Verfahren. Bei den Laboruntersuchungen handelt es sich im Einzelnen um folgende: Blutbild einschließlich Differentialblutbild, Routinelabor mit Elektrolyten, Nierenretentionswerten, Harnsäure, Albumin, LDH,CRP, BSG, β 2 -Mikroglobulin, Serum-Gesamteiweiß, Serum-Eiweißelektrophorese mit Bestimmung des M-Gradienten, Serum-Immunfixations-Elektrophorese, Urineiweiß, Urin-Eiweißelektrophorese mit Bestimmung des M-Gradienten, Urin-Immunfixations-Elektrophorese, Nachweis von Leichtketten im Urin ( Bence-Jones-Proteinurie ), Immunglobuline (IgG, IgA, IgM) quantitativ und Freie Kappa- und Lambda-Leichtketten im Serum quantitativ incl. Berechnung des Quotienten. Mit Hilfe der Eiweißelektrophorese können die Eiweiße im Serum bzw. im Urin in ihre einzelnen Bestandteile aufgetrennt werden und somit die einzelnen Gruppen genauer betrachtet werden. Abbildung 1.3A zeigt eine normale Eiweißelektrophorese eines Gesunden ohne Multiple Myelom Paraproteinveränderung, mit der typischen Aufteilung in die Albuminfraktion, welche im Blut den größten Anteil am Gesamtproteinen ausmacht und in die 4 verschiedenen Globulinfraktionen, mit α1-, α2-, β- und γ-globulinen. In Abbildung 1.3B ist die Eiweißelektrophorese eines IgGκ-MM-Patienten zu sehen, wie sie typischerweise bei der Diagnose des MM vorkommt. Auffällig sind dabei die verminderte Albuminfraktion sowie die deutliche Erhöhung der γ-globulin-fraktion, welche auch als M-Gradient bezeichnet wird. Grund hierfür ist die gesteigerte Paraproteinsynthese, in diesem Fall des Immunglobulins IgG und Kappa. Probleme bei der Paraproteinbestimmung mit Hilfe der Eiweißelektrophorese entstehen immer wieder, da die Bestimmung des pathologischen Peaks (M-Gradienten) in der γ-globulin-fraktion nicht einheitlich ist und somit stark vom Untersucher abhängt. Außerdem kommt es teilweise vor, dass Paraproteine nicht in der γ-globulin-fraktion, sondern in einer anderen Fraktion zu finden sind oder von anderen Serumkomponenten überlagert werden, was eine genaue Bestimmung des M-Gradienten erschwert oder sogar unmöglich macht. Die Knochenmarkdiagnostik wird zur Bestimmung der Plasmazellinfiltration eingesetzt, welche ein wichtiger Bestandteil der Diagnosekriterien nach IMWG darstellt. Ebenso wichtig,

14 1. Einleitung 8 wie die zytologische und histologische Beurteilung der Plasmazellen, ist in den letzten Jahren die zytogenetische Untersuchung mit Hilfe von konventionelle Chromosomenanalysen und Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) geworden. Mit ihrer Hilfe lässt sich das MM in verschiedene Risikogruppen aufteilen. Zur Beurteilung von Osteolysen oder diffusen Osteoporosen wird heutzutage als Standardverfahren eine Projektionsradiographie des Stammskeletts, Schädel und Röhrenknochen nach Pariser Schema durchgeführt. Diese beinhaltet die Untersuchung folgender Regionen: Schädel in zwei Ebenen, Wirbelsäule in zwei Ebenen, Thorax mit Rippendarstellung, Beckenübersicht und proximale Extremitätenabschnitte in zwei Ebenen. Die Computertomographie (CT), ohne Kontrastmittelgabe in sogenannter low dose Technik, bietet eine im Vergleich zur klassischen Projektionsradiographie bessere Spezifität und Sensitivität für den Nachweis von Knochenläsionen bei vergleichbarer Strahlendosis. Bei Verdacht auf extramedulläre Manifestation und neurologischer Symptomatik mit Wurzelkompressionssyndrom können zusätzlich der Einsatz von Magnet-Resonanz- Tomographie (MRT) und (FDG)-Positronen Emissionstomographie (PET) sinnvoll sein. Hierbei handelt es sich allerdings nicht um Standardverfahren, sondern diese sind Gegenstand klinischer Studien. Abbildung 1.3. Serum-Eiweißelektrophorese: A) Gesunder. B) Patient mit IgG-Kappa-Multiplen Myelom.

15 1. Einleitung PROGNOSE In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass definierte chromosomale Aberrationen mit einer schlechteren Prognose assoziiert sind. Mit Hilfe der FISH-Untersuchung (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) kann das Multiple Myelom nach z.b. der Mayo Clinic, im Hinblick auf die Prognose und einer risikoadaptierten Therapie in 3 verschiedene Risikogruppen eingeteilt werden (Tabelle 1.6; (Rajkumar 2013). Tabelle 1.6. Zytogenetische Risikoklassifikation beim Multiplen Myelom Standard-Risiko Intermediär-Risiko Hoch-Risiko Trisomie (Hyperdiploidie) t(4;14) Deletion 17pt(11;14) t(14;16) t(6;14) t(14;20) 1q + 1p Veränderungen Hoch-Risiko Genexpressionsprofil adaptiert nach Rajkumar 2013 Neben der Zytogenetik können weitere Prognosefaktoren, wie das Alter, Karnofsky Performance Status, die Anzahl an Komorbiditäten, die Nierenfunktion, das ISS und D&S Stadium, die erhöhte Laktatdehydrogenase sowie der Plasmazell-Labeling-Index und das Therapieansprechen für eine Risikoeinschätzung verwendet werden (Rajkumar 2013; Bergsagel et al. 2013; Kleber et al. 2009; Kleber et al. 2011; Kleber et al. 2012; Kleber et al. 2013). In den letzten Jahren wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen der Einfluss von bestimmten Komorbiditäten auf die Prognose und eine patientenspezifische Therapie untersucht. So konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Integration verschiedener Komorbiditäten bestimmte prognostische Relevanz im Gesamtüberleben von Myelompatienten darstellen. Mit dem Freiburger Komorbiditäts-Index (FCI), in dem die Beurteilung des Karnofsky Performance Status, Lungen- und Nierenfunktion eingehen, konnte somit ein leicht erhebbarer Score entwickelt werden, in dem patientenspezifische Risikofaktoren einfach erfasst werden und eine Abschätzung von Risikogruppen erlaubt. Die Erfassung solcher Scores wird grade bei der Auswahl von zunehmend speziellerer und diversifizierterer Myelomtherapie als wichtiger Faktor für eine patientenindividuelle und bestmöglich verträgliche Therapie gesehen (Kleber et al. 2011; Kleber et al. 2013).

16 1. Einleitung THERAPIE Die Therapie des MM ist bei symptomatischen Myelomen und/oder Endorganschäden nach den CRAB-Kriterien: C = hypercalcemia (Hyperkalziämie), R = renal impairment (Niereninsuffizienz (Krea > 1,4 mg/dl)), A = anemia (Anämie (Hb < 10 g/dl od. 2 g/dl < Norm)), B = bone disease (Osteolyse(n) oder Osteoporose) indiziert. Ein MGUS oder ein asymptomatisches Myelom haben keine Behandlungsindikation, da sich bei der Einleitung einer sofortigen Therapie für diese in den meisten Studien kein Überlebensvorteil gezeigt hat. Aus diesem Grunde wird derzeit empfohlen, die Erkrankung engmaschig zu kontrollieren und bei Auftreten von ersten Symptomen eine Therapie einzuleiten (Reinhardt et al. 2012). Unspezifische Symptome durch eine Infektneigung, AL- Amyloidose oder Polyneuropathie, sollten allerdings bereits im Stadium des MGUS bzw. SMM therapiert werden (Kortüm et al. 2013). Bei jüngeren und fitten Patienten sollte nach Möglichkeit eine Hochdosischemotherapie mit anschließender autologer Stammzelltransplantation angestrebt werden, da für dieses Vorgehen in Studien ein verlängertes progressionsfreies und Gesamtüberleben belegt werden konnte (Kortüm et al. 2013). Nach dem Behandlungskonzept der European Myeloma Network, wie es auch aktuell an der Universitätsklinik Freiburg Anwendung findet und in modifizierter Form in Abbildung 1.4 dargestellt ist, wird anhand von verschiedenen Kriterien wie dem Alter, dem Vorhandensein von Komorbiditäten, dem Stadium nach ISS, der Zytogenetik und dem Vorhandensein anderer extramedullärer Erkrankungen oder Knochenerkrankungen entschieden, ob der Patient für eine autologe Stammzelltransplantation in Frage kommt. Daraufhin erfolgt dann die Induktionschemotherapie, gefolgt von einer Konsolidierung mit autologer Stammzelltransplantation und ggf. anschließender Erhaltungschemotherapie. Für die einzelnen Stufen der Chemotherapie stehen diverse Medikamentenkombinationen zur Verfügung. Patienten, welche nicht für eine Stammzelltransplantation geeignet sind, erhalten eine entsprechende Therapie mit einer Kombination aus Alkylantien, Steroiden und neuen Substanzen (Engelhardt et al. 2013).

17 1. Einleitung 11 Abkürzungen: MM= Multiples Myelom, ASZT= autologe Stammzelltransplantation, CR= komplette Remission, vgpr= sehr gute partielle Remission, SD= stabile Erkrankung, MR= minimale Respons, ISS= International Staging System, VCD= Bortezomib, Cyclophosphamid, Dexamethason, CTD= Cyclophosphamid, Thalidomid, Dexamethason, VTD= Bortezomib, Thalidomid, Dexamethason, RVD= Lenalidomid, Bortezomib, Dexamethason, RAD= Lenalidomid, Adramycin, Dexamethason, VMP= Bortezomib, Melphalan, Prednison, MPT= Melphalan, Prednison, Thalidomid, VMPT-VT= Bortezomib, Melphalan, Prednison,Thalidomid gefolgt von Bortezomib, Thalidomid, MPR-R= Melphalan, Prednison, Lenalidomid gefolgt von Lenalidomid, Rd= Lenalidomid, low-dose Dexamethason, IMID s= Immunomodulatory drugs, PBSCT= periphere Stammzelltransplantation Abbildung 1.4. Behandlungskonzept für neu diagnostizierte Multiple Myelome, Modifiziert nach Engelhardt M. et al. 2014

18 1. Einleitung 12 Leider kommt es bei fast allen Patienten nach initialer Erstlinientherapie zum Rezidiv der Erkrankung. Für die Behandlung von Rezidiven und refraktären Myelomen liegen verschiedene Therapieoptionen vor (Rajkumar 2013): Patienten, bei denen in einem frühen Krankheitsstadium Stammzellen kryokonserviert wurden, können beim ersten Rezidiv und Profit der ersten Stammzelltransplantation eine weitere autologe Stammzelltransplantation erhalten. Wenn das Rezidiv mehr als 6 Monate nach Beendigung der Therapie auftritt, so kann die Erstlinientherapie, welche zur initialen Remission des MM geführt hat, wiederholt werden. Patienten mit indolentem Rezidiv, welche durch eine asymptomatische Erhöhung der M-Proteine im Serum und Urin, progressiver Anämie oder einigen kleinen Osteolysen auffallen, können meist mit Lenalidomid, Bortezomib oder Alkylantien plus niedrig dosierten Kortikosteroiden gut behandelt werden. Patienten, welche nicht auf Bortezomib oder Lenalidomid ansprechen, können im Rahmen von klinischen Studien, z.b. von einer Therapie mit Carfilzomib, Pomalidomid oder anderen in klinischer Prüfung befindlichen neuen Medikamenten profitieren. Bei besonders aggressiven Rezidiven wird zur Therapie oft eine Kombination aus mind. 3 oder 4 Substanzen, wie Bortezomib, Dexamethason und Cyclophosphamid, Thalidomid oder Lenalidomid benötigt. Bei manchen Regimen kann eine frühzeitige Unterbrechung der Therapie bereits beim Erreichen einer stabilen Plateauphase sinnvoll sein, um das Risiko toxische Nebenwirkungen so gering wie möglich zu halten. Die Therapie des solitären ossären Plasmozytoms sieht eine Strahlentherapie vor. Eine zusätzliche chemotherapeutische Therapie sollte nur bei Persistenz des Paraproteins oder Rezidiven begonnen werden. Primär extraossäre Plasmozytome, mit Lokalisation im Nasopharynx, Nasennebenhöhlen, Lunge, Milz, Niere und Magen, sollten ebenfalls mit einer Strahlentherapie behandelt werden (Berger et al. 2014). Parallel zur Behandlung des Multiplen Myeloms stehen eine Reihe an supportiven Therapien zur Verfügung, mit dessen Hilfe, bei frühzeitiger Anwendung, Komplikationen reduziert und die Lebensqualität des Patienten verbessert werden können (Tabelle 1.7; (Berger et al. 2014). Trotz der beachtlichen Fortschritte in der Behandlung des Multiplen Myeloms ist dies mit konventionellen Therapieverfahren heutzutage meist nicht heilbar. Ziel jeder Myelomtherapie sollte deshalb eine rasche Kontrolle der Krankheit mit Normalisierung myelombedingter Komplikationen, sowie die Symptomkontrolle und die Lebenszeitverlängerung unter bestmöglicher Lebensqualität sein (Kortüm et al. 2013).

19 1. Einleitung 13 Tabelle 1.7. Möglichkeiten zur supportive Therapie Indikation Therapie Osteolysen, Osteoporose, pathologischen Frakturen Hyperkalzämie Infektbehandlung Hyperviskositätssyndrom Anämie, Eisenmangel Hyperurikämie Schmerztherapie, lokale Radiatio, orthopädische Therapie mit eventueller operativer Stabilisierung Hydratation, Bisphosphonate, Steroide, ggf. Calcitonin, Dialyse frühzeitiger Einsatz von Antibiotika, Antimykotika, Impfungen, ggf. Immunglobuline Plasmapherese Eisen- / Erythropoetinsubstitution, Transfusion Alkalisierung des Urins, Allopurinol REMISSIONSKRITERIEN Zur Klassifikation des Therapieansprechens wurden von der European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) bestimmte Remissionskriterien erarbeitet (Tabelle 1.8) (Bladé et al. 1998). Tabelle 1.8. EBMT Response Kriterien. Modifiziert nach Bladé et al. 1998, (Bladé et al. 1998). Remissionskategorie Komplette Remission (CR) Partielle Remission (PR) Minimale Respons (MR) No Change (NC) Progressive Erkrankung (PD) Kriterien - M-Protein in Serum oder Urin > 6 Wochen nicht nachweisbar (Immunfixation, Elektrophorese) - Im Knochenmark (KM) < 5 % Plasmazellen - M-Protein im Serum 50 % reduziert - Leichtketten im Urin 90 % reduziert (oder < 200 mg/24h) für > 6 Wochen - Beim nichtsekretorischen Myelom 50 % Reduktion der Plasmazellen im KM für > 6 Wochen - M-Protein im Serum % reduziert - Leichtketten im Urin % reduziert für > 6 Wochen - Beim nichtsekretorischen Myelom % Reduktion der Plasmazellen im KM für > 6 Wochen - Kriterien für PR oder MR sind nicht erfüllt - Veränderung von M-Protein und Leichtketten um < 25 % für mindestens 3 Monate - Anstieg von M-Protein im Serum bzw. Leichtketten im Urin um > 25 % - Zunahme der Plasmazellen im KM > 25 % (oder KM- Infiltration > 10 % absolut) - Neue Osteolysen oder definitive Größenzunahme - Neue Weichteilmanifestation oder definitive Größenzunahme

20 1. Einleitung 14 Diese Kriterien wurden 2006 von Durie et al. überarbeitet und erweitert. Die Klassifikation nach der International Myeloma Working Group (IMWG) definiert zusätzlich Kriterien (Tabelle 1.9) (Durie et al. 2006). Tabelle 1.9. International Myeloma Working Group (IMWG) Response Kriterien. Modifiziert nach Durie et al. 2006, (Durie et al. 2006). Remissionskategorie Stringent komplette Remission (scr) Komplette Remission (CR) Sehr gute partielle Remission (vgpr) Partielle Remission (PR) Stabile Erkrankung (SD) Kriterien - Wie CR + - Normale Serum Freie Leichtketten Ratio + - Fehlen von klonalen Plasmazellen im Knochenmark mittels immunphänotypischer Analyse - Fehlender Nachweis eines Paraproteins in Serum und Urin + - negative Immunfixation + - Reduktion der Plasmazellinfiltration im Knochenmark auf unter 5% - Positive Immunfixation in Serum und/oder Urin oder - 90% Reduktion des Serum Paraproteins + - Bence-Jones Proteinurie < 100mg/24 h - 50% Reduktion des Serum Paraproteins % Reduktion der Bence-Jones Proteinurie oder Bence-Jones Proteinurie < 200mg/24 h - Kriterien für CR, vgpr, PR oder progrediente Erkrankung nicht erfüllt

21 1. Einleitung HINTERGRUND ZU FREELITE UND HEVYLITE Intakte Immunglobuline sind aus jeweils zwei identischen leichten und schweren Ketten aufgebaut, welche über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abbildung 1.6). Von den leichten Ketten gibt es 2 unterschiedliche Isotypen, welche als Kappa (κ) bzw. Lambda (λ) bezeichnet werden. Neben den an Immunglobuline gebundenen leichten Ketten liegen im menschlichen Körper zusätzlich ungebundene leichte Ketten vor, die sogenannten freie Leichtketten (FLC). Bei monoklonalen Gammopathien können entweder komplette, intakte monoklonale Immunglobuline und/oder monoklonale freie Leichtketten im Übermaß produziert werden. Zur Diagnostik und Verlaufskontrolle des Paraproteinspiegels von monoklonalen Gammopathien standen bisher die Immunfixation von Serum und Urin und die Gesamtimmunglobulinbestimmung im Serum zur Verfügung. Mit Hilfe der Immunfixation konnte die Qualität des jeweiligen Paraproteins bestimmt werden. Die quantitative Messung der intakten Immunglobuline im Serum erfolgte, bis zur Einführung des Freelite -Assay, lediglich als Gesamtmessung der einzelnen Kappa- und Lambda-Subtypen zusammen. Eine Aussage über die Quantität des jeweilligen Kappa- und Lambda-Subtyps war bis dahin nur im Urin als Bence-Jones-Protein möglich. Im Jahr 2001 entwickelte Bradwell et al. einen Immunoassay (Freelite ), mit dem es gelang, spezifisch die freien Leichtketten im Serum, welche nicht an ein Immunglobulin gebunden sind, getrennt nach Kappa- und Lambda-Subtypen zu messen (Bradwell et al. 2001). Der Freelite -Assay ermöglichte damit die Quantifizierung von freien Leichtketten im Serum bei LCMM Patienten oder die deutlich bessere Sensitivität gegenüber der Leichkettenmessung im Urin, wodurch die Anzahl an asekretorischen Myelomen weiter verringert werden konnte (Bradwell et al. 2003; Drayson 2001). Des Weiteren bietet der Freelite -Assay eine ausgezeichnete Methode zur Beurteilung des Therapieansprechens und des Krankheitsverlaufes bei MM Patienten, da freie Leichtketten mit 2-6 Stunden eine sehr viel kürzere Halbwertszeit als intakte Immunglobuline (IgG mit 21 Tagen) besitzen (Bradwell 2010). Die Vorteile des Freelite -Assay führten dazu, dass dieser bereits 2003 Eingang in die internationalen Richtlinien zur Diagnostik und Therapie von monoklonalen Gammopathien gefunden hat (Durie et al. 2003). Mit dem Immunglobulin heavy chain/light chain Immunoassay, kurz Hevylite, stellte Bradwell et al einen weiteren Immunoassay vor, der es ermöglicht, die verschiedenen Leichtkettentypen jeder einzelnen Immunglobulinklasse also IgGκ, IgGλ, IgAκ, IgAλ, IgMκ und IgMλ separat voneinander hochspezifisch zu erkennen und zu quantifizieren (Abbildung 1.5).

22 1. Einleitung 16 Abbildung 1.5. Schwer- und Leichtkettenpaare von IgG-, IgA- und IgM-Molekülen mit der Darstellung der Zielepitope für Hevylite in rot. Intakte Immunglobuline verfügen über einmalige Epitope innerhalb der konstanten Region, an der Bindungsstelle zwischen schwerer und leichter Kette (Abbildung 1.6). Der Hevylite Assay macht sich diese Eigenschaft zu Nutzen und bindet mit Hilfe der polyklonalen Hevylite Antikörper hochspezifisch an diese Epitope und ermöglichen damit die Identifikation und Quantifizierung des Leichtketten-spezifischen Immunglobulins. Somit kann mit Hilfe der Hevylite Bestimmung erstmals der Anteil an monoklonalem intakten Immunglobulin quantitativ gemessen werden. Zur Berechnung des Konzentrationsverhältnisses von involviertem monoklonalen zu nicht involviertem polyklonalen Immunglobulin werden Ig- Moleküle paarweise gemessen und die Werte zueinander ins Verhältnis gesetzt (HLC Ratio) (Bradwell et al. 2009). Abbildung 1.6. Schematische Darstellung eines Immunglobulins mit der Hevylite Bindungsstelle innerhalb der konstanten Region zwischen Schwer- und Leicht-Kette. Durch die quantitative Messung der Leichtketten-spezifischen Immunglobuline kann man unter anderem genauere Aussagen bei Patienten mit teilweise schwer zu quantifizierbarem Paraprotein in der Eiweißelektrophorese machen. Die Berechnung der HLC-Ratio (Verhältnis von monoklonalem zu nicht involviertem Immunglobulin) erlaubt es außerdem, Aussagen über die Klonalität zu machen. Dadurch könnten fragliche Resterkrankungen und Rezidive,

23 1. Einleitung 17 welche durch die Immunfixation nicht erfasst werden können, möglicherweise früher quantifiziert werden (Ludwig et al. 2012). Zudem ist die Detektion einer auch geringfügigen Resterkrankung damit leichter möglich. Die genauere Verlaufskontrolle stellt somit eine interessante Option der HLC-Ratio dar. Durch Schwankungen des Hämatokrits und des Plasmavolumens während des Krankheitsverlaufes und durch die extrem verkürzte Halbwertszeit von IgG im Stoffwechsel bei ansteigenden IgG-Konzentrationen, unterliegen auch die Messungen des Paraproteins extremen Schwankungen. Die HLC-Ratio ist unabhängig von diesen Schwankungen und könnte daher ein besserer Marker bei der Verlaufskontrolle darstellen (Bradwell et al. 2013). Des Weiteren konnte in mehreren Studien eine Korrelation zwischen der HLC-Ratio und dem progressionsfreien Überleben gezeigt werden, so dass geringeren vs. höheren HLC-Werten bzw. definierter HLC-Ratio Grenzen ein verlängertes bzw. verkürztes Überleben vorhersagbar wäre und HLC-Werte in die Prognosefaktoren bei MM-Patienten eingehen könnten (Bradwell et al. 2013; Avet-Loiseau H 2010). 1.3 ZIEL DER ARBEIT Ziel der Arbeit war es, den neuartigen Hevylite Assay auf seinen Nutzen in der Anwendung, der Diagnostik und der Verlaufskontrolle bei monoklonalen Gammopathien zu überprüfen und festzustellen, ob eine Implementierung des Hevylite-Kit in die Routinediagnostik von Multiplen Myelom Patienten für sinnvoll zu erachten ist. Auf der Grundlage dieses Zieles entwickelten wir 5 Hauptfragestellungen, die im Rahmen unserer Analyse beantwortet werden sollten: 1. Besteht eine Korrelation der Hevylite mit den herkömmlichen Myelom- Verlaufsparametern, wie Gesamteiweiß, γ-globulin, M-Gradient, Gesamtimmunglobulin und freien Leichtketten im Serum? 2. Besteht ein Zusammenhang zwischen der Hevylite und dem Stadium nach Durie & Salmon bzw. dem Internationale Staging System? 3. Besteht ein Zusammenhang zwischen der Hevylite und dem aktuellen Remissionsstand? 4. Gibt es eventuell Patientengruppen, bei denen der Hevylite Kit Vorteile gegenüber den Standardmethoden bietet? 5. Lassen sich mithilfe der Hevylite prognostische Aussagen über den Krankheitsverlauf der Patienten, zum progressionsfreien Überleben (PFS) und Gesamtüberleben (OS) machen?

24 2. Patienten, Material und Methoden PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN 2.1 PATIENTENKOLLEKTIV Im Rahmen dieser Kohortenstudie wurden insgesamt 146 konsekutive Multiple Myelom und Morbus Waldenstöm Patienten mit verfügbaren Serumproteinen untersucht. Die Auswahl der Patienten erfolgte über das Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg für solche, bei denen Serumproben seriell für die HLC Untersuchung zur Verfügung standen. Über einen Zeitraum von 15 Monaten wurden dabei solche konsekutive Patientenseren gesammelt, welche im Rahmen der Routinelaboruntersuchung in der Eiweißelektrophorese einen auffälligen M-Gradienten aufwiesen. Die Seren wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -20 Celsius archiviert. Ausgeschlossen wurden Patienten, welche als Krankheitsdiagnose kein Multiples Myelom, SMM, LCMM, MGUS oder Morbus Waldenström aufwiesen. 2.2 DATENERHEBUNG Mit Hilfe des klinikinternen Dokumentationssystems Medoc und der Tumorbasisdokumentation (TBD) wurden aus vorbestehenden Arztbriefen und Untersuchungsergebnissen alle krankheitsrelevanten Daten, wie Diagnose, Geburtsdatum, Zeitpunkt der Erstdiagnose, letzter Besuch, ggf. Zeitpunkt einer Progression bzw. Todesdatum, Zytologie, Stadium nach Durie und Salmon sowie nach ISS, Remissionsstand nach EBMT und Grad der Knochenmarkinfiltration jeweils zum Zeitpunkt der Blutentnahme, erfasst. Des Weiteren wurden folgende krankheitsspezifischen Laborparameter erfasst, welche bereits im Rahmen der Routinelabordiagnostik bestimmt wurden: Hämoglobin, Kreatinin, Albumin, Gesamteiweiß, Immunglobuline A, Immunglobulin G, Immunglobulin M, Alpha-1-Globulin, Alpha-2-Globulin, Beta-Globulin, Gamma-Globulin, M-Gradient, β-2-mikroglobulin, Serum freie Leichtketten Kappa, Serum freie Leichtketten Lambda und Ratio freie Leichtketten. 2.3 LABORDIAGNOSTISCHE UNTERSUCHUNG KLINISCHE CHEMIE UND HÄMATOLOGIE Die Immunglobuline stellen wichtige Parameter bei der Diagnose und der Verlaufskontrolle von monoklonalen Gammopathien dar. Bei steigenden Immunglobulinen des jeweils spezifischen Myelom-Isotyps kann von einer Proliferation des monoklonalen Klons ausgegangen werden. Des Weiteren signalisieren sinkende Immunglobuline des nicht involvierten Isotyps eine Verdrängung der normalen Hämatopoese im Konchenmark durch die Myelomzellen und ein damit verbundenes sekundäres Antikörpermangelsyndrom.

25 2. Patienten, Material und Methoden 19 Zudem wurde von der spanischen Myelomgruppe um Mateos et al. erst kürzlich ein Artikel veröffentlicht, in dem die frühzeitige Therapie von Patienten mit Hochrisiko-SMM untersucht wurde. In dieser Studie wurde ein Hochrisiko-SMM definiert, wenn mindestens eine Plasmazellinfiltration von 10%, ein M-Protein im Serum von 30 g/l oder Bence-Jones-Proteine im Urin von > 1g/24h, plus 95% phänotypisch aberrante Plasmazellen im Knochenmark oder eine Reduktion von ein oder zwei nicht-involvierten Immunglobulintypen von mehr als 25% gegenüber den Normwerten vorlagen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine frühzeitige Therapie mit Lenalidomid und Dexamethason bei Patienten mit Hochrisiko-SMM ein deutlich verlängertes progressionsfreis Überleben und ein erhöhtes Gesamtüberleben gegenüber einer watch and wait -Strategie induziert (Mateos et al. 2013), spannende Ergebnisse, die aber von weiteren Studien dupliziert werden müssen. Albumin spielt für die ISS Klassifikation eine bedeutende Rolle bei der Stadieneinteilung und der Prognose der Krankheit. Greipp konnte zeigen, dass die Parameter β2-mikroglobulin und Albumin zusammen die besten und einfachsten Parameter sind, um eine Aussage über die Prognose des Multiplen Myeloms zu erlauben (Greipp 2005). Der Nierenretentionsparameter Kreatinin dient der Beurteilung der Nierenfunktion. Dabei liegt meist eine CAST-Nephropathie, AL-Amyloidose oder LCDD als Grundlage der verschlechterten Nierenfunktion zugrunde. Diese kann mit Hilfe des Kreatinins und der egfr kontrolliert werden. Des Weiteren konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Nierenfunktion neben dem Karnofsky Performance Status und der Lungenfunktion ein entscheidender Faktor für die Prognose von Myelomerkrankungen darstellt (Kleber et al. 2011; Kleber et al. 2013). Die Bestimmung des Hämoglobins als eisenhaltiger roter Blutfarbstoff der Erythrozyten, lässt Rückschlüsse auf eine mögliche Anämie zu. Bei Patienten mit Multiplen Myelom kann es durch die Ausbreitung der malignen Plasmazellen im Knochenmark zu einer Verdrängung der blutbildenden Zellen und damit der Hämatopoese kommen, welches sich in einer Anämie äußert (König et al. 2013). Die Messungen der Laborparameter der klinischen Chemie erfolgten mit dem Analysegerät Cobas 8000 von Roche (Wu 2006). Die Messungen des Hämoglobin erfolgte mit dem Gerät XE2100 der Firma Sysmex. Die Referenzwerte wurden laut dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg wie folgt angegeben:

26 2. Patienten, Material und Methoden 20 Tabelle 2.1. Referenzbereiche für die Parameter der Klinischen Chemie und des Hämoglobin nach dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin Universitätsklinikums Freiburg Parameter (Einheit) Referenzbereich Immunglobulin A (mg/dl) Immunglobulin G (mg/dl) Immunglobulin M (mg/dl) Albumin (g/dl) 3,5-5,2 Gesamteiweiß (g/dl) 5,1-7,3 Kreatinin (mg/dl) : 0,67-1,17 : 0,51-0,95 Hämoglobin (g/dl) SERUMPROTEINE Von essentieller Bedeutung bei der Diagnose von Paraproteinämien ist bis heute die Serum-Eiweißelektrophorese. Mit der Elektrophorese können die einzelnen Serumproteine aufgetrennt werden und somit in der γ-globulin-fraktion die Immunglobuline (M-Gradient) dargestellt werden. Dadurch lässt sich die Erhöhung eines monoklonalen Paraproteins sehr gut nachweisen und mit Hilfe der Berechnung der Fläche unterhalb der Kurve der γ-globulin-fraktion, die Menge an Paraprotein näherungsweise abschätzen. Die Messung der Serumproteine sowie des M-Gradienten erfolgte mit dem Analysegerät Capillarys Protein(E)6 von Sebia (Chen et al. 1991; Bossuyt 2003). Die Referenzwerte für die verschiedenen Parameter der Eiweißelektrophorese wurden laut dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg wie folgt angegeben: Tabelle 2.2. Referenzbereich der Eiweißelektrophorese nach dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Universitätsklinikum Freiburg Parameter Referenzbereich in % Albumin 55,8-66,1 Alpha-1-Globulin 2,9-4,9 Alpha-2-Globulin 7,1-11,8 Beta-Globulin 7,9-13,1 Gamma-Globulin 11,1-18, FREIE LEICHTKETTEN Die Quantifizierung der freien Leichtketten im Serum bietet dazu Vorteile, bei der Diagnose, der Therapie- und der Verlaufskontrolle von monoklonalen Gammopathien, die Leichtketten-Parameter zu kontrollieren und damit das Therapieansprechen rasch zu erfassen, so dass diese in die internationalen Diagnose- und Therapierichtlinien aufgenommen wurden (Durie et al. 2003).

27 2. Patienten, Material und Methoden 21 Um den Hevylite - und den Freelite -Assay miteinander zu vergleichen und feststellen zu können, ob mit dem Hevylite -Assay ähnliche Vorteile verbunden sind, bestimmten wir die Parameter der freien Leichtketten bei allen Patienten. Beim β2-mikroglobulin handelt es sich um ein Plasmaprotein, welches als Tumormarker und Prognoseparameter bei Lymphomen und Myelomen eingesetzt wird. Die Messung der freien Leichtketten im Serum sowie des β2-mikroglobulin erfolgte mit Hilfe des Analysegerätes Immage von Beckman (Bradwell et al. 2001). Die Referenzwerte wurden laut dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg wie folgt angegeben: Tabelle 2.3. Referenzbereiche für die Freien Leichtketten und β2-mikroglobulin nach dem Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg Parameter (Einheit) Referenzbereich Serum freie Leichtketten Kappa (mg/l) 3,30-19,4 Serum freie Leichtketten Lambda (mg/l) 5,71-26,3 Freie Leichtketten Quotient Serum 0,26-1,65 β2-mikroglobulin (mg/l) 0,8-2, HEVYLITE Die labordiagnostische Untersuchung der Hevylite erfolgte mit Hilfe des Hevylite -Assay und des Analysegerätes SPAplus, beides von der Firma Bindingsite, Birmingham, UK. Bei allen 146 gesammelten Patientenseren wurden die Ig-Subtypen der jeweils involvierten Immunglobulinklasse paarweise gemessen. Das heißt bei Patienten mit IgG-MM, -SMM, LCMM, oder MGUS wurde die IgG-Hevylite, bei Patienten mit IgA-MM, -SMM, -LCMM, - MGUS wurde die IgA-Hevylite und bei IgM-MM, -SMM, -LCMM, -MGUS und Waldenströms Makroglobulinämie Patienten die IgM-Hevylite gemessen. Bei dem Gerät SPAplus handelt es sich um einen Proteinanalysator, der mit Hilfe der Turbidimetriemethode eine durch Antigen-Antikörper-Komplexe hervorgerufene Trübung photometrisch misst. Der verwendete Hevylite Kit der Firma Bindingsite beinhaltet folgende Reagenzien: 1) Antiserum: Besteht aus einem polyklonalen monospezifischen Schaf - Antikörper 2) Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid 0,1% E-aminocapronsäure (EACA) 0,01% Benzamidin 1mM Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA)

28 2. Patienten, Material und Methoden 22 Die Referenzwerte für die einzelnen Hevylite-Subtypen wurden von Katzmann et al. anhand der Seren von 129 gesunden Blutspendern bestimmt. Tabelle 2.4: Referenzbereich für Hevylite nach Katzmann et al. (Katzmann et al. 2013) Parameter (Einheit) Referenzbereich (95% Range) Median Hevylite IgG IgGκ (g/l) 4,34-10,80 6,45 IgGλ (g/l) 1,77-5,31 3,27 IgGκ/IgGλ Ratio 1,3-3,7 2,0 Hevylite IgA IgAκ (g/l) 0,53-2,62 1,22 IgAλ (g/l) 0,38-1,81 0,92 IgAκ/IgAλ Ratio 0,7-2,2 1,4 Hevylite IgM IgMκ (g/l) 0,22-1,43 0,64 IgMλ (g/l) 0,10-0,94 0,41 IgMκ/IgMλ Ratio 1,0-2,4 1,6 2.3 STATISTIK Die statistische Auswertung der erfassten Daten erfolgte in Kooperation mit Frau Dr. G. Ihorst der Clinical Trails Unit (Studienzentrum) des Universitätsklinikums Freiburg. Für die statistische Datenanalyse wurden die Statistikprogramme SAS statistical software version 9.4 (SASInstitute Inc, Cary, NC), sowie IBM SPSS Statistics 21 verwendet. Die deskriptive Analyse aller erhobenen Parameter erfolgte unter Angabe von Häufigkeiten, Medianen sowie Minimum / Maximum Werten. Die Berechnung der Korrelationen der einzelnen Hevylite Ergebnisse mit den Standard Methoden, welche zur Diagnose und zur Verlaufskontrolle von monoklonalen Gammopathien eingesetzt werden, erfolgten mit Hilfe der Spearman-Rangkorrelationen. Bei dem Spearman- Korrelationskoeffizient handelt es sich um ein parameterfreies Maß für Korrelationen, mit dessen Hilfe Zusammenhänge zwischen zwei verschiedenen Variablen analysiert werden können. Der Wertebereich liegt dabei zwischen +1 für einen positiven und -1, für einen negativen Zusammenhang. Umso näher der Korrelationskoeffizient an Null liegt, umso weniger Zusammenhang besteht, und andersherum, umso näher er bei 1 liegt, desto perfekter ist der Zusammenhang. Des Weiteren wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen den gemessenen Hevylite Parametern und dem Remissionsstand, welcher nach den Kriterien der European Group for Blood and Marrow Transplantation erhoben wurde (Bladé et al. 1998) sowie dem

29 2. Patienten, Material und Methoden 23 Krankheitsstadium nach Durie & Salmon (Durie und Salmon 1975) bzw. nach International Staging System (Greipp 2005), besteht. Da bei der statistischen Auswertung der Daten von einer nicht-symmetrischen Verteilung der Parameter ausgegangen wurde, erfolgten die Vergleiche zwischen den Gruppen mit dem U-Test (Wilcoxon-Mann-Whitney-Test) für zwei unabhängige Stichproben und dem Kruskall-Wallis-Test für mehrere unabhängige Stichproben. Beim U-Test handelt es sich um einen Rangsummentest, bei dem die Mediane zweier unabhängiger Gruppen miteinander verglichen werden. Dasselbe gilt für den Kruskall-Wallis-Test, wobei hier jedoch mehr als zwei unabhängige Gruppen miteinander verglichen werden können. Um beurteilen zu können, ob eine pathologische HLC Ratio mit einem verkürzten progressionsfreien Überleben (PFS) bzw. verkürzten Gesamtüberleben (OS) einhergeht, wurde das PFS und das OS der Hevylite Parameter mit Hilfe des Kaplan-Meier-Schätzers und log-rank Tests, die Signifikanz, die Hazard ratio und das 95% Konfidenzintervall mit der Cox-Regression berechnet (Cox 1972). Hierzu wurden alle Patienten über einen Zeitraum von insgesamt 34 Monaten vom Zeitpunkt der Serenarchivierung an nachbeobachtet. In der Auswertung wurde nur Patienten berücksichtigt, welche mindestens über einen Zeitraum von 6 Monaten seit dem Zeitpunkt der Erstdiagnose der Erkrankung beobachtet wurden. Dabei wurde das progressionsfreie Überleben (PFS) als die Zeit von der Erstdiagnose bzw. Erstvorstellung bis zum Eintreten eines Krankheitsprogresses, bis zum Tod oder bis zum letzten follow-up definiert. Das Gesamtüberleben (OS) wurde ab dem Zeitpunkt der Erstdiagnose bzw. Erstvorstellung bis zum Tod oder bis zum letzten follow-up definiert. Bei allen statistischen Tests wurde ein p-wert von <0.05 als statistisch signifikant definiert.