Abteilung Tumor Virologie (F010)

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1 374 Abteilung Tumor Virologie (F010) Leiter: Prof. Dr. Jean Rommelaere Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Jan Cornelis Dr. Celina Cziepluch Dr. Laurent Daeffler Dr. Laurent Deleu (9/02-) Dr. Christiane Dinsart Dr. Nathalia Giese (-9/02) Dr. Jean-Claude Jauniaux PD Dr. Jürgen A. Kleinschmidt Dr. Ute Koch (2/03-) Dr. Dirk Kuck Dr. Susanne Lang (4/03-) Barbara Leuchs Dr. Jürg Nüesch Dr. Rémy Poirey Dr. Zahari Raykov (4/02-4/03) PD Dr. Anne Régnier-VigourouxDr. Nathalie Salomé Prof. Dr. Jörg R. Schlehofer Dr. Ekkehard Werner Dr. Claudia Wrzesinski (-3/03) Gastwissenschaftler Dr. Karsten Geletneky Dr. Edicio Armbruster (12/02-1/03) Sao Paulo, Brasilien Dr. Jianhong Li (8/03-) Shanghai, VR China Dr. Oliver Müller Dr. Jiong Liu (7-12/02) Wuhan, VR China Dr. Noelia Valle Benitez (6-9/03) Madrid, Spanien Dr. Zi-Ling Wang (9/03-) Peking, VR China Dr. Zahari Raykov, (9/03-) Sofia, Bulgarien Doktoranden und Doktorandinnen Anette Abschütz (4/02-) Julie Aldinger Xanthippi Apsi (-7/02) Katrin Arndt (5-10/03) Svenja Bleker (7/02-) Christian Boeke (-12/02) Virginie Daeffler (-11/03) Simin Dexler (12/03-) Marta Enderlin Andreas Hartkopf (4/03-) Tim Kayser Klaudia Kiehl (-4/03) Regina Koch (10/02-) Yan Yan König (4/02-) Bettina Kohlhoff (-4/02) Stephanie Kronenberg Lars Krüger Sylvie Lachmann (-8/03) Susanne Lang (-3/03) Tobias Lau (-8/03) Christoph Leder (-7/03) Mirjam Leuchtenberger (6/02-) Jianhong LI (5-9/02) Dessislava Nikolova (3/03-) Julia Peters Sabine Poltermann (7/02-) Julius Pochhammer Zahari Raykow (-4/02) Katharina Till Daniel Waterkamp (2/03-) Daniel Weiß Christine Wenig (5/02-6/03) Natascha Winkelhöfer (1/02-) Marc Winnefeld (7/02-) Ying Ying (10/03-) Heiko Zimmer (-3/02) Diplomanden und Diplomandinnen Anette Abschütz (-1/02) Svenja Bleker (5/01-2/02) Stephanie Bölz (9/02-2/03) Jennyfer Carrière (4-9/03) Anika Eckert (7/03-) Sabrina Hahn Florian Hahne (2-11/03) Nicolas Jauniaux (2-5/03) Svenja Leible (3-7/03) Doreen Markur (3-8/03) Stefan Mehrle (-10/02) Christophe Olinger (9/03-) Florian Sonntag (7/01-4/02) Nicole Schwinn (1-9/03) Hanna-Mari Tervo (9/03-) Lia Tesfay (-5/02) Marc Winnefeld (-7/02) Arzt im Praktikum (AIP) Marta Herrero Technisches Personal Katrin Bächle Ginette Balboni (-4/02) Matthias Ehrbar Renate Geibig (Teilzeit) Annabel Grewenig Rita Hörlein (Teilzeit) Andrea Kern (Teilzeit) Michèle Klein Regina Ly Sabine Mende (-5/02) Marcus Müller Silvia Münstermann Claudia Plotzky (Teilzeit) Petra Poberschin (Teilzeit) Kristin Schmidt (Teilzeit) Anouk Smet (-1/02) Alexandra Stroh-Dege Katja Sucker (Teilzeit) (7/03-) Zivildienstleistende Jonas Müller (6/02-5/03) Dennis Reinhard (9/03-) Alexander Rothkopf (-8/02) Sekretariat Ellen Burkard Auszubildende Nina Hensch (5/02-3/03) Anja Irsigler (-11/02) Carmen Mader Joachim Neuert (10/03-) Sabine Rauth (8-10/02) Marlene Roth (10/03) Nadja Stephan (-4/02) Maria Talamini (2/03-) Neben Viren, die Tumoren induzieren, gibt es auch Viren, die das Krebswachstum hemmen. Auf die letztere Gruppe von Viren, die zur Familie der Parvoviren gehören, konzentriert die Abteilung ihre Forschungsaktivitäten. Die antitumorelle Wirkung der Parvoviren beruht - zumindest zum Teil - auf ihrer Fähigkeit, das Absterben von Tumorzellen oder Differenzierungsvorgänge von neoplastischen Zellen zu induzieren. Darüber hinaus haben einige Vertreter dieser Viren die interessante Eigenschaft, Tumorzellen gegenüber genotoxischen Agenzien, die bei der Krebstherapie eingesetzt werden, zu sensibilisieren. Die Arbeit der Abteilung zielt zum einen darauf, die Mechanismen aufzuklären, die für die krebshemmende Wirkung der Parvoviren verantwortlich sind, und zum anderen Parvoviren für einen Einsatz in der Gentherapie von Krebs zu entwickeln. Durch ihre biologischen Eigenschaften sind die Parvoviren viel versprechende Vehikeln zur Transduktion und Expression von Genen, die in definierten Geweben, insbesondere Tumoren, therapeutisch wirksam sind. Deshalb werden in der Abteilung auf der Basis von Parvoviren Vektoren entwickelt und nach neuen Effektorgenen gesucht, die zur Gentherapie von Tumoren eingesetzt werden können.

2 A) Analyse und Suppression der malignen Transformation mit Hilfe von normalen und rekombinanten Parvoviren (F010-01) J. Rommelaere, J. Cornelis, C. Cziepluch, L. Daeffler, l. Deleu, C. Dinsart, N. Giese, J.-C. Jauniaux, U. Koch, J. Li, J.P.F. Nüesch, R. Poirey, A. Régnier-Vigouroux, N. Salomé, N. Valle-Benitez, E. Werner, C. Wrzesinski, Z. Raykov, A. Abschütz, X. Apsi, V. Eichwald-Daeffler, M. Enderlin, T. Kayser, S. Lachmann, S. Lang, D. Nikolova, J. Peters, N. Winkelhöfer, M. Winnefeld, H. Zimmer, S. Bölz, J. Carrière, A. Eckert, S. Hahn, F. Hahne, N. Jauniaux, S. Leible, C. Olinger, N. Schwinn, H.-M. Tervo, L. Tesfay Diese Gruppe stellt eine gemeinsame Forschungseinheit des DKFZ und INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U375) dar. In Zusammenarbeit mit: J.M. Almendral, Universität Autonoma de Madrid, Madrid, Spanien; J.L. Souciet, Louis Pasteur University, Strasbourg, Frankreich; M. Tommasino, DKFZ; L. Willems, Faculty of Agronomy, Gembloux, Belgien; S. Sozzani, Institut Mario Negri, Mailand, Italien; W. Spaan, Universität Leiden, Leiden, Niederlande; J. van Damme, Universität Leuven, Leuven, Belgien; M. Möhler, Universität Mainz; K. Geletneky, Universität Heidelberg; M. Hergenhahn, H. Spring, E. Spiess, R. Zawatzky, alle DKFZ Zurückliegende in vitro wie auch tierexperimentelle Studien haben gezeigt, dass das Wachstum etlicher humaner Tumoren stark durch die onkolytischen und onkosuppressiven Aktivitäten von Wildtyp wie auch rekombinanten Derivaten autonomer Parvoviren beeinträchtigt wird. Wichtigstes Ziel der Arbeitsgruppe ist es deshalb, die onkosuppressiven Eigenschaften von Wildtyp und rekombinanten autonomen Parvoviren einer Anwendung in der Therapie von Krebserkrankungen zuzuführen. Gegenwärtig zielt ein Teil unserer Arbeit darauf, durch genetische Veränderungen Parvoviren mit verbesserter Wirkung zu entwickeln. Ansatzpunkte hierfür ergeben sich aus der Aufklärung einiger molekularer Mechanismen, die dem Onkotropismus autonomer Parvoviren zugrunde liegen. Des Weiteren sollen aber auch grundlegende Fragestellungen bezüglich der Parvovirus-vermittelten Zytotoxizität und Immunmodulation beantwortet werden, da diese beiden Aspekte der Parvovirus-Wirts-Wechselwirkung nur unzureichend aufgeklärt sind. Triebfeder für diese Arbeiten ist die Aussicht, durch die Entdeckung neuer zellulärer Faktoren bzw. Signaltransduktions-Kaskaden, die sich als Ziele für eine nichtkonventionelle Krebstherapie mit Parvoviren oder in der Wirkung analoger Substanzen eignen könnten, neue Anti- Krebstoxine bzw. Vakzine zu entwickeln. Neben der präklinischen Evaluation rekombinanter Parvoviren sollen die meist versprechenden Vektoren für eine klinische Nutzung erprobt werden. Mit unseren klinischen Kollaborationspartnern bereiten wir darüber hinaus Phase I/II Studien vor, die darauf abzielen Tumoren wie z.b. Gliome und Pankreastumoren zu behandeln, die sehr häufig konventionellen Therapien gegenüber resistent sind, die sich aber gegenüber einer Parvovirus-bedingten Toxizität als sensitiv erwiesen haben. 1) Parvovirale Onkolyse und die Entwicklung neuer Zielmoleküle zur Krebstherapie Koordinator: J. Rommelaere a. Parvovirale Zielmoleküle modulieren Signalwege der Antitumor Immunantwort L. Daeffler, U. Koch Für den Einsatz in der Krebstherapie bieten autonome Parvoviren (PV) aufgrund ihres Onkotropismus und ihrer onkolytischen Aktivität die besten Voraussetzungen. Ein Hauptziel unseres Forschungsinteresses liegt darin, den Vorgang, der durch das autonome PV Murine Virus of Mice Prototyp (MVMp) ausgelösten Zelllyse auf viraler und zellulärer Ebene aufzuklären. Das nicht-strukturelle Phosphoprotein 1 (NS1) des MVMp hat zentrale Funktionen, die essentiell für die Virusvermehrung sind. Insbesondere reguliert NS1 sowohl die virale DNA Replikation als auch die zytotoxische Wirkung in den Wirtszellen. Es wurde gezeigt, dass NS1 in anbetracht der zytotoxischen Wirkung zytostatische Effekte hat und zur Induktion der Zelllyse erforderlich ist. Mehrere der spezifischen Eigenschaften von NS1 werden durch eine sequentielle Phosphorylierung der viralen Polypeptide mittels der Proteinkinase C Proteinfamilien koordiniert. Durch gezielte Punktmutationen im Karboxylende des NS1 Proteins wurden zwei neue Mutanten des MVMp Virus hergestellt, die zum einen erhöhte und zum anderen reduzierte toxische und lytische Aktivität aufwiesen [22]. Zusammenfassend konnten wir erstmals zeigen, dass späte Phosphorylierungen in der Karboxyldomäne des MVMp NS1 Proteins die toxischen und lytischen Aktivitäten des Virus regulieren. Die Herstellung einer replikationsfähigen hypertoxischen Mutante des MVMp Virus eröffnet neue Perspektiven in der Anwendung von Nagerparvoviren in der Krebsbekämpfung. Die hypertoxische PV Mutante könnte durch verstärkte lytische Aktivität eine erhöhte Freisetzung tumorspezifischer Antigene und anderer immunstimulierender Moleküle von infizierten Krebszellen im Vergleich zum Wildtyp Virus bewirken. In Pilotexperimenten wurden der Wildtyp MVMp PV und eine Interferon β-induzierende Mutante in einem murinen Melanommodell analysiert und in Kokulturexperimenten wurden dendritische Zellen auf Aktivierungsmarker, Expressionsprofile der Toll-like Rezeptoren und Crosspriming untersucht. b. Induktion des Zelltods mittels autonomer Parvoviren L. Deleu In den letzten Jahren konnten wir zeigen, dass autonome PV H-1 und MVMp sowohl apoptotische als auch nichtapoptotische Signalwege des Zelltods induzieren. Dies geschieht jedoch immer in Abhängigkeit der Herkunft der jeweiligen Zelle. Konventionelle Krebstherapien, die auf genotoxischen Substanzen basieren, haben meistens sich teilende Zellen als Zielgewebe oder diese Therapien nutzenlösliche zelltodinduzierende Liganden (z.b. TNFα oder TRAIL). Diese Ansätze sind jedoch oft in der Effizienz dadurch begrenzt, dass die Krebszellen entweder durch natürliche Selektion oder durch allmähliche Resistenzselektionierung gegenüber diesen Agenzien widerstandsfähig werden. Deshalb ist eine klare Herausforderung in der Krebsbekämpfung, die Vorgänge, die das Überleben der neoplastischen Zellen bewirken, zu neutralisieren. Autonome PV sind in der Lage, verschiedene Signalwege des induzierten Zelltodes zu stimulieren. Deshalb kommt ihnen 375

3 376 Forschungsschwerpunkt F eine viel versprechende Bedeutung in der Krebstherapie zu. Wir untersuchten frühe Passagen von Zellen aus Gliomen und Astrozytomen von Krebspatienten in einer Kollaboration mit der Neurochirurgischen Universitätsklinik Heidelberg (Dr. Karsten Geletneky). Diese Zellen wurden auf ihre Sensitivität gegenüber konventionellen Behandlungstherapien und PV H-1 Infektionen untersucht. Bisher konnte gezeigt werden, dass PV H-1 den Zelltod besonders effektiv in Gliomen und Astrozytomen auslöste, unabhängig von deren Resistenz oder Sensitivität gegenüber konventionellen Krebsbekämpfungsmetho-den. Ferner löste das PV H-1 auch den spezifischen Zelltod durch die Aktivierung von zellulären Proteasen aus, unabhängig von Kaspase-induzierten Signalwegen. c. Zelluläre Funktion des humanen small glutamine-rich TPR-containing Proteins (hsgt) C. Cziepluch, M. Winnefeld Das zelluläre hsgt Protein wurde auf Grund seiner Interaktion mit NS1, dem wichtigsten regulatorischen Protein des autonomen Parvovirus H-1, identifiziert [Cziepluch et al., J. Virol. 72 (1998) 4149]. Nach Infektion akkumuliert hsgt zusammen mit NS1 in so genannten APAR-bodies nukleäre Strukturen, an denen die parvovirale DNA-Replikation erfolgt [Cziepluch et al., J.Virol. 74 (2000) 4807]. Es gibt Hinweise, dass hsgt eine Rolle in der viralen Replikation oder nachfolgenden Prozessen im viralen Lebenszyklus übernimmt. Da das SGT Protein in allen bislang untersuchten Zelllinien und Geweben nachgewiesen werden konnte, und SGT-kodierende Gene in Organismen von der Hefe bis zum A C Das humane SGT Protein lokalisiert während der Anaphase in einer Mitose-relevanten Struktur (midzone). A: Die Verteilung des hsgt Proteins (rot) in humanen Zellen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und konfokale Laser- Mikroskopie sichtbar gemacht. hsgt akkumuliert während der Anaphase in der midzone. B: Die Lokalisation von Tubulin (grün) in der selben Zelle. C: Eine Darstellung bei der die Signale aus A und B vereinigt wurden. Strukturen, die sowohl hsgt als auch Tubulin enthalten erscheinen gelb. D: In der Differential Interferenzkontrast Mikroskopie (DIC) sind die kondensierten Chromosomen gut zu erkennen. Abbildung in Zusammenarbeit mit Dr. H. Spring (DKFZ). B D Menschen gefunden wurden, geht man davon aus, dass es ein Housekeeping -Protein sein könnte. Die hier vorgestellte Untersuchung hat zum Ziel, zelluläre Prozesse zu identifizieren, an denen das hsgt Protein beteiligt ist, und die Funktion des Proteins aufzuklären. Erste Hinweise auf eine mögliche Rolle des hsgt Proteins in der Mitose ergaben Immunfluoreszenzanalysen, die zeigten, dass dieses Protein spezifisch in Mitose-relevanten Strukturen wie der Zentralspindel und dem Mittelkörper akkumuliert [Abbildung]. Der entscheidende Nachweis gelang durch Knock-down Ansätze. Es zeigte sich, dass teilungsaktive Zellen, in denen die zelluläre Menge des hsgt Proteins durch RNA Interferenz experimentell reduziert wurde, unmittelbar während der Mitose sterben [28]. Unklar ist bislang noch, welche Funktion hsgt in der Mitose hat. Da zuvor bereits Hinweise auf eine Co-Chaperon Aktivität des hsgt Proteins in der neuronalen Signaltransduktion erhalten wurden, ist nicht auszuschließen, dass dieses Protein auch in der Mitose als Co-Chaperon wirkt. Zur Aufklärung der molekularen Funktion des hsgt Proteins während der Zellteilung wird es nötig sein, Mitose-spezifische Interaktionspartner dieses Proteins zu identifizieren, eine Fragestellung, die im Fokus unserer aktuellen Forschung steht. d. Wechselwirkung zwischen parvoviralen Proteinen und der Wirtszellphysiologie J.P.F. Nüesch, J. Rommelaere Unsere Studien behandeln das Wechselspiel zwischen dem Parvovirus MVMp (minute virus of mice) und seiner Prototyp- Wirtszelle A9, eine transformierte Fibroblastenzelllinie der Maus. Dabei befassten wir uns in erster Linie mit der Regulation des grossen Nichtstrukturproteins NS1 seiner vielfältigen Funktionen und Eigenschaften, über Phosphorylierungen durch zelluläre Proteinkinasen. Dabei spielen Isoformen der PKC Familie, im Speziellen PKCλ und PKCη eine wesentliche Rolle, sind sie doch für die Aktivierung von NS1 seiner Funktionen in der viralen DNA-Replikation sowohl in zellfreien biochemischen Assays als auch in der Wirtszelle absolut notwendig [15, 17]. Dabei ist zu erwähnen, dass diese spezifischen Phosphorylierungsvorgänge gezielt das biochemische Spektrum des viralen Proteins verändern und so seine differenzierten Funktionen, wie die Initiation der Replikation, seine Eigenschaften als Transkriptionsfaktor, wie auch seine multiplen Funktionen, die den Zelltod und Lyse initiieren, beeinflussen. Die Studien über die Funktionen von NS1, die an der Replikation beteiligt sind, haben dabei maßgeblich mitgeholfen, diese Replikationsvorgänge aufzuschlüsseln [4]. In der Tat konnten wir zeigen, dass durch gezielte Mutation des viralen Proteins an PKC Phosphorylierungsstellen seine replikativen Eigenschaften von seiner zytotoxischen Wirkung getrennt werden konnten [22]. Dies bedeutet, dass Zelltod und Lyse nicht nur Nebenwirkungen der viralen Vermehrung sind, sondern spezifische virale Vorgänge darstellen, die einer optimalen Vermehrung und Verbreitung des Parasiten dienen. Da die onkolytischen Eigenschaften autonomer Parvoviren im Rahmen des Gentherapie Programms unserer INSERM-Gruppe im Vordergrund stehen, ist es uns wichtig, die molekularen Vorgänge, die nach Infektion zum Zelltod führen, im Detail aufzuschlüsseln. Dabei sind wir an der Interaktion von MVM mit zellulären Proteinkinasen interessiert. Die Abhängigkeit einer produktiven Infektion von spezifischen Phosphorylierungsvorgängen durch PKC Isoformen wies darauf hin, dass die virale Infektion auch die intrazelluläre Aktivität dieser Proteinkinasen

4 beeinflussen könnte. Interessanterweise konnten wir zeigen, dass beide NS1-regulierenden Kinasen PKCλ und PKCη nach MVM Infektion in der Zelle umverteilt werden [15,17]. Dies kann zu dramatischen Veranderungen der Zellphysiologie führen, und in Konsequenz zumindest eine Ursache für die Veränderungen in der Zellmorphologie (cytopathischer Effekt) sein. Deshalb steht gegenwärtig die Analyse der NS1-induzierten Zellveränderungen im Vordergrund unserer Untersuchungen. Kürzlich konnten wir zeigen, dass Ab- und Umbau von Mikro- und Intermediärfilamente des Zytoskeletts durch die virale Infektion betroffen sind, wobei Mikrotubuli während der ganzen Infektionsdauer erhalten bleiben (Publikation in Vorbereitung). Hierbei scheint die Aktivität der PKCs zumindest in der Regulation von NS1 eine wesentliche Rolle zu spielen. Frühere Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die NS1-induzierten Zellveränderungen durch Mutationen an PKC Phosphorylierungsstellen im viralen Protein inhibiert wurden. Dabei reguliert PKCλ die Interaktion von NS1 mit CKIIα, der katalytischen Untereinheit der zellularen Caseinkinase II. Dieser NS1/CKIIα Komplex reguliert die Phosphorylierung der Tropomyosinfilamente und bewirkt damit in dramatischer Weise den Umbau des Zytoskeletts (Manuskript in Vorbereitung). Aufgrund dieser Befunde haben wir semisynthetische Toxine entwickelt, die für die transformierte A9 Zelllinie toxisch sind, von anderen Zelllinien aber toleriert werden [Patent Nüesch und Rommelaere, 2003]. Die Weiterentwicklung solcher Onkotoxine und ihre Applikation durch heterologe virale Vektorsysteme sind weitere Projekte unserer Arbeitsgruppe. Im Rahmen unserer Studien zur Biologie der Parvoviren wurden wir auch eingeladen, an einem Kompendium über Viren mitzuarbeiten [14]. Chemokin IP-10 potenziert und in einem murinen Hämangiosarkom-Modell (Kaposi-Sarkom Analog) getestet. Bereits wenige intratumorale Anwendungen dieser rekombinanten MVMp-IP10 Viren genügten, um eine signifikante Reduktion der primären Tumoren zu erzielen. Diese Studien wurden in Zusammenarbeit mit Team 2 durchgeführt [3]. Unglücklicherweise induzieren sowohl natürlich vorkommende wie rekombinante autonome Parvoviren bereits nach wenigen Applikationen eine starke Immunantwort im Wirt. Dies stellt ein generelles Problem für die systemische Anwendung solcher Agenzien dar, da sie von neutralisierenden Antikörpern abgefangen werden. Um diesem negativen Einfluss zu entgehen, haben wir neue Strategien zur Applikation von autonomen Parvoviren entwickelt. (iii) Als Modell dienten krebsbefallene Ratten. Die metastasierenden Tumoren in der Lunge wurden durch Einspritzen einer Hepatomzelllinie induziert. Zur Behandlung mit autonomen Parvoviren wurde dieselbe Zelllinie mit dem Wildtyp des Rattenvirus H-1 infiziert. Durch gezielte γ-bestrahlung der infizierten Zellen wurde zwar das Wachstum der Krebszellen gestoppt, und damit eine Verbreitung der Geschwüre verhindert, die Replikation der Parvoviren hingegen blieb erhalten. Diese in vitro infizierten Zellen dienten dann als Vehikel, um das therapeutische Parvovirus in das krebsbefallene Tier zu schleusen. Mittels intravenöser Applikation solcher Parvovirus-tragenden Vehikel konnte eine hohe Konzentration der therapeutischen Viren in der Lunge (dem Metastasen tragenden Organ) erzielt werden, was zu einer bedeutenden Reduktion (60%) der bereits existierenden Tumoren führte [27]. Gegenwärtig versuchen wir, die gewonnenen Erkenntnisse weiter auszunutzen, um in neuen Versuchsreihen eine optimale Wirkung zu erziehlen. e. Strategien zum Einsatz von parvoviralen Komponeneten in der Gentherapie Z. Raykov, J. Rommelaere Das Ziel dieses Projekt besteht darin, mittels verschiedener Strategien durch den natürlichen Onkotropismus und die onkolytische Wirkung von Parvoviren eine Verbesserung in der Krebstherapie zu erzielen. Dabei standen drei Fragestellungen im Vordergrund: (i) Gegenwärtig können autonome Parvoviren noch nicht so verändert werden, dass sie lediglich eine gewünschte Zielzelle infizieren. Zudem ist die Kapazität, Fremdgene einzuschleusen, limitiert. Um diese Restriktionen zu umgehen und die gewünschten Eigenschaften dieser Viren zu erhalten, haben wir versucht, chimäre Viren zu entwickeln. Als Modell dienten rekombinante Adenoviren, welche eine Expressionskassette aus dem parvoviralen Genom enthielten. Die toxische Wirkung der konstitutiv exprimierten Nichtstrukturproteine NS1 und NS2 bewirkte dabei, dass die Herstellung solcher chimären Viren unmöglich wurde. Durch den gezielten Einsatz spezifischer Antisense-Oligonukleotide konnten wir die Produktion der toxischen Proteine soweit einschränken, dass eine Produktion solcher Chimären ermöglicht wurde [1]. Damit konnten wir zeigen, dass einerseits die Herstellung parvoviraler Chimären möglich ist, andererseits der gezielte Einsatz von Antisense-Oligos die Produktion von rekombinanten Viren ermöglicht, welche starke Toxine exprimieren. (ii) Nichtpropagierende autonome Parvoviren allein sind nicht in der Lage, pre-existierende Tumoren vollständig zu beseitigen. Um eine erfolgreiche Therapie zu erzielen, braucht man einen Bystander-Effekt. Zu diesem Zweck wurden die Eigenschaften autonomer Parvoviren mit dem angiostatischen 2) Parvovirus - Zielzelleninteraktionen J.-C. Jauniaux, N. Salomé Die autonom replizierenden Parvoviren MVM und H-1 Virus exprimieren vier verschiedene Proteine: die Strukturproteine VP1 und VP2, die zur Bildung des Kapsids notwendig sind, und die Nichtstrukturproteine NS1 und NS2. Das NS1 Protein ist essentiell für die parvovirale DNA-Amplifikation und Genexpression. NS1 spielt darüber hinaus beim parvovirusvermittelten Zelltod eine wichtige Rolle (s.o.). Das NS2 Protein spielt eine entscheidende Rolle beim Aufbau des viralen Kapsids und, als mögliche Konsequenz daraus, bei der Herstellung der einzelsträngigen Parvovirus-DNA. Es gibt darüber hinaus Hinweise, dass NS2 die zytotoxische Wirkung von NS1 moduliert. Die molekularen Mechanismen, die diesen Aktivitäten zugrunde liegen, sind jedoch noch unbekannt. Deren Aufklärung ist eines der Ziele unserer Arbeit. In zurückliegenden Studien haben wir nachgewiesen, dass das NS2 Protein mit dem nukleären Exportrezeptors Crm1 interagiert und über einen Crm1-abhängigen Reaktionsweg aktiv aus dem Kern infizierter Zellen transportiert wird. Um die Bedeutung dieser Interaktion für den viralen Lebenszyklus aufzuklären, wurden zwei mutierte genomische Klone hergestellt, die CRM1-Interaktions-defiziente NS2-NES(-) Proteine exprimieren. Die funktionelle Analyse dieser Klone offenbarte, dass der NS2-Crm1-Komplex weder für die Synthese der viralen Proteine (NS1, NS2, VP1 und VP2), noch für die Produktion infektiöser Virionen benötigt wird. Aber das Fehlen des nukleären Exports von NS2 und/oder die starke verringerung von NS2 im Zytoplasma der infizierten Zellen führt zur Ansammlung neu produzierter MVM-Parti- 377

5 378 Forschungsschwerpunkt F kel im Kern, was mit einem verspäteten Erscheinen der mutierten Partikel im Kulturmedium und einer verlängerten Überlebensdauer infizierter Zellpopulationen einher geht, im Vergleich zu Kulturen, die mit Wildtyp-Virus behandelt wurden. Wir haben aus diesen Daten den Schluss gezogen, dass NS2 unbedingt notwendig für die Freisetzung neu produzierter Virionen aus dem Kern ist [5], was vermuten lässt, dass NS2 eine entscheidende Rolle bei den späten Schritten im parvoviralen Lebenszyklus zukommt. Weitere Analysen deuten darauf, dass das NS2 Protein einen Beitrag zur Erzeugung und/oder Verpackung einzelsträngiger Virus-DNA leistet. Wie NS2 in diese Prozesse eingreift, wird gerade untersucht. Zusammenfassend weisen unsere Daten darauf hin, dass NS2 eine Schlüsselrolle in molekularen Prozessen übernimmt, die essentiell für die Vermehrung und Ausbreitung infektiöser Virionen sind. Dies bedingt, dass Replikations-aktive parvovirus-basierte Konstrukte, die in der Krebsgentherapie eingesetzt werden sollen, ein intaktes NS2-kodierendes Gen enthalten müssen [26]. Ein weiteres Ziel, das unsere Gruppe verfolgt, ist die Identifizierung von Genen, die nach Infektion mit Parvoviren in verschiedenen Tumorzelllinien systematisch hoch oder herab reguliert werden. Diese Studien werden mit Hilfe der cdna Microarrays durchgeführt, die es erlauben, Veränderungen im Expressionsmuster zellulärer Gene festzustellen. Wir haben damit begonnen, die Expressionsmuster von zwei menschlichen Zelllinien, der Leukämie-Zelllinie U937 und der Hepatokarzinom-Zelllinie QGY-7703, zu vergleichen, die entweder nicht oder mit H-1 Virus infiziert wurden. Mehr als 500 Gene, deren Expression in infizierten Zellen gegenüber nicht infizierten Zellen modifiziert waren, wurden identifiziert und mittels Gene Ontology klassifiziert. Die Verbindung einiger dieser Gene zur Induktion/Repression von Apoptose oder Immunantworten wird gerade untersucht. Diese Studien sollen mit anderen Tumorzelllinien wie z.b. Darmkrebszellen oder Gliomazellen fortgesetzt werden. Wir haben auch die Genexpressionsmuster der menschlichen Leukämie-Zelllinie U937, die sehr empfindlich gegenüber einer H-1 Virusinfektion ist, mit derjenigen von Infektions-resistenten Derivaten (genannt RU 1-4) verglichen. Mit Hilfe des Affymetrix-Systems konnten über 50 Gene identifiziert werden, deren Expression zumindest in einer Variante von RU der U937 Zelllinie verändert ist. Durch eine RealTime PCR Analyse konnte die Überexpression zwei dieser Gene in resistenten Klonen bestätigt werden. Die mögliche Beteiligung dieser Genprodukte an der Resistenz der Zellen gegenüber einer Infektion mit Parvoviren wird zurzeit untersucht. 3) Natürliche und rekombinante Parvoviren in der Krebstherapie J. Cornelis, C. Dinsart Mit dem Ziel die Antitumor-Effekte natürlicher Parvoviren zu verstärken, wurden rekombinante Viren (Vektoren) hergestellt, die therapeutisch wirksame Zytokine/Chemokine oder zytotoxische Proteine exprimieren, deren Transgene unter der Kontrolle des viralen Promoters P38 stehen. Diesen Vektoren fehlen nur die Kapsidprotein-kodierenden Gene, während alle bekannten regulatorischen Elemente, die für die Replikation und Expression der viralen DNA erforderlich sind, erhalten blieben. In der Vergangenheit entstanden bei der Produktion parvoviraler Vektoren immer wildtyp-ähnliche, replikationsfähige Viren. Deshalb wurden verschiedene Strategien verfolgt, um die Verunreinigung der Vektorstocks mit solchen Viren zu minimieren. Am erfolgreichsten war der Einsatz von Split- Helfer-Konstrukten [6] sowie das sog. Cross packaging, bei dem das virale Genom mit Kapsiden verwandter Parvoviren verpackt wird [19, 24, 26]. Mit Hilfe dieser Methode konnte die Entstehung replikationsfähiger Viren verhindert werden. Es besteht die Möglichkeit, dass Tumorzellen, die insbesondere durch Apoptose sterben, von dendritischen Zellen aufgenommen werden, und dass diese im Weiteren zytotoxischen T-Lymphozyten Tumorantigene präsentieren können, so dass letztendlich Tumorimmunität erzeugt wird. Für Parvoviren konnte gezeigt werden, dass sie Antitumor- Effekte in Tieren hervorrufen, dessen Mechanismus allerdings noch unbekannt ist. Es stellte sich die Frage, ob die Immunogenität von Tumorzellen nach einer Infektion mit Parvoviren erhöht werden kann. Die Freisetzung von heat shock Proteinen (HSP) steigert bekanntermaßen die Immunität. Nach der Infektion von menschlichen Melanomzellen mit H-1 Virus wurde eine erhöhte Freisetzung von induzierbarem HSP70 aber nicht von konstitutivem HSP70 beobachtet. Diese Freisetzung war ausgeprägter und hielt länger an als nach einer konventionellen heat shock Behandlung [16], was die Vermutung nahe legt, dass induzierbares HSP bei der tumorunterdrückenden Aktivität von Parvoviren eine Rolle spielt. Wir haben rekombinante Parvoviren produziert, die in der Lage sind, immunstimulierende Moleküle freizusetzen, und ihr Antitumor-Potential in verschiedenen Tumormodellen getestet [3, 24, 26, 31]. Die Bildung und das Wachstum von Tumoren in Nacktmäusen, die durch Implantation von menschlichen Zervixkarzinomzellen entstehen, wird gehemmt, aber nicht vollständig verhindert, wenn Vektorviren, die für das monozytische, chemotaktische Protein-3 (MCP-3) kodieren, eingesetzt werden [24, 26]. Interessanterweise wird die Tumorbildung in immunkompetenten Mäusen völlig unterdrückt, wenn Maus-Melanom-Zellen implantiert werden, die MVMp-vermittelte MCP-3 exprimieren. Das deutet auf eine Beteiligung von T-Zellen an der antitumoralen Wirkung von MCP-3 hin. Der Vektor MVMp/IP-10, der das Chemokin IP-10 exprimiert, zeigt in immunkompetenten Mäusen eine drastische Hemmung des Wachstums beim primären Mäusehämangiom und seiner aggressiven Metastasen. Unter den gleichen Bedingungen war Wildtyp-MVMp weit weniger wirksam [3]. Kürzlich wurden die Effekte der Parvoviren H-1 oder MVMp in verschiedenen Glioblastom- Zelllinien, die aus Maus und Mensch stammen, getestet. Diese Zelllinien sind sehr empfindlich gegenüber Parvovirusinduzierter Zytotoxizität [30]. Glioblastome sind stark durchblutete Tumoren und deshalb prädestiniert für eine Antiangiogenese-Therapie. In Übereinstimmung damit steht, dass die kombinierte Expression von IP-10 und TNFa mittels Parvoviren eine dramatische Rückbildung von Tumoren bewirkte, die nach subkutaner Implantation von murinen Glioblastomzellen in Empfängermäuse entstehen [31]. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass rekombinante Parvoviren, die immunstimulierende Moleküle oder für Tumorzellen toxisch wirkende Agenzien exprimieren, viel versprechende Vektoren für die Krebstherapie darstellen [24, 26, 29].

6 4) Gliazellen und Parvovirus-vermittelte Antitumorstrategie für Gehirntumoren A. Régnier-Vigouroux Vektoren auf der Basis von Parvoviren stellen viel versprechende Kandidaten für die Therapie von Gehirntumoren dar. Die häufigste Form von Gehirntumoren sind Gliome, die durch neoplastische Veränderung von Astrozyten entstehen. Nach geeigneter Stimulierung können Gliazellen (Astrozyten und Mikroglia) sehr effektiv zu Immunantworten beitragen. Von Gliomen ist bekannt, dass sie immunsuppressiv wirkende Substanzen sezernieren und die Immunkompetenz von Gliazellen negativ beeinflussen können. Daher könnte eine Vektor-vermittelte lokale Gentherapie, die gegen Gliomzellen gerichtet ist, nicht nur direkt Tumorzellen zerstören, sondern zudem helfen, die Antitumoraktivität der restlichen Gehirnzellen zu induzieren oder zu verstärken. Der Nutzen jeglicher Virus-vermittelter Antitumor-Strategie beruht jedoch nicht nur auf ihrer Effizienz sondern auch auf ihrer Spezifität bezüglich der Zielzellen. Darüber hinaus sind Viren ja keine neutralen Agenzien, denn sie können ihrerseits die Immunkompetenz von Gliazellen durch ihre Anwesenheit oder nach Infektion beeinflussen. Wir haben daher unsere Untersuchungen in Mausmodellen auf zwei wichtige Fragestellungen gerichtet: a) Spezifität und Sicherheit beim Einsatz von Parvoviren als Vektoren in der Gentherapie von Gehirntumoren b) Bewertung der Rolle der Mikroglia in der abgeborenen Abwehr von Gliomen a. Spezifität und Sicherheit beim Einsatz von Parvoviren als Vektoren in der Gentherapie von Gehirntumoren Unsere bisherigen Ergebnisse zeigten, dass in primären Gliazellkulturen Astrozyten aber nicht Mikroglia mit Wildtyp und rekombinanten Parvoviren infiziert werden können, wobei jedoch keine Produktion neuer Viren erfolgte. Das bedeutet, dass in vivo ein Teil der therapeutisch eingesetzten Parvoviren durch Infektion der nicht malignen Gehirnzellen verloren ginge und darüber hinaus deren Biologie beeinflusst werden könnte. Die derzeitige Arbeit ist daher auf folgende Themen fokussiert: (i) Die Bestätigung dieser Beobachtungen in einer physiologisch-relevanten Umgebung, wie sie eine Organ-typische Kultur (=organotypic culture, OTC) von P6-Mausgehirnen darstellt. In solchen OTC wird nach Implantation mit Tumorzellen oder ohne analysiert, inwieweit Astrozyten und Mikroglia mit Parvoviren infiziert werden können. Diese Studie soll zeigen, welche Zielzellen es in dieser multizellulären Umgebung für das Virus gibt, (ii) Eine Bewertung der Parvovirus-vermittelten Zytotoxizität auf in vitro oder in OTC infizierten Gliazellen; (iii) Eine Bewertung der möglichen Rolle von IFN β bei der Resistenz von Mikroglia gegenüber einer Infektion mit Parvoviren. Dies wird in Kollaboration mit Prof. Dr. Rainer Zawatzky (ATV) -/- untersucht. Es wird dazu die Infizierbarkeit von IFN β Mikroglia in Kultur und in OTC untersucht. Die hierfür notwendigen IFN β -/- Mäusen werden von Prof. Zawatzky zur Verfügung gestellt. b. Bewertung der Rolle der Mikroglia in der angeborenen Abwehr von Gliomen Die Neutralisation von Gliomen durch Phagozytose: Vorläufigen Ergebnisse aus unserem Labor zeigen, dass Mikroglia in Kultur in der Lage sind, apoptotische oder lebende Zellen zu phagozytieren. Mit Hilfe eines Lektin-Bindungsassay fanden wir, dass Gliomzellen auf ihrer Oberfläche mannosylierte Proteine exprimieren. Zurzeit untersuchen wir, ob der von Mikroglia exprimierte Mannose-Rezeptor [20,21] an dieser Phagozytose beteiligt ist. Zytotoxizität der Mikroglia: Von Mikroglia ist bekannt, dass sie nach Stimulation mit LPS und IFN γ eine gegen P815 Mastozytome gerichtete zytotoxische Aktivität entfalten können. Nach Behandlung von Mikroglia mit diesen Substanzen haben wir beobachtet, dass große Mengen an TNF α in Kultur oder in OTC freigesetzt werden. Darüber hinaus sind Überstände von diesen stimulierten Mikroglia toxisch für Gliomzellen. Wir versuchen nun, die toxische Substanz (TNF α, NO oder andere?), die von Mikroglia freigesetzt werden, zu identifizieren. Da gezeigt werden konnte, dass Ligandenbindung an Mannose-Rezeptoren eine toxische Aktivität der Makrophagen auslösen kann, untersuchen wir auch, ob eine Mannose-Mannose-Rezeptor Wechselwirkung zwischen Gliomen und Mikroglia zu der Mikroglia-vermittelten Toxizität und der Beseitigung der Gliome führen kann. Ein weiteres Ziel unserer Arbeit ist die Untersuchung von Parvovirus-vermittelten Effekten auf diese Antitumor-Aktivität der Mikroglia. 5) Programm der Europäischen Union zur funktionellen Analyse des Hefegenoms J.-C. Jauniaux Wir haben an dem Programm der Europäischen Union zur funktionellen Analyse des Hefegenoms (EUROFAN) teilgenommen. Im Rahmen dieses Programms haben wir in Zusammenarbeit mit Drs. J.L. Souciet und M. Tommasino die DUP240 [7] und Pmf1 [8] Genfamilien charakterisiert. Wir haben außerdem Beiträge zur Optimierung der Two-hybrid -Methode geleistet, und damit die Charakterisierung von Partnern für (i) das onkovirale G4 Protein des bovinen Leukämievirus, (ii) das akzessorische p13(ii) Protein des menschlichen T-Zell Leukämievirus Typ 1 [9] sowie für (iii) das Tax Protein des bovinen Leukämievirus [25] beigetragen. Diese Arbeit erfolgte in Kollaboration mit Dr. L. Willems. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Raykov, Z.,* Legrand, V., *Homann, H.E. and Rommelaere, J. (2002) Transient suppression of transgene expression by means of antisense oligonucleotides: a method for the production of toxin-transducing recombinant viruses. Gene Therapy 9, [2] Deleu, L., Daeffler, L., Faisst, S. and Rommelaere, J. (2002) Action oncolytique des parvovirus de rongeurs. Virologie 6, [3] Giese, N.A., Raykov, Z., De Martino, L., *Vecchi, A., *Sozzani, S., Dinsart, C., Cornelis, J.J. and Rommelaere, J. (2002) Suppression of metastatic hemangiosarcoma by a parvovirus MVM p vector transducing the IP-10 Chemokine into immunocompetent mice. Cancer Gene Therapy 9, [4] Willwand, K., *Moroianu, A., Hörlein, R., *Stremmel, W. and Rommelaere, J. (2002) Specific interaction of the nonstructural protein NS1 of minute virus of mice (MVM)with [ACCA] 2 motifs in the center of the right-end MVM DNA palindrome induces hairpinprimed viral DNA replication. Journal of General Virology 83, [5] Eichwald, V., Daeffler, L., Klein, M., Rommelaere, J. and Salomé, N. (2002) The NS2 proteins of parvovirus minute virus of mice are required for efficient nuclear egress of progeny virions in mouse cells. Journal of Virology 76, [6] *Brown, C.S., *DiSumma, F., Rommelaere, J., Dege, A.Y., Cornelis, J.J., Dinsart, C. and *Spaan, W.J.M. (2002) Production of recombinant H-1 parvovirus stocks devoid of replication-competent viruses. Human Gene Therapy 13,

7 380 Forschungsschwerpunkt F [7] Poirey, R., *Despons, L., *Leh, V., *Lafuente, M.J., *Potier, S., *Souciet, J.L. and Jauniaux, J.C. (2002) Functional analysis of the Saccharomyces cerevisiae DUP240 multigene family reveals membrane-associated proteins that are not essential for cell viability. Microbiology 148, [8] *Marchini, A., *Accardi, R., *Malanchi, I., *Schyr, E., *Oxelmark, E., *De Pinto, V., Jauniaux, J.C., *Maundrell, K. and *Tommasino, M. (2002) Schizosaccharomyces pombe Pmf1p is a mitochondrial protein and is structurally and functionally related to Mmf1p of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 19, [9] *Lefebvre, L., *Vanderplasschen, A., *Ciminale, V., *Heremans, H., *Dangoisse, O., Jauniaux, J.C., *Toussaint, JF., *Zelnik, V., *Burny, A., *Kettmann, R. and *Willems, L. (2002) Oncoviral bovine leukemia virus G4 and human T-cell leukemia virus type 1 p13 (II) accessory proteins interact with farnesyl pyrophosphate synthetase. Journal of Virology 76, [10] *Piontek, J., Régnier-Vigouroux, A. and *Brandt, R. (2002) Contact with astroglial membranes induces axonal and dendritic growth of human CNS model neurons and affects the distribution of the growth associated proteins MAP1B and GAP43. Journal of Neuroscience Research 67, [11] *Weber-Lotfi, F., *Guillemaut, P., Poirey, R., *Schmitz, M. and *Dietrich, A. (2002) Biochemical and molecular studies on declining and decline-resistant spruce in the North-East of France. Environmental Science and Pollution Research International 9, [12] Salomé, N. and Grimm, D. (2002) Gene therapy with parvoviruses? How viruses can be modified to turn into tools against cancer. In: Current Cancer Research. Stamatiadis-Smidt H., ed. Steinkopff Darmstadt-Springer New York, pp [13] Salomé, N. and Grimm, D. (2002) Gentherapie mit Parvoviren? In: Krebsforschung heute. Stamatiadis-Smidt H., ed. Steinkopff Darmstadt-Springer New York, pp [14] Rommelaere, J., *Almendral, J.M., Cornelis, J.J. and Nüesch, J.P.F. (2002) Parvovirus. In: The Springer Index of Viruses. Tidona, C.A. and Darai, G., eds. Springer Verlag Heidelberg, pp [15] Lachmann, S., Rommelaere, J. and Nüesch, J.P.F. (2003) Novel PKCγ is required to activate replicative functions of the major non-structural protein NS1 of minute virus of mice. Journal of Virology 77, [16] *Moehler, M., *Zeidler, M., *Schede, J., Rommelaere, J., *Galle, P.R., Cornelis, J.J. and *Heike, M. (2003) Oncolytic parvovirus H1 induces release of heat-shock protein HSP72 in susceptible human tumor cells but may not affect primary immune cells. Cancer Gene Therapy 10, [17] Nüesch, J.P.F., Lachmann, S., Corbau, R. and Rommelaere, J. (2003) Regulation of MVM NS1 replicative functions by atypical PKCd in vivo. Journal of Virology 77, [18] *Malerba, M., Daeffler, L., Rommelaere, J. and *Iggo, R.D. (2003) Replicating parvoviruses which target colon cancer cells. Journal of Virology 77, [19] Wrzesinski, C., Tesfay, L., Salomé, N., Jauniaux, J.C., Rommelaere, J., Cornelis, J. and Dinsart, C. (2003) Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. Journal of Virology 77, [20] Zimmer, H., *Riese, S. and Régnier-Vigouroux, A. (2003) Functional characterization of mannose receptor expressed by immunocompetent mouse microglia. Glia 42, [21] Régnier-Vigouroux, A. (2003) The mannose receptor in the brain. International Review of Cytology 226, [22] Daeffler, L., Hörlein, R., Rommelaere, J. and Nüesch, J.P.F. (2003) Modulation of minute virus of mice cytotoxic activities through site-directed mutagenesis within the NS coding region. Journal of Virology 77, [23] Cziepluch, C., Schlehofer, J.R. and *Veldwijk, M.R. (2003) Parvoviren in der Krebs- und Gentherapie. In: Onkologie. Zeller, W.J. and zur Hausen, H. eds. Ecomed Verlag Landsberg/Lech, Losbl.-Ausg. IV-21.2, pp [24] Cornelis, J.J., Lang, S., Stroh-Dege, A.Y., Balboni, G., Dinsart, C. and Rommelaere, J. (2004) Cancer therapy through autonomous parvovirus-mediated gene transfer. Current Gene Therapy, 4, [25] *Twizere, J.C., *Kruys, V., *Lefebvre, L., *Vanderplasschen, A., *Collete, D., *Debacq, C., *Lai, W.S., Jauniaux, J.C., *Bernstein, L., *Semmes, O.J., *Burny, A., *Blackshear, P.J., *Kettmann, R. and *Willems, L. (2004) Tax oncoproteins interact with tristetraprolin and regulate TNF-alpha expression. Journal of National Cancer, in press. [26] Cornelis, J.J., Salomé, N., Dinsart, C. and Rommelaere, J. (2004) Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer? Journal of Gene Medicine, 6, suppl. 1, [27] Raykov, Z., Balboni, G., *Aprahamian, M. and Rommelaere, J. (2004) Carrier cell-mediated delivery of oncolytic parvoviruses for targeting metastasis. International Journal of Cancer, 109, [28] Winnefeld, M., Rommelaere, J. and Cziepluch, C. (2004) The human small glutamine-rich TPR-containing protein (hsgt) is required for progress through cell division. Experimental Cell Research 293, [29] Rommelaere, J., Giese, N., Cziepluch, C. and Cornelis, J.J. (2004) Parvoviruses as anti-cancer agents. In: Virus Therapy of Human Cancers Sinkovics, J.G. and Horvath, J.C., eds. Marcel Dekker, Inc. in press. [30] Herrero y Calle, M., Cornelis, J.J., Herold-Mende, C., Rommelaere, J., Schlehofer, J.R. and Geletneky, K. (2004) Parvovirus H-1 infection of human glioma cells leads to complete viral replication and efficient cell killing. International Journal of Cancer 109, [31] Enderlin, M., *Struyf, S., *Van Damme, J., *Sozzani, S., *Vecchi, A., Rommelaere, J., Cornelis, J. and Dinsart, C. Combined expression of TNFα and IP.10 by means of parvoviruses induces regression of tumors derived from glioma cells implanted s.c. in mice. Journal of Gene Medicine (in press) Patentanmeldungen Nüesch, J.P.F. and Rommelaere, J. (2003) Fusion polypeptide suitable as a cytotoxin Application (Eur) Rommelaere, J., Cornelis, J., Dinsart, C., Schlehofer, J.R., Geletneky, K. and Herrero, Y. Calle, M. (2003) Use of parvovirus for brain tumor therapy Application 10/ (USA) Cziepluch, C., Rommelaere, J. and Winnefeld, M. (2003) Method to inhibit the propagation of an undesired cell population Application (Eur) Hochschulschriften C. Wrzesinski: Autonome Parvoviren. Entwicklung einer zweiten Generation von Vektoren für die Tumor-Gentherapie und Untersuchung des Einflusses der Infektion auf die zelluläre Genexpression. Dissertation, Tierärztliche Fakultät der Ludwig- Maximilians-Universität München (2002) H. Zimmer: Untersuchungen von Mikrogliazellen und des Mannose-Rezeptors unter einem immunologischen Blickwinkel. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät, Universität Heidelberg (2002) Z. Raykov: Gene transduction by means of parvoviral and chimeric adenoviral vectors for cancer therapy. Dissertation, Medizinische Fakultät, Universität Heidelberg (2002) X. Apsi: Funktion des SGT/NS1-Komplexes im Lebenszyklus autonomer Parvoviren. Dissertation, Naturwissenschaftlich- Mathematische Gesamtfakultät, Universität Heidelberg (2002) J. Li: Antineoplastic activity of autonomous parvovirus H1: identification of cellular genes differentially expressed in the hepatocellular carcinoma cell line QGY-7703 after parvovirus H1 infection. Dissertation, Joint supervision of the Universities of Louis Pasteur, Strasbourg 1, France, and Fudan of Shanghai, People Republic of China (2002) L. Tesfay: Production and efficacy of recombinant parvoviruses to deliver the isoforms of MIP-1α chemokine in brain tumour cells. Diplom, Department of Biotechnology, Mannheim University of applied Sciences (2002)

8 M. Winnefeld: Subzelluläre Lokalisation und posttranslationelle Modifikation des small glutamine-rich TPR-containing protein (SGT) in mitotischen Zellen. Diplom, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Bremen (2002) S. Olijslagers: Gene therapeutic application of the Chicken Anemia Virus-derived protein Apoptin. Dissertation, Medizinische Fakultät, Universität Heidelberg (2003) S. Lang: Rekombinante Parvoviren in der Gentherapie von Krebs: Vektorcharakterisierung und Analyse der Wirksamkeit. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg (2003) S. Lachmann: Funktionelle Bedeutung der Protein-Kinase Cη im Infektionszyklus des autonomen Parvovirus Minute Virus of Mice. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg (2003) V. Eichwald-Daeffler: La protéine non-structurale NS2 du parvovirus minute de souris (MVMp) joue un rôle clé dans la production et la libération de virions infectieux. Dissertation, Faculté des Sciences de la Vie, Université Louis Pasteur, Strasbourg (2003) S. Bölz: Characterisation of recombinant parvoviruses in comparison with their corresponding natural viruses. Diplom, Department of Biotechnology, Mannheim University of applied sciences (2003) N. Schwinn: Mögliche zytosolische Partner des Mannose- Rezeptors in Mikroglia. Diplom, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg (2003) F. Hahne: Rekombinante parvovirale Vektoren für die Expression RNAi-vermittelnder hsgt-spezifischer shrnas. Diplom, Fakultät für Biowissenschaften der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg (2003) B) Infektionsbiologie und Krebstherapeutische Nutzung von Parvoviren (F010-02) J.R. Schlehofer, J. Aldinger, C. Boeke, M. Ehrbar, E. Gueckel, A. Hartkopf, S. Hoecker, K. Kiehl, R. Koch, Y. König, A. Köylü, B. Kohlhoff, M. Leuchtenberger, R. Ly, D. Markur, S. Mehrle, J. Pochhammer, S. Poltermann, K. Till, D. Weiß, C. Wenig, K. Zscheppang In Zusammenarbeit mit: Jean Rommelaere, Laurent Deleu, Jan Cornelis, Brigitte Schlehofer, Evelyn Kludt, Iris Hettinger, Jürgen Wahrendorf, DKFZ; Karsten Geletneky, Neurochirurgische Universitätsklinik; Waltraut Eggert-Kruse, Universitäts-Frauenklinik; Magnus von Knebel Doeberitz, Abt. Molekulare Pathologie; Paul Schnitzler, Hygiene Institut, Abteilung Virologie, Universität Heidelberg; Marta Herrero, Neurochirurgische Universitätsklinik, Freiburg i. Br.; Volker Rohde, Urologische Universitätsklinik, Gießen; Gernot K. Beisler, Gynäkologe, Bad Wildbad-Calmbach; Keng-Ling Wallin, Karolinska Institut, Stockholm, Schweden; Theodoros Agorastos, Sophia Chrysaphi, B Universitiy Clinic OB/ GYN, Hippokrateion Hospital, Thessaloniki, Griechenland, E. Armbruster, Gynecology and Obstetrics Department, Faculty of Medicine, University of São Paulo, and Human Genetics Sections of the Butantan Institute São Paulo, Brasilien Zusatzfinanzierung: DFG (EG 71/2-1; SCHL 203/11-1) Graduiertenkolleg 793 ( Epidemiology of communicable and chronic, non-communicable diseases and their interrelationships ) 1) Infektiologie, tumorsuppressive Eigenschaften und Pathologie Adeno-assoziierter Viren (AAV) a. Biologie und klinische Bedeutung der genitalen AAV-Infektion Adeno-assoziierte Viren haben - wie andere Parvoviren auch - tumorhemmende Eigenschaften [1]. Der Infektion mit diesen Helfervirus-abhängigen Viren kann bislang kein Krankheitsbild zugeordnet werden, allerdings liegen systematische Untersuchungen zur möglichen Rolle von AAV bei chronischen Störungen oder Erkrankungen nicht vor. In Abwesenheit eines Helfervirus wird - zumindest in Zellkultur - das AAV- Genom ins zelluläre Genom in einem relativ spezifischen Locus auf Chromosom 19 integriert, wodurch AAV als Gen-Vektor geeignet ist. Zur Klärung der natürlichen AAV-Infektion wurde die persistierende/latente genitale Infektion genauer untersucht, da wir in den vorangegangenen Jahren AAV relativ häufig in menschlichem Genitalgewebe nachgewiesen hatten (Uterus- und Hodengewebe, Zervixabstriche, Sperma). Eine mögliche Bedeutung der AAV-Infektion in der Schwangerschaft wurde in Kooperation mit einem Gynäkologen und der Arbeitsgruppe Umweltepidemiologie des DKFZ in einer prospektiven Kohortenstudie (AAVIS-Studie) untersucht. In dieser Studie wurden Daten zur Anwesenheit von AAV-DNA im Fruchtwasser, zum AAV Antikörper- Status während der Schwangerschaft sowie zum klinischen Verlauf der Schwangerschaft erhoben, um einen möglichen Einfluß der AAV-Infektion auf die Schwangerschaft zu prüfen. AAV-DNA konnte in 38% der Fruchtwasserproben nachgewiesen werden. Perinatale Komplikationen (vorzeitiger Blasensprung, Gestose, Placentadysfunktion) wurden bei 41% der Frauen mit AAV-DNA-positiver Amnionflüssigkeit beobachtet, während diese Komplikationen bei AAV-DNA-negativem Fruchtwasser nur bei 26% der Schwangeren auftraten. Frühgeburten waren doppelt so häufig bei Frauen mit AAV-DNA-positivem Fruchtwasser, und AAV-DNA-positive Frauen hatten häufiger Fehlgeburten in der Anamnese. Es war keine Assoziation von AAV-DNA-Nachweis mit Blutung, vorzeitigen Wehen, Mißbildung oder Totgeburt nachweisbar. Andere Schwangerschafts-assoziierte Infektionen (Chlamydien-, Bakterien-, Virusinfektionen, Toxoplasmose) waren seltener bei positivem AAV-DNA-Nachweis als bei nichtinfiziertem Fruchtwasser. In dieser Studie bestätigte sich auch die relativ erhöhte Seroprävalenz (57%) von AAV-Antikörpern in der Frühschwangerschaft. Allerdings variierte die Antikörperprävalenz im Lauf der Schwangerschaft, sowohl individuell als auch für die Population: Zum Entbindungszeitpunkt waren Antikörper gegen AAV nur in 41% der Fälle nachweisbar. Der Nachweis von IgM-Antikörpern im Neugeborenenserum (18/262) bestätigte unsere frühere Hypothese einer inutero-infektion des Feten mit AAV. (Ob dies klinische Konsequenzen hat, konnte im Rahmen der AAVIS-Studie nicht untersucht werden.) In weiteren Studien zur AAV-Infektion in der Schwangerschaft wurden auch Trophoblasterkrankungen untersucht. Proben von Blasenmolen, Chorion-Karzinomen sowie Spontanaborten wurden auf AAV-DNA untersucht. Dabei wurde AAV-DNA in 28 von 49 Blasenmolen, in 4 von 14 Chorio-Karzinomen und in 11 von 15 Fehlgeburten detektiert [2]. Die Daten belegen die Infektion embryonaler Zellen mit AAV und unterstützen die Vermutung einer möglichen Rolle von AAV bei Schwangerschaftskomplikationen, sowie bei Fehlgeburten und Trophoblasterkrankungen. Hingegen konnte in Materialien von embryonalen Tumoren keine AAV-DNA nachgewiesen werden. Da AAV ein Helfervirus-abhängiges Parvovirus ist, wurden die Fruchtwasserproben (AAVIS-Studie, s.o.) zusätzlich auf 381