1. α -Aminosäuren. Der Nachweis der Aminosäuren erfolgt mit der Ninhydrinreaktion. Diese Reaktion beruht auf der vorhandenen freien Aminogruppe

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1 Chemie 1 1. α -Aminosäuren Aminosäuren besitzen eine Amino- und eine Carboxylgruppe im Molekül. Außer Glycin sind alle Aminosäuren optisch aktiv. Im Körper kommen α -Aminosäuren als Bausteine von Proteinen vor. Die allgemeine Formel lautet: Ist R nicht Wasserstoff (wie beim Glycin), so besitzt die Aminosäure ein asymmetrisches Kohlenstoffatom. Zum Aufbau der Peptide und Proteine wird mit wenigen Ausnahmen nur die L-Form verwendet. Als Beispiel sei hier die Struktur von L(+)-Alanin (= α - Aminopropionsäure) angegeben: Es gibt ca. 20 Aminosäuren, die regelmäßig in den Proteinen vorkommen. R kann außer CH 3 (wie beim Alanin) ein Kohlenwasserstoff- oder auch ein aromatischer Rest sein. Er kann auch weitere funktionelle Gruppen wie z.b. eine zweite Carboxyl- oder Aminogruppe beinhalten. Die Aminosäuren besitzen sowohl eine saure (COOH) als auch eine basische (NH 2 ) Gruppe im Molekül. Sie sind deshalb Ampholyte. Im nach außen hin ungeladenen Zustand liegen die Aminosäuren nicht entsprechend der obigen Formel vor, sondern sie weisen eine Zwitterionen-Struktur auf. Der ph-wert, an dem die Zwitterionen vorliegen, heißt isoelektrischer Punkt. Obige Formeln erklären auch den hohen Schmelzpunkt, die leichte Wasserlöslichkeit und die Puffereigenschaften. Wegen der basischen Eigenschaften der Aminogruppe sind Aminosäuren nicht wie gewöhnliche organische Säuren mit Laugen quantitativ titrierbar. Dies gelingt erst, wenn die Aminogruppe mit Formaldehyd zur N-Methylen-aminosäure (= Schiff sche Base) kondensiert wird, die dann mit Natronlauge maßanalytisch bestimmt werden kann. Der Nachweis der Aminosäuren erfolgt mit der Ninhydrinreaktion. Diese Reaktion beruht auf der vorhandenen freien Aminogruppe

2 2 Chemie Die entstandene Verbindung ist wegen der Mesomerie unter der Beteiligung der Wasserstoffbrückenbindung innerhalb des Systems konjugierter Doppelbindungen farbig. Die Trennung eines Aminosäuregemisches erfolgt durch Chromatographie (z.b. Dünnschichtchromatographie). Damit können kleinste Mengen (0,001-0,1 mg) analysiert werden. Durch Besprühen mit Ninhydrin und Erwärmen werden die Aminosäuren nach der Chromatographie z.b. auf der Dünnschichtplatte sichtbar gemacht. Die Dünnschichtchromatographie mit einer Kieselgelplatte beruht auf der Trennung durch ein Adsorptions- und Verteilungsgleichgewicht (Nernst scher Verteilungssatz). Die stationäre Phase, das Kieselgel, adsorbiert die Aminosäure. Je polarer die einzelnen Aminosäuren sind, umso stärker werden sie adsorbiert und umso langsamer werden sie durch die mobile Phase, das Laufmittel, wieder eluiert. Je polarer jedoch das Laufmittel ist, desto leichter gehen polare

3 Chemie 3 Substanzen von der stationären in die mobile Phase über. Wird dem Laufmittel Wasser zugesetzt, so überziehen sich die Kieselgel-Partikel mit einem Wasserfilm. Das zu trennende Substanzgemisch kann nun nicht mehr am Kieselgel adsorbiert werden; es verteilt sich zwischen der flüssigen mobilen Phase (Laufmittel) und der ebenfalls flüssigen stationären Phase (Wasserfilm). Eine charakteristische Größe bei der Dünnschichtchromatographie ist der R f -Wert. Er ist definiert als: Primäre, sekundäre und tertiäre Amine lassen sich aufgrund ihrer chemischen Reaktionen leicht voneinander unterscheiden. Primäre aliphatische und aromatische Amine reagieren mit salpetriger Säure (Natriumnitrit + Salzsäure) unter Bildung von Diazoniumsalzen. Aliphatische Diazoniumsalze sind nicht isolierbar; sie spalten sofort Stickstoff ab. Dagegen sind aromatische Diazoniumsalze in der Kälte relativ stabil. Die Bildung eines Diazoniumsalzes verläuft folgendermaßen: Aliphatische Diazoniumsalze spalten nun Stickstoff ab. Das entstehende Kation R + reagiert entweder mit Wasser zu einem Alkohol oder es spaltet am Nachbar-Kohlenstoffatom ein Proton ab, wobei ein Alken entsteht.

4 4 Chemie Sekundäre Amine bilden N-Nitrosamine (farbiges, öliges Reaktionsprodukt), die stark gesundheitsschädlich sind. Tertiäre Amine zeigen demgegenüber keine Reaktion. Die primäre Aminogruppe von Aminosäuren kann mit Aldehyden unter Bildung von Schiff schen Basen reagieren. Hierbei verliert die Aminogruppe ihre basische Eigenschaft und die verbleibende Karbonsäure kann titriert werden. In der Biochemie spielt diese Reaktion beim Stoffwechsel der Aminosäuren eine Rolle. Hierbei ist der Aldehyd das Pyridoxalphosphat. 2. Peptide und Proteine Werden mehrere Aminosäuren durch Säureamidbindungen (= Peptidbindung) miteinander verknüpft, so erhält man je nach Kettenlänge ein Oligopeptid (bis 12 Aminosäurereste), ein Polypeptid (bis 100 Aminosäurereste) oder ein Protein (über 100 Aminosäurereste). In den Proteinen wird die Reihenfolge der einzelnen Aminosäuren (Sequenz) als Primärstruktur bezeichnet. Eine Besonderheit der Peptidbindung ist die Behinderung der freien Drehbarkeit um die Peptidbindung selbst. Infolge Mesomerie ist eine Grenzstruktur beteiligt, die eine C=N-Doppelbindung aufweist.

5 Chemie 5 Dies bewirkt, dass sich die Gruppierung -CO-NH- wie eine "starre Platte" verhält, und dass die Peptidkette nur um die Bindungen beiderseits der -CHR-Gruppe beweglich ist. Somit kann ein großer Rest R die günstigste Lage im Raum einnehmen. Eine solche ist die Anordnung als Spirale (α -Helix), wobei die Stabilisierung der einzelnen Windungen durch Wasserstoffbrückenbindungen erfolgt, oder eine antiparallele Faltung zweier Ketten zueinander (ß-Faltblattstruktur). Die räumliche Anordnung wird auch Sekundärstruktur genannt. Eine Ausnahme sind Prolin und Hydroxyprolin, die als sekundäre, cyclische Amine nicht in diese Struktur passen und dadurch einen Knick in der Spirale bewirken. Die funktionellen Gruppen in den Resten (R) können zusätzlich noch Querverbindungen zwischen verschiedenen Teilen der Peptidkette bewirken. Das erfolgt sowohl durch salzartige und Wasserstoffbrückenbindungen als auch durch die kovalenten Disulfidbindungen (-S-S-) des Cystins zwischen Cysteinresten an verschiedenen Stellen des Moleküls. Weiterhin spielen van-der-waals-kräfte eine Rolle. Das ergibt eine bestimmte Konformation (Anordnung) des gesamten Moleküls im Raum, die Tertiärstruktur, wobei auch mehrere verschiedene Peptidketten durch -S-S-Brücken, wie z.b. beim Insulin, zusammengehalten werden können. Mehrere Proteinmoleküle können sich weiterhin zu größeren Molekülverbänden zusammenlagern (Quartärstruktur). Die auf der Lösung von Nebenvalenzbindungen beruhende Denaturierung kann reversibel oder irreversibel sein. Durch Ausbildung neuer Nebenvalenzbindungen oder durch Wechselwirkung mit dem Denaturierungsmittel werden neue Konformationen stabilisiert. Es bilden sich metastabile Zustände, die nach Wiederherstellung der physiologischen Bedingungen die Rückbildung der nativen Konformation gestatten (Renaturierung, verbunden mit wiedererlangter biologischer Aktivität). Hitzebehandlung führt im fortgeschrittenen Stadium meist zur Ausbildung einer ungeordneten Struktur, d.h. zu einer irreversiblen Denaturierung. Der Übergang vom nativen, energieärmeren Zustand in die denaturierte Form ist mit einem Ordnungsverlust und damit mit einer Entropiezunahme verbunden. Allerdings erhöht sich der Ordnungszustand der umgebenden Wassermoleküle durch Hydratisierung der freigesetzten hydrophoben Seitenkettenfunktionen, so dass dieser Effekt überkompensiert wird. Durch Zugabe von leicht löslichen Salzen erfolgt Fällung der Proteine (Aussalzung). Durch die Ionen des Salzes werden den Proteinen die Wassermoleküle zu ihrer Hydratisierung entzogen. Ebenso wirkt Aceton oder Ethanol. Diese Fällungen sind meistens reversibel, d.h. die Proteine erhalten ihre Funktion beim Lösen in Wasser zurück. Proteine besitzen genauso wie Aminosäuren einen isoelektrischen Punkt. Auch sie sind bei diesem ph-wert am wenigsten löslich. Zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen kann man verschiedene Methoden benutzen. Die Biuretreaktion beruht auf der Bildung eines violetten Farbkomplexes, der zwischen dem Cu 2+ -Ion und der Peptidbindung in alkalischer Lösung entsteht. Aminosäuren binden Cu 2+ -Ionen ohne Farbkomplex. Die Atomgruppierung des Biurets selbst, H 2 N-CO-NH-CO-NH 2, ist in Proteinen jedoch nicht vorhanden.

6 6 Chemie Die Xanthoprotein-Reaktion ist ein Nachweis von aromatischen Aminosäuren, z.b. von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, mit Salpetersäure. Der aromatische Ring wird dabei nitriert (elektrophile aromatische Substitution); die entstehenden Produkte haben eine gelbe Farbe. 3. Proteine als Kolloide Große Moleküle wie die Proteine (und auch andere hochmolekulare Stoffe wie z.b. Stärke) geben keine echten Lösungen mehr. Die einzelnen Teilchen bewirken zwar noch keine sichtbare Trübung, aber eine Opaleszenz gegen den dunklen Hintergrund. Die einzelnen Makromoleküle werden dadurch in Lösung gehalten, dass die Teilchen durch Adsorption von Ionen oder durch Dissoziation saurer oder basischer Gruppen elektrische Ladungen tragen und sich gegenseitig abstoßen. Zusätzlich enthält ihre Oberfläche infolge hydrophilen Charakters große Mengen locker gebundenen Wassers. Dies verhindert, dass die Teilchen einander berühren und durch Aggregation zu immer größeren Komplexen schließlich "ausflocken". Solche Lösungen nennt man Kolloide. Durch Umladung infolge Änderung des ph-wertes oder durch Entzug des Hydratwassers durch konzentrierte Lösungen leichtlöslicher Salze, insbesondere solcher mit mehrwertigen Ionen, oder durch Aceton, werden hydrophile Kolloide, wie schon oben beschrieben, ausgefällt. Da die Kolloidteilchen hier die gleich großen Eiweißmoleküle sind, gehören die Proteine zu den monodispersen und molekulardispersen Kolloiden. Polydisperse Kolloide, z.b. Metallhydroxide oder Kieselsäure, bestehen aus verschieden großen Molekülen oder Molekülaggregaten. Eine frei bewegliche kolloide Lösung heißt Sol, in ausgeflocktem Zustand spricht man von Gel-Zustand. Gele können zu Gallerten erstarren. 4. Weitere Naturstoffe 4.1. Hämoglobin Proteine sind oft mit anderen, nicht proteinischen Komponenten verbunden, die zur Erfüllung ihrer spezifischen Aufgaben notwendig sind. Man spricht dann von Proteiden, der nicht proteinische Anteil ist die prostetische Gruppe.

7 Chemie 7 Ein wichtiges Proteid ist das Hämoglobin, der Farbstoff der roten Blutkörperchen. Es transportiert den Sauerstoff im Blut. Hämoglobin enthält vier Peptidketten (zwei α -Ketten mit je 141 Aminosäureresten und zwei ß-Ketten mit je 146 Resten), wobei jede Kette mit einer Häm-Gruppe komplexartig verbunden ist. Häm besteht aus einem Porphyrinskelett und einem Eisen-(II)-ion. Das Häm geht durch Oxidation leicht in das Hämatin über, in dem das Eisen in der Oxidationsstufe +3 vorliegt. Um im Hämoglobin die Farbstoff- von der Eiweißkomponente abzutrennen, lässt man Blut in heißen Eisessig, der mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung versetzt ist, einfließen. Hierbei scheiden sich unter gleichzeitiger Oxidation des Häms braune Kristalle, mit bläulichem Oberflächenglanz, die sogenannten Teichmann schen Kristalle, ab, in denen das Chlorid des Hämatins, das Hämin vorliegt. Dieser Versuch wird im Rahmen der Vorlesung vorgeführt. Das Hämoglobin übt im Organismus die äußerst wichtige Funktion der Sauerstoffübertragung aus. Dabei wird pro Eisenion ein Molekül Sauerstoff unter Bildung von Oxyhämoglobin locker gebunden. Die roten Blutkörperchen nehmen den Sauerstoff in der Lunge auf und transportieren ihn im Blutkreislauf zu den Geweben, in denen er zur Zellatmung verbraucht wird. An Stelle von Sauerstoff wird auch Kohlenmonoxid unter Bildung von Kohlenoxidhämoglobin gebunden, das stabiler ist und mal langsamer als das bei der Atmung entstehende Oxyhämoglobin zerfällt. Dadurch wird die normale Funktion des Hämoglobins als Sauerstoffüberträger ausgeschaltet, die Zellatmung unterbunden und der Gesamtstoffwechsel gestört; bei längerem Einatmen von Kohlenmonoxid tritt der Tod ein (Kohlenmonoxidvergiftung) Chlorophyll Der grüne Blattfarbstoff, das magnesiumhaltige Chlorophyll, findet sich gemeinsam mit den roten und gelben Farbstoffen, den Carotinen und Xanthophyllen in den Chloroplasten der Pflanzenzellen. Seine biochemische Funktion übt es bei der Photosynthese aus. In den

8 8 Chemie Pflanzenzellen ist das Chlorophyll an Eiweiß gebunden, in Form eines lichtsensiblen, gegen Sauerstoff und Kohlendioxid beständigen Chromoproteids. Das natürliche Chlorophyll besteht aus zwei Komponenten, dem blaugrünen Chlorophyll a und dem in geringer Menge als Begleiter auftretenden, gelbgrünen Chlorophyll b. Während im Blutfarbstoff das Eisen als Zentralatom im Komplex fungiert, weisen die Chlorophylle je ein Atom Magnesium auf, das ebenfalls komplex gebunden ist Coffein Als Beispiel für die Extraktion einer Pflanze zur Isolierung eines Naturstoffes wird Ihnen der Versuch zur Gewinnung von Coffein aus Tee vorgeführt. Das Coffein ist eine Purinbase und leitet sich vom Xanthin ab. Es ist in den Kaffeebohnen (1 bis 1,5%) und im Tee (bis zu 5%) enthalten. Coffein übt eine anregende und belebende Wirkung auf das Zentralnervensystem und die Herztätigkeit aus und findet medizinische Verwendung.

9 Chemie 9 B. Aufgaben 1. Warum sind Aminosäuren im ph-bereich ihres isoelektrischen Punktes am wenigsten wasserlöslich? 2. Aminosäuren können aus den entsprechenden α -Halogencarbonsäuren durch Umsetzung mit Ammoniak erhalten werden. Formulieren Sie die Umsetzung am Beispiel von Valin. 3. Erklären Sie den ersten Schritt der Ninhydrin-Reaktion. 4. Was passiert bei der Umsetzung von Alanin mit Natriumnitrit im sauren Medium? 5. Warum gelingt die Pauly-Reaktion nicht bei Phenylalanin? 6. Suchen Sie alle erwähnten Aminosäuren heraus und stellen Sie für die entsprechenden Nachweise die Reaktionsgleichungen auf. 7. Warum besitzen Proteine einen isoelektrischen Punkt? 8. Warum denaturieren Proteine bei der Veränderung des ph-wertes? 9. Was bewirkt eine Temperaturerhöhung bei Proteinen? Versuchen Sie eine Erklärung zu finden. 10. Suchen Sie im Vorlesungsskript Verbindungen, die mit Coffein verwandt sind. Versuche Versuch 1: Van Slyke-Reaktion 1 Spatelspitze Alanin, in 3 ml Wasser gelöst, wird mit 1 ml verd. Essigsäure und mit einer Spatelspitze Natriumnitrit versetzt. Versuch 2: Umsetzung einer Aminosäure mit Benzaldehyd Eine Spatelspitze Glycin (oder Alanin) wird in 5 ml Wasser/Ethanol (1 : 1) gelöst. Prüfen Sie den ph-wert. Nun werden 0,5 ml Benzaldehyd zugesetzt und das Gemisch (keine klare Lösung) wird 10 Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt. Prüfen Sie nach dem Abkühlen erneut den ph-wert. Versuch 3: Oxidation von Cystein 1 ml einer 1 %-igen wäßrigen Lösung von Cystein wird tropfenweise (!) mit ca. 2 ml Iod- Kaliumiodid-Lösung versetzt.

10 10 Chemie Versuch 4: Proteinfällung a) Man gebe in 3 Reagenzgläser je 10 ml Eiweiß-Lösung und versetze das erste mit 1 ml 0,1 N Salzsäure, das zweite mit 1 ml Puffer-Lösung ph 4,7 (Acetatpuffer) und das dritte mit 1 ml 0,1 N Natronlauge, schüttele um und verteile die Lösungen auf jeweils 2 Reagenzgläser. Zu dem ersten Satz von 3 Reagenzgläsern mit je etwa 5 ml Lösung werden jeweils 5 ml Ethanol gegeben und umgeschüttelt. Was wird beobachtet? b) Denaturierung, Ausflockung und Koagulation: Die anderen 3 Gläser (Satz 2) werden in ein Becherglas gestellt, das 100 ml Wasser enthält und 10 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Ergebnis beurteilt. Zu den Reagenzgläsern Nr. 1 und 3 werden nun je 5 ml der Puffer-Lösung gegeben. Erklären Sie die Niederschläge in den Reagenzgläsern! Aus jedem Reagenzglas dieser Reihe werden 3 ml abgefüllt und mit überschüssiger 0,1 N Salzsäure versetzt. Was wird beobachtet? c) 3 ml der Eiweiß-Lösung werden mit Aceton versetzt, bis eine Fällung beobachtet wird. Versuch 5: Fällung von Proteinen durch Denaturierung 3 ml einer Eiweiß-Lösung werden tropfenweise a) mit 1 ml 20%-iger Perchlorsäure (Vorsicht!) und b) mit 1 ml 10 %-iger Trichloressigsäure versetzt. Anmerkung: Salzsäure und Schwefelsäure fällen nicht oder nicht vollständig, wegen Bildung löslicher Komplexe. Versuch 6: Aussalzen von Proteinen In ca. 2 ml Eiweiß-Lösung wird festes Ammoniumsulfat bis zur Sättigung eingetragen, d.h. bis nach längerem Schütteln noch ungelöste Salzkristalle am Boden des Reagenzglases bleiben. Was passiert beim Verdünnen mit Wasser? Versuch 7: Biuretreaktion Ca. 2 ml einer Eiweiß-Lösung werden mit Natronlauge alkalisch gemacht und mit einer Kappenpipette mit 3 Tropfen verd. Kupfersulfat-Lösung versetzt. Überschuss an Kupfersulfat ist sorgfältig zu vermeiden, da hierbei entweder eine unspezifische Blaufärbung oder gar ein Niederschlag an Kupferhydroxid entsteht. Versuch 8: Xanthoproteinreaktion 2 bis 3 ml Eiweiß-Lösung werden mit ca. 1 ml verd. Salpetersäure erhitzt. 0,5 bis 1 ml des Gemisches werden in ein neues Reagenzglas abgegossen und mit Ammoniak alkalisch gemacht. Versuch 9: Pauly-Reaktion Man stellt sich diazotierte Sulfanilsäure durch Vermischen von 3 ml HCl-haltiger Sulfanilsäure (=Diazoreagenz I) und 3 Tropfen 0,5%-iger Natriumnitrit-Lösung (=Diazoreagenz II) her.

11 Chemie 11 0,5 ml einer 1:10 verdünnten Tyrosin-Lösung werden mit Soda-Lösung bis zur alkalischen Reaktion und dann mit 0,5 ml der Diazomischung versetzt. Versuch 11: Extraktion von grünen Blättern Es sollen Chlorophyll a und b, Xanthophyll sowie Carotin nachgewiesen werden. Dazu wird ein Aceton-Extrakt frischer Blätter verwendet. Die Trennung erfolgt an Kieselgelplatten mit n-hexan/essigester (3:1) als Laufmittel.