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Transkript

1 Skript zum biomedizinischen Praktikum Modellorganismus Maus Institut für Klinische Neurobiologie 24. bis 28. October 2016!!! Bitte Laborkittel mitbringen!!! und! leeren USB Stick! Treffpunkt am , 8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5 INHALTSVERZEICHNIS Zusammenfassungen der Vorträge Kursprogramm Zellkultur Teil Immunhistochemischer Teil Ionenkanäle bei der Arbeit Deckblatt

2 Neurotrophe Faktoren (Prof. Sendtner) Neurotrophe Faktoren wurden ursprünglich als Überlebensfaktoren für embryonale Nervenzellen entdeckt. Viktor Hamburger und Rita Levi-Montalcini, die für die Entdeckung von Nerve Growth Factor (NGF) den Nobel-Preis erhalten hat, konnten zeigen, dass Proteine, die in sehr geringen Mengen im Innovationsgebiet von sensorischen, sympathischen und motorischen Nervenzellen produziert werden, für deren Überleben während der Embryonalentwicklung notwendig sind. Während der Embryonalentwicklung werden bei höheren Wirbeltieren verschiedene Populationen von Nervenzellen, darunter spinale Motoneurone, die sensorischen und sympathischen Nervenzellen der Hinterwurzel bzw. Paravertebralganglien, im Überschuss gebildet. Ca. 50% der postmitotischen Neurone, nachdem sie Kontakt mit dem Zielgewebe gemacht haben, gehen dann wieder zugrunde. Viktor Hamburger konnte in einer Reihe detaillierter Untersuchungen zeigen, dass dieser physiologische Zelltod nicht endogen programmiert ist, sondern durch Signalmoleküle aus dem Innervationsgebiet der jeweiligen Nervenzelltypen gesteuert wird. Diese Befunde waren Ausgangspunkt für Rita Levi-Montalcini für die Identifikation und Reinigung (zusammen mit J. Cohen) eines ersten neurotrophen Faktors, Nerve growth factor (NGF). Abb.1: Assay mit explantierten sympathischen Ganglien (R. Levi-Montalcini) nach Zugabe von Gewebeextrakten, die NGF enthielten NGF ist prototypisches Mitglied einer großen Familie von Neurotrophinen, der neben NGF auch BDNF, NT-3 sowie NT-4/5 bei Säugern angehören. Bei Fischen wurden weitere Mitglieder der Neurotrophin- Familie gefunden, NT-6 und NT-7. Diese neurotrophen Faktoren vermitteln ihre Wirkung auf das Überleben von Nervenzellen über hochaffine Rezeptoren, die ihre Liganden mit einer Affinitätskonstante (K D ) von M binden. Wesentlicher Bestandteil dieser hochaffinen Rezeptoren sind Transmembranproteine der Tropomyosin-Rezeptorkinase (Trk)-Familie, von denen Trk-A spezifisch NGF bindet, Trk-B sowohl BDNF als auch NT-4/5 erkennt, und Trk-C bevorzugt NT-3 bindet. 2

3 Abb.2: Schematische Darstellugn der Bindung von Mitgliedern der Neurotrophinfamilie an Trk Rezeptoren und den p75 NTR Rezeptor. Neben diesen Transmembrantyrosinkinaserezeptoren existiert ein niederaffiner Neurotrophin-Rezeptor (p75 NTR ), der alle bekannten Neurotrophine mit ähnlicher Affinität (K D 10-9 M) bindet. Aufgrund der hohen Bindungsaffinität von Neurotrophinen an hochaffine Rezeptoren (K D von M) ist verständlich, dass nur sehr geringe Mengen dieser Neurotrophine (weniger als 1ng/g Gewebe) ausreichen, um ca. die Hälfte der während der frühen Embryonalentwicklung generierten Neurone am Leben zu halten. Typisch für Mitglieder der Neurotrophinfamilie ist die hohe Spezifität für bestimmte Zellpopulationen: NGF wirkt nur auf sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien sowie eine Subpopulation sensorischer Neurone, jedoch nicht auf motorische Nervenzellen sowie propriozeptive sensorische Neurone. NT-3 wirkt insbesondere auf -Motoneurone sowie schnell leitende Subgruppen von sensorischen Nervenzellen, BDNF auf motorische Nervenzellen sowie Subgruppen sensorischer Neurone. Die Elimination des NGF-Gens führt zu einem fast vollständigen Absterben sympathischer Nervenzellen in den Paravertebralganglien, die Mäuse sind so nicht überlebensfähig und sterben spätestens in der 3. postnatalen Woche. Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei BDNF- und NT-3-defizienten Mäusen gemacht, bei denen die jeweiligen Neuronengruppen, die von diesen Faktoren abhängig sind, selektiv zugrunde gehen. Die Injektion bzw. transgene Überexpression von Neurotrophinen bewirkt nicht nur erhöhtes Überleben, sondern auch erhöhte neuronale Aktivität sowie Faseraussprossen. So führt z.b. die Injektion von NGF bei neugeborenen Mäusen und Ratten zu einem Aussprossen von Schmerz-leitenden Fasern und einer erhöhten Sensibilität. 3

4 Abb3: Wirkung einer Injektion von NGF bei neugeborenen Ratten auf Überleben und Faseraussprossen bei langsamleitenden sensorischen Neuronen Die Funktion des Nervensystems wird nicht nur durch die neurotrophen Faktoren der Neurotrophin- Familie, sondern auch durch andere Familien von neurotrophen Faktoren beeinflusst und reguliert. Zu diesen Faktoren gehören die Mitglieder der Glia-derived-neurotrophic-factor (GDNF-)Familie sowie die neurotrophen Zytokine der Ciliary neurotrophic factor (CNTF)/Leukemia-inhibitory factor (LIF)/Cardiotrophin-1 (CT-1)-Familie. Besonders die Mitglieder der letzten Familie werden erst relativ spät während der Entwicklung exprimiert, einzelne Faktoren, insbesondere CNTF erst postnatal, dann aber in sehr hohen Mengen. CNTF wird nicht im Zielgewebe von responsiven sensorischen und motorischen Nervenzellen exprimiert, sondern in myelinisierenden Schwannzellen. Nach Nervläsion steht dieser Faktor so direkt zur Verfügung und kann so das Überleben von axotomierten Nervenzellen verbessern. So ergibt sich ein komplexes Bild über die Wirkung von neurotrophen Faktoren: neben der klassischen Wirkung auf das Überleben spezifischer Gruppen von Nervenzellen während der Embryonalentwicklung sind sie notwendig für die Regulation synaptischer Aktivität, für die Aufrechterhaltung von Nervenzellverbindungen und Axonen sowie für die Regeneration nach Läsion. Literatur: Alberts: Molecular Biology of the Cell: Kapitel 21: Cellular mechanisms of development Kandel (4. Auflage) Part VIII: Develoment of the Nervous System. 4

5 Axonaler Transport I und Tiermodelle für Motoneuronerkrankung (Dr. Jablonka) Die Fortsätze von Nervenzellen können beim erwachsenen Menschen oft Längen von ca. 1 Meter erreichen. Jede Nervenzelle muss ständig Proteine und andere Strukturelemente transportieren um die Funktion auch in vom Zellkörper entfernten Kompartimenten aufrecht zu erhalten. Verschiedene Proteine aber auch mrnas werden im Zellkörper synthetisiert und in Axonen und Dendriten transportiert. Dieser Vorgang wurde bereits 1948 beschrieben und wird als axonaler bzw. dendritischer Transport bezeichnet. Erst in den vergangenen Jahren wurden die molekularen Mechanismen dieses Transports entlang von Mikrotubuli detailliert aufgeklärt. Bei Untersuchungen über den axonalen Transport stellte sich heraus, dass in beiden Richtungen Substanzen transportiert werden. Der anterograde Transport erfolgt vom Zellkörper zur Synapse hin und dient vor allem dem axonalen Wachstum. Beim gegenläufigen retrograden Transport werden Substanzen durch das Axon zum Zellkörper befördert. Hierbei handelt es sich zum Teil auch um Signalproteine und Komplexe, die zum Zellkörper transportiert werden. Nach der Geschwindigkeit kann man langsamen von schnellen axonalen Transport unterscheiden. Die Mikrotubuli bilden die Grundlage für zahlreiche zelluläre Bewegungsformen wie beispielsweise der intrazelluläre Transport von Membranvesikeln in den Axonen der Nervenzellen. Diese Bewegungen beruhen entweder auf der Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli oder auf der Aktivität der Mikrotubulus-Motorproteine Dynein und Kinesin. Abbildung 1: Dyneinkomplex sowie Kinesine sind Motorproteine für den anterograden sowie den retrograden Transport. 5

6 Ist der axonale Transport sowohl beim Menschen sowie bei der Maus gestört, kann es so einer sogenannten Motoneuronerkrankung kommen. Motoneuronerkrankungen sind degenerative Erkrankungen der -Motoneurone im Rückenmark, die zu Muskelschwäche und -atrophie führen. Die Motoneuronerkrankungen können verschiedenen Ursprungs sein. Die mit am weitesten verbreitete Motoneuronerkrankung ist die sogenannte amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Sporadische Formen der ALS beginnen im Erwachsenenalter und betreffen kortikospinale sowie spinale Motoneurone. Das Mausmodel für die sporadische Form der ALS ist die progressive motoneuronopathy mouse (pmn). Abbildung 2: Pmn-Mutante rechts, gesundes Geschwistertier links Das Krankheitsgen der pmn Mutante wurde durch positionelle Klonierung identifiziert und kodiert für ein sogenanntes Tubulinspezifisches Chaperon E (Tbc E), einen Cofaktor, der die Heterodimerisierung von und Tubulin unterstützt. Isolierte embryonale Tbc E-defiziente Motoneurone zeigen Störungen im Axonwachstum und weisen überdurchschnittlich viele axonale Schwellungen auf. In diesen axonalen Schwellungen liegt eine gestörte Kolokalisation von Tubulin und seinem assziierten Protein p-tau vor. Wildtyp Mutante p-tau Tubulin Overlay Abbildung: Verteilung von p-tau und Tubulin in Kontroll- und Tbc E-defizienten Motoraxonen von isolierten Motoneuronen. 6

7 Aber nicht nur Komponenten für die Bildung der Mikrotubuli, auch die Motorproteine können bei Dysfunktion zu Motorneuronerkrankungen führen (z.b. Loa und Cra Mäuse). Letzten Endes ist jedoch das Ziel der Untersuchung der pathomechanistischen Ereignisse, die zu Motoneuronerkrankungen führen, eine mögliche Therapie dagegen zu entwickeln. Erste Therapieansätze wurden bei der pmn Mutante entwickelt. Durch CNTF Gabe ist es gelungen, den pmn- Phänotyp zu mildern. + CNTF Kontroll Pmn Maus ohne CNTF Literatur: Fundamental Neuroscience, second edition Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition 7

8 Axonaler Transport II und Tiermodelle für Motoneuronerkrankungen (Dr. Jablonka) Während der Entwicklung brauchen Neurone sogenannte Meilensteine um ihr Zielgewebe oder die Zielzelle zu finden. Wie unterschiedlich diese "Wegfindungsmechanismen" sein können, ist sehr anschaulich an retinalen Ganglienzellen des Krallenfroschs gezeigt. Die Ganglienzellen wachsen entlang der Basallamina und Gliafortsetzen bis zum Eintrittspunkt in den Sehnerv. Innerhalb des Sehnervs finden sie den Weg mit Hilfe von Pionier-Neuronen; dann wandern sie entlang des optischen Trakts und treten schließlich ins optische Tektum ein. Abbildung 1: Die retinalen Axone auf ihrem Weg ins optische Tektum Ihr Ziel innerhalb des optischen Tektums wird durch sogenannte Wegfindungsmoleküle bestimmt. Es sind vier Klassen dieser Wegfindungsmoleküle bekannt: Semaphorine, Ephrine, Slit und Netrine. Diese Wegfindungsmoleküle können eine sowohl abstoßende wie auch anziehende Wirkung auf die Nervefortsätze haben. 8

9 Abbildung 2: Wegfindungsmoleküle können eine sowohl anziehende wie abstoßende Wirkung haben. Damit jedoch ein sich entwickelndes Neuron diese Signalmoleküle überhaupt erkennen kann, muss der Wachstumskegel eines Neurons mit den entsprechenden Rezeptoren ausgestattet sein. Wachstumskegel eines Neurons sind die Bereiche, die sich, wenn sie ihr Zielgewebe oder ihre Zielzelle gefunden haben, zu einer Präsynapse ausbilden. Während der Entwicklung dient der Wachstumskegel allerdings dazu die Wege und Ziele der Axone zu finden. Die Wegfindung ist ein sehr dynamischer Prozess und daher immer mit der Polymerisation und Depolymerization des Zytoskelttproteins ß-Aktin verbunden. Daher bildet ß-Aktin den Hauptbestandteil der Zyoskelettproteine im Wachstumskegel (im Gegensatz zum Tubulin in den Axonen). Abbildung 3: Der Wachstumskegel Um jedoch schnell auf externe Signale reagieren zu können, muss es dem Wachstumskegel möglich sein, den Rezeptortyp innerhalb von Minuten zu wechseln. Da selbst der schnelle anterograde Transport für membrangebundene Proteine oder Vesikel nur mm pro Tag beträgt, müssen die Rezeptoren bereits im Kegel vorliegen, damit ein schneller Austausch erfolgen kann. Hier kommt das Prinzip von lokaler Proteinsynthese zum Tragen. Abbildung 4: Es konnten bereits freie Ribosome im Wachstumskegelbereich von Neuronen identifiziert werden. mrnas werden entlang der Axone, nach dem Prinzip des axonalen Transport bis zum Wachstumskegel transportiert. Je nach ankommendem Signal werden dann die entsprechenden Rezeptoren translatiert und präsentiert. Genauer Ablauf und Mechanismus der lokalen Translation sind allerdings noch nicht vollständig geklärt. 9

10 Die Rezeptorausstattung von Neuronen hängt jedoch in erster Linie von ihrer Genetik ab. Friedrich Bonhöffer konnte sehr eindrücklich an seinem Membrane-Stripe-Assay zeigen, dass retinale Ganglienzellen aus unterschiedlichen Bereichen der Retina, unterschiedlich (mehr oder weniger sensitiv) auf Signalmoleküle regieren. Abbildung 5: Membrane-Stripe-Assay von Friedrich Bonhöffer; Axone von retinalen Ganglienzellen aus unterschiedlichen Bereichen der Retina reagieren unterschiedlich sensitiv auf Ephrin 2A. Die unterschiedliche Rezeptorausstattung von Neuronen ist typ- sowie entwicklungsspezifisch und die Grundvoraussetzung für die Ausbildung von topographischen Karten im Nervensystem. Ein Beispiel einer Motorneuronerkrankung bei der ein möglicher defekter axonaler mrna Transport vorliegt, ist die klassische Form der spinalen Muskelatrophie (SMA). Die spinale Muskelatrophie ist eine der häufigsten Formen von Motorneuronenerkrankungen bei Kindern. Sie ist charakterisiert durch den Verlust von spinalen und bulbären Motoneuronen, was zu Muskelschwäche und Atrophie führt. SMA wird autosomal rezessiv vererbt. Positionelle Klonierungsexperimente führten 1995 zur Identifizierung des sogenannten SMN Gens, das seither als Krankheitsgen gilt. Der Mensch besitzt zwei Kopien des SMN Gens, die sich in ihrer Expression unterscheiden. Nur die telomere Kopie ist in der Lage ein voll funktionstüchtiges Protein zu bilden. Mutationen innerhalb oder der Verlust der telomeren Kopie können demnach nicht vollständig durch die zentromere Kopie ersetzt werden. Es konnte gezeigt werden, dass isolierte primäre Motoneurone eines SMA Mausmodells einen ß-AktinmRNA Defizit im Wachstumskegel haben, was wiederum zum einem reduzierten ß-Aktin-Proteingehalt führt. Dieser ß-Aktin-Mangel bedingt ein Defizit an membranständigen Kalzium-Kanälen und endet letzten Endes in Erregbarkeitsproblemen im Wachstumskegelbereich des Motorneurons. Es wird davon ausgegangen, dass der ß-Aktin mrna Transport entlang der Axone gestört ist. 10

11 Axon Soma ß-Actin SM hnrnp Abbildung 6: Der SMN-hnRNP R Komplex transportiert spezifisch ß-Aktin mrna entlang der Axone bis in den präsynaptischen Bereich eines Motorneurons. Literatur: Fundamental Neuroscience, second edition Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition 11

12 Neurale Stammzellen (Dr. Götz) Die überwiegende Zahl von Zellen im Nervensystem wird in der embryonalen Entwicklung und in der frühen postnatalen Entwicklung gebildet. Aber es gibt auch Regionen im adulten Gehirn der Säuger in denen kontinuierlich neue Neuronen gebildet werden. Diese Neuronen stammen von neuralen Vorläuferzellen ab, die sogar in Kultur genommen und vermehrt werden können. Ependymale Zellen werden zu sich stark vermehrenden Zellen, die Neuronen generieren, die wiederum in das olfaktorische Epithel einwandern. Neurale Stammzellen können von den Ventrikelwänden und vom Hippocampus isoliert werden und haben die Kapazität zur Selbsterneuerung und Vermehrung in vivo wie auch in vitro. Stammzellen, die im Bereich der lateralen Ventrikel lokalisiert sind, werden zu immaturen Neuronen, die entlang des rostralen Migrationsweges in das olfaktorische Epithel einwandern und dort zu Neuronen werden. Durch die Forschung an Stammzellen in den letzten Jahren sind die Faktoren identifiziert worden, die einen Einfluß auf Stammzellen ausüben können. Diese Faktoren steuern die Selbsterneuerungskapazität (self-renewal) und die Differenzierung. Das Umfeld (Zellen und Faktoren) von Stammzellen bezeichnet man als Stammzellnische. Faktoren, die einen Einfluß auf Stammzellen ausüben sind zum einen diffundierbare Faktoren, wie z.b. Hormone und Wachstumsfaktoren, zum anderen Membranständige Proteine und ihre Liganden, wie etwa Eph/Ephrin und Notch/Jagged. Signale können aber auch von umliegenden Axonterminalen freigesetzt werden, hierbei werden Neurotransmitter freigesetzt (GABA, Glutamat, Ach). Auch können Signale von Komponenten der Extrazellulären Matrix erfolgen. Abb. 1: Komponenten und Signale der Stammzellnische. Zwei andere wichtige Begriffe sind die Stammzellplastizität und die Transdifferenzierung. Man hat herausgefunden, dass man durch die Zugabe von geeigneten Faktoren die Differenzierung von 12

13 Stammzellen beeinflussen kann. So kann man z.b. Stammzellen, die man aus dem Knochenmark isoliert hat, in Leber oder Muskelzellen transdifferenzieren. Hierbei versucht man Faktoren zu finden, die der endogenen Stammzellnische der jeweiligen Stammzelle entsprechen und versucht diese in vitro nachzustellen. Dieser Ansatz nährt die Hoffnung bislang nur schwer bis gar nicht therapierbare Erkrankungen zu behandeln. Erste Erfolge konnten auch in dem Feld der Neurodegenerativen Erkrankungen kürzlich erzielt werden. Literatur: Alberts: Molecular Biology of the Cell Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition 13

14 Alberts: Molecular Biology of the Cell Neuronale Schaltkreise des Hippocampus und des Kleinhirns (Dr. Blum) When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or persistently takes part in firing it, some growth process or metabolic change takes place in one or both cells such that A s efficiency, as one of the cells firing B, is increased (Donald Hebb, 1949) Die Signalübertragung zwischen Nervenzellen findet vorwiegend an Synapsen statt. Adaptive Prozesse an Synapsen (synaptische Plastizität), als Folge eines zeitlich und räumlich synchronisierten Informationsflusses über Synapsen, spielen eine bedeutende Rolle für die verschiedenen Formen von Lernen und Gedächtnis. Im Jahr 1973 beschrieben zwei Studien durch T.V.P Bliss, T. Lømo, und Gardner- Medwin erstmals das Phänomen der Langzeitpotenzierung (LTP, long-term potentiation). In ihren Experimenten konnten die Autoren zeigen, dass wiederholte, zeitlich koordinierte Reize von hippocampalen Eingangsstrukturen eine signifikante und langanhaltende Verstärkung von Synapsen im hippocampalen Schaltkreis hervorrufen. Erstbeschreibung der LTP. In Folge einer kurzen, aber intensiven synaptischen Reizung werden die aktivierten Synapsen zwischen Neuronen langanhaltend verstärkt. In dem gezeigten Experiment wurde durch das Auslösen von Aktionspotenzialserien auf den Axonen des Tractus perforans (PP) die glutamaterge Synapse der Körnerzellen im Gyrus dentatus (AD) so stark gereizt, dass die Effizienz der synaptischen Transmission im dendritischen Bereich der Körnerzellen, als auch die Erregbarkeit der Körnerzellen langfristig gesteigert war. Der definierte starke Gebrauch von Synapsen kann folglich schnelle, molekulare Änderungen hervorrufen, die dieselben Synapsen mit stark erhöhten Erregenden PostSynaptischen Potentialen (EPSPs) auf Einzelreize reagieren lässt. In Anlehnung an das Hebb sche Postulat aus dem Jahr 1949 werden aktivitätsabhängig modifizierbare synaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen auch Hebb sche Synapsen genannt. Heute wird das Phänomen der LTP als geeignetes Modell zur Erforschung der molekularen Grundlagen des Lernens erachtet, da es viele Kriterien eines neuronalen Korrelats des Gedächtnisses erfüllt. Die bedeutendsten neuronalen Schaltkreise zur Erforschung der synaptischen Plastizität sind die des Hippocampus und des Kleinhirns. Beide Modellsysteme sind strukturell einfach aufgebaut und verschaltet, bieten experimentellen Zugang unter in situ und in vitro Bedingungen und erlauben zumindest punktuell eine 14

15 Kausalbeziehung zwischen Vorgängen synaptischer Plastizität auf zellulärer Ebene und der Gedächtnisbildung auf Verhaltensebene. Hippocampus Funktionell ist der Hippocampus die zentrale Struktur des deklarativen Gedächtnisses (Fakten, Ereignisse, räumliche Zusammenhänge) und vermittelt auch Kontext-abhängige Elemente des Lernens. Die hippocampale Formation Hippocampus besteht aus dem Rindenband (Cornu ammonis; CA) und in dem Zellband (Gyrus dentatus, AD). Synaptische Plastizität kann im Hippocampus auf zwei Ebenen untersucht werden: (1) ausgehend von der Betrachtung des trisynaptischen, erregenden Schaltkreises des Hippocampus; (2) ausgehend von der Integration neugenerierter Körnerzellen in den bestehenden hippocampalen Schaltkreis im Rahmen der adulten Neurogenese. Der trisynaptische Schaltkreis: 1. Synapse: Input von Neuronen des entorhinalen Cortex, die ihre Axone über den Tractus perforans mit vielen Synapsen im Dendritenbaum der Körnerzelle des Gyrus dentatus verbinden. 2. Synapse: Die Axone der Körnerzellen (sog. Moosfasern) verbinden sich mit Pyramidenzellen in der CA3 Region. 3. Synapse: Eine Axonkollaterale der CA3 Pyramidenzelle (sog. Schafferkollaterale) projiziert zu Pyramidenzellen der CA1 Region. Die generalisierte Betrachtungsweise vieler Lehrbücher suggeriert einen einheitlichen molekularen Mechanismus synaptischer Lernvorgänge, wie sie an der Synapse CA3- CA1 (Schafferkollaterale-CA1) beobachtet wurden. Hier braucht die LTP einen postsynaptischen ionotropen Glutamatrezeptor (Typ NMDA) und ein postsynaptisches Ca 2+ Signal. Zwar wird an allen Synapsen des trisynaptischen Schaltkreises LTP unter glutamaterger Übertragung beobachtet, doch gilt es als erwiesen, dass synaptische Plastizität an der Moosfasersynapse NMDA-Rezeptor-unabhängig ist, ein präsynaptisches Ca 2+ Signal braucht und somit eine bevorzugt präsynaptische Komponente trägt. Die Kommunikation der Postsynapse mit der Präsynapse bei der synaptischen Plastizität ist weitgehend ungeklärt. Dennoch häufen sich Hinweise, dass das Neurotrophin BDNF (siehe Beitrag Prof. M. Sendtner) hier eine wesentliche Rolle spielt. Seit 1995 ist bekannt, dass die Freisetzung von BDNF im Rahmen der Induktion von LTP eine funktionelle Rolle spielt und sich über die Rezeptortyrosinkinase TrkB vermitteln kann. Die molekularen Signalübertragungsmechanismen, sowie Modelle, die die schnelle Sekretion des Proteins BDNF erklären können, sind jedoch umstritten. 15

16 Adulte Neurogenese im Hippocampus Jüngste Forschungen konnten in der Zone unterhalb des Körnerzellbands des Gyrus dentatus (subgranular zone) funktionelle, adulte Neurogenese nachweisen. Hier entstehen aus teilungsfähigen Vorläuferzellen mit Eigenschaften astrozytärer Gliazellen lebenslang glutamaterge Körnerzellen. Erst im Jahr 2008 konnte nachgewiesen werden, dass neugenerierte Körnerzellen sich in das bestehende neuronale Netzwerk des Hippocampus funktionell und synaptisch integrieren. Körnerzellen, die sich im adulten Gyrus dentatus neu gebildet haben. Die Zellen wurden mit einem Virus markiert, der nur in teilungsfähigen Zellen zum Ausdruck kommt und so die Entwicklungslinie der hippocampalen Stammzellen darstellen kann. Bild aus: Toni et al Kleinhirn Die physiologische Aufgabe des Kleinhirns ist Kontrolle Kontrolle der Halte- und Stützmotorik, der Bewegungskoordination, der Zielmotorik und ihrer Kurskorrektur, sowie ballistischer Bewegungen. Menschen mit Kleinhirndefekten sind in ihrem motorischen Lernen stark beeinträchtigt und zeigen einen gewissen Verlust bewegungsbezogener kognitiver Funktionen. Eine Besonderheit der Kleinhirnphysiologie ist die eindeutige Zuordnung der zellulären Grundlage des afferenten und efferenten Informationsflusses. Zentrale Schaltstelle ist die Purkinjezelle, die über die Moosfaser- und Kletterfasereingänge eine Efferenzkopie des motorischen Vorhabens erhält und optimierend in die Bewegung eingreift. Die Purkinjezelle besitzt im Vergleich zu anderen principal neurons des ZNS einige ungewöhnliche Eigenschaften. Sie besitzt (1) eine hohe, basale Aktivitätsrate, (2) kein klassisches Ruhemembranpotential, und (3) kommuniziert inhibitorisch über den Transmitter GABA. Die Projektion der Purkinjezelle zu den Kleinhirnkernen ist die einzige Efferenz aus dem cerebellären Kortex, einer zentralen Struktur des motorischen Lernens. Interessanterweise können synaptische Lernvorgänge an Purkinjezellsynapsen mit einer reziproken Form der synaptischen Plastizität, der LTD (Langzeitdepression, long term depression) korreliert werden. Hierbei wird durch koordinierte Stimulation der Kletterfaser- und Moosfasereingänge die Synapse der Parallelfaser zur Purkinjezelle in ihrer synaptischen Stärke langzeitig geschwächt und somit das Feintuning des cerebellären outputs bestimmt. Tiermodelle, bei denen diese spezifische synaptische Übertragung gestört ist, zeigen in Verhaltensversuchen eine starke Beeinflussung der motorischen Fähigkeiten und des motorischen Lernens, bis hin zu einer ausgeprägten Ataxie. Wird eine Parallelfaser repetitiv gereizt, so können in PF-Purkinjezellsynapsen zwei Typen von Ca 2+ Signalen beobachtet werden. (1.) Ein schnelles Ereignis wird durch 16

17 Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ initiiert (postsynaptische Depolarisierung) und öffnet unmittelbar spannungsabhängige, dendritische Ca 2+ Kanäle. (2.) Ein langsameres Ereignis vermittelt über metabotrope Glutamatrezeptoren (mglur1) die Freisetzung von Ca 2+ aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Freisetzung von Ca 2+ aus dem ER führt wiederum zur Aktivierung von Ionenkanälen in der Plasmamembran, die erneut eine lokale Depolarisierung des Dendriten bewirken. Verantwortlich für dieses Signal sind sogenannte Trp-Ionenkanäle (Trp, transient receptor potential channels). Aus der riesigen Familie der Trp-Kanäle, die man häufig auch als sensorische Kanäle des Nervensystems bezeichnet, wurde der Kanal TrpC3 als maßgeblich für die synaptische Transmission an der PF-Purkinjezelle ermittelt. Mausmodelle denen dieser Kanal fehlt, zeigen starke Defekte der motorischen Koordination (Hartmann et al. 2008). Ein natürlich vorkommendes Mausmodell mit motorischen Defekten (moonwalker) zeigt eine Mutation im Gen, das für den Kanal TrpC3 kodiert. Diese Befunde belegen eindringlich die Nützlichkeit einer detaillierten anatomischen, physiologischen und molekularen Beschreibung synaptischer Systeme. Dieses Wissen erlaubt ein besseres Verständnis klinischer Phänomene und hilft bei der Entwicklung neuartiger Therapien. Neuronaler Schaltkreis im cerebellären Kortex und Orte synaptischer Plastizität (1-5). Der cerebelläre Schaltkreis bietet innerhalb eines definierten Informationsflusses (Pfeile) die Möglichkeit Formen der synaptischen Plastizität zu untersuchen. An Purkinjezellsynapsen wird LTD durch Koinzidenz von zwei Signalen hervorgerufen, die über Kletterfasern (CF) und Parallelfasern (PF) vermittelt werden (CF-PF pairing). Signale, die zur Vermittlung der Purkinjezell-LTD führen, sind gut beschrieben und bieten eine experimentelle Grundlage zur Untersuchung der molekularen Mechanismen synaptischer Plastizität. Eine Purkinjezelle der Ratte unterhält bis zu Synapsen zu Parallelfasern und bis zu zu Kletterfasern. Es konnte gezeigt werden, dass postsynaptische Ca 2+ Signale in einzelnen Purkinjezellsynapsen ursächliche Mediatoren der Purkinjezell-LTD darstellen können. Jüngere Forschungen haben einen Mechanismus der synaptischen Plastizität offengelegt, der unabhängig von NMDA-Typ Glutamatrezeptor ist. Literatur: *Fundamental Neuroscience; *Principles of Neural Science, *Physiologie des Menschen. Milner, Squire & Kandel (1998) Cognitive Neuroscience and the study of memory. Neuron 20: 445 ff. Ito M. (2002) The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Rev Neurosci 3:

18 Dysfunktion der Nerven-Muskel-Synapse (Prof. Villmann) Geschwindigkeiten, mit denen elektrische Impulse im Gehirn weitergeleitet werden, sprengen unser menschliches Vorstellungsvermögen: So rasen die Impulse mit Höchstgeschwindigkeit eines Formel-1- Rennwagens rund 350 Kilometer pro Stunde von Zelle zu Zelle. Dazu müssen innerhalb einer tausendstel Sekunde viele tausend Ionen durch einen Ionenkanal geleitet werden. Wenn wir eine Buchseite umgeschlagen haben, dann haben sich nur um diese einfache Bewegung der Armmuskeln auszuführen im Gehirn gerade rund zwei Milliarden Ionenkanäle geöffnet und wieder geschlossen. Ionenkanäle sind membrangebundene Proteine, die den Ionenfluss über die Membran gewährleisten. Dieser ist entscheidend für viele physiologische Prozesse im Organismus wie Muskelkontraktion, Elektrolyt-Sekretion, und synaptische Transmission zwischen Nervenzellen. Die meisten Signalwege der schnellen synaptische Transmission werden durch die Superfamilie der Cys-Loop Rezeptoren gewährleistet, wozu die nikotinischen Acetylcholinrezeptoren, die GABA A/C Rezeptoren, der 5HT 3 Rezeptor, Glutamat-aktivierte Chloridkanäle und die Glycinrezeptoren zählen. Einige Mitglieder dieser Familie wie z.b. der nikotinische Acetylcholinrezeptor oder GABA A Rezeptoren sind Angriffspunkt für Pharmaka mit entscheidender klinischer Bedeutung. Obwohl bekannt ist, dass muskelentspannende, sedative und anxiolytische Pharmaka sowie Anti-Epileptika und Anästhetika über die Bindung an GABA A Rezeptoren wirken, gibt es dennoch einen erheblichen Anwendungsbereich für die Entwicklung neuer Therapeutika mit verbesserten Eigenschaften, reduzierter Abhängigkeit und weniger Nebenwirkungen. Eine andere wichtige Familie der inhibitorischen Cys-loop Rezeptoren sind die Glycinrezeptoren, die ebenfalls ein geeignetes therapeutisches Target für chronischen Schmerz, Tinnitus, Temporallappen Epilepsy und Spastizität darstellen. Obwohl die Bindung per se von Alkoholen, Taurin, -Alanin oder Anästhetika wie Propofol an Glycinrezeptoren bekannt ist, existieren aufgrund der fehlenden Kristallstruktur keine genauen Erkenntnisse über die Bindungsdomänen und Konformationsänderungen, die nach der Bindung stattfinden. Diese aufzuklären wird das Feld entscheidend beeinflussen und für die Entwicklung neuer Therapeutika für verschiedene Erkrankungen des zentralen Nervensystems maßgeblich sein. Wo im zentralen Nervensystem sind diese Rezeptoren präsent und welche Bedeutung für die Physiologie besitzen sie? Dies soll am Beispiel der Nerven-Muskel Synapse verdeutlicht werden. Zunächst wird durch die Erregung sensorischer Neurone, die sich in dorsalen Wurzelganglienzellen (DRGs) befinden, Glutamat als exzitatorischer Neurotransmitter ausgeschüttet. DRGs befinden sich in der Nähe zum Rückenmark. Folge der Glutamatausschüttung ist die Aktivierung von Glutamatrezeptoren, die sich in der Membran von Motoneuronen befinden. Die Membran wird depolarisiert, ein exzitatorisches postsynaptisches Potential entsteht (EPSP). Motoneurone feuern Aktionspotentiale zur neuromuskulären Endplatte, wo das Signal wieder über einen exzitatorischen Neurotansmitter, in diesem Fall Acetylcholin, weitergeleitet wird. Dieses System funktioniert mit größter Präzision, denn ein Aktionspotential im Motoneuron führt zu genau einen Aktionspotential an der Muskelfaser. Diese Kontrolle obliegt inhibitorischen Interneuronen im Rückenmark (Renshaw Zellen), die durch kollaterale Axone der Motoneurone erregt werden, selbst aber inhibitorische Synapsen mit der Motoneuronenmembran ausbilden. Diese Interneurone schütten Glycin aus, der dann an Glycinrezeptoren bindet. Dadurch wird ein inhibitorisches postsynaptisches Potential (IPSP) generiert, die Membran wird hyperpolarisiert. Durch diese Feedback Kontrolle, wird das Motoneuron in seiner Feuerrate kontrolliert, so dass letztlich nur soviel Acetylcholin ausgeschüttet wird, wie zur Erreichung des Schwellenwerts für ein Aktionspotential notwendig ist, dieses breitet sich entlang der Muskelfaser aus. Als Folge kann sich der menschliche Organismus kontrolliert bewegen (Abb.1). 18

19 A B Abb. 1 (A) Nerven-Muskel Synapse. Kontrolle durch inhibitorische Interneurone (Renshaw Zellen. (B) GABAerge Neurotransmission bedeutend in höheren Hirnarealen wie z.b. dem Hippocampus (C) Inhibitorische Synapse stark schematisiert. Beteiligung verschiedener Glycinrezeptorpopulationen. Rechts: Homologie Modell des pentameren Ionenkanals. C Mutationen in humanen sowie auch in murinen Genen, die für Glycinrezeptoruntereinheiten kodieren, sind mit motorischen Bewegungsstörungen assoziiert. Beim Menschen heißt diese Erkrankung Hyperekplexie (Stiff Baby Syndrome) und äußert sich bereits in der ersten Lebenswoche durch Krampfanfälle als Folge sensorischer oder taktiler Reize. Im Patienten wird durch Clonazepam-Gabe die GABAerge Neurotransmission hochreguliert und dadurch die fehlende glycinerge Inhibition kompensiert. Bei Mutationen in GABA A Rezeptoruntereinheiten wird eine Assoziation mit bestimmten Formen von Epilepsy diskutiert. Um die Pathomechanismen dieser Erkrankungen besser zu verstehen, nutzt man Mausmodelle die spontane Mutationen in Glycinrezeptorgenen tragen bzw. generiert transgene Tiere, die gezielt im Pateinten identifizierte Mutationen tragen. 19

20 Der Phänotyp der Tiere zeichnet sich durch massiven Tremor und Zusammenpressen der hinteren Extremitäten aus (Abb.2). Mausmutante oscillator elektrophysiologische Ganzzellableitungen Wildtyp Mutanten Mit Hilfe elektrophysiologischer Untersuchungen in vitro an transfizierten Zellen oder in Hirnschnitten aus dem Tier lassen sich die unterschiedlichen Kanaleigenschaften bis auf Einzelkanalniveau spezifizieren. Einzelkanalmessungen: Vergleich Wildtyp und spasmodic Mausmutante mit GlyR 1 Defekt (aus Graham et al., 2011, J. Physiol.) Die Patch-Clamp-Technik wurde ursprünglich zur Messung kleinster Ströme entwickelt und führte zur Vergabe des Nobelpreises für Medizin 1991 an Bert Sakmann und Erwin Neher. Mittlerweile ist sie Standardtechnik bei elektrophysiologischen Ganzzellableitungen von Neuronen und erlaubt eine detaillierte Untersuchung der unterschiedlich regulierten Ionenkanäle mit ihren charakteristischen Eigenschaften. Die Erkenntnisse aus den elektrophysiologischen Untersuchungen tragen zum besseren Verständnis der Signalwege bei und sind daher bedeutsam für die Entwicklung neuartiger Therapiemöglichkeiten. 20

21 Neurobiologie Kursprogramm Uhrzeit Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag Freitag GRUPPE Kleinhirn und Hippokampus Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen und Ionenkanäle Neuronale Stammzellen Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neurodegenerative Erkrankungen Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neurodegenerative Erkrankungen DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP Kleinhirn und Hippokampus Hippocampus Präparation Hippocampus Präparation Hippocampus Präparation Hippocampus Präparation Zellkultur DRGs Hippocampus Präparation Axonaler Transport Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen und Axonaler Transport Mausperfusion Mausperfusion Mausperfusion Gewebe einbetten Ionenkanäle Waschen der Schnitte Vortrag R.B. Immunhistochem. Waschen der Schnitte Vortrag R.B. Immunhistochem. 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Antikörper und Immunhisto 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Mikroskopie und Neuronale Stammzellen Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung Imaging PAUSE PAUSE Auswertung der Bilder, Abschlussbespr echung PAUSE Hippocampus Präparation PAUSE PAUSE PAUSE PAUSE Gewebe schneiden Waschen Zellkultur DRGs, PAUSE Gewebe schneiden Waschen und DAPI PC12 Färbung Zellkultur DRGs, PC12 clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Gewebe schneiden, Hirnregion eindeckeln Zellkultur DRGs, PC Zellkultur DRGs, PC Zellkultur DRGs, PC12 Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp Identifikation Blocken Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Einführung in konfokale Mikroskopie FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark 21

22 Uhrzeit Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag Freitag Gruppe Kleinhirn und Hippokampus Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen und Ionenkanäle Neuronale Stammzellen Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neuro-degenerative Erkrankungen Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neuro-degenerative Kleinhirn und Hippokampus Waschen der Schnitte Vortrag R.B. Immunhistochem. Erkrankungen Mausperfusion Waschen der Schnitte Vortrag R.B. Immunhistochem Mausperfusion 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Antikörper und Immunhisto Mausperfusion 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Mikroskopie und Imaging Axonaler Transport Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen und Axonaler Transport DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP Zellkultur DRGs Ionenkanäle Hippocampus Präparation Hippocampus Präparation Hippocampus Präparation Hippocampus Präparation Gewebe einbetten PAUSE PAUSE Hippocampus Präparation PAUSE PAUSE PAUSE Hippocampus Präparation PAUSE Waschen Zellkultur DRGs, PAUSE PC Gewebe schneiden Waschen und DAPI Zellkultur DRGs, PAUSE Färbung PC Gewebe schneiden eindeckeln Zellkultur DRGs, PC12 clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Gewebe schneiden, Hirnregion identifikation Einführung in konfokale Mikroskopie Blocken FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark FV1000, Cerebellum und Hippokampus, Rückenmark Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp clabs/ionenkanäle bei der Arbeit/Patch Clamp Neuronale Stammzellen Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung Auswertung der Bilder, Abschlussbesprec hung 22

23 Seminarvorträge: Mo. 9:00-10:00 Uhr und Di. - Fr. jeweils von 8:30-9:30 Uhr zu den angekündigten Themen. Die angegebenen Zeiten für die Vorlesungen können sich auch verschieben. Die Vorlesungen finden im MSZ Hörsaal statt. Treffpunkt am :50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5 Montag, :00 Uhr: Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neurodegenerative Erkrankungen, Prof. M. Sendtner Dienstag, :30 Uhr: Kleinhirn und Hippokampus, Dr. R. Blum Mittwoch, :30 Uhr Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen, Axonaler Transport, Dr. S. Jablonka Donnerstag, :30 Uhr Ionenkanäle, Prof. C. Villmann Freitag, :30 Uhr Neuronale Stammzellen, Dr. R. Götz 23

24 ZELLKULTUR TEIL Neuronale Zellen brauchen zum Überleben und zur Differenzierung unter anderem neurotrophe Faktoren und extrazelluläre Matrixproteine (siehe Vorlesung Prof. Sendtner). Um das Überleben und das Wachstumsverhalten von primären Neuronen in Gegenwart bzw. Abwesenheit von neurotrophen Faktoren sowie Matrixprotein zu untersuchen, werden primäre sensorische Neurone aus Hinterwurzelganglien (DRGs) von 14 Tage alten Mausembryonen isoliert und unter den unten genannten Bedingungen kultiviert. Präparation von Maus-Hinterwurzelganglien (DRGs) I. Vorbereitung 1. Lösungen F14-Medium + 10% Horse Serum (HS): 1Dose F14 Pulver (Life Tech/INVITROGEN) in 900ml Wasser lösen, 10ml Penicillin/Streptomycin-Lsg. (1:100 verd., EK: 100mg/l Streptomycin Sulfat, 60,6mg/l Penicillin G) zugeben, mit 1M NaOH auf ph 7,3 einstellen (=> rote Farbe!), 1,97g NaHCO3 zufügen und auf 1l auffüllen; CO 2 einleiten bis die Lösung lachsfarben ist, 10% HS zugeben, steril filtrieren Phosphate buffered saline; PBS 1% Trypsin (in Hanks balanced salt solution, HBSS; Life Tech/INVITROGEN) 2. Kulturschalen a) Am Vortag: Kulturschalen mit Poly-D,L-Ornithin (Sigma; 0,5mg PORN/ml 0,15M Boratpuffer ph 8,35) über Nacht bei 4 C beschichten b) Vor der Präparation: - 3x mit HBSS waschen - Beschichtung mit Laminin-111 Lösung (1:400 aus 1mg/ml-Maus-Laminin-Stammlösung in HBSS/HEPES verdünnen, EK: 2,5µg/ml) 3. Im Labor vorbereiten Eisbad, Präparierbesteck, 10cm-Petrischale zum Präparieren, 6cm-Petrischale mit PBS zum Sammeln und Versäubern, Pasteurpipette, Eppendorfgefäß mit 1ml PBS II. Präparation - 14 Tage alte Mausembryonen werden aus den Muttertieren präpariert und in einer Petrischale gesammelt 24

25 - Köpfe der Embryonen abschneiden, Körper in Petrischale legen - Zum Präparieren wird der Embryo auf den Bauch gelegt. Die Haut wird entfernt und das Rückenmark vorsichtig herausgelöst. - Das Rückenmark wird in eine Petrischale mit HBSS gesammelt. - Dann werden die Hinterwurzelganglien (DRGs), die seitlich entlang des präparierten Rückenmarks laufen, abgetrennt. - DRGs in 3 cm Petrischale mit PBS sammeln - Die Ganglien von überschüssigem Gewebe befreien und in 3 cm Petrischale mit frischem PBS überführen. III. Aufarbeitung in der Zellkultur (Gewinnen und Kultivieren der sensorischen Neurone) - DRGs in 5 cm Petrischale versäubern, dabei leicht schwenken (damit nichts hängen bleibt) und in 15 ml Röhrchen sammeln. - Falkon leicht schütteln (damit DRGs nach unten wandern) und Volumen mit Pipette auf ca. 1 ml reduzieren µl 1 % Trypsin in jedes Röhrchen dazugeben und leicht schwenken min bei 37 C im Brutschrank inkubieren. - Überstand mit Pasteurpipette vorsichtig abnehmen bis auf ca. 300 ml. - Ca. 10 mal mit 200 µl - Pipette triturieren (Auflösen des Zellverbands, Vereinzeln der sensorischen Neurone). Zellsuspension in einem 15 ml Röhrchen sammeln ml Röhrchen mit 9.5 ml Kulturmedium füllen. - Zellsuspension auf NUNC-Petrischale (10 cm) zum Pre-Plating geben. - 1 h bei 37 C in Brutschrank stellen. - Petrischale vorsichtig 2 mal schwenken und Inhalt in 15 ml Röhrchen überführen. - 8 min bei 400 g zentrifugieren. - Absaugen bis auf 500 µl, resuspendieren - Neubaur-Zählkammer mit 10 µl Zellsuspension befüllen und Zellen zählen (4 Eckquadrate auszählen; Mittelwert bilden; Mittelwert x 10 = Zellen pro 1 µl Zellsuspension) - Auf PORN bzw. PORN und Laminin-111 beschichtete 24-Wells ausplattieren, dazu Laminin-111 absaugen und gleichzeitig 500 µl Kulturmedium mit bzw. ohne NGF (10 ng/ml Endkonzentration) zugeben. - Errechnete Zellmenge an Zellsuspension in jede Vertiefung zugeben. IV. Kultur Kulturmedium: F % HS, Inkubation bei 37 C und 5% CO 2 Faktoren: NGF (Endkonz.: 10ng/ml) und eine Kontrolle ohne neurotrophen Faktor. Die Zellen werden auf Poly-Ornithin (PORN) oder PORN + Laminin-111 beschichteten Schalen ausplattiert. 25

26 Präparation von Hippocampus Neuronen - E18 Rattenembryonen (Wistar) aus getöteter Ratte entnehmen und in Schale mit kaltem Neurobasalmedium überführen. - Embryonen aus Fruchtblase herausnehmen, von Plazenta trennen und in neue Schale überführen. - Mit der Schere Embryo durch Genickschnitt töten, Haut am Schädel entfernen und Schädeldecke einschneiden von hinten nach vorn zur Nase. - Mit gebogener Pinzette das Gehirn herausnehmen und in Petrischale mit kaltem Neurobasal- Medium überführen. - Unter dem Binokular OB (bulbus olfactorius) entfernen, mit Skalpell zwischen den beiden Hemispheren einschneiden und beide Hemispheren vorsichtig abklappen und abtrennen. - Auf der Innenseite wird der Hippocampus als helle Mondstruktur sichtbar. - Meningen mit Pinzetten entfernen! - Hippocampus mit dem Skalpell herauspräparieren und in einer mit Neurobasal Medium (NB) gefüllten Petrischale auf Eis sammeln. - Die Hippocampi werden mit der Schere zerkleinert, in ein 15 ml Falcon-Gefäß überführt und der Überstand wird vorsichtig abgenommen. - Zugabe von 10 ml Trypsin/EDTA (1mg/ml) (hier 1ml) und 100 µl DNAse I (Endkonzentration 0,1 mg/ml; stock 10 mg/ml) (hier 10 µl). Ansatz 30 min bei 37 ºC im Wasserbad inkubieren. - Zugabe von 1 ml FCS (fötales Kälberserum) (hier 100 µl) zur Inaktivierung des Trypsins (Endkonzentration 10%). - Pasteurpipette zum Triturieren vorbereiten; scharfe Kanten in der Flamme eines Bunsenbrenners abrunden dabei Pipette zwischen Daumen, Zeige- und Mittelfinger in der Flamme drehen (KEINE Hakennasen produzieren!) - Mit einer Glaspipette (10 ml, dann 5 ml, dann Pasteurpipette) wird der Ansatz trituriert. Nach dem Absetzen von nicht lösbaren Zellbestandteilen (3 min), wird die Hälfte des Überstandes in ein neues Falcon überführt und der Rest erneut mit der Pasteurpipette trituriert. Erneut 3min stehen lassen. - Überstände werden vereint und 10 min bei 800 rpm zentrifugiert. - Zellpellet in 10 ml NB/B27 Medium (hier 1 ml) (37 ºC) aufnehmen und Triturierungsschritte (unter Punkt 13.) wiederholen, wieder zentrifugieren. Bei vielen Zelltrümmern, kann ein weiterer Waschschritt die Anzahl an Zelltrümmern vermindern. - Zellpellet in 10 ml NB/B27 Medium (hier 1 ml) aufnehmen und in Neugebauer Zählkammer zählen. Die Zellen werden auf mit Polylysin beschichteten Platten ausplattiert. - Nach 8 Tagen wird einmal pro Woche 50 % des Mediums ausgetauscht. 26

27 Aussaatdichten: Hippocampus 96 well Platte: pro well Zellen /100 µl Deckgläschen in 3 cm Schale Zellen /2.5ml Deckgläschen in 24 well Platte : Zellen / 500 µl pro well 3 cm Schale Zellen / 2.5 ml 6 cm Schale Zellen / 6 ml 10 cm Schale x 10 6 Zellen / 10 ml NB Medium: Neurobasal Medium 500 ml (Invitrogen) + 5 ml L-Glutamin (Endkonz. 2mM) + B27 Supplement (Gibco) Ionenkanäle bei der Arbeit Patch-Clamp-Setup gepatchtes Neuron In diesem Kursteil erhalten Sie eine Einführung in die Patch-Clamp Technik und dabei Möglichkeiten die Module dieser Ableittechnik kennenzulernen. Das ganze soll zunächst durch das Programm clabs- Neuron unterstützt werden, wo virtuelles Patchen möglich ist. Anschließend werden wir Ihnen an transfizierten Zellen (HEK293) und Hippocampus-Neuronen diese Technik nahe bringen und Ganzzellableitungen demonstrieren. Sie bekommen aber auch die Gelegenheit, selber Patch-Clamp-Ableitungen im Ganzzellmodus durchzuführen. Da die zur Verfügung stehende Zeit und die vorhandenen Meßplätze sehr begrenzt sind, werden wir uns auf wenige robuste Messungen beschränken und in 2er Gruppen an den jeweiligen Nachmittagen abwechseln. PATCHEN erfordert VIEL GEDULD! 27

28 IMMUNHISTOCHEMISCHER TEIL Die Antikörperfärbungen an hippokampalen und cerebellären Gewebeschnitten von jungen und adulten Mäusen, veranschaulichen den Aufbau und die Komplexität dieser Hirnregionen (siehe Vorlesung Prof. Sendtner, Dr. Jablonka, Dr. Blum). Es sollen anhand von Antikörperfärbungen die unterschiedlichen neuronalen Schichten und Zelltypen in der Kleinhirnrinde einer adulten und einer postnatalen Maus (Tag 5-8) untersucht und dokumentiert werden, um die Entwicklung des Cerebellums deutlich zu machen. Außerdem werden Schnitte des Hippokampus und Rückenmarks einer adulten Maus angefertigt und mit konfokaler Mikroskopie ausgewertet. Für die mikroskopische Untersuchung der Zellen in einem Gewebe wird das Gewebe zunächst präpariert, fixiert, eingebettet und geschnitten (siehe: Herstellung von Vibratom-Schnitten). Die meisten Gewebe bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, und die Immunhistochemie macht es möglich, einzelne Zelltypen im Gewebe bzw. auch von Strukturen innerhalb der Zellen darzustellen. Dieser Vorgang wird hier am Beispiel des Cerebellums beschrieben. Purkinjezellen und Interneurone des Cerebellums sollen mit Antikörpern gegen Parvalbumin identifiziert werden. Die Axone der Korbzellen, die Afferenten der Moosfasern und Kletterfasern sowie die Efferenten der Purkinje-Zellen sollen mit Anti-Phospho-Neurofilament detektiert werden. Herstellung von free floating sections mit dem Vibratom Mäuse werden mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PFA) perfundiert und das Gehirn wird freipräpariert. Nach einer kurzen Postfixation wird das Gewebe in Agarose eingebettet und mit einem Vibratom in µm dicke Scheiben geschnitten. Chemische Fixierung: Das Gewebe wird in Paraformaldehyd (4 % in der Pufferlösung PBS, ph 7.4, PFA) eingelegt. Durch Quervernetzung von Proteinen bleibt die Gewebsstruktur erhalten, Enzyme werden inaktiviert, das Gewebe wird härter und kann gelagert werden. Einbetten: Fixiertes Gewebe wird in 6%-iger Agarose eingegossen. Beim Abkühlen des Polymers entsteht ein hartes Präparat, das bei Raumtemperatur geschnitten werden kann. Trimmen: Das Präparat wird auf einem Probenhalter befestigt und mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge vorgeschnitten, so dass die interessante Gewebeseite exponiert wird (siehe Vorlesung). Schneiden: Der getrimmte Gewebeblock wird entsprechend dem Klingenverlauf des Vibratoms auf einem Probenhalter mit Sekundenkleber festgeklebt. Der Probenhalter wird im Vibratom befestigt. Die vibrierende Rasierklinge wird in der Wanne (gefüllt mit PBS) an der Schnittfläche entlanggeführt. Die Schnitte werden mit einem Pinsel abgefischt und in einer 24-well Platte, gefüllt mit PBS ph 7.4, gesammelt. Die Dicke der Schnitte wird durch den Vorschub des Probenhalters reguliert. 28

29 Indirekte Fluoreszenzfärbung von bestimmten Proteinen und Antigenen mit Antikörpern Zellen werden zunächst mit einem Detergenz (z.b. Triton X100, Tween 20) während des Blockings permeabilisiert, um den Antikörpern den Zugang zum Zytoplasma zu ermöglichen. Dann werden die Erstantikörper auf den Schnitt gegeben. Dabei ist wichtig, dass die beiden Antikörper in Tieren unterschiedlicher Gattungen produziert worden sind, z.b anti-parvalbumin im Kaninchen (polyklonal) und anti-smi-31 (monoklonal) in der Maus. Nach einem Waschgang bleiben nur dort Antikörper zurück, wo sie an ihr jeweiliges Antigen gebunden sind - also die einen an den Purkinje-Zellen und Interneuronen, die anderen an den Axonen. Nun werden die Zweitantikörper zugegeben, die gegen Antikörper der Tiere gerichtet sind, von denen die Erstantikörper stammen. Die anti-kaninchen- Zweitantikörper sind mit einem roten Fluorochrom konjugiert (z.b. Cy3, Dylight 549, Alexa 549), die anti- Maus-Zweitantikörper tragen ein grünes Fluorochrom (Alexa 488, Dylight 488). Diese Sekundärantikörper werden fast immer durch Immunisierungen von Ziegen (goat) oder Esel (donkey) mit IgG-Fraktionen der Erstantikörperspezies induziert und aus deren Serum gereinigt. Nach Abwaschen der nicht-gebundenen Antikörper kann nun mit dem Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop die Verteilung der Immunfärbung im Gewebeschnitt untersucht werden. Dabei muss das optische System so eingerichtet sein, dass Anregungs- und Emissionslicht der beiden Fluorochrome gut voneinander getrennt sind. Nur dann ist eine getrennte Darstellung der beiden Signale möglich. Blockierung: Mit PBS + BSA 10 % + Triton X-100 0,1 % werden unspezifische Bindungsstellen im Gewebe abgeblockt und Fette + Eiweiße aus Zellmembranen herausgelöst. Dadurch wird das Gewebe eingängiger für den Antikörper und somit eine bessere Färbung erzielt. 45 minbis 1 h bei RT sollten bei dieser Schnittdicke ausreichen. In der gesamten Prozedur kann BSA auch durch Serum ersetzt werden. Hier wird bevorzugt Serum verwendet, welches der Spezies der Sekundärantikörper entspricht. 1. Antikörper: Der Erstantikörper, welcher spezifische Proteine erkennt, wird in PBS + BSA + Triton X- 100 verdünnt und 4 h bei RT oder über Nacht bei 4 C mit dem Gewebe inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird 3-4x 10 min mit PBS gewaschen, um den überschüssigen, nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Achtung: ungebundener Antikörperüberschuß führt zu hohem Background. 2. Antikörper: der unspezifische Zweitantikörper, welcher den Erstantikörper erkennt und an diesen bindet, ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Dieser wird ebenso in PBS + BSA + Triton X-100 verdünnt, zupipettiert und für 1 1/2 h bei RT inkubiert. Anschließend wird wieder 3x mit PBS gewaschen und das Gewebe auf ein Objektträger gezogen. Fluorezenzgefärbte Schnitte werden in einem Einbettmedium (hier Aquafluomount) eingedeckelt und mit Nagellack umrandet. Die Färbungen können im Dunkeln bei 4 C gelagert werden. Warum welcher Puffer: Phosphat oder Tris-Puffer um einen für Antikörper-Antigen günstigen ph-wert zu erhalten. BSA oder Serum zum Blockieren unspezifischer Interaktionen. 29