Bildatlas Genexpression

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1 Bildatlas Genexpression von Fritz Höffeler 1. Auflage Bildatlas Genexpression Höffeler schnell und portofrei erhältlich bei beck-shop.de DIE FACHBUCHHANDLUNG Thematische Gliederung: Vorklinische Medizin: Grundlagenfächer Harri Deutsch 2011 Verlag C.H. Beck im Internet: ISBN

2 Fritz Höffeler Verlag Harri Deutsch

3 Bildnachweis Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen auf den Seiten 30, 32, 34, 36, 37, 168, 180 und 183 stammen von Herrn Prof. Dr. Gerhard Wanner, Botanisches Institut der Ludwig-Maximilians-Universität München. Von eye of science wurden die kolorierten EM-Aufnahmen der Drosophila-Mutanten auf Seite 148 gemacht. Für die Photos der Viren auf den Seiten 152 und 153 danke ich Herrn Dr. Hans Gelderblom, Robert Koch-Institut, Berlin. Die rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen auf Seite 33 und 153 erstellten Herr Prof. Dr. Hans Oberleithner und seine Mitarbeiter, Westfälische Wilhelms-Universität Münster. Die Polytänchromosomen auf Seite 168 photographierte Herr Dr. Christian Laforsch, Department Biologie II, Ludwig-Maximilians-Universität München. Alle Illustrationen und Graphiken wurden angefertigt durch Art For Science, Hamburg. Autor Fritz Höffeler, Jahrgang 1964, hat in Münster und Bielefeld Biologie studiert und war für mehrere Jahre im Zentralbereich F & E im Labor für Biotechnologie der Lurgi AG in Frankfurt am Main angestellt. Einige Jahre später studierte er zusätzlich in Hamburg Erziehungswissenschaft mit dem Schwerpunkt Didaktik gründete er Art For Science, ein Atelier für wissenschaftliche Illustrationen, und arbeitet seitdem als Illustrator und Wissenschaftsvermittler. Der Autor ist erreichbar unter: Fritz.Hoeffeler@Art4Science.de Die Webseite zum Buch Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. ISBN Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Alle Rechte, auch die der Übersetzung, des Nachdrucks und der Vervielfältigung des Buches oder von Teilen daraus sind vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form (Fotokopie, Mikrofilm oder ein anderes Verfahren), auch nicht für Zwecke der Unterrichtsgestaltung, reproduziert oder unter Verwendung elektronischer Systeme verarbeitet werden. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Der Inhalt des Werkes wurde sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autor und Verlag für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler keine Haftung. 1. Auflage 2011 Wissenschaftlicher Verlag Harri Deutsch, Frankfurt am Main, 2011 Umschlaggestaltung: Claudia Holz Lektorat: Manuela Kupfer Druck: fgb freiburger graphische betriebe < Printed in Germany

4 Vorwort Ziel eines Repetitoriums ist, größtenteils bereits bekanntes Wissen auf Wesentliches zu komprimieren und in einer übersichtlichen und überschaubaren Form zu präsentieren: Übersichtlichkeit durch Reduktion und Verständnisförderung durch Fokussierung. Lehrbuch und Repetitorium stellen somit keine alternativen, sondern einander ergänzende Lernsysteme dar. Der Themenschwerpunkt des vorliegenden Repetitoriums ist die Genexpression. Der Leser und Lerner wird durch aufeinander aufbauende Kapitel mit aufsteigender Komplexität hin zu komplizierten Systemen wie der Embryonalentwicklung von Drosophila geführt. Strukturen, Sequenzelemente und Prozesse, die mehreren thematischen Zusammenhängen zuzuordnen sind, werden zusätzlich im Kapitel Ergänzungen intensiver beleuchtet. Wo immer es sinnvoll und möglich erschien, wurden die Daten kristallographischer Strukturuntersuchungen als Grundlage für symbolische und stilisierte Darstellungen von Komplexen herangezogen. Hamburg, im Sommer 2011 Fritz Höffeler Danksagung Ganz herzlich möchte ich mich bei Herrn Dr. Gelderblom bedanken _ sowohl für die Überlassung der Photos als auch für die Beantwortung meiner Fragen. Großer Dank gebührt meiner Lektorin Frau Manuela Kupfer, die mir bereits beim Band Cytologie zur Seite stand. Ihr scharfer Verstand und ihre scharfen Augen bewahrten mich vor meiner eigenen Betriebsblindheit und den Tücken der Orthographie- und Interpunktionsregeln. Die Verlagsleitung hatte sehr viel Geduld mit mir, denn die Arbeit an diesem Buch hat enorm viel Zeit in Anspruch genommen. Auch ihr schulde ich Dank! Gewidmet meinem ehemaligen Biologielehrer Herrn Günter Jarmer, dessen Lebenskreis sich viel zu früh geschlossen hat.

5 INHALTSVERZEICHNIS I. DIE MOLEKÜLKLASSEN V. GENETISCHE MECHANISMEN II. SEQUENZELEMENTE 1. Allgemeines Replikationsursprünge Centromere Telomere Gene Promotoren Regulatorregionen Transponierbare Elemente Repetitive Elemente Weitere Elemente... III. CHROMOSOMALE ELEMENTE Struktur-Funktions-Beziehungen... Proteine... Nucleinsäuren... Interaktionen... Übersicht... Nucleoide... Chromosomen... Nucleoide der Organellen... Virale Chromosomen... Plasmide... Genome... IV. ZUSAMMENFASSUNG Strukturelle Grundlagen Übersicht... Replikation... - Strukturen... - Prozess... - Replisom... - Telomere... - Chromatinumformung... - Regulation, Besonderheiten... Transkription... - Strukturen... - Prozess... - Initiationskomplexe... - Initiation der Pol II... - Termination... - Chromatinumformung... - Transkripte... Processing... - Übersicht... - Additionen... - Modifikationen... - Editing... - Spleißen... - rrna... - trna... - mrna... - Zusammenfassung... RNA-Export... Translation... - Genetischer Code... - Strukturen... - Prozess... - Initiation... - Recodierungen... Zusammenfassung

6 INHALTSVERZEICHNIS VI. EXPRESSIONSREGULATION Übersicht... DNA... - Amplifikation... - Transposition Inversion... Methylierung Chromatin Prokaryoten Eukaryoten Dosiskompensation Transkription Übersicht Prokaryoten Eukaryoten Processing Poly-A-Stellen Alternatives Spleißen Editing RNA-Abbau Übersicht Allgemeine Abbauwege RNA-Interferenz Nonsense Mediated Decay Translation Prokaryoten Eukaryoten VII. SIGNALE UND KASKADEN VIII. VIREN Allgemeines Bau und Bestandteile RNA-Viren Retroviren DNA-Viren IX. ERGÄNZUNGEN 1. RNAs Histone Chromatin Interphase-Chromosomen DNA-Polymerasen RNA-Polymerasen Helicasen Topoisomerasen Promotoren Ribosomen Translationsfaktoren Replikation Regulatorproteine Geschlechter und Sexualität Transponierbare Elemente Mengen und Zahlen mtdna Gene und Genome Gentransfer Allgemeines Lichtinduktion Immunantwort Geschlechtsbestimmung Embryonalentwicklung von Drosophila ANHANG Abkürzungen Stichwortregister Literaturverzeichnis

7 ÜBERSICHT Der Seitenbaufbau ist so konzipiert, dass auf jeder Seite die hierarchische Themenorganisation des konkret behandelten Inhalts ersichtlich ist: I: Hauptthema und Unterthema II: Übergeordneter Themenkomplex mit Farbmarkierung 3. TRANSKRIPTION: Initiation der Pol II V. GENETISCHE MECHANISMEN INITIATIONSKOMPLEX DER EUKARYOTISCHEN RNA-POLYMERASE II Modell des PIC Aktivierung der Pol II Pol II 1 TFIID TFIIB TFIIA TFIIF TFIIE Protein-DNA-Kontaktbereiche BRE TATA INR DPE TFIIH Pol II (Rpb1 u. 2) TBP TFIID TAFs TFIIB TFIIF (α und β) TFIIE (α) TFIIH (XPB) 2 3 Phosphatrest phosphorylierte CTD Abbildungen gehören immer zum Text der (Doppel-)seite. INITIATIONSKOMPLEX DER POL II Der geschlossene Initiationskomplex (auch als PIC bezeichnet) der eukaryotischen RNA-Polymerase II enthält die geschlossene Promotorregion und den Basalkomplex, der wiederum aus der RNA-Polymerase und sechs basalen Transkriptionsfaktoren besteht. Dieser Basalapparat bildet sich entweder durch sukzessive Aggregation der Einzelkomponenten oder durch Zusammenfügen von zwei Teilkomplexen: der Pol II mit angebundenen TFs sowie der Reinitiationsplattform (s. u.). Die obere Darstellung ist ein vereinfachtes Modell, das nicht berücksichtigt, dass sich die DNA auf Grund der starken Biegung durch TBP/TFIID um diesen Basalkomplex windet. Die Positionierung und Stabilität dieses Komplexes ergibt sich aus einer Vielzahl kooperativer Protein-Protein- und Protein- DNA-Bindungen. Letztere können sich über einen großen DNA-Bereich erstrecken. AKTIVIERUNG DER POL II Innerhalb des PIC wird ca. 12 bp stromabwärts der TATA-Box u.a. mit Hilfe der beiden Helicase-UE des TFIIH ein Bereich von bp entwunden. In dieser Position kann der codogene Strang leicht zum aktiven Zentrum der Polymerase geführt werden. Dieser Zu- stand wird als offener Initiationskomplex bezeichnet. Es folgt die abortive Synthese mehrerer drei bis zehn Nt langer RNAs; erst ab einer Länge von ca. 30 Nt ist der Zusammenhalt von DNA, RNA und Polymerase so stabilisiert, dass die Polymerase in den Elongationsmodus wechseln kann. Um den Initiationskomplex verlassen zu können, muss die CTD, über die die Polymerase mit TFIID verbunden ist, phosphoryliert werden. Beim Menschen besteht die CTD aus 52 Heptapeptiden, die die Konsensussequenz Tyr1-Ser 2-Pro 3-Thr 4- Ser 5-Pro6-Ser7 aufweisen. Die Proteinkinase-UE des TFIIH kann jedes Heptapeptid an Ser5 phosphorylieren. Auf Grund dieser Modifikationen löst sich die CTD vom TFIID ab und es entstehen an der CTD gleichzeitig Bindestellen für Cappingfaktoren (S. 64). Die Pol II löst sich nun vom Initiationskomplex. Einige Komponenten des Basalapparats bleiben an die Pol II gebunden, einige lösen sich vom Komplex ab und einige können als Reinitiationsplattform am Promotor verbleiben. Diese Plattform ermöglicht einen schnellen Transkriptionsstart, indem sich ein Aggregat aus Pol II und verschiedenen TFs schnell anbinden kann. Dafür jedoch muss die CTD der neuen Pol II in einem unphosphorylierten Zustand vorliegen. Eine Phosphatase dephosphoryliert die Heptatpeptide. Die CTD muss sich also für die Initiation in einem unphosphorylierten und für die Elongation in einem phosphorylierten Zustand befinden ( S. 172, RNA-Polymerasen). 59 III: Konkret behandeltes Thema Texte enden immer am Ende einer (Doppel-)seite.

8 LEGENDE REGELN UND KONVENTIONEN 1. Sequenzen Nucleotid- und Aminosäuresequenzen werden entlang ihrer Syntheserichtung notiert: Einzelsträngige Nucleotidsequenzen in 5 3 -Richtung (vom Phosphat- zum Hydroxylterminus) und Peptide in N C Richtung (vom Amino- zum Carboxylterminus). Aminosäuren werden als Drei- oder Einbuchstaben-Codes wiedergegeben (s. S. 4) und Nucleotide (bzw. die entsprechenden Basen) als Einbuchstaben-Codes (s. S. 11). Um bei der Notierung von Dinucleotidfolgen und von Basenpaaren Missverständnisse zu vermeiden, werden beide unterschiedlich wiedergegeben: Die Basenfolge Cytosin-Guanin wird als CpG, das Basenpaar Cytosin-Gunanin als C/G oder CG formuliert. (Z. B. S. 24: Eukaryotische Promotoren enthalten sowohl GC-Boxen, die aus G/C-Basenpaaren bestehen als auch CpG-Inseln, die mehrere Dinucleotidfolgen CG enthalten.) Einzelne Aminosäuren und einzelne Nucleotide innerhalb eines Polymers werden mit entsprechenden Positionsziffern versehen, wobei bei Peptiden vom N-Terminus und bei Nucleinsäuren vom 5 -Ende her gezählt wird. Ser 33 bezeichnet demnach die Aminosäure Serin, die sich an der 33. Position des Peptids befindet und A2450 ein Adenin, das in der Position liegt. Um relative Positionen von Nucleotidsequenzen zu bezeichnen, werden die Begriffe stromaufwärts und stromabwärts verwendet: In der Sequenzabfolge 5 -X-Y-Z-3 liegt X stromaufwärts von (also vor) Y und Z liegt stromabwärts von (also hinter) Y. 2. Schrift Bezeichnungen für Gene werden immer kursiv und i. d. R. in Kleinbuchstaben geschrieben. Proteinnamen werden in Normalschrift aufgeführt, wobei sie mit einem Großbuchstaben beginnen oder vollständig in Großbuchstaben geschrieben werden können. Falls Strukturen von Menschen und Tieren dieselben Namen tragen, werden die der menschlichen Strukturen in Großbuchstaben, die der tierischen in Kleinbuchstaben notiert. Die Bezeichnungen von Arten, nicht jedoch von anderen taxonomischen Einheiten, werden kursiv gesetzt (z. B. Drosophila melanogaster; Homo sapiens; aber: Mammalia, Vertebrata). 3. Nomenklatur Lange und zusammengesetzte Namen werden _ meist in Form eines Akronyms _ abgekürzt (z. B. MPF = Maturation Promoting Factor). Gene und die darin codierten Proteine tragen i. d. R. dieselben Bezeichnungen (wie rec A und Rec A). Mitglieder von Gen- und Proteinfamilien erhalten zusätzlich zu ihrem Namen eine fortlaufende Ziffern- oder Buchstabenfolge (z. B. Papillomavirus- Gene E1A, E1B, E2, L1, L2 oder Histonproteine H1, H2A, H2B, H3, H4). In einigen Fällen werden Proteine auch dann durchnummeriert, wenn sie zwar nicht verwandt sind, aber einen eindeutigen Funktionszusammenhang aufweisen (z. B. die an der Replikation beteiligten Proteine von E. coli: DnaA [Initiatorprotein], DnaB [Helicase], DnaC [Helicaseladeprotein], DnaG [Primase]). Für die Namensfindung von Genen und Proteinen gibt es keine verbindliche Regelung. Proteine können z. B. nach ihrem Funktionszusammenhang (wie Rec A = Recombination A), nach ihrem Verhalten (wie TBP = TATA-Box Binding Protein), nach ihren Leistungen (wie RNA-Polymerasen) oder nach dem Kontext ihrer Erstentdeckung (wie MPF, der bei der Erforschung der Oocyten- Reifung entdeckt wurde) benannt werden. Enzyme erhalten die Endsilbe -ase. Nucleotidsequenzen können nach der tatsächlichen Sequenz benannt werden (z. B. TATA-Box, GC-Box), nach ihrer Funktion (wie Origin und Promotor) oder nach ihrem codierten Inhalt. Proteingene werden häufig nach den Symptomen benannt, die durch ihren Ausfall hervorgerufen werden (z. B. eyeless bei Drosophila). Komplexe aus mehreren Proteinen erhalten eigene Bezeichnungen (z. B. besteht MPF aus Cyclin B und Cdc2). 4. Mutationen Die folgende Regelung betrifft besonders die Bakteriengenetik: Mutationen eines Gens tragen hinter dem kursiv geschriebenen Namen des normalen Gens eine Zahl (z. B. hisc1, hisc2). Die Bezeichnung eines Phänotyps wird normal geschrieben, beginnt mit einem Großbuchstaben und trägt, je nach Leistungsvermögen des genannten Gens, ein hochgestelltes - oder + (z. B. His + ). Führt z. B. eine hisc1 genannte Mutation des hisc-gens bei E. coli zum Ausfall der Histidinsynthese, so wird der Phänotyp des mutierten E.-coli-Stamms mit His - bezeichnet. SYMBOLE UND ALLGEMEINE ABKÜRZUNGEN Nummerierung von Strukturen Reihenfolge von Prozessen ø < > Abb. bes. ca. d. h. euk. evtl. Fam. Durchmesser kleiner als größer als Querverweis auf zusätzliche Informationen im Kapitel Ergänzungen Abbildung besonders circa das heißt eukaryotisch eventuell Familie hpts. i. d. R. li Mio Nt NTP o. prok. re S. s. a. sog. u. a. u. Ä. UE versch. z. B. z. T. hauptsächlich in der Regel links Millionen Nucleotid (-e) Nucleosidtriphosphat (-e) oder prokaryotisch rechts Seite siehe auch sogenannte (-r, -s) unter anderem, und andere und Ähnliche (-s) Untereinheit (-en) verschiedene (-r, -s) zum Beispiel zum Teil 1

9 VI. EXPRESSIONSREGULATION 4. TRANSKRIPTION: Übersicht GRUNDLEGENDE REGULATIONSMECHANISMEN DER TRANSKRIPTION alternative Promotoren Regulatorproteine Aktivator RNAP Gene können mehrere Promotoren besitzen, die unterschiedlich reguliert werden. Je nach verwendetem Promotor entstehen verschiedene Primärtranskripte. Bei Eukaryoten schließen sich häufig alternative Spleißprozesse an. Es entstehen Isoformen der codierten Proteine. alternative Transkriptionsfaktoren Repressor Regulatorproteine binden an Regulationssequenzen und interagieren direkt oder indirekt mit der RNAP. Aktivatoren ermöglichen bzw. verstärken, Repressoren verhindern die Transkription. Ein Gen kann durch Aktivator- und Repressorregionen reguliert werden. Sekundärstrukturen der Transkripte alternative Struktur σ 54 nicht vorhanden σ 32 vorhanden Terminationsschleife Prokaryoten synthetisieren verschiedene Sigma-Faktoren, die an verschiedene Promotoren binden, wodurch in Form einer globalen Kontrolle mehrere Gene synchron exprimiert werden können. Die Sekundärstruktur der sog. Leader-Sequenz der wachsenden RNA kann verschiedene Konformationen einnehmen, ist beeinflussbar und bestimmt die Fortsetzung oder Termination der Transkription. ÜBERSICHT Die Expression der meisten Gene wird, besonders bei Prokaryoten, auf der Ebene der Transkription reguliert. Aus energetischen Gründen beziehen sich die meisten Kontrollmechanismen auf die Initiationsphase, einige jedoch auch auf die frühe Elongationsphase. Die Initiation kann durch zahlreiche Mechanismen verstärkt (Aktivierung) oder verhindert (Repression) werden, indem mit Hilfe verschiedener DNA-Regulationssequenzen und Regulatorproteinen die Interaktionen zwischen RNAP und Promotor manipuliert werden. Bei Genen, deren Transkripte in der 5 -UTR alternative Sekundärstrukturen ausbilden können, kann die frühe Elongation terminiert und somit die Transkriptionsrate des Gens geschwächt werden (Attenuierung). In diesen Fällen stellt nämlich eine der alternativen Konformationen, deren Ausbildung durch verschiedene Faktoren forciert werden kann, ein Stopp-Signal für die Transkription dar. Mit Hilfe der an den Transkriptionsregulationen beteiligten Komponenten können komplexe Regulationssysteme entstehen, durch die gleichzeitig mehrere Gene kontrolliert werden (globale Kontrolle) und durch die einzelne Gene Bestandteil mehrer Regulationsnetze sein können. Viele Gene stehen unter der gleichzeitigen Kontrolle mehrerer Regulationsmechanismen, die als alternative, kooperative oder redundante Systeme auf diese Gene einwirken. Die meisten Kontrollmechanismen basieren auf: - alternativen Promotoren Bei Pro- und Eukaryoten besitzen einige Gene verschiedene (multiple) Promotoren, die verschiedenen Regulationssystemen unterworfen sind. Auf diese Weise können Gene einerseits über unterschiedliche Signale aktiviert werden und andererseits können Protein-Isoformen gebildet werden. - alternativen Transkriptionsfaktoren Bei Prokaryoten können durch die gezielte Synthese verschiedener Sigma-Faktoren verschiedene Gene aktiviert werden; i. d. R. stehen mehrere Gene unter der Kontrolle eines gemeinsamen Sigma-Faktors. - Regulatorproteinen An der Transkriptionsverstärkung und -repression sind bestimmte Regulationssequenzen beteiligt, an die sequenzspezifisch bindende Proteine andocken. Besonders schwache Promotoren unterliegen einer aktivierenden Kontrolle. Bei Eukaryoten entstehen durch vielfältige Interaktionen von Aktivator- und Repressorproteinen komplexe Kontrollsysteme. ( S. a. S. 186, Regulatorproteine.) - Sekundärstrukturen der Transkripte Besonders bei Prokaryoten kann die Elongation durch Ausformung einer RNA-Terminationsschleife frühzeitig abgebrochen werden. Regulierend wirken entweder die Translationsgeschwindigkeit oder, bei sog. Riboschaltern, spezifische Liganden. 108

10 4. TRANSKRIPTION: Prokaryoten VI. EXPRESSIONSREGULATION ALTERNATIVE PROMOTOREN ALTERNATIVE SIGMA-FAKTOREN N (log) Wachstumsphasen einer E.-coli-Kultur Sigma-Faktor 1 Sigma-Faktor 2 Sigma-Faktor 3 P1 aktiv P2 inaktiv rrna-operon t Sigma-Faktor 4 P1 inaktiv P2 aktiv rrna-operon Alle sieben rrna-operons von E. coli besitzen zwei Promotoren: rrnp1 und rrnp2, die bei unterschiedlichen Umweltbedingungen aktiviert werden. P1 ist während der schnellen Wachstumsphasen aktiv, P2 während der stationären und der Übergangsphasen. Schematisch sind hier vier verschiedene Sigma-Faktoren angegeben, die an jeweils unterschiedliche Promotorsequenzen mehrerer, verteilter Gene binden und die RNAPs dorthin rekrutieren können. Einige Promotoren besitzen Bindestellen für mehrere Sigma-Faktoren. ALTERNATIVE PROMOTOREN Bei Prokaryoten werden multiple Promotoren hauptsächlich verwendet, um die Expression bestimmter Gene wechselnden Umweltbedingungen anzupassen. Bei E. coli werden ca. 40 % aller Gene durch mehr als einen Promotor reguliert, z. B. die beiden Promotoren rrnp1 und rrnp2, die vor allen sieben rrna-operons vorkommen. P1 liegt ca. 300 bp vor Beginn des 16SrRNA-Abschnitts, P2 ca. 200 bp davor. Die P1-Promotoren sind für den Hauptanteil der rrnas während der schnellen Wachstumsphasen der Zelle verantwortlich und P2 für eine geringe aber kontinuierliche Produktion während der stationären Phasen, in der P1 inaktiv ist. P2 wird außerdem in den Übergangsphasen aktiviert, wenn die Zellen in die stationäre Phase übergehen oder auf Grund verbesserter Nährstoffangebote erneut in eine Wachstumsphase eintreten. ALTERNATIVE TRANSKRIPTIONSFAKTOREN Stärker als bei Eukaryoten wird bei Prokaryoten die Genexpression durch den Austausch von allgemeinen Transkriptionsfaktoren reguliert. Bakterien besitzen verschiedene Sigma-Faktoren, die jeweils unterschiedliche Promotorsequenzen erkennen und die RNAP an verschiedene Promotoren binden können. Einige Pro- motoren besitzen Erkennungssequenzen für verschiedene Sigma-Faktoren. Da fast alle Faktoren mehrere Promotoren erkennen, können über die Synthese eines Faktors gleichzeitig mehrere Gene exprimiert werden. Sie kontrollieren funktionell zusammengehörige Gene, die sowohl den Grundzustand der Zelle aufrecht erhalten als auch als Antwort auf veränderte Umweltbedingungen aktiviert werden. Wenn bei E. coli z. B. die Temperatur von 30 C auf C erhöht wird, aktiviert der Faktor σ 32 ca. 20 Gene, die dann mit stark erhöhter Rate exprimiert werden. Zu den synthetisierten Proteinen gehören verschiedene Chaperone, Proteasen und der Standardfaktor σ 70 (vermutlich, um den Übergang in den Normalzustand zu beschleunigen). Die hochgestellten Ziffern beziehen sich auf die jeweiligen Molmassen. Die Sigma-Faktoren von E. coli: - Sigma 70 (σ 70 ); Gen: rpod (RNA Polymerase Subunit D); Standardfaktor - Sigma 32 (σ 32 ); Gen: rpoh; Faktor für Hitzeschockreaktionen - Sigma 54 (σ 54 ); Gen: rpon (ntr A); Faktor bei Stickstoffmangel - Sigma 28 (σ 28 ); Gen: flia; Faktor für Flagellensynthese und Chemotaxis - Sigma 24 (σ 24 ); Gen: rpoe; Faktor für Aktivierung des rpoh-promotors (Hitzeschockreaktion) - Sigma S (σ S ); Gen: rpos; Faktor für Übergang in die stationäre Wachstumsphase 109

11 VI. EXPRESSIONSREGULATION 4. TRANSKRIPTION: Prokaryoten REGULATORPROTEINE DES LAC-OPERONS laci (Repressor) lacz (β-galactosidase) Lac-Operon lacy (Permease) laca (Transacetylase) CAP- Bindestelle Operator (Repressorbindestelle) Promotor (RNAP-Bindestelle) Beginn des Transkripts Beginn des lacz-gens Glucose + Lactose + Operon ausgeschaltet, da CAP nicht gebunden ist. Lac-Repressor CAP Glucose + Lactose - Glucose - Lactose - Operon ausgeschaltet, da Lac-Repressor gebunden und CAP nicht gebunden ist. Operon ausgeschaltet, da zwar CAP aber auch Lac-Repressor gebunden ist. Induktor (Allolactose) Glucose - Lactose + Operon wird angeschaltet, indem Lactose-Isomere an Repressor binden, diesen deaktivieren und den Promotor freigeben; CAP ist gebunden und unterstützt die Anbindung der RNAP. RNAP REGULATORPROTEINE DES TRP-OPERONS Trp-Operon trpe trpd trpc trpb trpa Operator (Repressorbindestelle) Promotor (RNAP-Bindestelle) Beginn des Transkripts RNAP Der Trp-Repressor ist inaktiv und kann nicht an den Operator binden; das Trp-Operon ist angeschaltet. Corepressor (Trp) Trp-Repressor Binden bei genügend hoher Konzentration Tryptophanmoleküle an den Repressor, kann dieser an den Operator binden und die Transkription blockieren; das Trp-Operon ist ausgeschaltet. 110

12 4. TRANSKRIPTION: Prokaryoten VI. EXPRESSIONSREGULATION REGULATORPROTEINE a) b) Allgemeines Regulatorproteine (Aktivatoren und Repressoren) sind allosterische Proteine, deren Konformation durch Anbindung von sog. Effektoren (Induktoren und Corepressoren) verändert werden kann und die die Kinetik der RNAP-Promotor-Wechselwirkung beeinflussen können. Jedes Regulatorprotein bindet sequenzspezifisch an eine Regulatorsequenz, die bei Prokaryoten unabhängig von ihrer aktivierenden oder reprimierenden Wirkung als Operator bezeichnet wird. Die Operatoren der Aktivatorproteine befinden sich stromaufwärts der -35-Region und liegen i. d. R. vor schwachen Promotoren. Gebundene Aktivatoren unterstützen die Bindung der RNAP und/oder die Bildung eines offenen Initiationskomplexes. Die Operatoren der Repressoren befinden sich in unmittelbarer Nähe der Promotoren oder überlappen mit diesen; angebundene Repressoren blockieren den Zugang der RNAP zum Promotor. Nicht alle Promotoren sind regulierbar; bei E. coli werden über 75 Promotoren durch Repressoren und mehr als 50 Promotoren durch Aktivatoren reguliert. Ähnlich den Sigma-Faktoren können einige Regulatorproteine mehrere Gene gleichzeitig kontrollieren; eine durch ein Regulatorprotein kontrollierte Gengruppe wird als Regulon bezeichnet. Die Expression der meisten Gene wird durch mehr als ein Regulatorprotein kontrolliert. Regulation des Lac-(Lactose-)Operons Das Lac-Operon von E. coli codiert drei Enzyme, die am Lactose-Abbau beteiligt sind: lacz codiert β-galactosidase (spaltet Lactose in Glucose und Galactose), lacy codiert Lactose-Permease (transportiert Lactose aus dem Medium in die Zelle) und laca codiert Thiogalactosid-Transacetylase (überträgt Acetylgruppen auf Phenyl-, Thiophenyl- und Nitrophenyl-Galactoside). In Gegenwart von Lactose als einziger Kohlenstoff-(C-)Quelle steigt die Anzahl der β-galactosidase-moleküle innerhalb von nur 3 min von 60 auf bis zu /Zelle an. Solange genügend Glucose im Nährmedium vorhanden ist, bleibt das Lac-Operon verschlossen, indem der Lac-Repressor, ein Homotetramer, an den Operator bindet und der RNAP den Zugang zum Promotor verwehrt. Der Repressor wird durch das Gen laci (Induktor) codiert, das stromaufwärts des Lac-Promotors liegt. Fällt die Glucosekonzentration und wird dem Nährmedium Lactose zugefügt, bindet Allolactose, ein in der Zelle gebildetes Isomer der Lactose, an den Repressor. Auf Grund der induzierten Konformationsänderung löst sich der Repressor vom Operator ab und gibt den Promotor frei. Dieser Mechanismus wird als Substratinduktion bezeichnet. Ein zusätzliches Regulatorprotein verhindert, dass das Lac-Operon c) bei Anwesenheit von Glucose exprimiert wird: das CAP (Catabolite Activator Protein, oder auch CRP, camp Receptor Protein). CAP ist _ nur bei Abwesenheit von Glucose _ an der Aktivierung von über 30 Promotoren beteiligt, deren Gene Proteine für die Nutzung alternativer C-Quellen codieren, eine Eigenschaft, die als globale Kontrolle bezeichnet wird. Die Aktivierung von CAP ist durch folgenden Mechanismus an die verfügbare Glucosemenge gekoppelt: Die Mengen von camp und Glucose sind umgekehrt proportional, da der phosphorylierte, aktive Glucose-Transporter die Phosphatgruppe auf die Glucose überträgt und in unphosphoryliertem Zustand die Adenylatcyclase hemmt; ist der Transporter auf Grund fehlender Glucose inaktiv, bleibt er phosphoryliert und aktiviert die Adenylatcyclase, die nun camp bildet. Nachdem zwei camp-moleküle an das CAP gebunden sind, kann CAP auf Grund der erfolgten Konformationsänderung an die CAP-Bindestelle andocken und die Transkription des Lac-Operons aktivieren. Ohne CAP kann das Operon grundsätzlich nicht aktiviert werden. Dieser Mechanismus (Glucose hemmt das Lac-Operon) ist ein Beispiel für eine Katabolitrepression. Das Lac-Operon unterliegt also sowohl einer positiven als auch einer negativen Expressionskontrolle. Regulation des Trp-(Tryptophan-)Operons Das Trp-Operon von E. coli enthält fünf Gene (trpe, trpd, trpc, trpb, trpa), deren Produkte an der fünf-schrittigen Umwandlung von Chorismat zu L-Tryptophan beteiligt sind. Das Operon ist nur aktiv, wenn Tryptophan im Nährmedium in unzureichenden Mengen vorhanden ist, und wird abgeschaltet, wenn die Konzentration der Aminosäure wieder hoch genug ist. Diese Art der Regulation wird Endproduktrepression genannt. Der Repressor wird durch das Gen trpr (Repressor) codiert, der sich weit stromaufwärts des Operons befindet. Der Repressor ist ein Homodimer, an das sich zwei Tryptophanmoleküle anlagern und das Regulatorprotein durch die induzierte Konformationsänderung aktivieren können. Der Operator für den Repressor befindet sich innerhalb des Trp-Promotors, wo er durch sterische Hinderung der RNAP eine Transkription blockiert. Fällt die Tryptophankonzentration unter ein kritisches Niveau, lösen sich die Corepressoren vom Repressor und anschließend der Repressor vom Operator, wodurch das Operon wieder freigegeben wird. Wie das Lac-Operon untersteht auch das Trp-Operon einer weiteren, jedoch ganz anders gearteten Kontrolle (Attenuierung, s. S. 112). Das Trp-Operon weist noch eine Besonderheit auf: Es besitzt einen zusätzlichen, schwachen internen Promotor zwischen den Genen trpd und trpc, von wo aus die letzten drei Gene mit niedriger Rate exprimiert werden können, wenn der Hauptpromotor blockiert ist. 111

13 VI. EXPRESSIONSREGULATION 4. TRANSKRIPTION: Prokaryoten ATTENUIERUNG DER TRANSKRIPTION Leitsequenz mit Drosselelement Leitsequenz mit Riboschalter Operon Leitsequenz Gen 1 Gen 2 Gen 3 Operon Leitsequenz Gen 1 Gen 2 Drosselelement schnelle Translation Terminationsschlaufe Riboschalter mit Ligand Terminationsschlaufe Ribosom kann Drosselelement passieren Leitpeptid Verformung des Riboschalters durch Ligand Ligand langsame Translation Antiterminationsschlaufe ohne Ligand Antiterminationsschlaufe Ribosom wird am Drosselelement aufgehalten Das Operon enthält neben den Enzymgenen ein vorgeschaltetes Gen für ein Leitpeptid. Innerhalb der Leitsequenz befindet sich ein Drosselelement mit mehreren Codons, die die Aminosäure codieren, die durch das Operon synthetisiert werden kann. Kann das Ribosom schnell translatieren, entsteht eine Terminationsschlaufe und das gesamte Polycistron wird nicht transkribiert. alternative Basenpaarungen ohne Ligand In der 5 -UTR des ersten Gens eines Operons oder eines einzelnen Gens befindet sich eine Leitsequenz, die sich in zwei alternative Konformationen auffalten kann. Innerhalb dieser Sequenz liegt ein Riboschalter, an den hochselektiv ein Ligand andocken und durch die Anbindung die Struktur des Riboschalters und somit auch der gesamten Leitsequenz modifizieren kann. SEKUNDÄRSTRUKTUREN DER TRANSKRIPTE Leitsequenzen im 5 -Bereich bestimmter mrnas können selektiv und regulierbar eine von zwei alternativen Konformationen einnehmen: die neutrale Antiterminationsschlaufe und die Terminationsschlaufe, die die Transkription vorzeitig beendet. Dieser Mechanismus wird als Attenuierung (Abschwächung) der Transkription bezeichnet. Die Regulation erfolgt cotranskriptional und wird entweder durch die Translationsgeschwindigkeit an der noch wachsenden mrna oder durch die Anbindung eines Liganden induziert. a) Attenuierung durch Drosselelemente Dieser Mechanismus existiert nur bei Prokaryoten, da nur hier Transkription und Translation zeitgleich ablaufen. Kann das Ribosom schnell translatieren, faltet sich die Leitsequenz zwischen Ribosom und RNAP anders, als wenn das Ribosom nur langsam vorankommt. Einige Operons, deren Gene Enzyme synthetisieren, die an der Synthese bestimmter Aminosäuren beteiligt sind, enthalten innerhalb der Leitsequenz sog. Drosselelemente mit mehreren Tripletts, die eben diese durch das Operon synthetisierbare Aminosäure codieren. Im Trp-Operon von E. coli finden sich zwei Trp-Tripletts; bei Tryptophanmangel verzögert sich die Translation an dieser Stelle auf Grund des Mangels an trna Trp und es bildet sich die Antiterminationsschlaufe. Bei b) genügend hoher Trp-Konzentration und dadurch schnellerer Translation entsteht die Terminationsschlaufe. Dieser zweite Regulationsmechanismus für das Trp-Operon ist also eine Variante der Endproduktrepression. Andere Drosselelemente enthalten acht Thr-Codons im Thr-Operon, sieben His- Codons im His-Operon und sieben Phe-Codons im Phe-Operon. Attenuierung durch Riboschalter Riboschalter sind RNA-Elemente, die ihre Konformation durch hochselektive Bindung von Liganden verändern. In Transkriptions-Attenuierungen involvierte Riboschalter werden durch Effektoren i. d. R. in die terminierende Konformation gezwungen und liegen in der 5 -UTR _ werden also im Gegensatz zu den Drosselelementen nicht translatiert _ und sind gefolgt von einem Poly-U-Trakt. Das Riboflavin- Operon von Bacillus subtilis enthält Gene für die Riboflavinsynthese; Riboflavin (Vitamin B 2 ) ist die Vorstufe für die Coenzyme FMN (Flavin Mononucleotide) und FAD (Flavin Adenine Dinucleotide). FMN kann an die sog. RFN-Box, den Riboschalter des Rib-Operons, anbinden und die Ausbildung der terminierenden Konformation auslösen. Diese Variante der Endproduktrepression ist bei mehreren an Vitaminsynthesen beteiligten Operons nachgewiesen. Riboschalter können auch in die Regulation der Translation involviert sein (s. S. 129). 112

14 4. TRANSKRIPTION: Eukaryoten VI. EXPRESSIONSREGULATION ALTERNATIVE PROMOTOREN verschiedene 5 -UTRs, gleiche Proteine verschiedene 5 -UTRs, verschiedene Proteine P1 P2 Start-Codon P1 Start-Codon P2 Start-Codon Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Transkript von P1 Ε1 Ε3 Transkript von P1 Ε1 Ε3 von P2 Ε2 Ε3 von P2 Ε2 Ε3 P1 P2 Start-Codon P1 Start-Codon P2 Start-Codon Exon 1 Exon 2 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Transkript von P1 Ε1 Ε2 Transkript von P1 Ε1 Ε2 Ε4 von P2 Ε1 Ε2 von P2 Ε3 Ε4 Befinden sich alle Promotoren innerhalb der nicht-codierenden Exons, wird nur die 5 -UTR der Transkripte variiert, während der codierende Bereich und damit das Protein unverändert bleibt. Oben: Gene für IGF-I, IGF-II und α-amylase; unten: Onkogen MYC Liegen zwischen den Promotoren codierende Exons, wird auch der codierende Bereich und somit der N-Terminus des Proteins verändert. Oben: Gene für Porphobilinogen-Deaminase, Glucokinase und NADH-Cytochrom-b5-Reduktase; unten: Dystrophin-Gen ALTERNATIVE PROMOTOREN Eukaryoten nutzen alternative Promotoren z. B. für die Regulation von entwicklungs-, gewebe- und zelltypspezifischer Genexpression, Expressionsstärke, unterschiedlicher Ansprechbarkeit eines Gens, Stabilisierung der mrnas, Effektivität der Translation, Modifikation der Proteinfunktion durch Veränderung des N- Terminus. Für die Funktionalität der Promotoren ist ihre Position von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung alternativer Promotoren ist häufig mit differentiellen Spleißprozessen verbunden, durch die alternative Exonkombinationen entstehen (s. S. 118 f). a) ubiquitäre/gewebespezifische Expression In bestimmten Fällen besitzt ein Promotor ein ubiquitäres und der zweite Promotor ein gewebespezifisches Expressionsmuster. Das menschliche Gen für Porphobilinogen-Deaminase (ein Schlüsselenzym in der Synthese von Tetrapyrrolen wie Haem und Vitamin B 12 ) enthält zwei Promotoren: der entfernte Haushaltspromotor ist in allen Zellen, der nahe Promotor nur in Erythrocyten aktiv. Durch differentielles Spleißen entstehen zwei Isoformen. b) entwicklungsspezifische Expression Die Promotoren der menschlichen IGF-Gene (Insulin-like Growth Factor) sind in verschiedenen embryonalen und adulten Entwicklungsphasen und Geweben aktiv. P1 von IGF-I ist in den meisten fötalen c) d) e) und postnatalen Geweben aktiv; P2, der auf Wachstumshormone reagiert, wird nach der Geburt in der Leber aktiviert. Die Promotoren P2, P3 und P4 von IGF-II sind während der fötalen Entwicklung aktiv und werden nach der Geburt in der Leber abgeschaltet; stattdessen wird P1 angeschaltet. Expressionsstärke Das menschliche Gen für α-amylase besitzt einen nahen, schwachen Promotor, der in der Leber aktiv ist und einen 100-fach stärkeren, entfernten Promotor, der in den Speicheldrüsen aktiv ist. Das Genprodukt ist in beiden Fällen identisch. verschiedenartige Ansprechbarkeit Der stromaufwärts gelegene, unregulierte Promotor des Gens für Glucokinase ist in den β-zellen des Pankreas und in anderen neuroendokrinen Zelltypen aktiv. In Hepatocyten wird der stromabwärts gelegene Promotor genutzt, der durch Insulin aktiviert und durch Glucagon deaktiviert werden kann. Protein-Isoformen Das Enzym NADH-Cytochrom-b5-Reduktase existiert als membrangebundene und als freie Form. Entscheidend für die Lokalisierung ist der Membrananker im N-Terminus des Proteins. Der Haushaltspromotor P1 ist ubiquitär aktiv und liegt vor dem Membrananker codierenden Exons 1. P2 ist ausschließlich in Erythrocyten aktiv und liegt vor Exon 2, das keine Membranbindedomäne codiert. 113

15 VI. EXPRESSIONSREGULATION 4. TRANSKRIPTION: Eukaryoten DNA-REGULATIONSSEQUENZEN Komplexe genetische Schalter des eve-gens bei Drosophila eve-gen Das eve-gen wird in sieben Streifen exprimiert und codiert einen Transkriptionsfaktor Die Kontrollsequenzen von eve werden als Streifenmodule bezeichnet. Das Streifen-2-Modul reguliert die Expression des Gens im 2. Streifen des Embryos. Das Modul ist als komplexer genetischer Schalter organisiert und enthält Bindestellen für Aktivatoren und Repressoren. Je nach den lokalen Konzentrationsverhältnissen der Regulatorproteine wird das Gen aktiviert oder reprimiert (s. S. 145 f). Locus- und Genkontrollregionen des menschlichen Globingenclusters LCR Cluster der Globingene ε γ G γ A δ β Locuskontrollregion des Globingenclusters Genkontrollregion des β-globingens HS Die Locuskontrollregion beeinflusst die gesamte Gengruppe, die Genkontrollregion nur je ein Gen. Die HS-(DNase-I hypersensitive)- Stellen der LCR und die Genkontrollregionen enthalten Sequenzmotive für Regulatorproteine, von denen einige in verschiedenen Kontrollregionen vorkommen (z. B. GATA-Bindestellen in HS2, 3 und 4 und in beiden β-globingen- Kontrollsequenzen). MECHANISMEN DER AKTIVATORPROTEINE Bindestellen für Aktivatorproteine Enhancer Promotor Anbindung von Histon-Acetylasen/Chromatinumformungskomplexen Genkontrollregion Spacer Kontrollsequenzen Promotor Streifen-3- Streifen-2- Streifen-7-Modul Bindestellen für Aktivatorproteine Bindestellen für Repressorproteine Aktivatorprotein (-Komplex) Transkriptionsfaktoren An im Heterochromatin erreichbare Kontrollsequenzen können Aktivatoren anbinden, die HATs und Umformungskomplexe binden. Durch die nachfolgende Auflockerung des Chromatins werden weitere Kontrollsequenzen und der Promotor freigelegt. Mediator Enhancer (Verstärker) sind komplexe DNA-Proteinstrukturen mit Architekturproteinen, die die DNA biegen. Die durch Enhancer verursachte Biegung der DNA erleichtert Interaktionen zwischen Aktivatorproteinen und dem Initiationskomplex. Aktivatorproteine können mit allgemeinen Transkriptionsfaktoren oder mit dem Mediator interagieren, und dadurch die Rekrutierung, Ausrichtung und Aktivierung des Initiationskomplexes beschleunigen. 114

16 4. TRANSKRIPTION: Eukaryoten VI. EXPRESSIONSREGULATION REGULATORPROTEINE a) b) c) Allgemeines Die eukaryotischen allgemeinen Transkriptionsfaktoren sind grundsätzlich immer notwendig, um die Transkription eines Gens zu starten (s. S. 58). Im Gegensatz zu den prokaryotischen Sigma- Faktoren existieren zu den eukaryotischen allgemeinen TFs keine alternativen Faktoren. Eukaryoten besitzen jedoch Tausende von unterschiedlichen Regulatorproteinen, die komplexe Interaktionsnetze ausbilden können (beim Menschen codieren schätzungsweise 5-10 % aller Protein-codierenden Gene Regulatorproteine). Regulatorproteine Die Proteine besitzen eine DNA-Bindedomäne, mit der sie an die für dieses Protein charakteristische Nucleotidsequenz binden, und eine Aktivator- bzw. Repressordomäne, über die sie mit verschiedenen anderen Proteinen Kontakt aufnehmen können, z. B. mit allgemeinen TFs, dem Mediator (ein Komplex aus ca. 20 UE, der zusammen mit allgemeinen TFs und der RNAP ein Holoenzym bildet), Histon-modifizierenden Enzymen und Chromatinumformungskomplexen. Zahlreiche Regulatorproteine, besonders solche, die zu ihrer Aktivierung erst dimerisieren müssen, besitzen eine dritte Domäne, mit der sie an andere Regulatorproteine andocken können. Eukaryotische Regulatorproteine bilden häufig Komplexe und erst diese wirken, abhängig von der jeweiligen Zusammensetzung, aktivierend oder reprimierend. Da viele Proteine Bestandteil sowohl mehrerer als auch unterschiedlich wirkender Komplexe sind, können nicht alle Proteine eindeutig als Aktivatoren oder Repressoren klassifiziert werden, sondern lediglich die Gesamtkomplexe, deren Bestandteil sie sind. Diese Komplexe können neben den DNA-bindenden Regulatorproteinen auch Proteine enthalten, die selbst nicht an die DNA, sondern an die bereits gebundenen Regulatoren andocken; zu dieser Gruppe gehören die sog. Coaktivatoren bzw. Corepressoren und die Architekturproteine. Letztere verbiegen die umgebende DNA sehr stark und kommen z. B. an den komplexen Enhancern (Verstärkerelementen) vor. ( S. 186, Regulatorproteine.) DNA-Regulationssequenzen Die Nucleotidsequenzen, an die die Regulatorproteine binden, werden als Kontrollsequenzen bezeichnet. Sie können in Abhängigkeit der Wirkung durch gebundene Regulatorproteine unterteilt werden in Enhancer (Verstärkerelemente, die die Transkription verstärken) und Silencer (Drosselelemente, die die Transkription unterbinden). Die Kontrollsequenzen wirken unabhängig von ihrer Orientierung und Position zum Gen und können Tausende von bp entfernt vor oder hinter dem Pro- d) motor liegen _ besonders in der großen Entfernung unterscheiden sich die Kontrollsequenzen von den zahlreichen Sequenzelementen, die als Promotorbestandteile gezählt werden. Indem der zwischen Promotor und Kontrollsequenz liegende DNA-Abschnitt zu einer Schlaufe gebogen wird, können die Regulatorproteine mit dem Transkriptionsapparat am Promotor interagieren. Ein einzelner Promotor kann durch eine große Anzahl von Kontrollsequenzen reguliert werden; i. d. R. liegen mehrere dieser Sequenzen, durch Spacer -Sequenzen voneinander getrennt, hintereinander. Zusammen mit dem Promotor wird der gesamte Bereich als Genkontrollregion bezeichnet und kann sich über eine Länge von bis zu bp erstrecken. Die Gene eines Genclusters, also einer Reihe von Genen, unterliegen oftmals einer zusätzlichen Kontrolle durch eine Locuskontrollregion (LCR; Locus Control Region). LCRs regulieren die Zugänglichkeit und Expression eines Clusters über die Regulation des Kondensierungsgrades und kooperieren häufig mit Chromatinisolatoren, die die Kontrollregion begrenzen (s. S. 105). Eine weitere Klasse von Regulationssequenzen bilden die Enhancer blockierenden Isolatoren, die immer zwischen dem Enhancer und dem zu isolierenden Promotor liegen. Auch an diese DNA-Sequenzen binden spezifische Proteine, die mit weiteren Proteinen interagieren können. Einzelne Kontrollsequenzen können zu komplexen genetischen Schaltern oder Modulen zusammengesetzt sein, die sowohl Bindestellen für Aktivator- als auch für Repressorproteine enthalten. Solche Schalter findet man besonders bei Genen, bei deren Expressionsregulation eine Vielzahl von Signalen wahrgenommen und verrechnet werden muss. Eukaryoten besitzen also sehr große Regulationsbereiche, die sich aus einer Vielzahl von Sequenzmotiven zusammensetzen. Wirkungsweise der Aktivatorproteine Aktivatorproteine erhöhen die Transkriptionsgeschwindigkeit um das bis zu 1.000fache, indem sie die allgemeinen TFs und die Pol II bzw. das RNAP-Holoenzym rekrutieren, am Promotor positionieren und den Gesamtkomplex so verändern, dass die Transkription beginnen kann. Aktivatoren interagieren je nach Spezifikation mit dem Mediator, mit einzelnen allgemeinen TFs, mit HATs oder mit Chromatinumformungskomplexen. Aktivatorproteine arbeiten synergetisch, d. h., der Gesamteffekt ist größer als die Summe der Einzeleffekte. Eine Besonderheit stellen die Enhancer-Komplexe dar, die DNA-bindende Aktivatorproteine, Coaktivatoren und Architekturproteine enthalten können. Durch die durch sie verursachte starke Biegung der DNA können weitere Interaktionen zwischen Aktivatoren und Transkriptionsapparat forciert werden, auch wenn diese weit voneinander entfernt liegen. 115

17 VI. EXPRESSIONSREGULATION 4. TRANSKRIPTION: Eukaryoten MECHANISMEN DER REPRESSORPROTEINE Aktivatoren und Repressoren können sich bei überlappenden Bindestellen gegenseitig kompetitiv hemmen. Viele Aktivatorproteine sind Hetero- oder Homodimere und erst als Dimere voll funktionsfähig. Einige Repressorproteine wirken, indem sie an Aktivatormonomere binden und sie dadurch deaktivieren. Aktivatorprotein Repressorprotein Die Repressordomäne kann die Aktivatordomäne eines benachbart angebundenen Aktivatorproteins maskieren und somit deaktivieren. Bindung von Histon-Deacetylasen/ Chromatinumformungskomplexen Repressorproteine können mit allgemeinen Transkriptionsfaktoren interagieren und dadurch die Assemblierung des Initialkomplexes und/oder Interaktionen mit Aktivatorproteinen unterbinden. Repressorproteine können durch Hinzuziehen von Histon-Deacetylasen oder Chromatinumformungskomplexen DNA-Bereiche mit Aktivatorbindestellen oder Promotoren heterochromatisieren und dadurch für Aktivatoren und TFs unzugänglich machen. e) Die Aktivierung eines Gens durch Aktivatorproteine beinhaltet folgende Schritte, deren Reihenfolge jedoch nicht obligatorisch ist: 1) Aktivatoren binden an Chromatin und rekrutieren Chromatinumformungskomplexe. 2) Nach der Chromatinumformung binden Histonmodifizierende Enzyme an die freigelegten DNA-Sequenzen. 3) Nach der Chromatinauflockerung binden zusätzliche Aktivatorproteine an die nun erreichbaren Genkontrollregionen. 4) Allgemeine TFs und das RNAP-Holoenzym werden rekrutiert und der Prä-Initiationskomplex wird aufgebaut. 5) Weitere Aktivatorproteine führen zu einer Umordung innerhalb des Prä-Initiationskomplexes, wodurch die Transkription gestartet wird. Wirkungsweise der Repressorproteine Repressorproteine wirken auf sehr verschiedenartige Weisen, z. B.: Bei überlappenden Bindesequenzen für Aktivator- und Repressorproteinen kann ein gebundener Repressor die Bindung eines Aktivators verhindern. Ein Repressor kann die Aktivatordomäne eines Aktivators maskieren. Gebundene Repressoren können direkt mit allgemeinen TFs interagieren und die Ausbildung eines funktionsfähigen Prä-Initiationskomplexes verhindern. Repressorproteine können Chromatinumformungskom- f) g) plexe rekrutieren, die das Chromatin verdichten. Sie können Histon-Deacetylasen binden, durch die ebenfalls eine Chromatinverdichtung induziert wird. Bei dimerisierenden Aktivatoren können Repressoren mit den Aktivatormonomeren Heterodimere bilden, so dass keine funktionsfähigen Aktivatordimere entstehen können. Wirkungsweise der Isolatorproteine Eine Wirkungsweise der Enhancer-blockierenden Isolatoren ist die Aggregation der an mehrere Isolatoren gebundenen Proteine, wodurch DNA-Schlaufen entstehen, die die Enhancer-Promotor-Interaktionen, die ja ebenfalls auf DNA-Schlaufenbildungen beruhen, unterbinden. Enhancer und Promotor werden also getrennt anstatt zusammengeführt. kombinatorische Regulation Ein besonderes Kennzeichen der eukaryotischen Expressionsregulation ist die enorme Komplexität der interagierenden Faktoren: Bestimmte Regulationsproteine müssen als Homo- oder Heterodimere vorliegen, ehe sie an ihre Kontrollsequenzen binden können; an Enhancern und Silencern müssen sich erst verschiedene Regulatorproteine zu einem Komplex ansammeln, ehe diese Regulationselemente wirksam werden können, und komplexe genetische Schalter können in Abhängigkeit der in der Zelle synthetisierten Regulatorproteinen als Verstärker- oder als Drosselelemente wirken. 116