Institut für Klinische Neurobiologie. 07. bis 11. November Bitte Laborkittel mitbringen und leeren USB Stick!!!

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1 Skript zum Praktikum Spezielle Biowissenschaften II Institut für Klinische Neurobiologie 07. bis 11. November 2011 Bitte Laborkittel mitbringen und leeren USB Stick!!! Treffpunkt am um 8:50 Uhr am Eingang von Haus E4, Versbacherstr. 5 Zusammenfassungen der Vorträge Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix, Prof. Sendtner Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark), Dr. Jablonka Hippokampus, Dr. Blum Synaptologie, Dr. Götz Kursprogramm Zellkultur Teil Immunohistochemischer Teil Neuronale

2 Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix, Prof. Sendtner Neurotrophe Faktoren wurden ursprünglich als Überlebensfaktoren für embryonale Nervenzellen entdeckt. Viktor Hamburger und Rita Levi-Montalcini, die für die Entdeckung von Nerve Growth Factor (NGF) den Nobel-Preis erhalten hat, konnten zeigen, dass Proteine, die in sehr geringen Mengen im Innovationsgebiet von sensorischen, sympathischen und motorischen Nervenzellen produziert werden, für deren Überleben während der Embryonalentwicklung notwendig sind. Während der Embryonalentwicklung werden bei höheren Wirbeltieren verschiedene Populationen von Nervenzellen, darunter spinale Motoneurone, die sensorischen und sympathischen Nervenzellen der Hinterwurzel bzw. Paravertebralganglien, im Überschuss gebildet. Ca. 50% der postmitotischen Neurone, nachdem sie Kontakt mit dem Zielgewebe gemacht haben, gehen dann wieder zugrunde. Viktor Hamburger konnte in einer Reihe detaillierter Untersuchungen zeigen, dass dieser physiologische Zelltod nicht endogen programmiert ist, sondern durch Signalmoleküle aus dem Innervationsgebiet der jeweiligen Nervenzelltypen gesteuert wird. Diese Befunde waren Ausgangspunkt für Rita Levi-Montalcini für die Identifikation und Reinigung (zusammen mit S. Cohen) eines ersten neurotrophen Faktors, Nerve growth factor (NGF). Abb.1: Assay mit explantierten sympathischen Ganglien (R. Levi-Montalcini) nach Zugabe von Gewebeextrakten, die NGF enthielten NGF ist prototypisches Mitglied einer großen Familie von Neurotrophinen, der neben NGF auch BDNF, NT-3 sowie NT-4/5 bei Säugern angehören. Bei Fischen wurden weitere Mitglieder der Neurotrophin- Familie gefunden, NT-6 und NT-7. Diese neurotrophen Faktoren vermitteln ihre Wirkung auf das Überleben von Nervenzellen über hochaffine Rezeptoren, die ihre Liganden mit einer Affinitätskonstante (K D ) von M binden. Wesentlicher Bestandteil dieser hochaffinen Rezeptoren sind Transmembranproteine der Tropomyosin-Rezeptorkinase (Trk)-Familie, von denen Trk-A spezifisch NGF bindet, Trk-B sowohl BDNF als auch NT-4/5 erkennt, und Trk-C bevorzugt NT-3 bindet. 2

3 Abb.2: Schematische Darstellung der Bindung von Mitgliedern der Neurotrophinfamilie an Trk Rezeptoren und den p75 NTR Rezeptor. Neben diesen Transmembrantyrosinkinaserezeptoren existiert ein niederaffiner Neurotrophin-Rezeptor (p75 NTR ), der alle bekannten Neurotrophine mit ähnlicher Affinität (K D 10-9 M) bindet. Aufgrund der hohen Bindungsaffinität von Neurotrophinen an hochaffine Rezeptoren (K D von M) ist verständlich, dass nur sehr geringe Mengen dieser Neurotrophine (weniger als 1ng/g Gewebe) ausreichen, um ca. die Hälfte der während der frühen Embryonalentwicklung generierten Neurone am Leben zu halten. Typisch für Mitglieder der Neurotrophinfamilie ist die hohe Spezifität für bestimmte Zellpopulationen: NGF wirkt nur auf sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien sowie eine Subpopulation sensorischer Neurone, jedoch nicht auf motorische Nervenzellen sowie propriozeptive sensorische Neurone. NT-3 wirkt insbesondere auf γ-motoneurone sowie schnell leitende Subgruppen von sensorischen Nervenzellen, BDNF auf motorische Nervenzellen sowie Subgruppen sensorischer Neurone. Die Elimination des NGF-Gens führt zu einem fast vollständigen Absterben sympathischer Nervenzellen in den Paravertebralganglien, die Mäuse sind so nicht überlebensfähig und sterben spätestens in der 3. postnatalen Woche. Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei BDNF- und NT-3-defizienten Mäusen gemacht, bei denen die jeweiligen Neuronengruppen, die von diesen Faktoren abhängig sind, selektiv zugrunde gehen. Die Injektion bzw. transgene Überexpression von Neurotrophinen bewirkt nicht nur erhöhtes Überleben, sondern auch erhöhte neuronale Aktivität sowie Faseraussprossen. So führt z.b. die Injektion von NGF bei neugeborenen Mäusen und Ratten zu einem Aussprossen von Schmerz-leitenden Fasern und einer erhöhten Sensibilität. 3

4 Abb3: Wirkung einer Injektion von NGF bei neugeborenen Ratten auf Überleben und Faseraussprossen bei langsamleitenden sensorischen Neuronen Die Funktion des Nervensystems wird nicht nur durch die neurotrophen Faktoren der Neurotrophin- Familie, sondern auch durch andere Familien von neurotrophen Faktoren beeinflusst und reguliert. Zu diesen Faktoren gehören die Mitglieder der Glia-derived-neurotrophic-factor (GDNF-)Familie sowie die neurotrophen Zytokine der Ciliary neurotrophic factor (CNTF)/Leukemia-inhibitory factor (LIF)/Cardiotrophin-1 (CT-1)-Familie. Besonders die Mitglieder der letzten Familie werden erst relativ spät während der Entwicklung exprimiert, einzelne Faktoren, insbesondere CNTF erst postnatal, dann aber in sehr hohen Mengen. CNTF wird nicht im Zielgewebe von responsiven sensorischen und motorischen Nervenzellen exprimiert, sondern in myelinisierenden Schwannzellen. Nach Nervläsion steht dieser Faktor so direkt zur Verfügung und kann so das Überleben von axotomierten Nervenzellen verbessern. So ergibt sich ein komplexes Bild über die Wirkung von neurotrophen Faktoren: neben der klassischen Wirkung auf das Überleben spezifischer Gruppen von Nervenzellen während der Embryonalentwicklung sind sie notwendig für die Regulation synaptischer Aktivität, für die Aufrechterhaltung von Nervenzellverbindungen und Axonen sowie für die Regeneration nach Läsion. Extrazelluläre Matrix Der Extrazellulärraum erfüllt nicht nur Aufgaben für die Stabilität der Architektur des Nervensystems, sondern ist auch aktiv in Regelprozesse einbezogen, die die Funktionalität von Glia- und Nervenzellen beeinflussen. Diese Regelmechanismen spielen gerade für Neurone eine große Rolle. Verschiedene Bestandteile der extrazellulären Matrix sind für das Auswachsen von Nervenfasern von großer Bedeutung, und sie beeinflussen die Funktionalität von synaptischen Verbindungen. Neben den klassischen Matrixmolekülen wie Fibronectin, Laminin und Collagen, die über Integrin-Rezeptoren 4

5 Signale in den Nervenzellen vermitteln, enthält die extrazelluläre Matrix eine Reihe von Bestandteilen, die als klassische Signalmoleküle über Tyrosinkinaserezeptoren Differenzierung, Zellwanderung, Überleben, Axonwachstum und synaptische Aktivität beeinflussen. Dazu gehören einerseits an Heparin gebundene Wachstumsfaktoren, zum anderen Signalmoleküle, die Axonwachstum stimulieren bzw. blockieren, aber auch Proteine wie Agrin, die eine wesentliche Rolle bei der Bildung spezifischer Synapsen, z.b. an der neuromuskulären Endplatte spielen. Empfohlene Literatur: Albert, Bray, Lewis et al: Molecular Biology of the Cell, 3. Auflage 1994, Kapitel IV/19, Cell Junctions, Cell Adhesion, and the extracellular Matrix S Literatur: Alberts: Molecular Biology of the Cell: Kapitel 21: Cellular mechanisms of development Kandel (4. Auflage) Part VIII: Develoment of the Nervous System. 5

6 Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark), Dr. Jablonka Motorische Hirnrinde: Repräsentationsfelder und Verteilung kortikaler Motorneurone im Gyrus Präcentralis Projektion von der motorischen Großhirnrinde zum Rückenmark Das Rückenmark hat vom Großhirn unabhängige Schaltkreise 6

7 Projektion vom Rückenmark zum Muskel Kleinhirn: 3 Spinocerebellu Cerebrocerebellum Cerebrocerebellum Vestibulocerebellum Das Kleinhirn (Cerebellum) besteht aus einem unpaarigen Mittelteil (Vermis) und Kleinhirnhemisphären. 7

8 Die Gliederung kann nach verschiedenen Gesichtspunkten erfolgen: Nach phylogenetischen Aspekten in das Archicerebellum, das Palaeocerebellum und das Neocerebellum. Makroanatomische Einteilung entsprechend transversalen Fissuren in den Lobus anterior der durch die Fissura prima vom Lobus posterior getrennt ist, und der wiederum durch die Fissura posterolateralis vom Lobus flocculo-nodularis Nach Verbindungen und funktionellen Aspekten in das Spinocerebellum (Bewegungsausführung, ~Lobus anterior) Cerebrocerebellum (Bewegungsplanung, ~Lobus posterior) und das Vestibulocerebellum (Gleichgewichtssteuerung, ~Lobus flocculo-nodularis) Gliederung des Kleinhirns entsprechend transversalen Fissuren in 10 Folien, die mit römischen Ziffern von I bis X bezeichnet werden. Im Kleinhirn unterscheidet man wie im Großhirn zwischen Rinde und dem Mark mit den zentralen Kernen. Die Rinde schickt ihre Efferenzen in die Kleinhirnkerne. Im Cerebellum gibt es 5 verschiedene Neuronentypen, 2 afferente Fasertypen sowie Gliazellen Basalganglien Die Funktion wird indirekt über den Kortex vermittelt, neuronale Schaltkreise der Basalganglien entwerfen komplexe Erregungsmuster, sie dienen der Einleitung (Initiierung) und der Erleichterung 8

9 (Fazilitation) von Willkürbewegung, zugleich werden ungewollte oder unwillkürliche Bewegungen unterdrückt. Axonaler Transport und Motoneuronerkrankungen Die Fortsätze von motorischen Nervenzellen des Rückenmarks können beim erwachsenen Menschen oft Längen von ca. 1 Meter erreichen. Jede Nervenzelle muss ständig Proteine und andere Strukturelemente transportieren, um die Funktion auch in vom Zellkörper entfernten Kompartimenten, insbesondere den präsynaptischen Kompartimenten in der Axonterminale aufrecht zu erhalten. Verschiedene Proteine, aber auch mrnas werden im Zellkörper synthetisiert und in Axonen und Dendriten transportiert. Dieser Vorgang wurde bereits 1948 beschrieben und wird als axonaler bzw. dendritischer Transport bezeichnet. Erst in den vergangenen Jahren wurden die molekularen Mechanismen dieses Transports entlang von Mikrotubuli detailliert aufgeklärt. Bei Untersuchungen über den axonalen Transport stellte sich heraus, dass in beiden Richtungen Substanzen transportiert werden. Der anterograde Transport erfolgt vom Zellkörper zur Synapse hin und dient, in Axonen, vor allem dem axonalen Wachstum sowie synaptischen Plastizitätsprozessen. Beim gegenläufigen retrograden Transport werden Substanzen durch das Axon zum Zellkörper befördert. Hierbei handelt es sich zum Teil auch um Signalproteine und Komplexe, die zum Zellkörper transportiert werden, darunter Rezeptoren für neurotrophe Faktoren mit ihren Liganden. Nach der Geschwindigkeit kann man langsamen von schnellen axonalen Transport unterscheiden. Die Mikrotubuli bilden die Grundlage für zahlreiche zelluläre Bewegungsformen wie beispielsweise der intrazelluläre Transport von Membranvesikeln in den Axonen der Nervenzellen. Diese Bewegungen beruhen entweder auf der Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli oder auf der Aktivität der Mikrotubulus-Motorproteine Dynein und Kinesin. 9

10 Abbildung 1: Dyneinkomplex sowie Kinesine sind Motorproteine für den retrograden bzw. den anterograden Transport. Störungen des axonalen Transport beim Menschen oder bei der Maus sind eine der möglichen Ursachen für Motoneuronerkrankungen, und treten, als Ursache oder sekundär bei fast allen Formen dieser Erkrankungen auf. Motoneuronerkrankungen sind degenerative Erkrankungen der - Motoneurone im Rückenmark, die zu Muskelschwäche und -atrophie führen. Die Motoneuronerkrankungen können verschiedenen Ursprungs sein. Die mit am weitesten verbreitete Motoneuronerkrankung ist die sogenannte amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Sporadische Formen der ALS beginnen im Erwachsenenalter und betreffen kortikospinale sowie spinale Motoneurone. Das Mausmodel für die sporadische Form der ALS ist die progressive motoneuronopathy mouse (pmn). Abbildung 2: Pmn-Mutante rechts, gesundes Geschwistertier links Das Krankheitsgen der pmn Mutante wurde durch positionelle Klonierung identifiziert und kodiert für ein sogenanntes Tubulinspezifisches Chaperon E (Tbc E), einen Cofaktor, der die Heterodimerisierung von α und β Tubulin unterstützt. Isolierte embryonale Tbc E-defiziente Motoneurone zeigen Störungen im Axonwachstum und weisen überdurchschnittlich viele axonale Schwellungen auf. In diesen axonalen Schwellungen liegt eine gestörte Kolokalisation von Tubulin und seinem assoziierten Protein p-tau vor. 10

11 Wildtyp Mutante p-tau Tubulin Overlay Abbildung: Verteilung von p-tau und Tubulin in Kontroll- und Tbc E-defizienten Motoraxonen von isolierten Motoneuronen. Aber nicht nur Komponenten für die Bildung der Mikrotubuli, auch die Motorproteine können bei Dysfunktion zu Motorneuronerkrankungen führen (z.b. Loa und Cra Mäuse). Letzten Endes ist jedoch das Ziel der Untersuchung der pathomechanistischen Ereignisse, die zu Motoneuronerkrankungen führen, eine mögliche Therapie dagegen zu entwickeln. Erste Therapieansätze wurden bei der pmn Mutante entwickelt. Durch CNTF Gabe ist es gelungen, den pmn- Phänotyp zu mildern. + CNTF Kontroll Pmn Maus ohne CNTF Literatur: Fundamental Neuroscience, second edition Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition 11

12 Aufbau von und Reizleitung an Synapsen, Dr. Götz Tiere nehmen Reize der Umgebung wahr und reagieren darauf in ihrem Verhalten, z. B. durch Bewegungen. Eine sehr große Zahl von Nervenzellen oder Neuronen (etwa beim Menschen) ist an der Erfüllung dieser Leistung beteiligt. Die Hauptaufgaben der Neurone sind Empfang, Integration und Weiterleitung von Information als elektrisches oder chemisches Signal. Die Neurone sind durch Kontaktstellen, Synapsen, untereinander oder mit anderen Zelltypen, wie z. B. Muskelzellen, verschaltet. Der Begriff Synapse wurde von Charles Sherrington eingeführt, um die Kontaktregion zu beschreiben. Neurale Schaltkreise werden strukturell durch Axone, Dendriten und die sie verbindenden Synapsen definiert. Neuronale Fortsätze haben in der Regel eine hohe Dichte an Synapsen. Ein typisches Neuron besitzt etwa eintausend synaptische Verbindungen. Ermöglicht wird dies durch die komplexe Struktur von Nervenzellen mit ihren ausgeprägten Fortsätzen und der damit verbundenen großen Oberfläche. Bei Neuronen mit langen Axonen kann die Oberfläche sogar Millionen von µm 2 betragen. Eine hohe Zahl an Synapsen kann auch durch weit verzweigte Dendritenbäume und deren axonale Kontakte zustande kommen, wie es z. B. bei den Purkinjezellen mit ihren etwa Synapsen der Fall ist. Abbildung. Weitverzweigter Dendritenbaum im Kleinhirn (Cerebellum). Im Cerebellum bildet jede Purkinjezelle viele Tausend Parallefasesynapsen aus, und zwar in einen hochgradig verzweigten Dendritenbaum, welcher Synapsen mit den Axonen (Parallelfasern) der Körnerzellen (granule cells) bildet. Bild aus Wong und Ghosh, Nature Reviews Neuroscience, 3, , Synapsen werden je nach Form der Erregungsübertragung und Art der Erregung in elektrische und chemische Synapsen untergliedert. Die große Mehrheit der Synapsen im Gehirn sind chemische Synapsen, d. h., sie setzen Neurotransmitter frei, um eine Reizantwort in der postsynaptischen Zelle auszulösen. Man unterscheidet erregende von hemmenden Neurotransmittern. Der wichtigste erregende Neurotransmitter im Gehirn ist Glutamat (exzitatorische Synapse). Die wichtigsten hemmenden Transmitter im ZNS sind Gamma-Aminobuttersäure (GABA) und Glyzin (inhibitorische Synapse). Andere Transmitter sind Noradrenalin, Acetylcholin, Dopamin, Serotonin. Acetylcholin vermittelt zum Beispiel die Erregungsübertragung zwischen Nerv und Muskel an der neuromuskulären Endplatte. 12

13 Im Fall der elektrischen Synapse erfolgt die Erregung der postsynaptischen durch die präsynaptische Nervenzelle durch eine direkte strukturelle Verbindung, sog. gap-junction Kanäle. Der synaptische Spalt misst nur rund 3,5 nm. Elektrische Synapsen arbeiten verzögerungsfrei. Die Erregungsübertragung kann in beide Richtungen laufen. Sie kommen vor allem dort vor, wo eine schnelle Reizübertragung notwendig ist, wie z. B. in der Vertebratenretina oder dem Lidreflex. Abbildung. Struktur und molekulare Organisation von Zell-Zell-Kanälen (gap junctions). Zell-Zell- Kanäle werden zwischen gegenüberliegenden Membranen von zwei benachbarten Zellen ausgebildet. Jeder Halb-Kanal, auch Connexon genannt, besteht aus sechs Connexin Untereinheiten und bildet eine Pore aus, durch die Ionen und kleine Moleküle bis zu einer Masse von Da passieren können. Bild aus Bloomfield und Völgyi, Nature Reviews Neuroscience, 10, , Im Unterschied zur elektrischen Synapse gibt es bei der chemischen Synapse keine strukturelle Verbindung zwischen dem prä- und postsynaptischen Neuron. Alle chemischen Synapsen besitzen ein präsynaptisches Terminal. Diese spezialisierten Vergrößerungen können entweder am Ende des Axons (Endknöpfe oder Boutons terminaux) oder auch entlang des Axonschafts (Boutons en passant) lokalisiert sein. Im Gehirn gibt es auch Synapsen zwischen Axonen und zwischen Dendriten. Die postsynaptische Region (post-synaptic density) ist durch den synaptischen Spalt (etwa 20-40nm weit) vom präsynaptisches Terminal getrennt. Die Mehrheit der glutamatergen exzitatorischen Synapsen im Gehirn ist in dendritischen Dornfortsätzen (englisch spines) lokalisiert. Diese wachsen oft mit einem schmaleren Hals aus der Dendritenoberfläche empor und enden mit einem mehr oder weniger voluminösen Kopf, in dem sich auch die zugehörige Synapse befindet. Die Dornfortsätze bilden sich während der Entwicklung aus und werden später bis ins adulte Alter reizabhängig verändert. Um bei der Synapsenbildung die präsynaptische aktive Zone in Nachbarschaft zur Postsynapse räumlich korrekt ausbilden zu können, werden vielfältige Signale benutzt. So wird z. B. von Motoneuronen Agrin freigesetzt, welches einen Transmembranrezeptor auf den Muskelzellen aktiviert und so das Klustern von Acetylcholinrezeptoren in der neuromuskulären Endplatte induziert. Um einen Reiz zu übertragen, setzt die Präsynapse Neurotransmitter aus synaptischen Vesikeln frei. Die synaptischen Vesikel sind an Stellen lokalisiert, die man aktive Zonen nennt. Ein präsynaptisches Aktionspotential führt zum Kalzium (Ca 2+ )-Einstrom nach Öffnung spannungsgesteuerter Ca 2+ -Kanäle in 13

14 der aktiven Zone. Die Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration führt dann zur Fusion der Vesikel mit der präsynaptischen Membran und dementsprechend der Neurotransmitter-Freisetzung in den synaptischen Spalt. Die Neurotransmitter diffundieren durch den synaptischen Spalt und binden an passende Rezeptoren der postsynaptischen Zellmembran. Neurotransmitter-Rezeptoren sind zusammen mit mehr als 500 anderen Proteinen in der postsynaptischen Dichte (postsynaptic density) konzentriert. Die Bindung der Neurotransmitter an postsynaptische Rezeptoren führt zur Aktivierung von Ionenkanälen, wodurch sich das Membranpotential in der postsynaptischen Zelle ändert. Abbildung. Glutamaterge Synapsen des Gehirns. In der aktiven Zone befinden sich Vesikel mit dem Neurotransmitter Glutamat. Die präsynaptische Region ist vom Dornfortsatz im postsynaptischen Dendriten durch einen Synapsenspalt getrennt. In der postsynaptischen Membran des Dendriten befinden sich Glutamatrezeptoren (AMPA, α-amino-3-hydroxy-5-methlisoxazole-4-propionic acid, und NMDA, N-methly-D-aspartate, Rezeptoren), die von Gerüstproteinen zusammengehalten werden und die postsynaptische Dichte (postsynaptic density) bilden. Synaptische Aktivität setzt Glutamat in den Synapsenspalt frei. Dadurch wird der NMDA Rezeptor aktiviert; durch den Einstrom von Ca 2+ -über den NMDA Rezeptor kann sich die Morphologie und Stärke der Synapse verändern. Bild aus Cohen und Greenberg, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, , Der Ca 2+ -Einstrom über den NMDA Rezeptor verändert sowohl lokal die Synapse als auch die Transkription von Genen und die Synthese von Proteinen, die stabil die neuronale Funktion verändern können. Im adulten Gehirn stattfindende Schaltkreisveränderungen werden durch den Begriff der funktionellen und strukturellen synaptischen Plastizität beschrieben. Hiermit wird das Phänomen erfasst, dass eine Stimulation von Neuronen die Stärke der synaptischen Übertragung verändern kann. Diese Änderungen können sowohl durch Änderungen der Morphologie als auch der Physiologie der Synapse verursacht werden. Die am besten untersuchten Formen dieser Reiz-abhängigen Anpassung der Synapsenstärke ist die sog. Hebb'scher Plastizität, die LTP (long-term potentiation) und LTD (long-term depression) umfasst. Man glaubt, dass die bei der synaptischen Plastizität verstärkten, neu gebildeten oder verschwindenden Synapsen die Basis für Langzeitgedächtnis und Lernvorgänge sind. LTP und LTD der synaptischen Aktivität werden kurzfristig durch lokale Synapseneffekte gesteuert, z. B. die Lokalisierung der AMPA Rezeptoren in der Synapse oder außerhalb der Synapse. Dies gilt ebenso für 14

15 die Verteilung der NMDA Rezeptoren, da synaptische NMDA Rezeptoren Signalwege des neuronale Überlebens aktivieren, während extrasynaptische Lokalisierung Signalwege aktiviert, die zum Zelltod führen können. Eine Fehlverteilung der NMDA Rezeptoren wird als ein möglicher molekularer Pathomechanismus bei der Huntington schen Erkrankung diskutiert. Langfristige Änderungen der Synapsenstärke erfolgen dadurch, dass der Ca 2+ -Einstrom Signalwege aktiviert, die die Expression von Genen im Zellkern reguliert. Die aktivitätsgesteuerte Expression von mrna und Proteinen erlaubt es, dass der Zellkern die Synapsen verändern kann. Als ein Beispiel sei hier der selektive Transport der mrna für den Wachstumsfaktor BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) in den Dornfortsatz des Dendriten erwähnt. Die Translation der BDNF mrna erfolgt aktivitätsabhängig im Dornfortsatz, wodurch das BDNF Protein freigesetzt wird und über die Bindung an präsynaptische BDNF-Rezeptoren die Präsynapse verändern kann (sog. retrograder Signalweg). Literatur: Principles of Neural Science, 4 th Edition. Herausgeber Eric R. Kandel, James H. Schwartz, Thomas M. Jessell. McGraw-Hill, New York. 15

16 Hippokampus, Dr. Blum Die Signalübertragung zwischen Nervenzellen findet vorwiegend an Synapsen statt. Adaptive Prozesse an Synapsen (synaptische Plastizität), als Folge eines zeitlich und räumlich synchronisierten Informationsflusses über Synapsen, spielen eine bedeutende Rolle für die verschiedenen Formen von Lernen und Gedächtnis. Im Jahr 1973 beschrieben zwei Studien durch T.V.P Bliss, T. Lømo, und Gardner-Medwin erstmals das Phänomen der Langzeitpotenzierung (LTP, long-term potentiation). In ihren Experimenten konnten die Autoren zeigen, dass wiederholte, zeitlich koordinierte Reize von hippocampalen Eingangsstrukturen eine signifikante und langanhaltende Verstärkung von Synapsen im hippocampalen Schaltkreis hervorrufen. Erstbeschreibung der LTP. In Folge einer kurzen, aber intensiven synaptischen Reizung werden die aktivierten Synapsen zwischen Neuronen langanhaltend verstärkt. In dem gezeigten Experiment wurde durch das Auslösen von Aktionspotenzialserien auf den Axonen des Tractus perforans (PP) die glutamaterge Synapse der Körnerzellen im Gyrus dentatus (AD) so stark gereizt, dass die Effizienz der synaptischen Transmission im dendritischen Bereich der Körnerzellen, als auch die Erregbarkeit der Körnerzellen langfristig gesteigert war. Der definierte starke Gebrauch von Synapsen kann folglich schnelle, molekulare Änderungen hervorrufen, die dieselben Synapsen mit stark erhöhten Erregenden PostSynaptischen Potentialen (EPSPs) auf Einzelreize reagieren lässt. In Anlehnung an das Hebb sche Postulat aus dem Jahr 1949 werden aktivitätsabhängig modifizierbare synaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen auch Hebb sche Synapsen genannt. Heute wird das Phänomen der LTP als geeignetes Modell zur Erforschung der molekularen Grundlagen des Lernens erachtet, da es viele Kriterien eines neuronalen Korrelats des Gedächtnisses erfüllt. Die bedeutendsten neuronalen Schaltkreise zur Erforschung der synaptischen Plastizität sind die des Hippocampus und des Kleinhirns. Beide Modellsysteme sind strukturell einfach aufgebaut und verschaltet, bieten experimentellen Zugang unter in situ und in vitro Bedingungen und erlauben zumindest punktuell eine Kausalbeziehung zwischen Vorgängen synaptischer Plastizität auf zellulärer Ebene und der Gedächtnisbildung auf Verhaltensebene. 16

17 Hippocampus Funktionell ist der Hippocampus die zentrale Struktur des deklarativen Gedächtnisses. Der Hippocampus besteht aus dem Rindenband (Cornu ammonis; CA) und in dem Zellband (Gyrus dentatus, AD). Synaptische Plastizität kann im Hippocampus auf zwei Ebenen untersucht werden: (1) ausgehend von der Betrachtung des trisynaptischen, erregenden Schaltkreises des Hippocampus; (2) ausgehend von der Integration neugenerierter Körnerzellen in den bestehenden hippocampalen Schaltkreis im Rahmen der adulten Neurogenese. Der trisynaptische Schaltkreis: 1. Synapse: Input von Neuronen des entorhinalen Cortex, die ihre Axone über den Tractus perforans mit vielen Synapsen im Dendritenbaum der Körnerzelle des Gyrus dentatus verbinden. 2. Synapse: Die Axone der Körnerzellen (sog. Moosfasern) verbinden sich mit Pyramidenzellen in der CA3 Region. 3. Synapse: Eine Axonkollaterale der CA3 Pyramidenzelle (sog. Schafferkollaterale) projiziert zu Pyramidenzellen der CA1 Region. Die generalisierte Betrachtungsweise vieler Lehrbücher suggeriert einen einheitlichen molekularen Mechanismus synaptischer Lernvorgänge, wie sie an der Synapse CA3-CA1 (Schafferkollaterale-CA1) beobachtet wurden. Hier braucht die LTP einen postsynaptischen ionotropen Glutamatrezeptor (Typ NMDA) und ein postsynaptisches Ca 2+ Signal. Zwar wird an allen Synapsen des trisynaptischen Schaltkreises LTP unter glutamaterger Übertragung beobachtet, doch gilt es als erwiesen, dass synaptische Plastizität an der Moosfasersynapse NMDA-Rezeptor-unabhängig ist, ein präsynaptisches Ca 2+ Signal braucht und somit eine bevorzugt präsynaptische Komponente trägt. Die Kommunikation der Postsynapse mit der Präsynapse bei der synaptischen Plastizität ist weitgehend ungeklärt. Dennoch häufen sich Hinweise, dass das Neurotrophin BDNF (siehe Beitrag Prof. M. Sendtner) hier eine wesentliche Rolle spielt. Seit 1995 ist bekannt, dass die Freisetzung von BDNF im Rahmen der Induktion von LTP eine funktionelle Rolle spielt und sich über die Rezeptortyrosinkinase TrkB vermitteln kann. Die molekularen Signalübertragungsmechanismen, sowie Modelle, die die schnelle Sekretion des Proteins BDNF erklären können, sind jedoch umstritten. Adulte Neurogenese im Hippocampus Jüngste Forschungen konnten in der Zone unterhalb des Körnerzellbands des Gyrus dentatus (subgranular zone) funktionelle, adulte Neurogenese nachweisen. Hier entstehen aus teilungsfähigen 17

18 Vorläuferzellen mit Eigenschaften astrozytärer Gliazellen lebenslang glutamaterge Körnerzellen. Erst im Jahr 2008 konnte nachgewiesen werden, dass neugenerierte Körnerzellen sich in das bestehende neuronale Netzwerk des Hippocampus funktionell und synaptisch integrieren. Entzieht man mit genetischen Methoden den neugenerierten Neuronen lediglich den TrkB Rezeptor, so wird die Integration neuer Körnerzellen in den trisynaptischen Schaltkreis erschwert (Bergami et al. 2008). Körnerzellen, die sich im adulten Gyrus dentatus neu gebildet haben. Die Zellen wurden mit einem Virus markiert, der nur in teilungsfähigen Zellen zum Ausdruck kommt und so die Entwicklungslinie der hippocampalen darstellen kann. Bild aus: Toni et al Kleinhirn Die physiologische Aufgabe des Kleinhirns ist Kontrolle Kontrolle der Halte- und Stützmotorik, der Bewegungskoordination, der Zielmotorik und ihrer Kurskorrektur, sowie ballistischer Bewegungen. Menschen mit Kleinhirndefekten sind in ihrem motorischen Lernen stark beeinträchtigt und zeigen einen gewissen Verlust bewegungsbezogener kognitiver Funktionen. Eine Besonderheit der Kleinhirnphysiologie ist die eindeutige Zuordnung der zellulären Grundlage des afferenten und efferenten Informationsflusses. Zentrale Schaltstelle ist die Purkinjezelle, die über die Moosfaser- und Kletterfasereingänge eine Efferenzkopie des motorischen Vorhabens erhält und optimierend in die Bewegung eingreift. Die Purkinjezelle besitzt im Vergleich zu anderen principal neurons des ZNS einige ungewöhnliche Eigenschaften. Sie besitzt (1) eine hohe, basale Aktivitätsrate, (2) kein klassisches Ruhemembranpotential, und (3) kommuniziert inhibitorisch über den Transmitter GABA. Die Projektion der Purkinjezelle zu den Kleinhirnkernen ist die einzige Efferenz aus dem cerebellären Kortex, einer zentralen Struktur des motorischen Lernens. Interessanterweise können synaptische Lernvorgänge an Purkinjezellsynapsen mit einer reziproken Form der synaptischen Plastizität, der LTD (Langzeitdepression, long term depression) korreliert werden. Hierbei wird durch koordinierte Stimulation der Kletterfaser- und Moosfasereingänge die Synapse der Parallelfaser zur Purkinjezelle in ihrer synaptischen Stärke langzeitig geschwächt und somit das Feintuning des cerebellären outputs bestimmt. Tiermodelle, bei denen diese spezifische synaptische Übertragung gestört ist, zeigen in Verhaltensversuchen eine starke Beeinflussung der motorischen Fähigkeiten und des motorischen Lernens, bis hin zu einer ausgeprägten Ataxie. 18

19 Neuronaler Schaltkreis im cerebellären Kortex und Orte synaptischer Plastizität (1-5). Der cerebelläre Schaltkreis bietet innerhalb eines definierten Informationsflusses (Pfeile) die Möglichkeit Formen der synaptischen Plastizität zu untersuchen. An Purkinjezellsynapsen wird LTD durch Koinzidenz von zwei Signalen hervorgerufen, die über Kletterfasern (CF) und Parallelfasern (PF) vermittelt werden (CF-PF pairing). Signale, die zur Vermittlung der Purkinjezell-LTD führen, sind gut beschrieben und bieten eine experimentelle Grundlage zur Untersuchung der molekularen Mechanismen synaptischer Plastizität. Eine Purkinjezelle der Ratte unterhält bis zu Synapsen zu Parallelfasern und bis zu zu Kletterfasern. Es konnte gezeigt werden, dass postsynaptische Ca 2+ Signale in einzelnen Purkinjezellsynapsen ursächliche Mediatoren der Purkinjezell-LTD darstellen können. Jüngere Forschungen haben einen Mechanismus der synaptischen Plastizität offengelegt, der unabhängig von NMDA-Typ Glutamatrezeptor ist. Wird eine Parallelfaser repetitiv gereizt, so können in PF-Purkinjezellsynapsen zwei Typen von Ca 2+ Signalen beobachtet werden. (1.) Ein schnelles Ereignis wird durch Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ initiiert (postsynaptische Depolarisierung) und öffnet unmittelbar spannungsabhängige, dendritische Ca 2+ Kanäle. (2.) Ein langsameres Ereignis vermittelt über metabotrope Glutamatrezeptoren (mglur1) die Freisetzung von Ca 2+ aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Freisetzung von Ca 2+ aus dem ER führt wiederum zur Aktivierung von Ionenkanälen in der Plasmamembran, die erneut eine lokale Depolarisierung des Dendriten bewirken. Verantwortlich für dieses Signal sind sogenannte Trp- Ionenkanäle (Trp, transient receptor potential channels). Aus der riesigen Familie der Trp-Kanäle, die man häufig auch als sensorische Kanäle des Nervensystems bezeichnet, wurde der Kanal TrpC3 als maßgeblich für die synaptische Transmission an der PF-Purkinjezelle ermittelt. Mausmodelle denen dieser Kanal fehlt, zeigen starke Defekte der motorischen Koordination (Hartmann et al. 2008). Ein natürlich vorkommendes Mausmodell mit motorischen Defekten (moonwalker) zeigt eine Mutation im Gen, das für den Kanal TrpC3 kodiert. Diese Befunde belegen eindringlich die Nützlichkeit einer detaillierten anatomischen, physiologischen und molekularen Beschreibung synaptischer Systeme. Dieses Wissen erlaubt ein besseres Verständnis klinischer Phänomene und hilft bei der Entwicklung neuartiger Therapien. Literatur: *Fundamental Neuroscience; *Principles of Neural Science, *Physiologie des Menschen. 19

20 Neurobiologie Kursprogramm Uhrzeit Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag Freitag Gruppe Hippokampus Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark) Synaptologie Abschlussbespre chung Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP Hippokampus Mausperfusion Mausperfusion Mausperfusion Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark) Waschen der Schnitte Waschen der Schnitte 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Synaptologie Neuronale Trypsinierung Neuronale Zellzahlbestimm. Neuronale Abschlussbespre chung Abschlussbespre chung Abschlussbespre chung DRG-Präparation, Tier-OP Gewebe einbetten, DRGs fixieren 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Neuronale Aussäen Zellkultur DRGs Pause DRGs fixieren Waschen und Eindeckeln Pause Pause Pause Waschen und Eindeckeln Zellkultur DRGs, Gewebe Waschen und PC12 schneiden Eindeckeln Zellkultur DRGs, PC Zellkultur DRGs, PC Zellkultur DRGs, PC Zellkultur DRGs, PC Live-Cell- Imaging, Nicolas Live-Cell- Imaging, Nicolas Live-Cell- Imaging, Nicolas Gewebe schneiden Gewebe schneiden Blocken, Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Histologie Histologie SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2, Cerebellum und Hippokampus Histologie SP2 Mikroskopieren Pause Neuronale Faktorzugabe Neuronale Neuronale Neuronale Zugabe BrDU Neuronale 20

21 Uhrzeit Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag Freitag Gruppe Hippokampus Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark) Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix Hippokampus Waschen der Schnitte Mausperfusion Waschen der Schnitte Mausperfusion 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark) Neuronale Trypsinierung DRGs fixierin Neuronale Zellzahlbestimm. DRGs fixieren Neuronale Synaptologie Synaptologie DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP Abschlussbespre chung Abschlussbespre chung Abschlussbespre chung Abschlussbespre chung Mausperfusion 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Neuronale Aussäen Zellkultur DRGs Gewebe einbetten, Waschen und Eindeckeln Pause Waschen und Eindeckeln Gewebe schneiden Waschen und Eindeckeln Pause Pause Neuronale Faktorzugabe Gewebe schneiden Neuronale Gewebe schneiden Neuronale Blocken, Neuronale Zugabe BrDU Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte SP2, Cerebellum und Hippokampus Histologie SP2, Cerebellum und Hippokampus Histologie SP2, Cerebellum und Hippokampus Histologie SP2, Cerebellum und Hippokampus Histologie SP2 Mikroskopieren Neuronale Live-Cell- Imaging, Nicolas Live-Cell- Imaging, Nicolas Live-Cell- Imaging, Nicolas Pause Pause Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 21

22 Uhrzeit Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag Freitag Gruppe Hippokampus Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark) Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix Neuronale Trypsinierung Hippokampus DRG-Präparation, Tier-OP DRG-Präparation, Tier-OP Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark) Mausperfusion Mausperfusion Synaptologie Synaptologie Waschen der Schnitte Waschen der Schnitte Abschlussbespre chung Abschlussbespre chung Abschlussbespre chung Abschlussbespre chung Neuronale Zellzahlbestimm. DRG-Präparation, Tier-OP Mausperfusion 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Neuronale Zellkultur DRGs Gewebe einbetten, DRGs fixieren 2. Antikörper auf Cerebellum und Hippo. Schnitte Neuronale Aussäen Pause Pause DRGs fixieren Waschen und Eindeckeln Pause Pause Pause Waschen und Eindeckeln Neuronale Zellkultur DRGs, PC12 Gewebe schneiden Waschen und Eindeckeln Faktorzugabe Neuronale Zellkultur DRGs, PC12 Gewebe schneiden Neuronale Zellkultur DRGs, PC12 Gewebe schneiden Neuronale Zellkultur DRGs, Blocken, Neuronale Zugabe BrDU Neuronale PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Zellkultur DRGs, PC12 Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte Blocken, 1. Antikörper auf Cerebellum und Hippoc. Schnitte SP2, Cerebellum und Hippokampus SP2, Cerebellum und Hippokampus Live Cell-Imaging, Histologie SP2, Cerebellum und Hippokampus Live-Cell- Imaging, Nicolas Histologie SP2, Cerebellum und Hippokampus Live-Cell- Imaging, Nicolas Histologie SP2 Mikroskopieren 22

23 Einführungs-Vorlesungen 07. bis 11. November: Beginn Montag 07. Nov Uhr, HS MSZ, Versbacherstr.5, Würzburg Treffpunkt am : 8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5 Montag, :00 Uhr Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix, Prof. Sendtner Dienstag, Uhr Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark), Dr. Jablonka Mittwoch, Uhr Hippokampus, Dr. Blum Donnerstag, Uhr Synaptologie, Dr. Götz Freitag, :30 Uhr Abschlussbesprechung Für den praktischen Teil werden die Studenten in drei Gruppen aufgeteilt (2x 7 und 1x 6 Studenten). 23

24 ZELLKULTUR TEIL Neuronale Zellen brauchen zum Überleben und zur Differenzierung Signale von neurotrophen Faktoren und extrazellulären Matrixproteinen (siehe Vorlesung Prof. Sendtner). Um das Überleben und das Wachstumsverhalten von primären Neuronen in Gegenwart bzw. Abwesenheit von neurotrophen Faktoren sowie Matrixproteinen zu untersuchen, werden primäre sensorische Neurone aus Hinterwurzelganglien (DRGs) von 8-9 Tage alten Hühnchenembryonen oder von Tage alten Mausembryonen isoliert und unter den unten genannten Bedingungen kultiviert. I. Präparation von Maus-Hinterwurzelganglien (DRGs) I. Vorbereitung 1. Lösungen F14-Medium + 10% Horse Serum (HS): 1Dose F14 Pulver (Life Tech/INVITROGEN) in 900ml Wasser lösen, 10ml Penicillin/Streptomycin-Lsg. (1:100 verd., EK: 100mg/l Streptomycin Sulfat, 60,6mg/l Penicillin G) zugeben, mit 1M NaOH auf ph 7,3 einstellen (=> rote Farbe!), 1,97g NaHCO3 zufügen und auf 1l auffüllen; CO 2 einleiten bis die Lösung lachsfarben ist, 10% HS zugeben, steril filtrieren Phosphate buffered saline; PBS 1% Trypsin (in Hanks balanced salt solution, HBSS; Life Tech/INVITROGEN) 2. Kulturschalen a) Am Vortag: Kulturschalen mit Poly-D,L-Ornithin (Sigma; 0,5mg PORN/ml 0,15M Boratpuffer ph 8,35) über Nacht bei 4 C beschichten b) Vor der Präparation: - 3x mit HBSS waschen - Beschichtung mit Laminin-111 Lösung (1:400 aus 1mg/ml-Maus-Laminin-Stammlösung in HBSS/HEPES verdünnen, EK: 2,5µg/ml) 3. Im Labor vorbereiten Eisbad, Präparierbesteck, 10cm-Petrischale zum Präparieren, 6cm-Petrischale mit PBS zum Sammeln und Versäubern, Pasteurpipette, Eppendorfgefäß mit 1ml PBS 24

25 II. Präparation - E13 Tage alte Mausembryonen werden aus den Muttertieren präpariert und in einer Petrischale gesammelt - Köpfe der Embryonen abschneiden, Körper in Petrischale legen - Zum Präparieren wird der Embryo auf den Bauch gelegt, die Haut entfernt und das Rückenmark freipräpariert. - Dann werden die Hinterwurzelganglien (DRGs), die seitlich entlang des Muskels laufen, abgetrennt. - DRGs in 3 cm Petrischale mit PBS sammeln - Die Ganglien von überschüssigem Gewebe befreien und in 3 cm Petrischale mit frischem PBS überführen. III. Aufarbeitung in der Zellkultur (Gewinnen und Kultivieren der sensorischen Neurone) - DRGs mit 1 ml Pipette aus der Petrischale aufsammeln, dabei leicht schwenken (damit nichts hängen bleibt) und in 15 ml Röhrchen sammeln. - Falkon leicht schütteln (damit DRGs nach unten wandern) und Volumen mit Pipette auf ca. 1 ml reduzieren µl 1 % Trypsin dazugeben und leicht schwenken min bei 37 C im Brutschrank inkubieren. - Überstand mit Pasteurpipette vorsichtig abnehmen bis auf ca. 300 ml. - Ca. 10 mal mit 200 µl - Pipette triturieren (Auflösen des Zellverbands, Vereinzeln der sensorischen Neurone) ml Röhrchen mit 9.5 ml Kulturmedium füllen. - Zellsuspension auf NUNC-Petrischale (10 cm) zum Pre-Plating geben. - 2 h bei 37 C im Brutschrank inkubieren. - Petrischale vorsichtig 2 mal schwenken und Inhalt in 15 ml Röhrchen überführen. - 8 min bei 400 g zentrifugieren. - Absaugen bis auf 500 µl, resuspendieren - Neubaur-Zählkammer mit 10 µl Zellsuspension befüllen und Zellen zählen (4 Eckquadrate auszählen; Mittelwert bilden; Mittelwert x 10 = Zellen pro 1 µl Zellsuspension) - Auf PORN bzw. PORN und Laminin-111 beschichtete 24-Wells ausplattieren, dazu Laminin-111 absaugen und gleichzeitig 500 µl Kulturmedium mit bzw. ohne NGF (10 ng/ml Endkonzentration) zugeben. - Errechnete Zellmenge an Zellsuspension in jede Vertiefung zugeben. IV. Kultur Kulturmedium: F % HS, Inkubation bei 37 C und 5% CO 2 Faktoren: NGF (Endkonz.: 10ng/ml) und eine Kontrolle ohne neurotrophen Faktor. Die Zellen werden auf Poly-Ornithin (PORN) oder PORN + Laminin-111 beschichteten Schalen ausplattiert. 25

26 II. In vitro Analyse des Proliferations- und Differenzierungspotentials embryonaler neuraler der Maus. Das Nervensystem von Säugetieren entsteht aus dem Neuroektoderm, das in Neuralrohr und Neuralleiste strukturiert wird. Aus diesen Strukturen entstehen sowohl Nervenzellen als auch Stützzellen (Glia). Neurale können sowohl in Nervenzellen als auch Glia differenzieren, im Gegensatz zu späteren neuronalen, deren Differenzierungspotential auf Nervenzellen beschränkt ist. Frühe neurale bilden das Neuroepithel; sie proliferieren durch symmetrische Zellteilungen. Unter bestimmten Stimuli können sie alternativ durch asymmetrische Zellteilung sich selbst erneuern, wobei die zweite Tochterzelle in ein postmitotisches Neuron differenziert. Im Praktikumsteil sollen Zellkulturtechniken für neurale erlernt werden, um die Signale für Mitose und Differenzierung untersuchen zu können. Dazu generieren Sie adhärente Kulturen neuraler, die aus Mäuseembryonen gewonnen wurden, behandeln sie mit Wachstumsfaktoren (EGF und bfgf) und analysieren die Zellproliferation. In einem zweiten Versuchsansatz untersuchen Sie die Differenzierung neuraler zu Neuronen. Kultur embryonaler neuraler der Maus. Neurale können entweder als Neurosphären in serumfreiem Neurobasal-Medium mit dem Supplement B27 und den beiden Wachstumsfaktoren EGF (20 ng/ml) und Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2 oder bfgf, 10 ng/ml) kultiviert werden. Alternativ wachsen sie adherent auf Zellkulturplastik, wenn zusätzlich Heparin (5µg/ml) zum Medium zugegeben wird. Ziel 1: Nachweis der neuronalen Differenzierung und des Zellüberlebens unter differenzierenden Bedingungen. Dazu werden Zellen auf beschichteten Glasplättchen in 4-well Zellkulturschalen (Nunc #14444) ausgesät. Dies ermöglicht die Lebendbeobachtung ebenso wie Immunfärbungen (zum Nachweis z. B. der Apoptose, etc.) nach der Fixierung der Zellen. Nach 24 h Inkubation werden die Schalen mikroskopiert und Photos gemacht. Dann werden die adhärenten Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit 4% PFA in PBS fixiert. Ziel 2: Nachweis des EGF und bfgf Effekts auf die Proliferation. Dazu werden Zellen auf beschichteten Glasplättchen in 4-well Zellkulturschalen (Nunc #14444) ausgesät. 2 Stunden später erfolgt die Zugabe der Wachstumsfaktoren. Zum Nachweis der Proliferation wird der Zellproliferationsmarkers Bromodeoxyuridine (BrdU) zugegeben. Nach 24 h Inkubation werden die 26

27 Schalen mikroskopiert und Photos gemacht. Dann werden die adhärenten Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit 4% PFA in PBS fixiert. Well 1 Well 2 Well 3 Well 4 kein Faktor EGF (Endkonzentration 20ng/ml) bfgf (Endkonzentration 10ng/ml) EGF plus bfgf Durchführung: Als erstes werden die 10mm Gläschen, die bereits am Vortag mit Poly-D,L-Ornithin beschichtet wurden, mit Laminin beschichtet (siehe DRG Versuch). Die Wachstumsmedien für Differenzierung und Proliferation werden angesetzt. Jede Gruppe befüllt eine 4 Well-Platte für den Proliferationsansatz und eine weitere Platte für die Differenzierung. Die neuralen sind auf 3-cm Schalen der Firma Falcon kultiviert. Es wird in einer Sterilwerkbank gearbeitet und wie folgt verfahren: - Medium absaugen - Vorsichtig mit 2.5ml PBS waschen - 1ml PBS zugeben - 40µl 1% Trypsin zugeben - Schale vorsichtig schwenken und 2 min im Brutschrank inkubieren - Im Mikroskop die Ablösung der Zellen von der Schale prüfen - 40µl 1% Trypsininhibitor und 500µl Neurobasal/B27 zugeben - Zellen durch Triturieren mit einer blauen Spitze/Pipette dissoziieren - In ein 15ml Falconröhrchen überführen - Zentrifugation 1.400rpm, 4min, RT - Überstand absaugen (verwerfen) - Zum Zellpellet 500µl Neurobasal/B27 zugeben und lösen (5-mal triturieren) - Erneute Zentrifugation 1.400rpm, 4min, RT - Überstand absaugen (verwerfen) - Zum Zellpellet 500µl Neurobasal/B27 zugeben und lösen (10-mal triturieren) - Zellzahl bestimmen (Neubauer Zählkammer) - Ggf. Photo davon machen - Berechnen der benötigten Zellmenge (µl) pro well - Mischen von Medium mit den Zellen (=>Zellsuspension) - Aussäen von 500µl Zellsuspensiopro Well, dazu wird vorher die Laminin-Lösung abgesaugt. - Ggf. Zugabe der Faktoren gemäß Schema - Ggf. Zugabe des Zellproliferationsmarkers Bromodeoxyuridine (BrdU, Endkonzentration von BrdU im Medium 10µM) Kulturmedium: Neurobasal Medium, Gibco

28 2% B27, Gibco # U/ml Penicillin 10 µg/ml Streptomycin 1% Glutamax 1% MEM Non-essentaial amino acids, Gibco Wachstumsfaktoren (Stammlösungen): 20 ug/ml EGF 10 ug/ml FGF-2 Kultur von PC12 Zellen PC12 (Phaeochromocytoma) Zellen sind ursprünglich aus einem Tumor der Nebenniere der Ratte isoliert worden. Diese Zellen proliferieren in Kultur unter Vollserum -Bedingungen. Sie können mit Hilfe des neurotrophen Faktors NGF (nerve growth factor) differenziert werden. Die PC12 Zellen werden dann postmitotisch, und lassen Neuriten auswachsen. Verstärkt wird dieser Effekt von NGF noch durch die Reduktion von Serum im Medium. Im Rahmen des Praktikums sollen PC12 Zellen kultiviert und unter verschiedenen Bedingungen differenziert werden. Dabei soll der Einfluss des Faktors NGF auf das Neuritenwachstum beobachtet werden, aber auch der Einfluss des Substrats (Extrazelluläre Matrix) auf das Überleben und das Neuritenwachstum. PC12 Zellmedium (Proliferationsmedium, Vollserum) DMEM, (high glucose, 4.5 g / l) 10 % Pferdeserum (Horse serum) 5 % fötales Kälberserum (FCS) 1 % Pen / Strep PC12 Zellmedium (Differenzierungsmedium, Niedrigserum) DMEM, (high glucose, 4.5 g / l) 1 % Pferdeserum (Horse serum) 50 ng / ml NGF Die PC12 Zellen werden in Vorkultur in Proliferationsmedium in einer mittleren Flasche bereitgestellt. Für das Vereinzeln der Zellen werden sie zunächst 2x mit PBS gewaschen um Serumreste zu entfernen. Anschließend werden die Zellen mit 1 ml 1 % Trypsin / EDTA-Lösung behandelt (2-5 min bei Raumtemperatur). Trypsin (Protease) löst den Zellverband auf. Die so vereinzelten Zellen werden mit 1 ml Proliferationsmedium versetzt (im Serum befinden sich Trypsin-Inhibitoren, die die Reaktion des 28

29 Trypsin beenden). Anschließend werden die Zellen mit 10 ml Differenzierungsmedium ohne NGF!!! verdünnt. Die so verdünnten Zellen werden gezählt und auf eine Konzentration von 10 5 Zellen / ml eingestellt. 1 ml der Zellsuspension wird dann auf die entsprechend vorbehandelten und beschichteten Platten gegeben und mit weiteren 2 ml Differenzierungsmedium ohne NGF!!! Versetzt. Anschließend wird NGF in einer Endkonzentration von 50 ng / ml zugesetzt. 29

30 IMMUNHISTOCHEMISCHER TEIL Die Antikörperfärbungen an hippokampalem und cerebellärem Gewebe von jungen und adulten Mäusen, veranschaulichen den Aufbau und die Komplexität dieser Hirnregionen (siehe Vorlesung Prof. Sendtner und Dr. Jablonka). Es sollen anhand von Antikörperfärbungen die unterschiedlichen neuronalen Schichten und Zelltypen in der Kleinhirnrinde einer adulten und einer 1 Woche alten Maus untersucht und dokumentiert werden, um die Entwicklung des Cerebellums deutlich zu machen. Außerdem werden Schnitte des Hippokampus und Rückenmarks einer adulten Maus angefertigt und ausgewertet. Für die mikroskopische Untersuchung der Zellen in einem Gewebe wird das Gewebe zunächst präpariert, fixiert, eingebettet und geschnitten (siehe: Herstellung von Vibratom-Schnitten). Die meisten Gewebe bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, und die Immunhistochemie macht es möglich, einzelne Zelltypen im Gewebe bzw. auch von Strukturen innerhalb der Zellen darzustellen. Dieser Vorgang wird hier am Beispiel des Cerebellums beschrieben. Purkinjezellen und Interneurone des Cerebellums sollen mit Antikörpern gegen Parvalbumin identifiziert werden. Die Axone der Korbzellen, die Afferenten der Moosfasern und Kletterfasern sowie die Efferenten der Purkinje-Zellen sollen mit Anti-Phospho-Neurofilament detektiert werden. Herstellung von free floating sections mit dem Vibratom Mäuse werden mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PFA) perfundiert und das Gehirn wird freipräpariert. Nach einer kurzen Postfixation wird das Gewebe eingebettet und in µm dicke Scheiben geschnitten. Chemische Fixierung: Das Gewebe wird in Paraformaldehyd (4 % in einer Pufferlösung, PFA) eingelegt. Durch Quervernetzung von Proteinen bleibt die Gewebsstruktur erhalten, Enzyme werden inaktiviert, das Gewebe wird härter (wichtig fürs Schneiden) und kann gelagert werden. Einbetten: Fixiertes Gewebe wird in 6%iger Agarose eingegossen. Beim Abkühlen des Polymers entsteht ein hartes Präparat, das bei Raumtemperatur geschnitten werden kann. Trimmen: Das Präparat wird auf einem Probenhalter befestigt und so vorgeschnitten, dass die interessante Gewebeseite exponiert wird. Schneiden: Der Probenhalter wird in einem Schneidegerät (Vibratom) befestigt. Die vibrierende Rasierklinge wird in der Wanne (gefüllt mit PBS) an der Schnittfläche entlanggeführt. Die Schnitte werden mit einem Pinsel abgefischt und in einer 24-well Platte, gefüllt mit PBS ph 7.4, gesammelt. Die Dicke der Schnitte wird durch den Vorschub des Probenhalters reguliert. 30