Elektrophysiologische Untersuchungen volumensensitiver Ionenkanäle mittels planarer Patch-Clamp-Technik. Bachelorarbeit

Transkript

1 Elektrophysiologische Untersuchungen volumensensitiver Ionenkanäle mittels planarer Patch-Clamp-Technik Bachelorarbeit von Ludwig Vielsmeier aus München Hochschule München Fakultät Feinwerk- und Mikrotechnik, Physikalische Technik Studiengang Bachelor Bioingenieurwesen Schwerpunktbereich Medizin- und Pharmatechnik Referent: Prof. Dr. H. Clausen-Schaumann Korreferent: Prof. Dipl.-Phys. Armin Giebel Betreuer: Dr. Andrea Brüggemann, Nanion Tag der Einreichung: München

2 Abstrakt Die Aufgabenstellung meines Titels Elektrophysiologische Untersuchungen volumensensitiver Ionenkanäle mittels planarer Patch-Clamp-Technik, ist als Versuch zu interpretieren, mit den von Nanion Technologies zur Verfügung gestellten planaren Patch-Clamp-Methoden Ströme durch volumensensitive bzw. mechanosensitive Ionenkanäle zu messen. Anders als viele weitere Publikationen, die sich ebenfalls mit dem Thema der mechanosensitiven Ionenkanäle beschäftigen, finden in dieser Arbeit die Methoden der planaren Patch-Clamp-Technik Anwendung. Im Vergleich zur klassischen Patch-Clamp-Technik, die eine Pipette verwendet um eine Zelle zu fixieren, wird bei der planaren Variante ein Chip verwendet. Zuvor wurden mit den elektrophysiologischen Messgeräten von Nanion mechanosensitive Ionenkanäle durch mechanische Stimuli noch nicht aktiviert. Abstract The task given by the title Electrophysiological Investigations of Volume-sensitive Ion Channels using Planar Patch-Clamp Technique is the effort to measure currents through mechanosensitive ion channels by patch-clamp methods provided by Nanion Technologies. Unlike many other papers, dealing with mechanosensitive ion channels as the central theme, in this work the planar patch-clamp-technique is studied. Compared to the classical patch-clamp-technique, using a pipette to fix a cell, the planar alternative works with a chip. To date, mechanosensitive ion channels have not been studied by using a mechanical stimulus with one of Nanion's setups. 2

3 Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis...5 Tabellenverzeichnis...7 Stichwortverzeichnis Einführung Grundlagen Zellmembran Elektrochemischer Gradient Elektrisches Modell einer Zellmembran Ionenkanäle mpiezo1 Kanal VSOR-Chloridkanal Patch-Clamp-Technik Prinzip Planare Konfiguration Material und Methoden Material Zelllinien Zellkultur Elektrophysiologische Messungen Software Methoden Zellbiologische Methoden Elektrophysiologische Methoden Methoden zur Ergebnisauswertung

4 4. Ergebnisse Untersuchungen des mpiezo1-kanals in HEK-Zellen Messergebnisse Veränderung der Osmolaritäten zur Ergebnisverbesserung Protokolländerungen zur Ergebnisverbesserung Verschiedene Erntemethoden zur Ergebnisverbesserung Änderung der Passagiermethode zur Ergebnisverbesserung Diskussion Untersuchungen des VSOR-Chloridkanals in HeLa-Zellen Charakterisierung der Stromantwort in isotoner Lösung Untersuchung des Stromanstiegs Volumenänderung der Zellen Untersuchung des Stromabfalls Chloridanteil der maximalen Stromantwort Einfluss von Arachidonsäure Bindungseigenschaften von Arachidonsäure Einfluss von FBS auf blockierte Kanäle Diskussion Zusammenfassung...60 Quellen- und Literaturverzeichnis

5 Abbildungsverzeichnis Abbildung 2.1: Biomembran 11 Abbildung 2.2: Ersatzschaltbild einer Biomembran 15 Abbildung 2.3: Angelegte Rechteckspannung und Stromantwort eines RC-Gliedes 16 Abbildung 2.4: Aufbau eines nikotinischen Acetylcholinrezeptors 17 Abbildung 2.5: Mögliche Piezo-Strukturen bzw. Aktivierungsmodelle 19 Abbildung 2.6: Klassische Patch-Clamp-Technik 21 Abbildung 2.7: Patch-Clamp-Konfigurationen 22 Abbildung 2.8: Planare Patch-Clamp-Technik 23 Abbildung 2.9: Ersatzschaltbild einer Zelle im Whole-cell-mode 24 Abbildung 3.1: Messaufbau für die Benutzung des Port-a-Patch 31 Abbildung 3.2: Chip für den Port-a-Patch 33 Abbildung 3.3: Messprotokoll für die Messung an VSOR-Chloridkanälen 34 Abbildung 4.1: Messprotokoll für die Messung an mpiezo1-ionenkanälen 37 Abbildung 4.2: Spannungsimpuls in Form einer Rampe 43 Abbildung 4.3: Standardstromantwort von HeLa-Zellen auf eine Spannungsrampe 44 Abbildung 4.4: Vergleich von kaliumhaltiger und kaliumfreier internen Lösung 44 Abbildung 4.5: Stromantwort vor und nach Einwirken von hypotoner Lösung 46 Abbildung 4.6: Vergleich der Strommaxima vor und nach dem Austausch durch hypotoner Lösung Abbildung 4.7: 47 Vergleich der Stromminima vor und nach dem Austausch durch hypotoner Lösung 47 Abbildung 4.8: Aufzeigen der Darstellungsmethode folgender Graphen 48 Abbildung 4.9: Steigende Strommaxima und -minima nach dem Austausch isotoner gegen hypotoner, externer Lösung 49 5

6 Abbildung 4.10: HeLa-Zelle in isotoner Lösung mit Referenzpfeil 49 Abbildung 4.11: HeLa-Zelle nach 3 Minuten in hypotoner Lösung mit Referenzpfeil 49 Abbildung 4.12: Stromabfall nach einem Lösungsaustausch der hypotonen gegen eine isotone Lösung 50 Abbildung 4.13: Durch einen zweiten Lösungsaustausch hypotoner Lösung erzwungener schwacher Stromanstieg Abbildung 4.14: Eine in Agar-Agar platzierte Elektrode Abbildung 4.15: Vergleich der Stromantwort von chloridhaltiger und chloridfreier externer Lösung Abbildung 4.16: Inhibierender Effekt von Arachidonsäure auf den Strom Abbildung 4.17: Stromanstieg durch Austausch der Arachidonsäure in hypotoner Lösung gegen rein hypotone Lösung 56 Abbildung 4.18: Stromanstieg durch Austausch der Arachidonsäure in hypotoner Lösung gegen FBS in hypotoner Lösung 57 6

7 Tabellenverzeichnis Tabelle 2.1: Freie Ionenkonzentrationen und Gleichgewichtspotentiale einer Säugetiermuskelzelle 13 Tabelle 3.1: Medienbestandteile und deren Menge 26 Tabelle 3.2: In der Zellkulutr verwendete Artikel und ihren Bezugsquellen 27 Tabelle 3.3: Verwendete Lösungen 28 Tabelle 3.4: Messgeräte 29 Tabelle 3.5: Zur Messung und Auswertung benutzte Software 29 Tabelle 3.6: Verlauf des Strombildes bei einer vorgegebenen Rechteckspannung und dazugehörige Zahlenwerte bis zur Erreichung eines Gigaseals in der Whole-cell Konfiguration Tabelle 4.1: Verschiedene Austauschvorgänge von Lösungen, um die Öffnung der mpiezo1-ionenkanäle zu stimulieren Tabelle 4.2: Abfolge von Austauschschritten, durch die eine Vorhersage der grundlegenden Bindungseigenschaften von Arachidonsäure an VSOR-Chloridkanälen möglich ist 55 7

8 Stichwortverzeichnis A Membranfläche ATP Adenosintriphosphat C Kapazität Ca2+ Calciumion/en Cl- Chloridion/en d Membrandicke DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DPC Diphenylamine-2-carboxylate E Elektrisches Potential EDTA Ethylendiamintetraacetat Elektrische Feldkonstante des Vakuums Relative Permittivität des Dielektrikums F Faraday-Konstante (F = 96485,34 ) FBS Fetal bovine serum GGW Gleichgewicht HEK Human Embryonic Kidney (Zelllinie) HEPES 2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure I Stromstärke K+ Kaliumion/en n Anzahl der Messungen Na+ Natriumion/en NPPB 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate PBS Phosphate buffered saline R Universelle Gaskonstante (R = 8,31447 SITS 4-acetamido-4'-isothiocyanostilbene T Temperatur t Zeit U Spannung VSOR-Cl--Kanal Volume-sensitive outwardly rectifying Chloridkanal z Äquivalentzahl ) 8

9 1. Einführung Ionenkanäle sind Transmembranproteine. Eine Einlagerung dieser Proteine in die zelluläre Membran ermöglicht Ionen das Passieren entlang ihres elektrochemischen Gradienten. Dabei bilden Ionenkanäle im geöffneten Zustand eine Pore, die dann für eine bestimmte oder mehrere Arten von Ionen durchlässig ist. Neben den großen Klassen der spannungsgesteuerten und ligandengesteuerten Ionenkanäle, rücken zunehmend mechanosensitive Kanäle in den Fokus der Forschung. So lassen sich beispielsweise die Funktionen von Tastsinn und Gehörsinn auf mechanisch aktivierbare Ionenkanäle zurückführen. Die Funktion besteht dabei im Allgemeinen in der Umwandlung eines mechanischen Stimulus in ein vom Körper verwertbares, biochemisches Signal in Form eines Ionenstroms. (Faller, 2008) Neben diesen offensichtlichen Funktionen fungieren diese Art von Kanälen auch als Sensoren in vielen viszeralen Organen. So können zum Beispiel Ionenkanäle, die in spezialisierten Zellen neben Endothelzellen eingelagert sind, physikalische Reize wie intravasale Flussgeschwindigkeiten oder intravasalen Druck messen und als biochemisches Signal weitergeben (Freie Universität Berlin, 2013). Mit diesen Informationen kann vor allem im zentralen Nervensystem auf Veränderungen entsprechend reagiert werden. Damit sind die mechanosensitiven Ionenkanäle die erste Schnittstelle eines klassischen Regelkreises. Gerade weil viele Arten mechanosensitiver Ionenkanäle in Aufbau, Form und genauer Funktion noch nicht ausreichend erforscht sind, sucht die Grundlagenforschung nach geeigneten Methoden diese Fragen zu klären. Eine Möglichkeit bieten dabei elektrophysiologische Messungen. Auch große Pharmaunternehmen greifen vermehrt auf die Möglichkeiten dieser Messungen zurück. Grund sind die steigenden Anforderungen an pharmazeutische Produkte in Bezug auf therapeutische Effekte und zu vermeidende Nebenwirkungen. 9

10 Die Patch-Clamp-Technik ist eine der wichtigsten Standardmethoden der Elektrophysiologie. Mit ihrer Hilfe können Ströme und Spannung über eine Biomembran gemessen und so auf die durch Ionenkanäle geflossenen Ladungsträger in Form von Ionen geschlossen werden. Eine besondere Form stellt dabei die planare Patch-Clamp-Technik dar. Sie verwendet anstatt der klassischen Pipette eine Öffnung in der Mitte eines Chips und ermöglicht so einen größeren Probendurchsatz. In dieser Arbeit werden zwei Arten mechanosensitiver Ionenkanäle mittels planarer Patch-Clamp-Technik untersucht. 10

11 2. Grundlagen 2.1 Zellmembran Je nach Typ und Art einer Zelle finden sich im Cytoplasma, der inneren Grundstruktur der Zelle, verschiedene Organellen und strukturgebende Proteine. Allen Zellen gemein ist jedoch eine Membran, durch die eine Abgrenzung des Zellinneren zur äußeren Umgebung ermöglicht wird. Diese Plasmamembran besteht hauptsächlich aus Phospholipiden, die sowohl einen hydrophilen, als auch einen hydrophoben Bereich besitzen und damit als amphiphil gelten. Diese Eigenschaft ermöglicht eine Zusammenlagerung der hydrophilen bzw. hydrophoben Bereiche der einzelnen Moleküle und somit die Entstehung der Zellmembran. In diese sind - neben vielen weiteren Strukturen (Abbildung 2.1) - auch Kanalproteine eingebaut, die einen Transport von Ladungsträgern in Form von Ionen ermöglichen. Auf diese Ionenkanäle wird später in einem eigenen Kapitel näher eingegangen. Abbildung 2.1: Biomembran mit verschiedenen ein- oder angelagerten Strukturen. (Wikipedia, 2013) 11

12 2.2 Elektrochemischer Gradient Wie bereits erwähnt können geladene Teilchen mit Hilfe passender Ionenkanäle die Zellmembran überwinden. Ohne diese Kanalproteine allerdings, wäre die Membran unter physiologischen Bedingungen für Ladungsträger nahezu undurchlässig. Durch aktiven Transport von Ladungsträgern und einem Verschließen der meisten Ionenkanäle ist die Zelle also in der Lage einen Gradienten aufrecht zu erhalten, durch dessen Ladungsverteilung eine Potentialdifferenz über der Membran entsteht. Zusätzlich zu den Kräften, die elektrischen Ursprungs sind (elektrischer Gradient), entstehen durch eine ungleichmäßige Verteilung von Ionen auch Konzentrationsgefälle (chemischer Gradient), die sich auszugleichen versuchen und dabei Kräfte erzeugen. Erst wenn sich der elektrische und chemische Gradient bzw. alle Kräfte in ihrer Gesamtheit aufheben, ist ein Diffusionsgleichgewicht erreicht und der elektrochemische Gradient ist null. Zur Beschreibung des im Diffusionsgleichgewicht herrschenden Potentials über der Zellmembran wird oft die Nernst-Gleichung (2.1) verwendet. Dabei ist R die universelle Gaskonstante (R = 8,31447 ), T die absolute Temperatur in Kelvin, z die Ladung der jeweiligen Ionenspezies oder auch Äquivalentzahl und F die Faraday-Konstante (F = 96485,34 ). Bezogen auf die physiologische Situation gibt E1 bzw. [S]1 die internen Verhältnisse, E2 bzw. [S]2 die externen Verhältnisse der Zelle an. Ein Potential von z.b. -90mV ist demnach gleichbedeutend einer intrazellulär vorherrschenden Spannung von -90mV relativ zur extrazellulären. (Hille, 2001) Membranpotentialdifferenz = E1-E2 = (2.1) 12

13 Für verschiedene Ionensorten (2.2, 2.3, 2.4, 2.5) kann man also schreiben: (2.2) (2.3) (2.4) (2.5) Eine gute Übersicht der Konzentrationsverteilungen, sowie der Gleichgewichtspotentiale der wichtigsten Ionen in einer Säugetiermuskelzelle bietet die Tabelle 2.1 aus Ion Channels of Excitable Membranes von Hille, Das Ruhepotential (Anmerkung b) beschreibt dabei einen Zustand, bei dem sich das Membranpotential zeitlich nicht verändert. (The Axon Guide, 2008) Ionensorte Extrazelluläre Konzentration (mm) Intrazelluläre Konzentration (mm) [Ion]außen/ [Ion]innen Gleichgewichtspotentiala (mv) Na K , ,5 100nM , b 2+ Ca Cl - b b Tabelle 2.1: Freie Ionenkonzentrationen und Gleichgewichtspotentiale einer Säugetiermuskelzelle a b Aus der Gleichung 2.1bei 37 C kalkuliert Annahme des Ruhepotentials bei -90mV und eines Gleichgewichtszustandes der Chloridionen Das gesamte Membranpotential setzt sich also aus den Gleichgewichtspotentialen der einzelnen Ionensorten, aber auch aus deren Permeabilitäten zusammen. Als Umkehrpotential wird jene künstlich angelegte Membranspannung bezeichnet, bei der alle Ionenströme im Gleichgewicht (GGW) sind. Das heißt, durch den betrachteten Kanal fließt kein Nettostrom. Wäre nur eine Ionenspezies in einem betrachteten System vorhanden, entspräche das Umkehrpotential dem GGW13

14 potential dieser Ionensorte. Da es mit der Nernst-Gleichung (2.1) schwierig ist, das Umkehrpotential für Kanäle vorauszusagen, die für mehr als ein Ion permeabel ist, wird gerne auf die einfachste Darstellung der Goldman-Hodkin-Katz-Gleichung (2.6) zurückgegriffen (Hille, 2001). (2.6) Dabei beschreibt P die jeweiligen Permeabilitäten der verschiedenen Ionensorten. Die Permeabilität P setzt sich wiederum aus dem Quotient des Diffusionskoeffizienten und der Membrandicke zusammen. Auch das Ruhepotential kann mit Hilfe der Gleichung (2.6) bestimmt werden. Je höher die Permeabilität einer Ionensorte ist, desto näher wird das Ruhepotential dem Nernstpotential dieser Ionensorte sein, da die Ionenkonzentrationen durch die verschiedenen Permeabilitäten unterschiedlich gewichtet werden. Unter physiologischen Bedingungen hat Kalium die größte Permeabilität aller häufig vorkommenden Ionen und somit den größten Einfluss auf das Ruhepotential mit z.b. E(K) = -98mV für eine Säugetiermuskelzelle (wie aus Tabelle 2.1 ersichtlich). Der Grund für die erhöhte Permeabilität von Kalium liegt in einer Vielzahl an offenen Ionenkanälen, die selektiv Kalium leiten. Je nachdem welche Ionenkanäle in der Zellmembran geöffnet werden, können die Permeabilitäten der verschiedenen Ionen geändert werden. Der Einfluss der veränderten Membranpermeabilität auf das Ruhepotential kann wiederum mit Hilfe der Goldman-Hodkin-Katz-Gleichung (2.6) aktualisiert werden. Ein Beispiel für eine Veränderung des Membranpotentials ist ein durch Na+-Kanal-Öffnung induziertes Aktionspotential in Nervenzellen. 14

15 2.3 Elektrisches Modell einer Zellmembran Zur besseren Verständlichkeit werden die Eigenschaften der untersuchten Zellmembranen gerne durch ein elektrisches Ersatzschaltbild dargestellt. So wird die Potentialdifferenz über der Membran als Spannungsquelle interpretiert. Die Lipiddoppelschicht der Membran kann aufgrund ihrer geringen Leitfähigkeit mit einem Kondensator und der Ionenkanal mit einem variablen, elektrischen Widerstand verglichen werden. Die Kapazität der Lipiddoppelschicht wird dabei durch die Formel (2.7) berechnet und wächst mit der Größe der betrachteten Membranstelle. Sie beträgt in etwa 1µF/cm2. Das sich ergebende Ersatzschaltbild wird also annäherungsweise durch eine Parallelschaltung aus einem Kondensator und variablem Widerstand, entsprechend einem RC-Glied dargestellt (siehe Abbildung 2.2). (Hille,2001) (2.7) Dabei ist die elektrische Feldkonstante des Vakuums, die relative Permittivität des Dielektrikums, A die untersuchte Membranfläche und d die Membrandicke. Abbildung 2.2: RC-Glied als vereinfachtes Ersatzschaltbild der Eigenschaften einer Biomembran. R stellt dabei den Widerstand des Ionenkanals und C die Kapazität der Membran dar. (Hille, 2001) Die elektromotorische Kraft, also die Fähigkeit, die Potentialdifferenz aufrecht zu erhalten, geht vor allem von Natrium-Kalium-Pumpen der Zelle aus. Anders als Ionenkanäle transportieren diese, entgegen des elektrochemischen Gradienten, Natriumionen in den extra- und Kaliumionen in den intrazellulären Raum. Dieser aktive Transport benötigt Energie und hydrolysiert für diesen Zweck ATP. Wird an einem wie in Abbildung 2.2 gezeigten Stromkreis ein künstlicher 15

16 Spannungsimpuls angelegt, so fließt während der Änderung der Spannung ein kapazitiver Strom, der den Kondensator auf- bzw entlädt. Nachdem sich eine konstante Spannung eingestellt hat, fließt der Strom allerdings nur noch über den Widerstand und ist je nach Konformationszustand der Ionenkanäle unterschiedlich. Ein Beispiel einer Rechteckspannung als Impuls und einer Antwort eines RC-Gliedes wird in Abbildung 2.3 gezeigt. Abbildung 2.3: Angelegte Rechteckspannung und Stromantwort eines RCGliedes. (Axon Guide, 2008) 16

17 2.4 Ionenkanäle Ionenkanäle sind in der Zellmembran eingelagerte Proteinkomplexe, mit deren Hilfe Ionen die Zellmembran entlang ihres elektrochemischen Gradienten überwinden können. Sie setzen sich aus mehreren gleichen oder verschiedenen Untereinheiten zusammen. Um fest in der Membran verankert zu sein, müssen Proteinstrukturen, die sich innerhalb der Membran befinden hydrophoben, Strukturen, die sich unteroder oberhalb der Membran befinden, hydrophilen Charakter besitzen. Ein schematischer Aufbau eines nikotinischen Acetylcholinrezeptors kann in Abbildung 2.4 betrachtet werden. Abbildung 2.4: Schematischer Aufbau eines nikotinischen Acetylcholinrezeptors mit symmetrischen Untereinheiten. (Scheffel, 2013) Die Permeabilität wird durch Konformationsänderung der Kanalproteine verändert. Eine Öffnung würde die Permeabilität erhöhen, während ein geschlossener Zustand die Permeabilität der Biomembran senken würde. Grundsätzlich gibt es drei mögliche Stimuli, bei denen sich Kanalproteine öffnen können: elektrische, chemische oder physikalische Reize. Abhängig davon, durch welchen dieser Reize ein Ionenkanal geöffnet werden kann, unterscheidet man spannungsgesteuerte, ligandengesteuerte und mechanosensitive, lichtgesteuerte oder temperaturgesteuerte Ionenkanäle. 17

18 Eine weiteres wichtiges Merkmal zur Klassifikation dieser Proteinkomplexe findet sich in ihrer Selektivität. Je nach Porendurchmesser und Porenstruktur sind manche Ionenkanäle nichtselektiv und unterscheiden nur zwischen Kationen und Anionen, andere wiederum lassen nur eine Art von Ion passieren und gelten als hochselektiv. Die von Ionenkanälen unterstützten Funktionen sind sehr vielseitig. So sind spannungs- und ligandengesteuerte Kanäle z.b. für Leitungsprozesse in und zwischen Nerven essentiell. Bezüglich mechanosensitiven Kanälen, die Thematik dieser Bachelorarbeit sind, sind außerdem die Fähigkeiten des Tastens, des Hörens, der Schmerzempfindung, sowie der Messung und Regelung des Blutdrucks zu erwähnen, die ohne Kanäle, die auf mechanische Reize reagieren, so nicht funktionieren könnten. Andererseits sind Fehler in der Abfolge der Aminosäuresequenz dieser Proteine oder an den mit den Kanälen interagierenden Molekülen für viele Krankheiten verantwortlich, wie beispielsweise der Schmetterlingskrankheit (verursacht starke Schmerzen bei sanfter Berührung) oder bestimmten Formen der Taubheit mpiezo1 Kanal Die Aktivierung des mpiezo1 erfolgt während der Messungen durch das Anlegen eines negativen Drucks (Saugimpulses) im Bereich weniger mmhg. Das Piezo1 Gen (auch Fam38A) wurde zunächst in der Publikation Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels (Coste, 2010) als für die mechanische Aktivierung von Kationenkanälen wichtiger Genabschnitt identifiziert. In diesem Paper wurde durch RNA-Interferenz und Überexpression des Piezo1 Proteins eine eindeutige Abhängigkeit dieses Proteins mit mechanisch aktivierbaren (MA) Strömen festgestellt. Bereits gut ein Jahre später in Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels (Coste, 2012) konnte die Aussage bekräftigt werden, dass Piezo1 selbst ein Ionenkanal sei. Dies geschah unter anderem durch 18

19 aufgereinigte mpiezo1-proteine, die ohne weitere Proteinstrukturen Eigenschaften eines eigenständigen nichtselektiven Kationenkanals zeigten. Eine kleine Zusammenfassung dieser Thematik schrieb Bernd Nilius in Pressing and squeezing with Piezos (2012). Eine große, ungeklärte Fragestellung bleibt aber der genaue Gating-Mechanismus der Piezos. In Abbildung 2.5 sind mehrere, denkbare Möglichkeiten zur Öffnung des Kanals bzw. seine mögliche Strukturen zu sehen. Abbildung 2.5: Mögliche Piezo-Strukturen bzw. Aktivierungsmodelle. (A) Topologisches Modell, welches 30 Transmembran Bereiche enthält. (B) Mechanosensitiver Öffnungsmechanismus durch eine mechanische Spannung der Membran. (C) Öffnungsmechanismus durch eine Krümmung der Membran. (D) Öffnungsmechanismus durch Kraftinteraktion mit anderen zellulären Strukturen, wie z.b. dem Zytoskelett. (E) Der Piezo1 könnte auch nur eine Untereinheit des gesamten Ionenkanalkomplexes sein. (Nilius, 2013) 19

20 2.4.2 VSOR-Chloridkanal Der VSOR (volume-sensitive outwardly rectifying) Chloridkanal wird durch osmotisches Schwellen aktiviert. Dazu muss die Osmolarität der intrazellulären Lösung relativ zur extrazellulären größer sein. Ravshan Sabirov schlug dabei 2012 zwei Möglichkeiten vor: Entweder kann die Osmolarität der externen Lösung durch Reduktion der NaCl-Konzentration gesenkt werden oder die Osmolarität der internen Lösung, z.b. durch Zugabe von Mannitol, im Vergleich zur externen Lösung erhöht werden. Der VSOR-Chloridkanal ist ein selektiver Kanal, der Cl-, je nach Gradient und angelegter Spannung in beide Richtungen leiten kann. Neben Chlorid werden weitere physiologisch weniger bedeutsame Anionensorten unterschiedlich gut transportiert: SCN- > I- > Br- > Cl- > F- > Gluconat-. Als mögliche Blocker kommen vor allem SITS, NPPB, DPC und Arachidonsäure, eine vierfach ungesättigte Fettsäure, zum Einsatz. (Okada, 1991) Erst 2011 fand Okada und Sabirov heraus, dass der VSOR-Chloridkanal neben weiteren wichtigen Anion-Kanälen bei der Volumenregulation von Thymocyten, sowie deren Proliferation und Apoptosis eine wichtige Rolle spielt. Demnach kann der Kanal bei Krankheiten wie thymus atrophy oder thymocyte depletion das Ziel von Immunmodulatoren sein. 20

21 2.5 Patch-Clamp-Technik 1976 stellten Erwin Neher und Bert Sakmann erstmals die Patch-Clamp-Technik vor. Ziel war und ist die Messung von Strömen, die durch Ionenkanäle fließen und nur wenige pa klein sein können. Nachdem die Bedeutung der Patch-Clamp-Technik für die Forschung an Ionenkanälen erkannt wurde, wurde den Erfindern 1991 der Nobelpreis verliehen Prinzip Die Idee, die hinter der Patch-Clamp-Technik steckt, ist unter Zuhilfenahme der Abbildung 2.6 schnell erklärt. Abbildung 2.6: Schematischer Aufbau eines klassischen Patch-Clamp Experiments. (Wikipedia, 2013) Zunächst wird eine mit einer Elektrolytlösung gefüllte Glaspipette an eine einzelne Zelle herangeführt. Diese Zelle muss den zu untersuchenden Ionenkanal ausreichend exprimieren. Durch das Anlegen eines Unterdrucks innerhalb der Pipette und einer negativen Spannung wird ein Teil der Zellmembran an die Pipettenspitze gesaugt. Befindet sich innerhalb der Pipettenlösung und in der extrazellulären Lösung jeweils eine Elektrode, können Ströme zwischen diesem Elektrodenpaar gemessen werden. Wenn die Verbindung zwischen dem Rand der Pipettenspitze und des angesaugten Membranflecks (engl. patch) dicht genug ist fließt der Hauptteil des gemessenen Stroms durch die Ionenkanäle im Membranfleck. Eine sehr gute Verbindung wird auch als Gigaseal bezeichnet, in Anlehnung an 21

22 einen großen elektrische Widerstand (> 1GOhm), den der Strom überwinden muss, um zwischen Rand der Pipette und der Zellmembran hindurch zu fließen. Ist dieser Widerstand zu niedrig, fließt sogenannter Leak-Strom an der Zelle vorbei und verfälscht das Messergebnis. Ein hoher Sealwiderstand R seal ist also eine Grundvoraussetzung für eine vertrauenswürdige Messung. Ausgehend von der beschriebenen Konfiguration, die auch als On-cell- oder Cellattached-mode bekannt ist, können noch drei weitere Konfigurationen entstehen (siehe Abbildung 2.7). Für die Messungen dieser Arbeit ist vor allem der Whole-cellmode von Bedeutung. Dabei wird durch mehrere, größer werdende negative Druckimpulse der Membranfleck zum Aufbrechen gebracht, so dass die Pipettenlösung (interne Lösung) die intrazelluläre Lösung praktisch komplett austauscht. Der so gemessene Strom fließt, anders als bei den übrigen Konfigurationen, durch die Ionenkanäle der gesamten Zelle und ist entsprechend größer. Abbildung 2.7: Vier verschiedene Patch-ClampKonfigurationen, die je nach Vorgehensweise aus der On-cell-Konfiguration entstehen können. (Hille, 2001) Bei den Elektroden handelt es sich um chloridierte Silberdrähte (Ag / AgClElektroden). Durch sie kann man neben dem Messen eines Ionenstroms auch eine künstliche Spannung über der Membran anlegen. 22

23 2.5.2 Planare Konfiguration Im Rahmen dieser Arbeit wurden sämtliche Messung mit einer Weiterentwicklung der klassischen Patch-Clamp-Technik durchgeführt. Es handelt sich dabei um die chipbasierte oder auch planare Konfiguration. Anders als die klassische Methode verzichtet dieser Ansatz auf ein Mikroskop, einen Mikromanipulator zur Pipettenpositionierung, einen schwingungsgedämpften Tisch und einen alles umschließenden Faraday-Käfig, um störende Einflüsse von außerhalb auszuschließen. Wie in Abbildung 2.8 gezeigt, wird bei der planaren Variante die klassische Glaspipette durch einen Glaschip ersetzt, unter welchem sich, in der internen Lösung, eine der Elektroden befindet. Der Chip besitzt eine runde Öffnung, deren Durchmesser ca. 1 Mikrometer zählt. Abbildung 2.8: Schematischer Aufbau einer planaren Patch-Clamp-Konfiguration. (Wikipedia, 2013) Die Pipette muss also nicht mehr unter Beobachtung an eine ausgewählte Zelle herangefahren werden, sondern es wird eine Zelle, der auf den Chip aufgetragenen Zellsuspension, durch Anlegen eines Unterdrucks in mehreren Stufen an das Loch im Chip angepresst. Aus gegebenen Gründen kann in der planaren Konfiguration nur im On-cell- oder Whole-cell-mode gemessen werden. In Abbildung 2.9 sind alle wichtigen Kapazitäten und Widerstände der planaren Whole-cell-Konfiguration in einem Elektronischen Ersatzschaltbild zusammengefasst. 23

24 Abbildung 2.9: Ersatzschaltbild einer Zelle im Whole-cell-mode und einer planaren Patch-Clamp-Konfiguration. Neben dem bekannten Membranwiderstand (Rmem) und der Membrankapazität (C slow) ist vor allem der serielle Widerstand oder Zugangswiderstand (Rseries) wichtig der möglichst klein sein sollte. Auch die Kapazität, die vom Chip selbst ausgeht (C f ast) und der Seal Widerstand (Rseal), der, wie beschrieben, über die Qualität der Verbindung zwischen Zelle und Chiprand Auskunft gibt, sind eingezeichnet. (Barthmes, Diplomarbeit 2010) Als Mindestvoraussetzungen für gute Messungen sollte stets gelten: Rseal > Rmem >> Rserial 24

25 3. Material und Methoden Unter Material und Methoden werden alle zur erfolgreichen Darstellung von Ergebnissen benötigten Hilfsmittel aufgezählt. 3.1 Material Das beschriebene Material umfasst, neben den eigentlichen Messgerätschaften, auch deren Software und zum Erhalt der Zellen benötigte Verbrauchsgegenstände, sowie die Zellen selbst Zelllinien Die HEK-Zelllinie (genauer HEK 293) findet in verschiedensten Bereichen der Forschung Anwendung. HEK steht dabei für Human Embryonic Kidney, also eine menschliche Nierenzelle. Sie ist ein Transformationsprodukt einer klassischen HEKZelle und eines Adenovirus 5. Sie ist recht einfach zu handhaben und wächst adhärent meist über mehrere Wochen, ohne dabei großen qualitativen Schwankungen zu unterliegen. Die in dieser Arbeit benutzten HEK-Zellen des Patapoutian Labs wiesen eine Resistenz gegen das Antibiotikum Puromycin auf und überexprimierten den mpiezo1-ionenkanal. HeLa-Zellen sind sehr breit eingesetzte Epithelzellen eines Gebärmutterhalskrebses. Sie sind die ersten menschlichen Zellen, die als permanente Zelllinie etabliert wurden. Ihr Name stammt von der ehemaligen Patientin Henrietta Lacks, aus der diese Zellen isoliert wurden. Die hier verwendeten HeLa-Zellen überexprimieren kein untersuchtes Protein und besitzen den VSOR-Chloridkanal natürlicherweise. Sie stammen von der Firma Bayer. 25

26 3.1.2 Zellkultur Die Rezepturen der Medien, in denen die jeweilige Zelllinie im Brutschrank wachsen kann, wurden von den Herstellern mitgeliefert. Tabelle 3.1 gibt Auskunft über die einzelnen Bestandteile und den jeweils zugeführten Mengen. Medium für HEK-mPiezo1 Medium für HeLa-Zellen Grundmedium 500ml DNEM 500ml DNEM Nährzusatz 50ml FBS 50ml FBS Antibiotika 5 ml Penicillin/Streptomycin (x100), 1µg/ml Puromycin 5 ml Penicillin/Streptomycin (x100) Tabelle 3.1: Übersicht der in den Medien enthaltenen Bestandteile und deren Menge. 26

27 Weitere verwendete Materialen, wie Messgeräte, Einwegartikel und Chemikalien sind in Tabelle 3.2 aufgelistet. Artikel/ Gerät Bezugsquelle Sterilbank Thermo Scientific, Bonn, D Inkubator Heraeus Thermo Scientific, Bonn, D Kulturschalen TPP, Trasadingen, CH 15ml Tube SPL, Gyeonggi-do, Korea Latexhandschuhe Meditrade, Kiefersfelden, D PipetteBoy Integra, Fernwald, d ZentrifugeHermle Z 230 A MK II Hermle Labortechnik, Wehingen, D Pipettenspitzen Josef Peske ohg, Karlsruhe, D Sterilfilter TPP, Trasadingen, CH Salzsäure Carl Roth, Karlsruhe, D Natronlauge Carl Roth, Karlsruhe, D ph-meter Sartorius, Göttingen, D Osmometer Thermo Scientific, Bonn, D Arachidonsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D Medienbestandteile PAA, Cölbe, D PBS PAA, Cölbe, D Trypsin PAA, Cölbe, D EDTA Carl Roth, Karlsruhe, D Tabelle 3.2: Übersicht aller verwendeten Artikel in der Zellkultur und ihren Bezugsquellen. 27

28 3.1.3 Elektrophysiologische Messungen Sämtliche als intern und extern verwendeten Lösungen sowie Konzentrationen verwendeter Wirkstoffe können der Tabelle 3.3 entnommen werden. Lösung Zusammensetzung / Konzentration externe Standardlösung 10mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM Glukose, 4mM KCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2 externe, hypertone Standardlösung (nur für mpiezo1-ionenkanal) 10mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM Glukose, 4mM KCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, 100mM bzw. 50mM NMDG externe, hypotone Standardlösung 10mM HEPES, 105mM bzw. 70mM NaCl, 5mM Glukose, 4mM KCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2 externe, hypotone, chloridfreie S.lösung 10mM HEPES, 70mM NaHO3, 5mM Glukose, 2mM CaMSA interne Kalium-Standardlösung 20mM EGTA, 10mM HEPES, 50mM KCl, 10mM NaCl, 60mM KF interne Cäsium-Standardlösung 20mM EGTA, 10mM HEPES, 50mM CsCl, 10mM NaCl, 60mM CsF interne hypertone Cäsium-S.lösung (nur für mpiezo1-ionenkanal) 20mM EGTA, 10mM HEPES, 50mM CsCl, 10mM NaCl, 60mM CsF, 100mM NMDG Sealenhancer 10mM HEPES, 80mM NaCl, 35mM CaCl2, 10mM MgCl2, 3mM KCl Arachidonsäurelösung 60µM in externer, hypotoner S.lösung FBS-Lösung 2mg/ml FBS in ext., hypotoner S.lösung Tabelle 3.3: Übersicht der verwendeten Lösungen. 28

29 Die zur Messung benötigten Apparaturen sind in Tabelle 3.4 aufgelistet. Gerät Hersteller Port-a-Patch Nanion Technologies GmbH, München, D Patch-Clamp-Verstärker EPC10 HEKA Elektronik, Lambrecht/ Pfalz, D PC Proline, Chicago, USA Zentrifuge Hermle Z 230 A MK II Hermle Labortechnik, Wehingen, D Lichtmikroskop (40fach Objektiv) TILL Photonics, Gräfelfing, D Tabelle 3.4: Auflistung der Messgeräte Software Die benutzte Software wurde teilweise von Nanion selbst zur Verfügung gestellt. Diese Software wurde zur Steuerung der elektrophysiologischen Geräte von HEKA und Nanion genutzt. Eine Auflistung aller verwendeten Programme findet sich in Tabelle 3.5. Software Hersteller PatchControl Nanion Technologies GmbH, München, D FitMaster HEKA Elektronik, Lambrecht/ Pfalz, D PatchMaster (Verstärkersoftware) HEKA Elektronik, Lambrecht/ Pfalz, D Igor Pro WaveMetrics, Portland, USA OpenOffice Open Source Programm Tabelle 3.5: Übersicht der zur Messung und Auswertung benutzten Software. 3.2 Methoden Das Unterkapitel Methoden beinhaltet neben den praktisch anzuwendenden Verfahren in der Zellkultur und den elektrophysiologischen Messungen auch statistische Methoden zur Ergebnisauswertung. 29

30 3.2.1 Zellbiologische Methoden Alle hier beschriebenen Tätigkeiten wurden in der Zellkultur durchgeführt. Die Zelllinien selbst werden in Brutschränken bzw. Inkubatoren aufbewahrt, in denen strikte Bedingungen eingehalten und überprüft werden müssen. Dazu zählen neben einer Temperatur von 37 C und einem CO2-Gehalt von 5% auch eine relative Luftfeuchtigkeit von 90%. Außer den elektrophysiologischen Messungen selbst wurden alle Arbeiten mit Zellen unter einer Sterilbank durchgeführt. Das Passagieren der Zellen gehört zu den wichtigsten dieser Tätigkeiten. Zweck des alle zwei bis drei Tage durchgeführten Passagierens oder Umsetzens war eine für elektrophysiologische Messungen optimal vorbereitete Zelllinie. Wird in einem zu dünnen oder zu dichten Verhältnis umgesetzt, ist ein suboptimales Wachstum die Folge. Im schlimmsten Fall können Zellen auch für die Messung essentielle Ionenkanäle verlieren oder absterben. Der Passagiervorgang läuft immer recht ähnlich ab. Zunächst wird eine Kulturschale mit der passenden Zelldichte (etwa 80%) mit Hilfe eines Lichtmikroskop ausgewählt. Anschließend muss das alte Medium verworfen werden und die verbliebenen, adhärenten Zellen werden mit PBS gewaschen. Eine dreiminütige Einwirkzeit von Trypsin oder PBS-EDTA löst schließlich die Zellen von der Kulturschale. Da Trypsin Proteine an spezifischen Stellen spalten kann, muss dieses direkt nach der Einwirkzeit durch einen Zentrifugiervorgang (2,5 Minuten bei 1500 U/min) entfernt werden. Danach wird das Zellpellet oder die Zellsuspension mit nicht trypsinhaltigem Ablösemittel in mit 10ml frischem Medium gefüllten Schalen aufgeteilt. Je nach gewünschter Dichte und geplanten Messtagen wird das Mengen- und Verteilungsverhältnis entsprechend variiert. Für die Messungen müssen die jeweiligen Zellen geerntet werden. Dazu wird wie zunächst wie beim Passagieren verfahren. Das Zellpellet bzw. die Zellsuspension 30

31 wird aber nicht auf neue Schalen aufgeteilt, sondern abhängig von der Zelldichte in ca. 1ml externer Lösung gelöst / gegeben und für die Messung bereitgestellt Elektrophysiologische Methoden Alle in dieser Bachelorarbeit gezeigten Messungen wurden mit Hilfe der planaren Patch-Clamp-Technik durchgeführt. Dafür wurde das Port-a-Patch von Nanion verwendet, dessen Aufbau samt benötigter Apparatur in Abbildung 3.1 zu sehen ist. Abbildung 3.1: Messaufbau mit PC, Verstärker und Port-a-Patch mit dazugehöriger SuctionControl. (Nanion Port-a-Patch Product Sheet, 2012) Bevor mit den eigentlichen Messungen begonnen werden kann, bedarf es einiger Vorbereitung. Ist die planare Konfiguration wie in Abbildung 3.1 aufgebaut, müssen der PC und die Verstärkereinheit eingeschaltet werden. Danach werden die Programme PatchControl und PatchMaster gestartet; es sind die Protokolle zur Erlangung des gewünschten Sealwiderstandes und für den eigentlichen Messvorgang einmalig zu erstellen, alle weiteren male nur noch aufzurufen. 31

32 Alle wichtigen Ergebnisse dieser Arbeit wurden in der Whole-cell-Konfiguration erreicht. Tabelle 3.5 stellt den Verlauf bis zum Erreichen dieser Konfiguration mit dazugehörigem elektrischem Ersatzschaltbild dar. Tabelle 3.6: Verlauf des Strombildes bei einer vorgegebenen Rechteckspannung und dazugehörige Zahlenwerte bis zur Erreichung eines Gigaseals in der Whole-cell Konfiguration. Ionenkanäle werden in dieser Phase als geschlossen angenommen. (Stoelzle, 2006) 32

33 Je nachdem, welche Lochgröße im Chip bevorzugt wird, sind die für den Port-aPatch verwendeten Einwegchips in unterschiedlichen Widerständen erhältlich. Hier wurden fast ausschließlich Chips mit einem Widerstand von 2 bis 3,5MOhm verwendet. Zunächst wird die Unterseite mit einem Tropfen der vorbereiteten internen, die Oberseite des Chips mit einem Tropfen der externen Lösung benetzt (siehe Abbildung 3.2). Dabei ist darauf zu achten, die Tropfen möglichst mittig über dem Loch zu platzieren. Die genaue Menge der Elektrolytlösungen kann variieren und sollte zwischen 10µl und 20µl liegen. Abbildung 3.2: Chip für den Port-a-Patch, auf den ein Tropfen externer Lösung plaziert wurde. Der benetzte Chip wird nun auf den Port-a-Patch aufgeschraubt und der Aufsatz, der als Faraday-Käfig dient, auf den Chip umschließend aufgesteckt. Jetzt kann das Sealprotokoll durchlaufen oder manuell Druck und Spannung angelegt werden und nach Erreichen des letzten Schrittes von Tabelle 3.6 mit dem Messen begonnen werden. Für die Messungen an VSOR-Chloridkanälen wurde dazu ein Messprotokoll, wie es in Abbildung 3.3 zu sehen ist, gestartet. 33

34 Abbildung 3.3: Messprotokoll, das für die Messungen an VSOR-Chloridkanälen verwendet wurde. Es generiert alle 5 Sekunden eine neue Spannungsrampe. 34

35 3.2.3 Methoden zur Ergebnisauswertung Alle im Kapitel Ergebnisse aufgeführten Zahlenwerte wurden aus jeweils mehreren Messungen gewonnen. Dabei wurde insbesondere auf möglichst gleiche Bedingungen während der Messungen zu einem Experiment geachtet. Diese Bedingungen beinhalteten neben einer konstant guten Zellqualität auch den immer gleichen Messaufbau ohne Protokolländerungen. Nach ausreichend vielen Einzelmessungen wurde mit Hilfe des arithmetische Mittels (3.1) das Endergebnis dargestellt. Zu jedem dieser Endergebnisse wurde die Standardabweichungen der Grundgesamtheit mit der Gleichung 3.2 geschätzt und die Anzahl der Messungen mit n = 'Anzahl der Einzelmessungen' vermerkt. (3.1) (3.2) 35

36 4. Ergebnisse 4.1 Untersuchungen des mpiezo1-kanals in HEK-Zellen Der mpiezo1-ionenkanal wurde in diese HEK-Zellen gentechnisch eingebunden. So überexprimieren diese Zellen den Kanal und können unter Druckbelastung einen mit Patch-Clamp-Methoden sichtbaren Strom über die Membran fließen lassen Messergebnisse Untersucht wurden in diesem Kapitel mit mpiezo1-kanälen stabil transfizierte HEKZellen. Die Idee war die Messung einer Stromantwort aufgrund der Öffnung des Kanals durch einen mechanischen Stimulus. Dieser Stimulus bestand aus einem negativen Druck, der im On-cell-mode und im Whole-cell-mode in Form eines Rechteckimpulses angelegt wurde (siehe Abbildung 4.1). Zusätzlich wurde durch die beiden Elektroden des Port-a-Patch's eine künstliche Spannung von -70mV angelegt. Dadurch sollte ein Strom messbarer Größe folgen. Tatsächlich aber waren alle Versuche einen passenden Strom zu messen nicht erfolgreich. So sind anschließende Kapitel lediglich eine Auflistung verschiedener Anstrengungen, sinnvolle Messergebnisse zu erhalten. 36

37 Abbildung 4.1: Ein Messprotokoll, das für die Messung von mpiezo1-kanälen verwendet wurde. Es generiert alle 20 Sekunden einen neuen, rechteckigen Druckimpuls. 37

38 4.1.2 Veränderung der Osmolaritäten zur Ergebnisverbesserung Eine Veränderung der Osmolaritäten interner und externer Lösungen kann laut A. Dubin einen verstärkenden Effekt auf die Aktivierung der mpiezo1-kanäle hervorrufen. Wichtig dabei ist, für eine Osmolarität zu sorgen, die außerhalb der Zelle kleiner ist als innerhalb. So wurde die interne Standardlösung zusätzlich mit 100mM NMDG versetzt, um eine im Vergleich niedrigere Osmolarität der externen Lösung zu erhalten. Leider gestaltete sich ein Wechsel der internen Lösung während eines laufenden Protokolls schwierig. Deshalb wurde zusätzlich zur internen eine externe Standardlösung mit 100mM NMDG versetzt. Deren Osmolarität konnte nach Erreichen der Whole-cell-Konfiguration wiederum durch einen mehrstufigen Austauschprozess weniger hypertoner externen Lösungen gesenkt werden. Dadurch wird die Zelle bis zum Beginn der Messung keinen großen osmotischen Schwankungen ausgesetzt. Die Reihenfolge der Austauschvorgänge, deren Osmolarität und Bedeutung sind Tabelle 4.1 zu entnehmen. Lösung Osmolarität in mosm intern (+100mM NMDG) 460 extern 295 Bedeutung für den osmotischen Effekt verantwortlich für physiologische Bedingungen intern und extern osmotisch extern (+100mM NMDG) 442 ähnliche Bedingungen (direkt nach Whole-cell-Konfiguration) z.b. extern (+50mM NMDG) 369 Erhöhung des Osmolaritätunterschiedes... Tabelle 4.1: Verschiedene Austauschvorgänge von Lösungen, um die Öffnung der mpiezo1-ionenkanäle zu stimulieren. 38

39 4.1.3 Protokolländerungen zur Ergebnisverbesserung Der Rundown, eine Art Desensibilisierung der Piezo-Kanäle, der von Coste und Sachs beschrieben wird, tritt bei zu großen und zu lang anhaltenden Druckunterschieden, die über der Membran angelegt werden, auf. Anschließend befinden sich die Kanäle in einem permanent inaktiven Zustand und sind für die jeweiligen Ionensorten kaum noch leitend. Um diesem Rundown vorzubeugen, wurden verschiedene Änderungen am Druckprotokoll, das die mechanischen Stimuli vorgibt und vor allem an den zum Sealen der Zellen benutzten Protokollen vorgenommen. Folgend werden mehrere Bedingungen aufgezeigt, die in den entsprechenden Protokollen umgesetzt wurden. Wurde im Cell-attached mode gemessen, musste bis zum Erreichen des gewünschten Seal-Widerstandes ein Druck von <4mbar angelegt werden. So konnte ein Rundown aufgrund des Sealvorgangs eher ausgeschlossen werden. Die Schwierigkeit bestand dabei darin, bei derart kleinen Drücken einen für Einzelkanalmessungen ausreichenden Seal-Widerstand zu erzeugen. Wurde hingegen im Whole-cell-mode gemessen, war zumindest bis zum Aufreißen der Zellmembran die Größe des angelegte Drucks irrelevant. Dort nämlich, wo der angelegte Druck die Kanäle permanent inaktivieren könnte, wird die Membran für das Erreichen der Whole-cell-Konfiguration in jedem Fall aufgerissen. Zudem fallen diese wenigen, nicht mehr funktionierenden Kanäle im Vergleich zu den restlichen über die Membran verteilten Kanäle kaum ins Gewicht. Nach Erreichen der jeweiligen Konfiguration wurden die mechanischen Stimuli in Dauer, Größe und Form variiert. So wurden von einfachen Rechteckimpulsen, deren Größe sich alle 30s von anfänglich -40mbar um jeweils 20mbar auf bis +40mbar erhöhte, über Rampenimpulsen, die alle 5s von positive in negative Druckbereiche wechselten, bis hin zu alternierenden Druckschwankungen viele mögliche Protokolle verwendet. Leider konnte durch keiner dieser Änderungen ein Messerfolg erzielt werden. 39

40 4.1.4 Verschiedene Erntemethoden zur Ergebnisverbesserung Wie bereits beschrieben, können mpiezo1-kanäle durch entsprechende mechanische Stimuli bereits vor der Messung permanent inaktiviert werden. Ein weiterer möglicher Ansatzpunkt, diese Inaktivierung eventuell zu vermeiden, liegt in der Variation des Ernteverfahrens. Möglicherweise tritt bereits während dieses Vorgangs die Inaktivierung ein. In den meisten Papern (wie B. Coste 2010, B. Coste 2012, A. Dubin 2012), die sich diversen Fragestellungen des Piezo-Kanals annehmen, wurde mit einem konventionellen Patch-Clamp-Aufbau gemessen. Es fallen also auch mögliche Probleme einer Desensibilisierung der Kanäle während des Ernteverfahrens weg, da die konventionelle Patch-Clamp-Technik auf das Ernten der Zellen komplett verzichtet. Eine Veränderung, den Vorgang für spätere Messungen zu optimieren, lag im Verzicht auf das oft bei adhärenten Zellen verwendete Ablösemittel Trypsin. Laut A. Dubin konnte bei Messungen mit Trypsin kein passender Strom ausgemacht werden, so dass eine Alternative nötig war. Das schwächer wirkende Ablösemittel PBS-EDTA, selten auch Trypsin LE, wurde ab hier statt Trypsin verwendet. Durch die Verwendung von PBS-EDTA blieb jedoch der Großteil der adhärenten Zellen auf der Schalenoberfläche zurück. Nur durch mechanisches Einwirken mittels Pipette konnten genügend Zellen von der Platte gelöst werden. Eine Inaktivierung der Kanäle wäre wiederum eine vorstellbare Folge. Eine weitere Variation bestand im Verzicht auf den Zentrifugiervorgangs. Dabei wurden zunächst, nach Entfernung des Mediums, die verbliebenen adhärenten Zellen mit 2ml PBS-EDTA und 4minütiger Einwirkzeit so schonend wie möglich von der Schalenoberfläche gelöst. Da PBS-EDTA, nicht wie Trypsin, Proteine an bestimmten Stellen spalten und damit unbrauchbar machen kann, war ein Herauszentrifugieren der Substanz auch nicht zwingend erforderlich. 40

41 4.1.5 Änderung der Passagiermethode zur Ergebnisverbesserung Um mögliche Störung des Trypsins zu vermeiden wurde nicht nur die Erntemethode, sondern auch alle weiteren Passagiermethoden entsprechend angepasst. Der Verzicht des Trypsins beim Umsetzvorgang gab mehr Sicherheit, dass die Proteinkomplexe nach dem Passagieren noch intakt waren. Eine weitere Veränderung der standardisierten Passagiermethode war ein dünnes Verteilungsverhältnis von Zellen der Vorgängerkulturplatte auf Platten, mit denen in den kommenden Tagen Messungen durchgeführt werden sollten. Dadurch waren die Zellen bereits auf den Kulturplatten gut vereinzelt und beim Erntevorgang weniger mechanischer Belastung ausgesetzt. Unglücklicherweise wuchsen die HEK-Zellen dadurch auch sehr schlecht und anschließende Messungen blieben ebenfalls ohne Erfolg. 41

42 4.1.6 Diskussion Keine der beschriebenen Maßnahmen konnte sinnvolle Ergebnisse liefern. Es können aber mehrere Punkte aufgezählt werden, woran gute Messungen vermutlich scheiterten: Durch das klassische Ernteverfahren sind die HEK-Zellen starken mechanischen Belastungen ausgesetzt. Obwohl Zentrifugiervorgänge minimiert wurden, mussten Mindestbelastungen angewendet werden, um die Zellen für die bevorstehenden Messungen ausreichend zu vereinzeln. Bereits hier könnte eine permanente Inaktivierung der Kanäle das Aus jeder weiteren Messung sein. Weiter könnten Rundowneffekte während des Sealprozesses auftreten. Der von B. Coste vorgeschlagene Druck, der bis zum Beginn der On-cell Messungen angelegt werden sollte, müsste kleiner als 4mbar sein. Die von Nanion entwickelte suction control kann jedoch nicht unter 5mbar Druck anlegen. Somit sind die Voraussetzungen für On-cell Messungen suboptimal. Messungen die im Whole-cell-mode durchgeführt werden sollen, unterliegen keinen Rundowneffekten. Sie wurden aber in den beschriebenen Papern, anders als das Port-a-Patch von Nanion es zulässt, nicht durch Saugimpulse, sondern durch mechanische Stimulation mit einer zweiten Pipette durchgeführt. Durch technische Maßnahmen könnte eine ähnliche Situation für Messungen mit Geräten von Nanion herbeigeführt werden. Für zukünftige Messungen an mpiezo1-kanälen empfehle ich sowohl eine komplette Überarbeitung der Erntemethode als auch die Kombination dieser Erntemethode zunächst mit einem klassischen Patch-Clamp-Aufbau. So lässt sich schneller der Grund der bisherigen Messfehlschläge ermitteln und es können weitere Ideen in die Geräteentwicklung einfließen. 42

43 4.2 Untersuchungen des VSOR-Chloridkanals in HeLa-Zellen Der VSOR-Chloridkanal kommt in HeLa-Zellen vor. Er ist dort nicht überexprimiert und reguliert u.a. das Anschwellen der Zellkörper unter osmotischem Druck Charakterisierung der Stromantwort in isotoner Lösung Um alle Messergebnisse der durchgeführten Versuche vergleichbar zu halten, musste zuerst ein passender Input gewählt werden, der die Stromantwort von HeLaZellen in verschiedenen Spannungsbereichen aufzeigt. Bewährt hat sich hier der Spannungsimpuls als Rampenfunktion (Abbildung 4.2), mit -100mV und +100mV als Spitzenwerte und einer Rampendauer von 200ms. Während des Sealens der Zelle wurde eine Spannung von -70mV angelegt, um den Vorgang zu beschleunigen. Deshalb wurde die Spannung vor und nach der Rampe ebenfalls bei -70mV, selten auch bei 0mV gehalten. 150 mv ms Abbildung 4.2: Spannungsimpuls in Form einer Rampe. Die über die Zeit aufgetragene Stromantwort von HeLa-Zellen auf die in Abbildung 4.2 dargestellte Spannungsrampe ist in Abbildung 4.3 dargestellt. Es handelt sich dabei, wie bei allen folgenden Ergebnissen, um Messungen in der Whole-cellKonfiguration. 43

44 Abbildung 4.3: Standardstromantwort von HeLa-Zellen auf eine Spannungsrampe. Vor und nach der Rampe lagen 0mV an. Der in Abbildung 4.3 gezeigte Strom setzt sich aus dem Fluss verschiedener Ionensorten der internen bzw. externen Lösung zusammen. Ein Austausch des gesamten in der internen Lösung enthaltenen Kaliumchlorids durch Cäsiumchlorid, bot die Möglichkeit den Anteil des internen Kaliums an der Gesamtstromantwort zu ermitteln (siehe Abbildung 4.4). Grund dafür ist eine sehr viel kleinere Permeabilität der zellulären Membran gegenüber Cäsium. Abbildung 4.4: Vergleich von kaliumhaltiger und kaliumfreier internen Lösung. 44

45 Da Kalium nur in der internen Lösung ausgetauscht wurde, war vor allem eine signifikante Hemmung des Kaliumausstroms zu erwarten. Nach Konvention ist eine Hemmung des Kaliumausstroms einer Verkleinerung des positiven Stroms zuzuordnen. Bei der maximal angelegten Spannung von +100mV betrug diese Verkleinerung 30±12% (n = 4) des Stroms, der mit KCl-haltiger interner Lösung erreicht wurde. Ebenfalls zu sehen ist eine Verschiebung des Umkehrpotentials ins Positive. Zu erklären ist dieser Effekt, da ohne den Einfluss von permeabelerem, ausströmendem Kalium eine nicht mehr so kleine Spannung benötigt wird, um den Nettostrom zu nullieren. Um die Veränderung des Umkehrpotentials zu bestimmen, musste zuerst die zeitliche Verschiebung der Ströme abgelesen werden (siehe Abbildung 4.4). Anschließend konnte über die Steigung dv/dt der Spannungsrampe auf die veränderte Spannung geschlossen werden. Die gemittelte Verschiebung betrug +19±12mV (n = 4). Der Austausch wurde dabei in verschiedenen Versuchen von KCl auf CsCl und von CsCl auf KCl durchgeführt. Damit wurden Effekte ausgeschlossen, die bei jedem Austausch interner Lösung durch eine andere interne Lösung auftreten können und das Ergebnis verfälschen könnten. Da in folgenden Versuchen vor allem der durch VSOR-Kanäle fließende Chloridstrom von Interesse war, wurde als interne Lösung stets CsCl statt KCl verwendet. Dadurch konnte die Messung verfälschender Ströme von Seiten des Kaliums ausgeschlossen werden Untersuchung des Stromanstiegs Die Thematik dieses Teils meiner Arbeit befasste sich mit der Abhängigkeit des Stroms von einem mechanischen Stimulus, der volumensensitive Kanäle aktivieren konnte. Für die Untersuchung des VSOR-Chloridkanals schlug Ravshan Sabirov eine Änderung der osmotischen Verhältnisse zwischen interner und externer Lösung 45