Untersuchungen zum Zusammenspiel von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur und Zellzykluskontrolle nach ionisierender Strahlung

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1 Aus dem Bereich Theoretische Medizin und Biowissenschaften Fachrichtung Biophysik der Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes, Homburg/Saar Untersuchungen zum Zusammenspiel von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur und Zellzykluskontrolle nach ionisierender Strahlung Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Medizinischen Fakultät der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES 2007 vorgelegt von Dipl.-Biol. Dorothee Deckbar geb. am: in: Werneck/Ufr.

2 Erstgutachten: Zweitgutachten: Prof. Dr. Markus Löbrich Prof. Dr. Klaus Römer

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4 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis...i 1. ZUSAMMENFASSUNG/ SUMMARY EINLEITUNG Strahlenbiologische Grundlagen Strahlenphysikalische Grundlagen Arten Strahlen-induzierter DNA-Schäden Biologische Auswirkungen Strahlen-induzierter DNA-Schäden Arten von Chromosomenaberrationen und deren Entstehung Dosis-Effekt-Kurven und Krebsrisiko im Niedrig-Dosis-Bereich DSB-Schadensantwort in eukaryotischen Zellen Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen Nicht-homologes End-joining (NHEJ) Homologe Rekombination (HR) Zellzyklus und Zellzykluskontrolle Der G1/S- und der intras-checkpoint Der G2/M-Checkpoint Chromosomeninstabilitätssyndrome in Zusammenhang mit der DSB- Schadensantwort Ataxia telangiectasia Artemis Weitere Chromosomeninstabilitätssyndrome Nachweisverfahren von DNA-Doppelstrangbrüchen Pulsfeld-Gelelektrophorese Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) Chromosomenaberrationen Zielsetzung Messung von Chromosomenaberrationen nach Bestrahlung mit niedrigen Dosen ionisierender Strahlung... 38

5 Inhaltsverzeichnis Untersuchungen zum Zusammenspiel von DSB-Reparatur und Zellzykluskontrolle MATERIAL UND METHODEN Materialien und Geräte Chemikalien und Zusammensetzung verwendeter Lösungen Verwendete Chemikalien Verwendete Lösungen Antikörper Zelllinien und Zellkultur Zelllinien Zellkultur Kryokonservierung von Zellen Auftauen von Zellen Röntgenbestrahlung Chromosomale Analysen Metaphasen-Präparation auf Objektträgern PCC (premature chromosome condensation) in G Giemsa-Färbung Aufnahme und Auswertung der Giemsa-gefärbten Präparate Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) Protein-Verdau und Vorbehandlung der Objektträger Denaturierung der Sonden und Hybridisierung Post-Hybridisierung bei 3-Farben-FISH Aufnahme und Auswertung der Fluoreszenz-Bilder Immunfluoreszenz-Studien Fixierung von Zellen für Immunfluoreszenz-Färbung CENP-F/γH2AX-Doppelfärbung ΒrdU/γH2AX-Doppelfärbung Auswertung der γh2ax-foci... 52

6 Inhaltsverzeichnis 3.7. Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) Zellkultivierung, Markierung mit Methyl- 3 H-Thymidin Isolierung genomischer DNA für Pulsfeld-Gelelektrophorese Pulsfeld-Gelelektrophorese Gelfärbung und dokumentation Eluierung der genomischen DNA aus den Agarose-Blöckchen, Szintillationsmessung und Auswertung Durchflusszytometrische Untersuchungen BrdU-Markierung und Fixierung für Durchflusszytometrie BrdU-Färbung für Durchflusszytometrie phosphoh3-färbung für Durchflusszytometrie Messung am Durchflusszytometer ERGEBNISSE Dosis-Effekt-Kurve nach niedrigen Dosen ionisierender Strahlung Untersuchung des Zellzyklusverhaltens mittels Durchflusszytometrie (FACS) nach ionisierender Bestrahlung Bestimmung der Dosis-Effekt-Kurve in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Bestimmung der Dosis-Effekt-Kurve nach zweiwöchiger Wachstumsphase nach Bestrahlung (Lang-Zeit-Experimente) Untersuchungen zur Entstehung von Chromosomenaberrationen nach ionisierender Strahlung Auswirkungen einer Bestrahlung in der S-Phase auf Zellzyklusprogression und DSB-Reparatur Untersuchungen zur DSB-Reparatur nach einer Bestrahlung in der S-Phase mittels γh2ax-immunfluoreszenz-mikroskopie DSB-Reparatur nach Bestrahlung in der G2-Phase in AT- und Artemis-Zellen Die Wirksamkeit von Aphidicolin in primären humanen Fibroblasten Messung der DSB-Reparatur in der G2-Phase mittels Premature chromosome condensation (PCC) Messung der DSB-Reparatur in der G2-Phase mittels Pulsfeld- Gelelektrophorese (PFGE)... 75

7 Inhaltsverzeichnis Etablierung von Zellsystemen zur Untersuchung der Reparatur- und der Checkpoint-Funktion von ATM Untersuchung zur Induktion des ATM- abhängigen G2/M-Checkpoints in WT-, AT- und Artemis-Zellen nach Bestrahlung in der G2-Phase Chemische Inhibierung des G2/M-Checkpoints Einfluss des Chk1/2-Inhibitors SB auf den G2/M-Checkpoint Einfluss des Chk1/2-Inhibitors SB auf die DSB-Reparatur Chromosomale Studien in der Mitose nach Bestrahlung in der G2-Phase Abschätzung der Gesamtzahl an mitotischen Brüchen einer in der G2-Phase bestrahlten Zellpopulation Ein neues Konzept zur Betrachtung von Chromosomenaberrationen Abschätzung der Gesamtzahl mitotischer Brüche anhand durchflusszytometrischer Untersuchung BrdU-markierter G2-Zellen nach ionisierender Bestrahlung Abschätzung der Gesamtzahl mitotischer Brüche mittels phosphoh3-analyse von in der G2-Phase bestrahlten Zellen Weiterführende Pilot-Experimente und Ausblick DISKUSSION Dosis-Effekt-Kurve im Niedrig-Dosis-Bereich Vor- und Nachteile der Methode zur Messung von Chromosomenaberrationen im Niedrig-Dosis-Bereich Dosis-Effekt-Kurven in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung Dosis-Effekt-Kurven nach zweiwöchiger Kultivierung Dosis-Effekt-Kurven und Krebsrisiko Über das Reparaturverhalten von AT- und Artemis-Zellen in der G2-Phase Über die Regulation des G2/M-Checkpoints in AT- und Artemis-Zellen Regulation des ATM-unabhängigen G2/M-Checkpoints Regulation des ATM-abhängigen G2/M-Checkpoints Über das Zusammenspiel von DSB-Reparatur und Checkpoints in der G2-Phase Chromosomale Untersuchungen in der Mitose

8 Inhaltsverzeichnis Ein neues Konzept zur Betrachtung chromosomaler Studien Der Schwellencharakter des G2/M-Checkpoints Weiterführende Studien - Ausblick LITERATURVERZEICHNIS Anhang I Publikationen Danksagung Lebenslauf...162

9 Abkürzungsverzeichnis i Abkürzungsverzeichnis Art Artemis AT Ataxia Telangiektasia ATM Ataxia Telangiectasia Mutated Bq Becquerel (Einheit der Radioaktivität) BrdU 5-Bromo-2 deoxy-uridin BSA bovines Serum Albumin CENP-F Zentromer-Protein F DAPI 4',6-Diamidino-2-phenylindol DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DNA-PK CS katalytische Untereinheit der DNA-Proteinkinase DSB DNA-Doppelstrangbruch ECACC European Collection of Animal Cell Culture EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ESB Einzelstrangbruch FACS Fluorescence-activated Cell Sorting FAR Fraction of radioactivity released FCS Fötales Kälberserum FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FITC Fluoreszeinisothiocyanat G1-Phase erste gap-phase im Zellzyklus G2-Phase zweite gap-phase im Zellzyklus Gy Gray (Einheit der Strahlungsdosis) H 2 O dest. destilliertes Wasser HR Homologe Rekombination htert human Telomerase reverse transcriptase IFM Immunfluoreszenz-Mikroskopie IR Ionising radiation (Ionisierende Strahlung) kv Kilovolt LET Linearer Energietransfer Lig4 Ligase 4 LMDS Locally multiply damaged site

10 Abkürzungsverzeichnis ii LNT-Modell Mbp MEM MI MRN-Komplex NBS NEAA NHEJ PBS PCC PFGE PI PIKK RDS RT SDS S-Phase SSC ssdna Sv TBE TE TR Tris UV V(D)J v/v w/v WT XRCC Linear-no-threshold-Modell Megabasenpaare Minimal essential medium mitotischer Index Mre11-Rad50-NBS1-Komplex Nijmegen Breakage Syndrome Non-essential amino acids Nicht-homologes Endjoining Phosphate buffered saline Premature chromosome condensation Pulsfeld-Gelelektrophorese Propidiumiodid Phosphatidyl-inositol-3-Kinase-ähnliche Kinase radio-resistant DNA-synthesis Raumtemperatur Sodiumdodecylsulfat Synthese-Phase Saline-sodium citrat buffer Einzelstrang-DNA Sievert (Einheit der Äquivalentdosis) Tris-Borsäure-EDTA Tris-EDTA Texas Red Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Ultraviolett Variable (diversity) joining volume per volume (Volumenprozent) weight per volume (Gewichtsprozent) Wildtyp X-ray-cross-complementing

11 Zusammenfassung 1 1. Zusammenfassung/ Summary Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Entstehung von Chromosomenaberrationen nach Röntgenbestrahlung im Dosis-Bereich 1Gy untersucht, um Rückschlüsse auf ein potentielles Krebsrisiko in einem für den Strahlenschutz relevanten Dosis-Bereich zu ziehen. Zu diesem Zweck wurden mittels Premature chromosome condensation (PCC) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) Dosis-Effekt-Kurven für unreparierte Chromosomenbrüche sowie Translokationen in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung erstellt. Hierbei stiegen sowohl Chromosomenbrüche als auch Translokationen zwischen 250mGy und 1Gy annähernd linear mit der Dosis an. Ausgehend von der Annahme, dass nur Aberrationen für die Entstehung kanzerogenen Wachstums ausschlaggebend sind, welche für die Zelle nicht letal sind, wurden nach Bestrahlung und zweiwöchiger Wachstumsphase erneut Dosis-Effekt- Kurven erstellt. Dabei stiegen in erster Linie die Translokationen linear mit der Dosis an, wenn auch auf wesentlich niedrigerem Niveau als in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung. Ein Teil der induzierten Translokationen waren somit letale Ereignisse, während stabile nichtletale Aberrationen in der Population über zwei Wochen erhalten blieben. Diese Daten sind mit epidemiologischen Studien oberhalb von 250mGy sowie dem daraus resultierenden Linear-no-threshold-Modell, welches bis heute zur Beschreibung des Krebsrisikos im Niedrig-Dosis-Bereich herangezogen wird, konsistent. Die Tatsache, dass Zellen mit Aberrationen die S-Phase durchlaufen, warf die Frage nach den Entstehungsmechanismen der Aberrationen auf. Die Zelle besitzt in erster Linie zwei Mechanismen, um die Erhaltung der chromosomalen Integrität zu gewährleisten. Reparaturmechanismen beseitigen DNA-Schäden, während Checkpoints die Proliferation verlangsamen, um Zeit für die Reparatur zur Verfügung zu stellen. Somit wurde im weiteren Verlauf das Zusammenspiel dieser Funktionen untersucht. Dazu wurden Zellsysteme etabliert, welche defizient in einer oder beiden Funktionen waren, wobei besonderes Augenmerk auf die Reparatur in der G2-Phase bzw. die Regulation des G2/M-Checkpoints gerichtet wurde. Zellen von Patienten mit der Krankheit Ataxia telangiectasia (AT) besitzen Defekte in der Zellzykluskontrolle. Weiterhin ist das in diesen Zellen defekte Protein ATM in der G0/G1- Phase gemeinsam mit der Nuklease Artemis an der Reparatur einer Unterklasse von Doppelstrangbrüchen beteiligt (Riballo et al., 2004). Mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese und PCC wurde in AT- und Artemis-Zellen derselbe Reparaturdefekt in der G2-Phase nachgewiesen, wohingegen anhand durchflusszytometrischer Untersuchungen gezeigt wurde, dass Artemis-Zellen, im Gegensatz zu AT-Zellen, den G2/M-Checkpoint induzieren. Mit AT-

12 Zusammenfassung 2 Zellen stand somit ein Zellsystem zur Verfügung, welches in der G2-Phase einen dualen Defekt aufweist, während Artemis-Zellen nur in der Reparatur defizient sind. Des Weiteren stand durch den Einsatz eines Chk1/2-Inhibitors in WT-Zellen ein Zellsystem zur Verfügung, welches Reparatur-profizient ist, aber denselben Checkpoint-Defekt wie AT-Zellen besitzt. Nach Etablierung der benötigten Zellsysteme wurde das Zusammenspiel von Reparatur und Checkpoints bei der Erhaltung der genomischen Integrität untersucht. Chromosomale Studien in der Mitose an in der G2-Phase bestrahlten Zellen zeigten, dass sowohl die Reparaturfunktion als auch die Checkpointfunktion einen Beitrag zur Vermeidung chromosomaler Brüche in der Mitose leisten. In dieser Art der Auswertung wurde die Anzahl der Brüche pro mitotischer Zelle bestimmt. Aus den Zellzyklusstudien war jedoch ersichtlich, dass sich die verschiedenen Zelllinien in Abhängigkeit von ihrem Checkpointstatus in ihrer Progression in die Mitose unterscheiden. Daher wurde ein neues Konzept zur Auswertung von Chromosomenstudien entwickelt, welches die Anzahl aller mitotischen Brüche einer in der G2-Phase bestrahlten Population von Zellen unter Berücksichtigung des unterschiedlichen Checkpoint-Verhaltens betrachtet. Dies führte zu dem Ergebnis, dass bei Checkpointprofizienten Zelllinien die meisten mitotischen Brüche zu den Zeiten auftreten, zu denen der Checkpoint aufgehoben wird. So fand die Aufhebung des G2/M-Checkpoints in Artemis- Zellen aufgrund des durch den Reparaturdefekt vorhandenen erhöhten Niveaus an Doppelstrangbrüchen zu einem späteren Zeitpunkt statt als in WT-Zellen. Durch die Kooperation von Reparatur und Checkpoint entstand somit nur eine marginale Erhöhung der mitotischen Brüche in Artemis-Zellen gegenüber WT-Zellen. Eine alleinige Checkpoint- Defizienz führte zu einer deutlicheren Erhöhung der mitotischen Brüche, während der duale Defekt, repräsentiert durch AT-Zellen, die größte Erhöhung an mitotischen Brüchen bewirkte. Der gleichzeitige Ausfall von Checkpoint und Reparatur bewirkte somit einen Anstieg der mitotischen Brüche, welcher über den der einzelnen Defekte sowie die Summe der Erhöhungen der einzelnen Defekte hinausging. Daraus wurde geschlossen, dass Reparatur und Checkpoints synergistisch und nicht additiv wirken. Aus den Chromosomenstudien geht des Weiteren hervor, dass der G2/M-Checkpoint sowohl in WT- als auch in Artemis-Zellen zu einem Zeitpunkt aufgehoben wird, zu dem alle Zellen im Schnitt 3-4 PCC-Brüche bzw. 1-2 mitotische Brüche aufweisen. Dies führte zu dem Schluss, dass der G2/M-Checkpoint einen Schwellenwert an Doppelstrangbrüchen besitzt, unterhalb dessen er aufgehoben wird. Unter der Annahme, dass ein PCC-Bruch 3-6 Doppelstrangbrüchen entspricht, liegt dieser Schwellenwert bei Doppelstrangbrüchen.

13 Zusammenfassung 3 Abschließend wurden Pilot-Experimente durchgeführt, welche die Auswirkungen des Durchlaufens der Mitose mit unreparierten Brüchen auf den nachfolgenden Zellzyklus klären sollten. So zeigten Zellen, welche in der G2-Phase bestrahlt wurden, einen Arrest in der anschließenden G1-Phase. Dies führte zu der Annahme, dass Doppelstrangbrüche nach Passieren der Mitose schwieriger zu reparieren sind als Doppelstrangbrüche, welche in der G1-Phase entstanden waren, und dass der G1/S-Checkpoint empfindlicher auf das Schadensniveau reagiert als der G2/M-Checkpoint. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Doppelstrangbruch-Reparatur und Checkpoint-Kontrolle kooperieren. Der G2/M-Checkpoint ist dabei nicht perfekt, sondern er entlässt Zellen mit Doppelstrangbrüchen in die Mitose. Welche Implikationen dies für die Entstehung einer Strahlen-induzierten genomischen Instabilität hat, bleibt in nachfolgenden Arbeiten zu klären. In the first part of this work the development of chromosome aberrations after X-irradiation with doses 1Gy was investigated to draw conclusions for the potential cancer risk in a dose range relevant for radiation protection. Using premature chromosome condensation (PCC) and fluorescence-in-situ-hybridisation (FISH) dose-effect-curves for unrepaired chromosome breaks and translocations were established in the first G2-phase after irradiation. In the dose range between 250mGy and 1Gy chromosome breaks as well as translocations increased nearly linearly. Based on the assumption that only non-lethal aberrations are crucial for the development of carcinogenic growth, dose-effect-curves were generated after a two-week period of permanent sub-cultivation following irradiation. In this case, predominantly translocations increased linearly with dose even though at a significantly lower level than in the first G2-phase after irradiation. Therefore, a fraction of the induced translocations were lethal, whereas non-lethal aberrations persisted in the population over a period of at least two weeks. These data are consistent with epidemiological studies and the resulting Linear-nothreshold-model which is used to describe the cancer risk in the low-dose range. The fact that cells passage the S-phase with aberrations raised the question of how they develop. A cell possesses two mechanisms to maintain its chromosomal integrity: repair mechanisms remove DNA-damage while checkpoints slow down the proliferation to provide time for repair. To investigate the interplay of these functions, cell systems were established which were deficient in one or both functions. Special emphasis was placed on repair in G2 and the G2/M checkpoint. Cells of patients with the desease ataxia telangiectasia (AT) display have defects in the regulation of the cell cycle. Furthermore, ATM, the protein which is defect

14 Zusammenfassung 4 in these cells, together with the nuclease Artemis participates in the repair of a subset of DNA-double-strand breaks in G0/G1 (Riballo et al., 2004). Utilising pulsed-field gelelectrophoresis and PCC a similar repair defect could be demonstrated in the G2 phase. Flow cytometry analyses demonstrated that Artemis-cells, unlike AT-cells, are proficient in the induction of the G2/M checkpoint. Thus, AT-cells provide a cell system which harbour a dual defiency whereas Artemis-deficient cells display the repair defect and not the checkpoint defect. By utilising a Chk1/2-inibiting drug in WT-cells a cell system was available which is repair-proficient but has the same checkpoint defect as AT-cells. Having established the required cell systems, the interplay of repair and checkpoint control in maintaining chromosomal integrity was investigated. Chromosomal studies in mitosis after irradiation in G2 showed that repair as well as checkpoint control both contribute to the avoidance of chromosomal breakage in mitosis. So far, only the number of breaks per mitotic cell was detected. The cell cycle analyses revealed that different cell lines vary in their progression into mitosis after irradiation and therefore in the number of cells reaching mitosis at a specific time. Applying a new concept for the evaluation of chromosomal studies, the total number of mitotic breaks of a G2-irradiated cell population was examined under consideration of the different checkpoint behaviour. This demonstrated that in checkpoint-proficient cells the majority of mitotic breaks arise at times when the checkpoint is abrogated. In Artemis-cells this took place at a later time than in WT-cells due to the elevated levels of double-strand breaks resulting from Artemis repair defect. As a result of the cooperation between repair and checkpoint control the total number of mitotic breaks was only slightly increased in Artemiscells compared to WT-cells. Checkpoint deficiency alone resulted in a stronger increase of mitotic breaks, while the dual deficiency, represented by AT-cells, led to the strongest increase of mitotic breaks. Therefore, the dual deficiency resulted in a higher level of mitotic breaks than the sum of each deficiency alone. This led to the conclusion that repair and checkpoints do not operate additively but in a synergistic manner. The chromosomal studies also indicate that the G2/M checkpoint in WT-cells as well as in Artemis-cells is abrogated at times when a cell harbours 3-4 PCC breaks or 1-2 mitotic breaks. This led to the conclusion that the G2/M checkpoint is characterised by a threshold of double-strand breaks below which cells are released into mitosis. Under the assumption that a PCC break corresponds to 3-6 double-strand breaks the threshold lies between 10 and 20 double-strand breaks. Finally, pilot experiments should clearify the consequences on the following cell cycle when a cell passages mitosis with unrepaired breaks. Cells irradiated in G2 arrested in the subsequent

15 Zusammenfassung 5 G1 phase. This led to the conclusion that double-strand breaks may be harder to repair after cell division than double-strand breaks induced by irradiation in G1. Additionally, the G1/S checkpoint is probably more sensitive than the G2/M checkpoint. In this work it could be demonstrated that double-strand break repair and checkpoint control cooperate. The G2/M checkpoint is not perfect but releases cells into mitosis with double-strand breaks. The implication of this for the development of irradiation-induced genomic instability, however, needs further investigations.

16 Einleitung 6 2. Einleitung 2.1. Strahlenbiologische Grundlagen Die DNA in der Zelle wird ständig durch verschiedene Einflüsse geschädigt. Dies geschieht zum einen endogen durch natürliche Vorgänge wie der Meiose, der V(D)J-Rekombination oder durch Produkte oxidativer Stoffwechselwege. Exogen können DNA-Schäden durch chemische Agenzien oder Strahlung erzeugt werden. Die Strahlenbiologie untersucht die Wirkungen ionisierender Strahlung (ionising radiation; IR) auf biologische Systeme. Um diese Einflüsse zu verstehen, ist es notwendig, sowohl physikalische Grundlagen zu betrachten, als auch die Auswirkungen auf zellulärer Ebene zu studieren Strahlenphysikalische Grundlagen Prinzipiell lässt sich IR in Teilchenstrahlung und elektromagnetische Wellen unterteilen. Teilchenstrahlung kann z.b. aus Elektronen, Protonen, α-teilchen oder Schwerionen bestehen. Elektromagnetische Strahlung wird abhängig von der Wellenlänge und der Herkunft in Röntgen- und γ-strahlung unterteilt. Trifft IR auf biologisches Gewebe und wird dort absorbiert, führt dies zu Anregungen oder Ionisationen im Gewebe. Elektromagnetische Strahlung lässt sich als ein Strom von Photonen darstellen. Dabei besitzt jedes einzelne Photon prinzipiell genügend Energie, um eine Ionisation hervorrufen zu können. In Abhängigkeit von der Photonenenergie kommt es zu unterschiedlichen Wechselwirkungen mit der bestrahlten Materie. So dominiert bei hochenergetischer Röntgenstrahlung der Compton-Effekt. Dabei schlägt das auftreffende Photon ein Elektron aus der äußeren Hülle des absorbierenden Atoms. Das Photon gibt einen Teil seiner Energie an das Elektron ab, wird von seiner Bahn abgelenkt und kann, jetzt mit niedrigerer Energie, weitere Ionisationen verursachen. Das freigesetzte Sekundärelektron besitzt in der Regel eine ausreichend hohe Energie, um beim Auftreffen auf andere Atome oder Moleküle ebenfalls Ionisationen zu verursachen. Bei niederenergetischer Röntgenstrahlung (< 60kV) dominiert der photoelektrische Effekt. Dabei interagiert das auftreffende Photon mit einem Elektron einer Kernnahen Schale des absorbierenden Atoms. Das Photon gibt dabei seine gesamte Energie an das Elektron ab. Da ein Teil der Energie zur Überwindung der Bindungsenergie aufgebracht werden muss, besitzt das Elektron eine geringfügig niedrigere Energie als das Photon. Das Elektron verlässt dadurch sein Orbital und kann als freies Sekundärelektron weitere Ionisationen bewirken.

17 Einleitung 7 Die Energie von IR wird nicht gleichmäßig über den gesamten Zellkern abgegeben, sondern entlang der Bahnspuren der geladenen Teilchen oder der Sekundärelektronen deponiert. In Abhängigkeit von der Ionisationsdichte entlang der Bahnspuren wird die Strahlung in dicht und dünn ionisierende Strahlung unterteilt. Dabei wird die pro Wegstrecke abgegebene Energie als LET (linear energy transfer) definiert. Der LET ist bei dünn ionisierender Strahlung wie γ- oder Röntgenstrahlung klein, da die entstehenden Sekundärelektronen innerhalb ihrer Spur vergleichsweise wenige Ionisationen erzeugen. Beim Durchtritt eines α- Teilchens durch den Zellkern werden dagegen entlang der Bahnspur tausende von Ionisationen erzeugt, weshalb Teilchenstrahlung einen hohen LET besitzt. Die biologische Wirkung einer Strahlung richtet sich neben dem LET nach ihrer Dosis. Dabei ist die Dosis definiert als absorbierte Energie pro Masse und wird in der Einheit Gy (Gray) angegeben. Die biologische Wirkung IR beruht auf Wechselwirkungen mit der DNA als kritischem Angriffspunkt (Abb. 2.1). Direkte Ionisationen an der DNA werden entweder von der hochenergetischen Teilchenstrahlung selbst oder von Sekundärelektronen hervorgerufen und bewirken direkt eine chemische Veränderung wie das Aufbrechen kovalenter Bindungen. Eine indirekte Ionisation kommt meist durch dünn ionisierende Röntgen- oder γ-strahlung zustande. Dabei gibt das Photon genügend Energie an das absorbierende Material ab, so dass dort Sekundärelektronen entstehen, welche über die Bildung von Radikalen die DNA schädigen können (Hall, 2000). Abb. 2.1: Direkte und indirekte Wirkung ionisierender Strahlung. Beim direkten Effekt wechselwirkt ein Sekundärelektron, welches durch Absorption eines Photons durch ein Atom oder Molekül entstanden ist, direkt mit der DNA. Beim indirekten Effekt wechselwirkt das Sekundärelektron mit z.b. einem Wassermolekül, was zur Entstehung von Hydroxylradikalen (OH ) führt. Diese Hydroxylradikale können nun Schäden an der DNA hervorrufen. Bei dicht ionisierender Strahlung überwiegt der direkte Strahleneffekt, bei dünn ionisierender Strahlung der indirekte Effekt. (S = Zucker; P = Phosphat; A = Adenin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin) (aus: Hall, 2000)

18 Einleitung 8 Da Zellen zu etwa 80% aus Wasser bestehen, sind Wassermoleküle meist die ersten Interaktionspartner von Photonen. Trifft ein Photon mit ausreichend hoher Energie auf ein Wassermolekül, wird dieses ionisiert. Dabei entstehen ein Elektron und ein ionisches Radikal (H 2 O + ). H 2 O H 2 O + + e - (Ionisation) H 2 O + + H 2 O H 3 O + + OH Dieses ionische Radikal besitzt eine positive Ladung und ein ungepaartes Elektron in der äußeren Schale. Dadurch ist es sehr reaktiv und hat nur eine kurze Halbwertszeit von ~ Sekunden. Das ionische Radikal reagiert mit anderen Wassermolekülen, was zur Bildung von freien Hydroxylradikalen (OH ) führt. Diese freien Radikale sind chemisch hoch reaktiv und besitzen aufgrund ihrer Kurzlebigkeit eine kurze Reichweite. Entstehen diese Hydroxylradikale im Abstand von nur wenigen Nanometern zur DNA, können sie dort chemische Veränderungen hervorrufen und damit DNA-Schäden induzieren. Neben der Ionisierung eines Wassermoleküls kann es auch zu dessen Anregung und zur anschließenden Homolyse des Wassermoleküls kommen. Dabei entsteht neben einem Hydroxylradikal zusätzlich ein Wasserstoffradikal. H 2 O H + OH (Spaltung) Somit entstehen durch Strahlung in Anwesenheit von Wasser durch die Bildung freier Elektronen sowie von Hydroxyl- und Wasserstoffradikalen drei Arten reaktiver Spezies, welche die DNA schädigen (Goodhead, 1989; Riley, 1994) Arten Strahlen-induzierter DNA-Schäden Bereits frühe Experimente zeigten, dass eine Bestrahlung des Zellkerns das Überleben von Zellen wesentlich stärker beeinträchtigte als eine Bestrahlung des Cytoplasmas (Munro, 1970). Weitere Experimente deuteten darauf hin, dass dabei die DNA das kritische Ziel IR ist. Heute weiß man, dass die durch Strahlung induzierten ionisierenden Moleküle, insbesondere die Hydroxylradikale, eine große Bandbreite an Läsionen an der DNA verursachen können. In ausführlichen Studien wurde gezeigt, dass Hydroxylradikale besonders die C5=C6- Doppelbindungen von Pyrimidinen angreifen. Auf diese Weise entstehen Derivate wie z.b. Thyminglykole (Ward, 1988). Eine weitere Basenmodifikation ist das 8-Oxoguanin, welches häufig zu einer Fehlpaarung bei der darauf folgenden DNA-Synthese führt. Des Weiteren

19 Einleitung 9 können Purinreste zyklieren, wodurch Produkte wie z.b. Cyclodeoxyguanosin gebildet werden und eine Verzerrung der Doppelhelixstruktur bewirken (Dizdaroglu et al., 1987). Neben UV-Strahlung kann auch IR durch Anregungen gelegentlich zur Ausbildung von Dimeren zwischen benachbarten Basen desselben Stranges wie z.b. einem Thymidin-Dimer führen. Dies beeinträchtigt die DNA-Synthese und kann im schlimmsten Fall ein Absterben der Zelle bewirken (Setlow et al., 1963; Prakash & Prakash, 2002). Durch direkte Ionisation oder Reaktion eines Hydroxylradikals mit der Desoxyribose des Zucker-Phosphat-Rückgrats der DNA kann es zur Entstehung eines Desoxyribose-Radikals kommen (Breen & Murphy, 1995). Durch verschiedene Mechanismen kann dieses Zuckerradikal zum Entstehen eines Einzelstrangbruchs führen (Friedberg et al., 2006). Wird eine große Menge Energie auf kleinem Raum abgegeben, entstehen lokal begrenzt eine große Anzahl an Hydroxylradikalen. Da diese Radikale nur eine Reichweite von wenigen Nanometern haben, dafür aber hochreaktiv sind, kommt es in der Regel zu einer Anhäufung von Basenschäden oder Schäden des Zucker-Phosphat-Rückgrats im Bereich weniger Basenpaare (Hutchinson, 1985; Goodhead, 1989). Diese Locally multiply damaged sites (LMDS) werden nur durch jeweils eine Bahnspur erzeugt (Abb. 2.2). Die Wahrscheinlichkeit für deren Auftreten erhöht sich dabei mit der Dosis sowie mit dem LET der jeweiligen Strahlung (Prise et al., 1994; Holley & Chatterjee, 1996). Ein Beispiel für eine LMDS ist der DNA-Doppelstrangbruch (DSB). Dieser tritt auf, wenn das Zucker-Phosphat-Rückgrat beider Stränge gleichzeitig in einem Bereich von etwa 10bp Abb. 2.2: Schematische Darstellung einer Locally Multiply Damaged Site (LMDS). Die Energie von IR wird nicht kontinuierlich über den gesamten Zellkern verteilt abgegeben, sondern in diskreten Portionen entlang der Bahnspur eines geladenen Teilchens oder Sekundärelektrons. Die Ausmaße der ionisierten Bereiche (spurs und blobs) sind dabei vergleichbar mit dem Durchmesser der DNA-Doppelhelix. Tritt eine Ionisation in der Nähe der DNA auf, so kommt es zu zahlreichen Ionisationen innerhalb eines bestimmten Bereichs der DNA, so dass viele Schäden auf eng begrenztem Raum auftreten. (aus: Hall, 2000)

20 Einleitung 10 durch den Angriff von Radikalen oder durch direkte Ionisierung geschädigt wird. Die wenigsten DSBs besitzen dabei glatte Enden, wie man sie z.b. nach Behandlung mit einem Restriktionsenzym erhält. In der Regel befinden sich im Bereich des Bruchs weitere Schäden wie die bereits erwähnten Basenmodifikationen. Oftmals fehlt auch die 3 -OH-Gruppe, Phosphatgruppen oder die terminale Base, so dass diese DSBs nicht durch einen einfachen Ligationsschritt repariert werden können (Henner et al., 1982; Obe et al., 1992; Goodhead, 1994). Die genaue Morphologie dieser schwer reparierbaren Brüche ist bis heute weitestgehend ungeklärt. Im Folgenden sollen diese Brüche als komplex bezeichnet werden Biologische Auswirkungen Strahlen-induzierter DNA-Schäden Wird die DNA durch die Einwirkung IR geschädigt und ist die Zelle nicht in der Lage, die Schäden korrekt zu reparieren, kann es zu Mutationen kommen. So kann die Veränderung einzelner Basen zu Punktmutationen führen, bei denen eine Base durch eine andere Base ersetzt wird. Ein Beispiel für eine solche Punktmutation wäre die GC-TA-Transversion nach dem Auftreten von 8-Oxoguanin (Cheng et al., 1992). Besonders wichtig sind diese Basensubstitutionen, wenn codierende Bereiche von Genen betroffen sind. So kann es zu missense- Mutationen kommen, d.h. das Codon einer Aminosäure wird so verändert, dass es nun für eine andere Aminosäure codiert. Mögliche Folgen wären ein partieller oder kompletter Funktionsverlust oder eine Änderung in der Funktion des Proteins. Wird das Codon einer Aminosäure in ein Stop-Codon verändert, so spricht man von einer nonsense-mutation. Da hierbei die Synthese des Proteins frühzeitig abgebrochen wird, führt diese Art der Mutation meist ebenfalls zu einem partiellen oder kompletten Funktionsverlust des Proteins. Basensubstitutionen können aber auch außerhalb codierender Bereiche schwerwiegende Folgen für die Zelle haben. Betrifft eine solche Mutation z.b. regulatorische Sequenzen, kann die Regulation der Genexpression geändert werden. Eine Mutation des origin of replication kann dazu führen, dass die Initiation der DNA-Replikation gestört wird. Ein weiteres Beispiel für eine Punktmutation wäre die Insertion oder die Deletion weniger Basenpaare. Werden dabei 3n+1 oder 3n+2 Basen innerhalb einer codierenden Sequenz inseriert oder deletiert, so führt dies zu einer Verschiebung des Leserasters (frameshift- Mutation). Das betroffene Protein ist dabei in der Regel nicht mehr funktional. Bei der Insertion oder Deletion von 3n Basenpaaren tritt zwar keine Verschiebung des Leserasters auf, da jedoch die Primärstruktur des resultierenden Proteins verändert wurde, kann auch dies die Funktionalität des Proteins beeinträchtigen. Findet eine solche Mutation in regulatorischen

21 Einleitung 11 Sequenzen statt, so kann dies ähnliche Folgen haben wie für Basensubstitutionen beschrieben. Diese Art der Insertion oder Deletion tritt in der Regel in Gegenwart von z.b. interkalierenden Substanzen auf, gelegentlich aber auch nach Bestrahlung (Friedberg et al., 2006). Eine Dosis von 1Gy IR induziert in einer diploiden humanen Zelle etwa dieser Basenschäden. Wesentlich seltener sind dagegen Einzelstrangbrüche (ESBs), von denen etwa nach dieser Dosis in einer Zelle vorliegen. Sowohl Basenschäden als auch ESBs können von der Zelle sehr effizient repariert werden. Nach Applikation physiologisch relevanter Dosen haben diese Schäden keine signifikante Auswirkung auf das Überleben und die Mutagenese einer Zelle (Ward, 1995). Im Gegensatz dazu besitzen DSBs eine biologische Wirkung, die um ein Vielfaches höher als die der Basenschäden oder ESBs ist. Pro Gy werden nur etwa dieser DSBs in einer humanen Zelle erzeugt. Die Reparatur von DSBs ist für die Zelle nicht so trivial wie die Reparatur simplerer Schäden, da hier die kovalente Verbindung der DNA auf beiden Strängen unterbrochen wurde und somit kein intakter Strang mehr vorliegt, welcher als Matrize für die Reparatur dienen könnte. Außerdem befinden sich an den Enden meist zusätzliche Schäden wie Basenschäden, ESBs oder einzelsträngige Überhänge, so dass die Brüche vor der Ligation erst prozessiert werden müssen. Sind Zellen nicht in der Lage, die DSBs zu reparieren, so kann dies zum Verlust von genetischem Material bei der nächsten Zellteilung führen, was den Tod der Zelle bedeuten könnte (Olive, 1998). Beim Auftreten mehrerer DSBs besteht weiterhin die Gefahr, dass Enden falsch miteinander verknüpft werden, was zur Entstehung von Chromosomenaustauschaberrationen führen kann. Dabei kann bereits eine einzelne Chromosomenaberration für die Zelle ein letales Ereignis darstellen, wenn dadurch die Zellteilung gestört wird oder durch die Fehlverknüpfung essentielle Gene unterbrochen werden. Chromosomenaberrationen können auch zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen, was ein kanzerogenes Wachstum zur Folge haben kann. In der Tat liegen in nahezu allen Tumoren Chromosomenaberrationen vor (Albertson et al., 2003) Arten von Chromosomenaberrationen und deren Entstehung IR ist sehr effizient bei der Erzeugung von Chromosomenaberrationen. Prinzipiell unterscheidet man dabei zwischen Chromosomentyp-Aberrationen und Chromatidtyp- Aberrationen. Chromosomentyp-Aberrationen entstehen meist durch Schädigung der DNA in der G0/G1-Phase des Zellzyklus, bevor das Chromatin dupliziert wird. Während der semikonservativen Replikation werden die beiden Einzelstränge separat verdoppelt. Somit liegt nach der Replikation die Aberration auf beiden Chromatiden des Chromosoms an derselben

22 Einleitung 12 Stelle vor und erscheint in der darauf folgenden Metaphase, wenn die Chromosomen kondensiert vorliegen, als Chromosomenaberration. Chromatidtyp-Aberrationen treten meist als Folge einer Schädigung nach der Synthese-Phase auf, wenn die Chromatiden bereits verdoppelt vorliegen. In der Regel betrifft die Schädigung nur eine Chromatide, während die Schwesterchromatide unbeeinträchtigt bleibt (Cornforth & Bedford, 1993). Aberrationen können einzelne Chromosomenfragmente oder Austäusche zwischen verschiedenen Chromosomen sein. Chromosomenfragmente treten auf, wenn ein Chromosom gebrochen ist und nicht mehr repariert wurde (Abb. 2.3). Bei der Zellteilung kann dies aufgrund des fehlenden Zentromers (azentrisches Fragment) nicht auf die Tochterzellen aufgeteilt werden, was ein Absterben der Zelle zur Folge haben kann. Bei den Austauschreaktionen unterscheidet man zwischen symmetrischen und asymmetrischen Austäuschen. Während bei einem symmetrischen Austausch alle induzierten Chromosomenfragmente so miteinander verknüpft werden, dass jedes Chromosom wieder ein Zentromer besitzt (zentrische Fragmente), kommt es bei einem asymmetrischen Austausch zur Entstehung von Chromosomenfragmenten ohne Zentromer (azentrische Fragmente). Ein symmetrischer Austausch kann intrachromosomal z.b. eine Inversion eines Chromosomenoder Chromatidfragments sein, interchromosomal eine reziproke Translokation von Chromosomen- oder Chromatidstücken. Beispiele für asymmetrische Austäusche sind das Auftreten von Ringchromosomen (intrachromosomaler Austausch) oder die Bildung von dizentrischen Chromosomen, also Chromsomen mit zwei Zentromeren, und azentrischen Abb. 2.3: Arten von Strahlen-induzierten Chromosomenaberrationen. Chromosomale Brüche entstehen, wenn die Bruchenden nicht repariert wurden. Translokationen entstehen durch die Fehlverknüpfung von Bruchenden. Werden alle Bruchenden verknüpft, so liegt eine vollständige Translokation vor. Bleiben Bruchenden unverbunden, ist die Translokation unvollständig. Enstehen nach der Translokation Chromosomen mit jeweils einem Zentromer, so liegt ein symmetrischer Austausch vor. Werden die Bruchenden so verknüpft, dass Chromosomen ohne (azentrische Fragmente) bzw. Chromosomen mit zwei Zentromeren (dizentrische Fragmente) entstehen, spricht man von einem asymmetrischen Austausch, welcher für die Zelle letal ist. (mit freundlicher Genehmigung von Helge Hussong)

23 Einleitung 13 Fragmenten ohne Zentromer (interchromosomaler Austausch). Zu asymmetrischen Chromatidaustäuschen zählt z.b. das Auftreten von quadriradialen Strukturen. Symmetrische Austäusche sind aufgrund der wiederhergestellten Chromosomenmorphologie zunächst nicht für die Zelle letal. Asymmetrische Austäusche führen dagegen bei der Zellteilung zu einer Beeinträchtigung der Chromosomenaufteilung auf die Tochterzellen und verursachen somit meist das Absterben der Zelle. Bereits frühzeitig beschäftigten sich Strahlenbiologen mit den Mechanismen der Entstehung von Chromsomenaberrationen. Abweichende Meinungen gab es dabei bereits bei der Frage nach der Art des initialen Schadens, welcher die Entstehung von Aberrationen auslöst. Ausgehend von der Art des Schadens entstanden verschiedene Modelle zum Mechanismus. So führte Revell die Exchange Hypothesis zur Erklärung von Chromatidtyp-Aberrationen ein, deren Prinzipien später aber auch auf Chromosomentyp-Aberrationen ausgeweitet wurden. Er postulierte, dass die Ursache für eine Chromosomenaberration nicht ein Bruch sondern eine andersartige, undefinierte Läsion sei. Diese Läsion könne dann mit einer anderen nahe gelegenen Läsion eines anderen Chromosoms interagieren, was zu einem Austausch führen könnte (Revell, 1959). Ein alternatives Modell ist das breakage-and-reunion-modell nach Sax. Dieses geht davon aus, dass durch Einwirken DNA-schädigender Agenzien Chromosomenbrüche entstehen, die anschließend wieder zusammengefügt werden (Sax, 1939). Liegen dabei mehrere Chromosomenbrüche in räumlicher und zeitlicher Nähe, könnte es dabei auch zu einer Fehlverknüpfung der Chromosomenenden und somit zur Entstehung von Translokationen kommen. Zu einem späteren Zeitpunkt wurde spezifiziert, dass es sich bei den Brüchen um DNA-DSBs handelt (Bender et al., 1974; Ward, 1988). Weitere wichtige Hinweise, dass DSBs die initialen Läsionen sind, lieferte die Beobachtung, dass eine Behandlung von Zellen mit Restriktionsendonukleasen, welche einzig DSBs induzieren, zur Ausbildung von Chromosomenaberrationen führt (Bryant, 1984; Ager et al., 1991). Diese Ergebnisse wurden u. a. von den Beobachtungen von Natarajan und Mitarbeitern bekräftigt. Sie zeigten, dass nach der Behandlung bestrahlter Zellen mit der Einzelstrang-spezifischen Neurospora crassa- Endonuklease vermehrt Chromosomenaberrationen gegenüber Zellen auftraten, die zwar bestrahlt, aber nicht mit der Endonuklease behandelt wurden. Die Forscher erklärten dies so, dass die durch Bestrahlung erzeugten ESBs durch die Nuklease in DSBs umgewandelt wurden, was schließlich zur Entstehung von Aberrationen führte (Natarajan et al., 1980; Natarajan & Zwanenburg, 1982). Weitere Hinweise, dass DSBs die initialen Läsionen sind, liefert die Betrachtung verschiedener Reparatur-Mutanten. So zeigen Zellen, welche Defekte

24 Einleitung 14 in Proteinen der DSB-Reparatur aufweisen, in der Regel eine hohe chromosomale Instabilität. Mutanten, welche Defekte in der ESB- oder Basenexcisionsreparatur aufweisen, sind dagegen genomisch stabil. Somit ist zum heutigen Tag allgemein anerkannt, dass der DSB die kritische Läsion bei der Entstehung von Chromosomenaberrationen ist (Cornforth, 1998). Beiden Modellen gemeinsam ist, dass sie von mindestens zwei gleichzeitig auftretenden Schädigungen ausgehen, die räumlich und zeitlich nahe beieinander liegen, so dass sie interagieren können. Im Gegensatz dazu steht die one-hit-theorie. Diese geht von einem Bruch in nur einem Chromosom aus. Durch enzymatische Prozesse wird ein zweiter Bruch in einem anderen Chromosom induziert. Der Strahlen-induzierte Bruch kann somit durch rekombinatorische Prozesse unter Zuhilfenahme des enzymatisch induzierten Bruchs repariert werden, wobei es auch hierbei zu Fehlverknüpfungen kommen kann (Chadwick & Leenhouts, 1978; Griffin et al., 1996; Chadwick & Leenhouts, 1998). Bis heute ist nicht endgültig geklärt, welches dieser Modelle die Entstehung von Chromosomenaberrationen am treffendsten beschreibt. Immer häufiger kommen Computersimulationen zum Einsatz, welche die bisherigen experimentellen Daten verarbeiten und auch unter biophysikalischen und statistischen Gesichtspunkten analysieren. Anhand der daraus gewonnen Erkenntnisse wird zumindest für in der G0/G1-Phase bestrahlte Säuger-Zellen das breakage-and-reunion-modell favorisiert. Dennoch lässt sich nicht ausschließen, dass auch andere Mechanismen bei der Entstehung von Chromosomenaberrationen eine Rolle spielen (Hlatky et al., 2002) Dosis-Effekt-Kurven und Krebsrisiko im Niedrig-Dosis-Bereich Da Chromosomenaberrationen eine der Hauptursachen für die Entstehung von Krebs sind, besteht nach wie vor ein großes Interesse daran, die Mechanismen der Aberrationsentstehung aufzuklären. Rückschlüsse auf den möglichen Mechanismus lassen sich z.b. aus der Betrachtung von Dosis-Effekt-Kurven ziehen. Dosis-Effekt-Kurven beschreiben das Auftreten von Aberrationen in Abhängigkeit von der Dosis. Sax beobachtete, dass die Häufigkeit von Chromatidbrüchen nach Röntgenbestrahlung linear mit der Dosis anstieg, während sich Austauschreaktionen etwa proportional zum Quadrat der Dosis erhöhten (Cornforth & Bedford, 1993). Ähnliche Beobachtungen wurden auch von anderen Wissenschaftlern gemacht. So wurde berichtet, dass Chromatid- und Chromosomenbrüche wesentlich häufiger zu beobachten seien als andere Läsionen und diese linear mit der Dosis anstiegen (Swanson & Schwartz, 1953; Davies, 1963). Zu anderen Ergebnissen kam Revell, als er in den 60er Jahren Experimente mit der Ackerbohne Vicia faba zur Entstehung von

25 Einleitung 15 Chromatidtyp-Aberrationen durchführte. Hierbei konnte er zeigen, dass bei der von ihm verwendeten Röntgenstrahlung achromatische Läsionen (gaps) die häufigsten Läsionen waren und linear mit der Dosis anstiegen (Revell, 1966). Andere Läsionen wie Chromatidaustäusche, Isochromatidbrüche und vor allem Chromatidbrüche traten seltener auf und zeigten dagegen eine aufwärts gekrümmte Dosis-Effekt-Kurve. Deren Form ließ sich am besten durch die quadratisch-lineare Funktion Y = αd + βd 2 beschreiben. Dabei ist D die Dosis und α und β sind Proportionalitätskonstanten, welche bei der Auswertung der unterschiedlichen Läsionen variierten. Diese Diskrepanz in Bezug auf das Auftreten von Chromatidbrüchen beurteilte Revell so, dass beim Auswerten der Läsionen in den vorherigen Arbeiten häufig gaps als Chromatidbrüche gewertet wurden, da diese nur schwer voneinander zu unterscheiden seien (Revell, 1966). Somit herrschte zwar Einigkeit darüber, dass entweder achromatische Läsionen oder Chromatidbrüche die primären Läsionen bei der Entstehung von Aberrationen seien, da diese zum einen am häufigsten auftraten und zum anderen als einzige Aberration eine lineare Dosisabhängigkeit zeigten. Dies verdeutlicht jedoch auch, dass bereits das Anlegen verschiedener Kriterien bei der Klassifizierung der unterschiedlichen Läsionen zu unterschiedlichen Ergebnissen und wie bereits im vorherigen Kapitel beschrieben - zu unterschiedlichen Modellen für die Entstehung chromosomaler Aberrationen führt. Abb. 2.4: Entstehung dizentrischer Chromosomen in Abhängigkeit von der Dosis und der Strahlenart. Hochenergetische Strahlung erzeugt eine lineare Dosis-Effekt-Kurve. Mit abnehmendem LET der Strahlungsart erhöht sich der quadratische Anteil der Dosis-Effekt-Kurve. (aus: Kiefer, 1989) Der Verlauf der Dosis-Effekt-Kurven für Chromosomenaberrationen ist auch von der Art der Strahlung abhängig (Abb. 2.4). Im Gegensatz zu der dünn ionisierenden Röntgen- oder γ- Strahlung erhöht sich bei dicht ionisierender Teilchenstrahlung mit einem hohen LET das Auftreten aller Aberrationsarten linear mit der Dosis (Lloyd et al., 1976; Kiefer, 1989; Sachs

26 Einleitung 16 & Brenner, 1993; Rydberg et al., 2005). Diese Beobachtungen lassen Rückschlüsse auf die Mechanismen bei der Entstehung von Chromosomenaberrationen zu. Während die primären Läsionen (gaps oder Chromatid- bzw. Chromosomenbrüche) linear mit der Dosis ansteigen, zeigen Austauschreaktionen wie z.b. dizentrische Chromosomen eine mehr als lineare Abhängigkeit von der Dosis. Dies lässt sich dadurch erklären, dass bei dünn ionisierender Strahlung mit niedrigem LET DSBs relativ zufällig über den gesamten Zellkern verteilt entstehen. Geht man von dem breakage-and-reunion-modell aus, so ist die Wahrscheinlichkeit, dass bei einer niedrigen Dosis zwei DSBs in enger räumlicher Nähe liegen und somit fehlverknüpft werden können, relativ gering. Da jeder DSB aus zwei potentiell reaktiven Enden besteht, die theoretisch unabhängig voneinander verknüpft werden können, steigt diese Wahrscheinlichkeit jedoch mit zunehmender Dosis mehr als linear an, wodurch sich der quadratische Term in der Dosis-Effekt-Kurve ergibt. Bei Teilchenstrahlung induziert ein Teilchen einer bestimmten Energie immer dieselbe Anzahl an DSBs entlang seiner Bahnspur. Die Dosis bestimmt lediglich, wie viele Teilchen einen Zellkern passieren. Damit ist die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere DSBs in enger Nachbarschaft liegen und somit fehlrepariert werden, bereits bei niedrigen Dosen relativ hoch. Bei dicht ionisierender Strahlung lassen sich somit schon bei niedrigen Dosen Fehlreparaturereignisse beobachten. Da mit zunehmender Dosis die Anzahl der Teilchen linear ansteigt und die Fehlreparatur jeweils auf der Bahnspur eines Teilchens beruht, steigt bei dicht ionisierender Strahlung auch die Fehlreparaturrate linear mit der Dosis an. Die Effekte sind bei sehr niedrigen Dosen nur sehr gering. Daher werden Experimente zur Messung von Chromosomenaberrationen in der Regel bei Dosen im Bereich oberhalb mehrerer 100mGy durchgeführt. Diese Dosen sind zwar für Fragestellungen der Strahlentherapie relevant, für eine Abschätzung des Krebsrisikos nach Niedrig-Dosis-Bestrahlung wie im diagnostischen Bereich sind sie jedoch zu hoch. Besonders der Strahlenschutz ist daran interessiert herauszufinden, welche Formen Dosis-Effekt-Kurven im Bereich < 100mGy annehmen. Bisher ließen sich keine zuverlässigen experimentellen Daten für den Verlauf der Dosis-Effekt-Kurve in diesem niedrigen Dosis-Bereich gewinnen. Außerdem lässt sich das Krebsrisiko nicht allein anhand zellulärer Experimente abschätzen. Daher beruhen bis heute die meisten Daten zum Abschätzen des Krebsrisikos im Niedrig-Dosis-Bereich auf epidemiologischen Studien. Eine der größten Studien beschäftigte sich mit den Überlebenden der Atombombenabwürfe von Hiroshima und Nagasaki (Pierce & Preston, 2000; Preston et al., 2003). Bei dieser Studie wurden über einen Zeitraum von 47 Jahren ca Überlebende im Hinblick auf die durch eine akute Strahlendosis induzierte Entwicklung von

27 Einleitung 17 Krebs, die daraus resultierende Sterblichkeitsrate sowie die Sterblichkeit aufgrund anderer Strahlen-induzierter Ursachen untersucht. Anhand dieser Daten erlangte man Hinweise, dass das Krebsrisiko ab einer Dosis von ~ 50mSv (= 50mGy Röntgenstrahlung) mit zunehmender Dosis linear anstieg. Da eine direkte Messung des Krebsrisikos im niedrigeren Dosis-Bereich bisher nicht möglich war, wird auch heute noch aus pragmatischen Gründen die Dosis-Effekt- Kurve für den Niedrig-Dosis-Bereich linear extrapoliert. Diese Vorgehensweise impliziert, dass selbst die geringsten Dosen IR potentiell Krebs verursachen können (Linear-nothreshold-Modell, LNT-Modell) (Brenner et al., 2003; Preston, 2003). Dennoch ist sehr wohl denkbar, dass dieses Modell aufgrund diverser biologischer Effekte das tatsächliche Krebsrisiko unter- oder überschätzt (Preston et al., 2003; Hall, 2003; Mothersill & Seymour, 2004). Somit ist es weiterhin Ziel der Forscher, bessere Testsysteme zur Abschätzung des Krebsrisikos zu etablieren, um auch Daten für den Niedrig-Dosis-Bereich zu erhalten. Da Chromosomenaberrationen eng mit kanzerogenem Wachstum verknüpft sind und nach physiologischen Dosen relativ einfach nachgewiesen werden können, sind sie wahrscheinlich der wichtigste zelluläre Endpunkt in der Kanzerogenese, der auch nach niedrigen Dosen IR noch messbar ist DSB-Schadensantwort in eukaryotischen Zellen Durch intrazelluläre Vorgänge wie der Replikation, der Meiose oder der V(D)J- Rekombination zur Herstellung der Antikörper-Diversität werden gezielt DSBs in der DNA erzeugt. Aber auch oxidative Stoffwechselprodukte tragen zur Entstehung von DSBs bei. DSBs können auch durch exogene Agenzien wie IR, bestimmte Chemikalien oder Chemotherapeutika entstehen. Während unreparierte DSBs zum Zelltod führen, können fehlreparierte DSBs Mutationen und chromosomale Aberrationen verursachen. Dies gefährdet die chromosomale Stabilität und kann zur Krebsentstehung beitragen (Hoeijmakers, 2001; van Gent et al., 2001). Tritt ein DSB in der Zelle auf, so werden Signal-Transduktions-Kaskaden aktiviert, um den Schaden zu beseitigen (Abb. 2.5). Der DSB wird initial von Sensor-Proteinen erkannt. Diese übermitteln das Signal an Transducer-Proteine, welche das Signal verstärken und, je nach Art des Schadens, an die entsprechenden Effektor-Proteine weiterleiten. Durch die Effektor- Proteine werden verschiedene DSB-Schadensantworten eingeleitet. So kann die Zelle Reparaturmechanismen zur Beseitigung des Schadens aktivieren. Um mehr Zeit für die

28 Einleitung 18 Abb. 2.5: Schematische Darstellung der DSB-Schadensantwort. DSBs werden von Sensor-Proteinen erkannt. Über eine Signalkaskade von Tranducer-Proteinen wird das Signal verstärkt und an die Effektor-Proteine weitergeleitet, welche einen Zellzyklus-Arrest, die DSB-Reparatur oder die Apoptose aktivieren. (aus: Khanna und Jackson, 2001) Reparatur zur Verfügung zu stellen, kann durch einen Zellzyklusarrest die Progression im Zellzyklus angehalten werden. Sind die DNA-Schäden zu schwerwiegend, kann die Zelle durch Einleitung der Apoptose aus dem Zellverband eliminiert werden (Zhou & Elledge, 2000; Khanna & Jackson, 2001; Shiloh, 2003) Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen Die beiden wichtigsten Mechanismen zur Reparatur von DSBs sind das Nicht-homologe Endjoining (NHEJ) und die Homologe Rekombination (HR). In niederen Eukaryoten wie Hefen ist die HR der Hauptreparaturweg und findet in allen Zellzyklusphasen statt. Die HR ist daher in diesen Organismen sehr gut charakterisiert. Die HR benötigt zur Reparatur große Bereiche homologer DNA-Sequenzen. In höheren Eukaryoten findet eine Reparatur der DSBs über HR nur in der S- und der G2-Phase statt. Hier liegen in unmittelbarer Nähe homologe Sequenzen vor, z.b. die homologe Schwesterchromatide, welche als Matrize bei der Reparatur des DSBs dienen. Die Reparatur über HR verläuft somit weitestgehend fehlerfrei. Der vorherrschende Reparaturweg in höheren Eukaryoten wie Säugerzellen ist das NHEJ. Das NHEJ basiert prinzipiell auf der Verknüpfung von DSB-Enden. Dazu werden keine homologen DNA- Bereiche benötigt, welche als Matrize dienen könnten, was gelegentlich zu Fehlverknüpfungen oder Mikrodeletionen an den Bruchstellen führen kann. Das NHEJ ist der einzige Reparaturweg in der G0/G1-Phase, spielt aber auch in den anderen Zellzyklusphasen eine wichtige Rolle (Haber, 2000; van Gent et al., 2001; Cromie et al., 2001).

29 Einleitung Nicht-homologes End-joining (NHEJ) Das NHEJ wird sowohl bei der Reparatur exogen induzierter DSBs als auch bei der Reparatur von DSBs benötigt, die bei der V(D)J-Rekombination gezielt in die DNA eingebracht werden. Die core-komponenten des NHEJ sind das Ku70/Ku80-Heterodimer, die katalytische Untereinheit der DNA-PK, sowie der XRCC4/LigaseIV-Komplex (Jeggo, 1998a; Jackson, 2002). Darüber hinaus sind jedoch noch weitere Proteine an dem NHEJ beteiligt, welche eine unterstützende Funktion einnehmen oder nur bei der Reparatur einer bestimmten Klasse von DSBs benötigt werden. Das Prinzip des NHEJ beruht auf der Verknüpfung von DSB-Enden. An die Bruchenden bindet zunächst das Ku70/Ku80-Heterodimer (Walker et al., 2001) (Abb. 2.6). Anschließend wird die katalytische Untereinheit der DNA-PK (DNA-PK CS ) an die Bruchenden rekrutiert. Diese bildet zusammen mit dem Ku70/Ku80-Heterodimer das aktivierte DNA-PK- Holoenzym. Die DNA-PK gehört zur Familie der Phosphatidyl-inositol-3-Kinase-ähnlichen Kinasen (PIKK), zu denen auch ATM und ATR gehören. Die Bindung an einen DSB aktiviert dabei ihre Ser/Thr-Kinaseaktivität und führt zur Autophosphorylierung der DNA-PK. Die Funktion der DNA-PK liegt u. a. darin, ein Auseinanderdiffundieren der Brüche zu verhindern (Gottlieb & Jackson, 1993; DeFazio et al., 2002). Des Weiteren aktiviert die DNA- PK neben anderen Reparaturfaktoren den XRCC4/LigaseIV-Komplex, welcher die Bruchenden ligiert (Grawunder et al., 1998; Jackson, 2002; Burma & Chen, 2004; Drouet et al., 2005). Kürzlich konnte als weiterer NHEJ-Faktor XLF(XRCC4-like factor)/cernunnos identifiziert werden, welches ebenfalls mit dem XRCC4/LigaseIV-Komplex interagiert Abb. 2.6: Schematische Darstellung des Nicht-homologen End-joinings. An die Bruchenden binden das Ku70/Ku80- Heterodimer, sowie die katalytische Untereinheit der DNA-PK. Nach Prozessierung der Enden rekrutieren diese den LigaseIV/XRCC4-Komplex, welcher die Enden verbindet. (aus: Jackson, 2002)

30 Einleitung 20 (Ahnesorg et al., 2006; Buck et al., 2006). Der Ausfall eines dieser Proteine führt in der Regelzu starken Defiziten bei der Reparatur von DSBs, welche sich häufig in einer stark erhöhten Strahlenempfindlichkeit der Zellen äußern (Chang et al., 1993; Riballo et al., 1999; Wachsberger et al., 1999). Neben den core-komponenten sind noch weitere Proteine am NHEJ beteiligt. Nach IR weisen DSBs selten glatte Enden auf. Meist befinden sich an den Bruchenden weitere Läsionen wie Basenschäden oder ESBs, so dass die DSB-Enden vor der Ligation prozessiert werden müssen. Es gibt Hinweise darauf, dass an der Erkennung und der Prozessierung eines DSBs ein Multienzymkomplex bestehend aus der Nuklease Mre11, Rad50 und NBS1 (MRN- Komplex) beteiligt ist. Die genaue Funktion des MRN-Komplexes ist dabei noch nicht vollständig verstanden, jedoch wird ihm auch eine Funktion beim Zusammenhalten der Bruchenden zugeordnet (Hopfner et al., 2001; D'Amours & Jackson, 2002; van den et al., 2003; van den Bosch et al., 2003; Lisby & Rothstein, 2004). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Nuklease Artemis zumindest in stationären Zellen für die Prozessierung komplexer DSBs benötigt wird und dabei zusammen mit ATM an einem Unterweg des NHEJ beteiligt ist (Riballo et al., 2004) Homologe Rekombination (HR) Die Hauptfaktoren der HR sind die Komponenten der Rad52-Epistasisgruppe. Dazu gehören die Homologen der S. cerevisiae-proteine Rad51, Rad52 und Rad54, sowie die Rad51- Paraloge XRCC2, XRCC3, Rad51B, Rad51C und Rad51D (Symington, 2002; Thompson & Schild, 2002). Der initiale Schritt bei der HR ist die Erkennung des DSBs durch den MRN- Proteinkomplex bestehend aus Mre11, Rad50 und Nbs1 (Xrs2 in Hefen), wobei die genaue Funktionsweise des MRN-Komplexes noch nicht eindeutig geklärt ist (Abb. 2.7). Dabei werden Mre11 und Nbs1 nach IR von der Kinase ATM phosphoryliert, was vermutlich die Nukleaseaktivität von Mre11 verändert (Gatei et al., 2000; Costanzo et al., 2001). Nach der Erkennung des DSBs kommt es somit zur nukleolytischen Prozessierung der Bruchenden wahrscheinlich durch Mre11, so dass einzelsträngige 3 -Überhänge entstehen. An diese bindet zunächst mit hoher Affinität das Einzelstrang-Bindeprotein RPA und löst Sekundärstrukturen auf. Anschließend ersetzt die Rekombinase Rad51, das RecA-Homolog aus E. coli, mit Hilfe von BRCA2 RPA an den einzelsträngigen Überhängen (Sung et al., 2003; Shivji & Venkitaraman, 2004). Unterstützt durch Komponenten der Rad52-Epistasisgruppe erfolgt im Anschluss die Stranginvasion dieses Nukleoprotein-Filaments in den DNA-Doppelstrang der ungeschädigten Schwesterchromatide (West, 2003).

31 Einleitung 21 Abb. 2.7: Schematische Darstellung der Homologen Rekombination. Der DSB wird durch den MRN-Komplex erkannt und prozessiert. Die Stranginvasion in den homologen DNA-Bereich wird u. a. von Rad51 katalysiert. Anschließend werden die freien Enden durch Neusynthese der DNA anhand der homologen Matrize verlängert. Nach Ligation der Enden werden die Holliday-Strukturen aufgelöst. (aus: Jackson, 2002) Das 3 -Ende der geschädigten DNA wird unter Zuhilfenahme der Matrize des ungeschädigten Strangs durch die DNA-Polymerase I verlängert. Nach der Ligation der offenen Enden durch die Ligase I kommt es zur Auflösung der Doppel-Holliday-Struktur, wobei Crossovers auftreten können. Während dieser Vorgang in E. coli recht gut beschrieben ist, sind in eukaryotischen und besonders in humanen Zellen vor allem die späten Schritte nicht endgültig geklärt (Constantinou et al., 2002; Heyer et al., 2003). Man geht davon aus, dass an der Auflösung der Holliday-Struktur Mitglieder der Familie der RecQ-Helikasen beteiligt sind, wie z.b. BLM und WRN (Saintigny et al., 2002; Hickson, 2003; Rao et al., 2005). Neben diesem klassischen Weg der HR sind weitere Varianten der Homologie-gerichteten DSB-Reparatur beschrieben. Beim synthesis-dependent strand annealing (SDSA) paart der eingewanderte Strang nach der Elongation mit dem einzelsträngigen Überhang des anderen DSB-Endes, ohne dass Holliday-Srukturen ausgebildet werden. Die Bruch-induzierte Replikation (BIR) spielt eine Rolle, wenn das zweite Ende eines DSBs nicht verfügbar ist, was z.b. durch Fehler bei der Replikation auftreten kann. Beide Vorgänge bedürfen einer Stranginvasion in eine homologe Sequenz. Tritt dagegen ein DSB zwischen zwei eng beieinander liegenden repetitiven Sequenzen auf, ist ein Strangaustausch nicht notwendig. Nach der Resektion der Bruchenden paaren diese anhand der repetitiven Sequenzen und die Einzelstränge werden unter Verlust genetischer Information ligiert (single-strand annealing; SSA) (Haber, 2000; Sung & Klein, 2006). Während Defekte in vielen für die HR benötigten Proteinen embryonal letal sind, zeigen Zellen mit nicht-letalen Defekten häufig eine erhöhte chromosomale Instabilität und die betroffenen Organismen eine erhöhte Krebsprädisposition.

32 Einleitung 22 Dies zeigt, dass HR auch in Säugerzellen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der chromosomalen Stabilität spielt (Valerie & Povirk, 2003) Zellzyklus und Zellzykluskontrolle Das Wachstum eines Gewebes oder einer Zellkultur kommt durch die Teilung einzelner Zellen zustande. Dabei durchlaufen die Zellen in einer geordneten Abfolge aufeinander folgende Phasen, welche in ihrer Gesamtheit den Zellzyklus bilden und je nach Zellart von unterschiedlicher Dauer sein können. Der Zellzyklus ist in vier Phasen unterteilt: die G1- (gap), die S- (Synthese) und die G2-Phase sowie die Mitose (Zellteilung). Die G1-, S- und die G2-Phase können als Interphase zusammengefasst werden und bilden die Phase zwischen zwei Zellteilungen. Die postmitotische G1-Phase ist in erster Linie durch das Wachstum der Zelle gekennzeichnet. Durch die Produktion von während der darauf folgenden S-Phase benötigten Enzyme (Polymerasen, Ligasen, u. a.) sowie Desoxyribonukleosid-Triphosphaten bereitet sich die Zelle auf die Replikation der DNA vor. In der darauf folgenden S-Phase wird das Genom repliziert, so dass am Ende dieser Phase die Chromosomen aus zwei Chromatiden bestehen. Mit Abschluss der Replikation tritt die Zelle in die prämitotische G2-Phase ein. Hierbei kommt es zur Produktion zellteilungsspezifischer Proteine, in Geweben lösen sich die Zellkontakte, und die Zelle bereitet sich auf die Zellteilung vor. Während der Mitose teilen sich zunächst die Chromosomen, wobei je eine Chromatide eines Chromosoms an einen der Kernpole gezogen wird. Anschließend teilt sich der Zellkern (Karyokinese) und schließlich die Zelle (Cytokinese). Zellen, welche sich nicht mehr teilen, treten aus der G1-Phase in die G0-Phase über, welche durch einen permanenten Zellzyklusarrest gekennzeichnet ist. Für die Erforschung der Regulierung des Zellzyklus wurde im Jahre 2001 der Medizin- Nobelpreis an die Forscher Hartwell, Hunt und Nurse vergeben. Sie fanden u. a. heraus, dass die Regulation des Zellzyklus über Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) erfolgt. Der Gehalt eines jeden Cyclins nimmt in der Zelle im Laufe des Zellzyklus auf charakteristische Weise ab und zu. Die Cycline komplexieren dabei mit den CDKs, wodurch diese aktiviert werden. Erst das Auftreten eines aktiven Cyclin-CDK-Komplexes ermöglicht das Fortschreiten im Zellzyklus. Tritt in der Zelle ein Schaden auf, so ist es notwendig, die Progression im Zellzyklus zu verlangsamen oder zu stoppen, bis der Schaden beseitigt ist. Dies geschieht über die Regulation der Cyclin-CDK-Komplexe an verschiedenen Stellen im Zellzyklus. Solche Checkpoints existieren am Übergang von der G1- in die S-Phase, innerhalb der S-Phase, am Übergang von der G2-Phase in die Mitose sowie innerhalb der Mitose. Die Prinzipien der

33 Einleitung 23 Signalkaskaden der einzelnen Checkpoints sind dabei z. T. sehr ähnlich, und die einzelnen Komponenten nehmen oft redundante Funktionen ein. Dennoch besteht zum vollen Verständnis der Vorgänge noch ein großer Klärungsbedarf (Hartwell & Weinert, 1989; Murray, 2004; Lukas et al., 2004b) Der G1/S- und der intras-checkpoint Werden Zellen während der G1-Phase DSB-verursachenden Agenzien ausgesetzt, so verhindert ein G1/S-Checkpoint, dass die Zelle mit diesen Schäden in die S-Phase progressiert und sich der Schaden durch die Duplikation des Genoms auf beiden Chromatiden manifestieren kann. Der G1/S-Checkpoint stellt dabei das kritische Hindernis im Zellzyklus einer Zelle dar, da hier die Entscheidung getroffen wird, ob eine Zelle den Zellzyklus durchläuft und sich teilt, oder ob sie in einen permanenten Arrest übergeht. Der Übergang von der G1- in die S-Phase wird u. a. vom CDK2/CyclinE-Komplex und dem Phosphorylierungsstatus des Retinoblastoma-Proteins (Rb) reguliert. Rb wird im Laufe der G1-Phase zunächst von CDK4/CyclinD, später von CDK2/CyclinE hyperphosphoryliert. In der hyperphosphorylierten Form ist Rb nicht in der Lage, mit dem Transkriptionsfaktor E2F, welcher für die Expression von während der S-Phase erforderlichen Komponenten benötigt wird, zu assoziieren und somit die Transkription zu unterbinden (Flemington et al., 1993; He et al., 2000; Cobrinik, 2005). Das antagonistisch wirkende Protein Phosphatase 1 (PP1) bewirkt dagegen die Dephosphorylierung von Rb und ist somit ebenfalls an der Regulation des G1/S- Überganges beteiligt (Yan & Mumby, 1999; Tamrakar et al., 2000). Dieser Punkt im Wachstumszyklus einer Zelle wird auch als Restriktionspunkt bezeichnet und ist der Punkt, an dem sich entscheidet, ob eine Progression in die S-Phase und somit ein neuer Teilungszyklus stattfindet (Bartek et al., 1996; Giacinti & Giordano, 2006). Der G1/S-Checkpoint wird im Wesentlichen über zwei Signalkaskaden reguliert, welche unabhängig voneinander operieren (Abb. 2.8). Das schnelle Einsetzen des G1/S-Checkpoints nach IR erfolgt über die Erkennung des DSBs durch die Kinase ATM. Diese phosphoryliert die Checkpoint-Kinase Chk2, was wiederum zu deren Aktivierung führt (Matsuoka et al., 2000). Ein Zielprotein von Chk2 ist die Phosphatase cdc25a. Im aktiven Zustand entfernt cdc25a die inhibierende Phosphatgruppe am Tyr15 des CDK2/CyclinE-Komplexes, wodurch dieser aktiv ist und den Übergang von der G1- in die S-Phase ermöglicht. Eine Phosphorylierung am Ser123 von cdc25a durch Chk2 bewirkt dessen Ubiquitinylierung, was zum Abbau durch Proteasome und somit zum Zellzyklusarrest führt (Mailand et al., 2000; Busino et al., 2004). Dieser Mechanismus der Checkpoint-Aktivierung verläuft über

34 Einleitung 24 Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen, Ubiquitinylierungen und Proteolyse, so dass der Zellzyklusarrest nach DNA-Schädigungen schnell einsetzen kann. Abb. 2.8: Der G1/S-Checkpoints nach Auftreten eines DSBs. Nach Auftreten eines DSBs wird der Übergang von der G1- in die S-Phase über zwei unabhängig voneinander operierende Signaltransduktionskaskaden verhindert. Beide Wege führen dabei zur Inaktivierung des Cdk2/CyclinE- Komplexes, was wiederum eine Inaktivierung des für die DNA- Synthese benötigten Rb-Proteins zur Folge hat. In einen zweiten Mechanismus ist der Tumorsuppressor p53 involviert. Durch DSBs aktiviertes ATM phosphoryliert p53 direkt u. a. am Ser15, was dessen Transport aus dem Zellkern entgegenwirkt (Banin et al., 1998). Eine Phosphorylierung von p53 am Ser20 durch Chk2 bewirkt weiterhin, dass p53 von der Ubiquitinligase Mdm2 dissoziiert und somit stabilisiert wird (Hirao et al., 2000). Dieser Prozess wird weiterhin unterstützt durch die direkte Phosphorylierung von Mdm2 durch ATM (Maya et al., 2001). Auf diese Weise aktiviertes p53 dient als Transkriptionsfaktor für den CDK-Inhibitor p21. Die Akkumulation von p21 bewirkt dessen Bindung an den CDK2/CyclinE-Komplex, wodurch Rb nicht hyperphosphoryliert wird und an die katalytische Domäne von E2F bindet, was ein Fortschreiten im Zellzyklus verhindert (Giacinti & Giordano, 2006). Aufgrund der erforderlichen Transaktivierung von p21 kann dieser Weg der Checkpoint-Aktivierung bis zu mehreren Stunden dauern. Vermutlich komplementiert dieser Mechanismus die transiente akute Inhibierung von CDK2 durch cdc25a und führt somit zu einer längeren Aufrechterhaltung des G1/S-Checkpoints oder einem permanenten Zellzyklusarrest (Bartek & Lukas, 2001).

35 Einleitung 25 Da während der S-Phase das gesamte Genom repliziert wird, ist die Zelle in diesem Stadium des Zellzyklus sehr anfällig für DNA-schädigende Agenzien. Eine präzise Abstimmung von Reparatur und Replikation ist somit für den Erhalt der genomischen Integrität von äußerster Wichtigkeit. Im Gegensatz zum G1/S-Checkpoint, welcher einen anhaltenden Zellzyklusarrest zur Folge hat, bewirken S-Phase-Checkpoints nach IR in erster Linie eine Verlangsamung der DNA-Replikation und somit der Zellzyklusprogression. Die Regulation der S-Phase-Checkpoints verläuft nach heutigen Erkenntnissen über mehrere parallel operierende Wege (Falck et al., 2002; Bartek et al., 2004). Ein Weg scheint ähnlich dem G1/S-Checkpoint über ATM, Chk2 und cdc25a zu arbeiten und wird durch das Replikations-unabhängige Auftreten von DSBs außerhalb von Replikons aktiviert (Falck et al., 2001; Sorensen et al., 2003; Bartek et al., 2004). Das von Chk2 phosphorylierte cdc25a wird abgebaut, was in der Inaktivierung von CDK2/CyclinE/A resultiert. Dies hat zur Folge, dass an den replication origins die Initiation der Replikation unterbunden wird, bis der DSB repariert ist. Neben diesem Replikations-unabhängigen intras-checkpoint existieren Replikations-abhängige S- Phase-Checkpoints. Das Auftreten von DNA-Schäden, eine chemische Inhibierung der Polymerasen oder ein Mangel an Nukleotiden kann zu einer Blockade der Replikationsgabeln führen. In diesem Fall entstehen einzelsträngige DNA-Bereiche, welche eine Rekrutierung des ATRIP-ATR-Komplexes an diese DNA-Bereiche bewirken, was wiederum die Aktivierung einer Reihe von Checkpoint-Mediatoren zur Folge hat. So wird u. a. über die Aktivierung von Chk1 und die Degradation von cdc25a die Initiation weiterer Replikationsgabeln verhindert (Bartek et al., 2004; Shechter et al., 2004a). Weiterhin wurde berichtet, dass die Komponenten des MRN-Komplexes sowie BRCA1, Smc1, 53BP1 und Mdc1 in die Regulation der S-Phase-Checkpoints involviert sind. Die diesen Wegen zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch bis zum heutigen Tag noch nicht vollständig geklärt (Xu et al., 2001; Maser et al., 2001; Yazdi et al., 2002; Wang et al., 2002; Goldberg et al., 2003; Lee & Lim, 2006). Eine Defizienz in einer bei der Induktion der S-Phase-Checkpoints beteiligten Komponente resultiert in der Unfähigkeit, nach IR die DNA-Synthese zu verlangsamen oder anzuhalten, bis die Schäden behoben sind. Diese strahlungsresistente DNA-Synthese (RDS; radio-resistent DNA synthesis) wurde neben AT-Zellen auch für Zellen mit Defekten in NBS1, Smc1, Mdc1, 53BP1 und BRCA1 beschrieben und ist somit ein Hinweis auf die Beteiligung dieser Proteine bei der Regulation der DNA-Synthese (Yazdi et al., 2002; Falck et al., 2002; Goldberg et al., 2003).

36 Einleitung Der G2/M-Checkpoint Der G2/M-Checkpoint verhindert das Eintreten der Zelle mit DSBs in die Mitose. Er stellt somit für die Zelle die letzte Möglichkeit dar, die Schäden vor der Zellteilung zu reparieren. Analog zum G1/S-Checkpoint lässt sich auch der G2/M-Checkpoint sowohl durch schnell einsetzende Mechanismen mit posttranslationalen Modifikationen, als auch durch verzögert einsetzende Mechanismen, welche Änderungen der Transkriptionsmuster beinhalten, aktivieren (Lukas et al., 2004b). Der Mitose-fördernde Komplex besteht hierbei aus CDK1 und CyclinB. Die Regulation dieses Komplexes wird durch ein Gleichgewicht aus Phosphorylierung durch die Ser/Thr-Kinase Wee1 und Dephosphorylierung durch Mitglieder der cdc25-familie erreicht (O'Connell et al., 1997; Furnari et al., 1997; Raleigh & O'Connell, 2000). Abb. 2.9: Der G2/M-Checkpoint nach Auftreten eines DSBs. Nach Auftreten eines DSBs wird der Eintritt in die Mitose über verschiedene Signaltransduktionskaskaden reguliert. Alle Wege führen dabei zur Inaktivierung des Mitose-fördernden Cdk1/CyclinB-Komplexes. Während der G2-Phase auftretende DSBs führen zur Aktivierung von ATM und im weiteren Verlauf von Chk1 und Chk2 (Matsuoka et al., 1998) (Abb. 2.9). Diese phosphorylieren Mitglieder der cdc25-familie, vornehmlich cdc25c, welche daraufhin eine Bindung mit dem Protein eingehen, aus dem Zellkern ausgeschleust und degradiert werden. Folglich bleibt der Mitose-fördernde CDK1/CyclinB-Komplex phosphoryliert und inaktiv, was eine Progression der Zelle in die Mitose verhindert (Peng et al., 1997; Zhao et al., 2002b; Donzelli & Draetta, 2003). IR während der S-Phase kann ebenfalls zu einer Initiation des G2/M- Checkpoints führen. Dabei wird neben ATM vermutlich aufgrund kollabierender

37 Einleitung 27 Replikationsgabeln und großer Bereiche ssdna auch ATR aktiviert. ATR wiederum phosphoryliert Chk1, was zur Phosphorylierung, Ubiquitinylierung und Proteolyse von cdc25a führt. Ohne Dephosphorylierung des CDK1/CyclinB-Komplexes bleibt dieser inaktiv, und der G2/M-Checkpoint wird initiiert (Mailand et al., 2002; Donzelli & Draetta, 2003). Neben den ATM/ATR- und Chk1/Chk2-vermittelten Signaltransduktionskaskaden gibt es auch Hinweise, dass Mediatoren wie 53BP1 und BRCA1 zur Signalübertragung und Aktivierung des G2/M-Checkpoints beitragen (Xu et al., 2001; Wang et al., 2002; Fernandez- Capetillo et al., 2002). Weiterhin wurde berichtet, dass die transkriptionelle Funktion von p53 für die Aktivierung von p21 und GADD45 und somit zur Aufrechterhaltung des G2/M- Checkpoints benötigt wird. Da jedoch auch p53-defiziente Zellen in der Lage sind, nach IR in der G2-Phase zu akkumulieren, scheint diese Funktion von p53 durch andere Proteine wie z.b. BRCA1 kompensiert werden zu können (Wang et al., 1999; Taylor & Stark, 2001; Nyberg et al., 2002; Yarden et al., 2002). Ist die Zelle in die Mitose eingetreten, so kann eine nicht vollständige Anordnung der Chromosomen in der Äquatorialebene mitotische Checkpoints auslösen. Auch die unvollständige Ausbildung oder Anheftung des Spindelfaserapparats an die Kinetochoren sowie die inkorrekte Trennung der Schwesterchromatiden führt zu einer Verzögerung der Zellteilung (Cahill et al., 1998; Clarke & Gimenez-Abian, 2000) Chromosomeninstabilitätssyndrome in Zusammenhang mit der DSB- Schadensantwort Ataxia telangiectasia Ataxia telangiectasia (AT) ist eine genetisch bedingte Krankheit, welche autosomal rezessiv vererbt wird und bereits in früher Kindheit auftritt. AT ist u. a. gekennzeichnet durch eine neuronale Degeneration, zerebelläre Ataxie, Erweiterung der kleinen Arterien (Teleangiektasien) vor allem im Gesicht und der Bindehaut des Auges und einer Immundefizienz. Die betroffenen Personen zeichnen sich weiterhin durch eine erhöhte Krebsprädisposition aus. Bei einer durchschnittlichen Lebenserwartung von ~ 30 Jahren beträgt das Lebenszeitrisiko, an Krebs zu erkranken, 30-40%. Lymphome und Leukämie sind mit einem Anteil von 60-70% die häufigsten Krebsformen. Aber auch bei soliden Tumoren wurde besonders bei älteren Patienten eine erhöhte Krebsrate festgestellt. Des Weiteren zeigen AT-Patienten eine ausgeprägte Sensitivität auf Strahlung und Radiomimetika (Meyn, 1999; McKinnon, 2004). Bereits in den 1970er deuteten Untersuchungen an primären

38 Einleitung 28 Hautfibroblasten von AT-Patienten darauf hin, dass sich die Strahlenempfindlichkeit der AT- Patienten auch auf zellulärer Ebene in Form eines verminderten Überlebens sowie einer erhöhten Rate an Chromosomenaberrationen äußert (Taylor et al., 1975; Taylor, 1978; Cornforth & Bedford, 1985). Heute weiß man, dass die Krankheit AT auf einem Defekt in dem für das Protein ATM codierenden Gen beruht (Savitsky et al., 1995). Dieses Gen ist auf dem langen Arm von Chromosom 11 lokalisiert. Das ATM-Protein hat eine Größe von 370kDa, gehört zu den Phosphatidyl-inositol-3-Kinase-ähnlichen Kinasen (PIKK) und besitzt eine Serin/Threonin- Kinaseaktivität. ATM spielt in der Zelle eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion nach IR. ATM liegt in inaktiver Form als Homodimer im Zellkern vor. Vermutlich führen Veränderungen der Chromatinstruktur nach Auftreten von DSBs zur intermolekularen Autophosphorylierung des Dimers am Ser1981, wodurch dieses dissoziiert. Die auf diese Weise aktivierten Monomere sind anschließend in der Lage, weitere an der Schadensantwort beteiligte Faktoren zu phosphorylieren, wie z.b. die Checkpoint-Kinasen Chk1 und Chk2 (Bakkenist & Kastan, 2003). So führen Defekte in ATM zu einer Unfähigkeit, nach Bestrahlung aktives p53 zu akkumulieren, und somit zu einem eingeschränkten G1/S- Checkpoint (Kastan et al., 1992; Beamish et al., 1994). Defekte in der Kontrolle des intras- Checkpoints bewirken einen ausgeprägten RDS-Phänotyp (Falck et al., 2002). Die Rolle von ATM bei der Induktion des G2/M-Checkpoints führt weiterhin dazu, dass AT-Zellen auch nach IR in der G2-Phase ungehindert in die Mitose progressieren (Beamish et al., 1996). Mittlerweile konnte gezeigt werden, dass ATM auch an der Reparatur von DSBs beteiligt ist (Blöcher et al., 1991; Riballo et al., 2004; Kühne et al., 2004). Weniger bekannt ist über die Rolle von ATM in der Mitose, und eine Rolle von ATM bei der Regulation der Apoptose scheint abhängig vom Zelltyp zu sein (Khanna et al., 2001) Artemis Defekte im Artemis-Gen führen zu einem fehlerhaften Immunsystem sowie zu einer ausgeprägten Strahlensensitivität. Die betroffenen Patienten leiden unter der Krankheit RS- SCID (radiosensitive severe combined immune deficiency). Das Artemis-Gen ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 10 lokalisiert und codiert für ein 78kDa großes Protein der Familie der Metallo-β-Lactamasen (Moshous et al., 2001). Artemis wurde zunächst als Komponente der V(D)J-Rekombination charakterisiert, einem Mechanismus der DNA- Rearrangierung bei der Antikörperherstellung. Durch die RAG1- und RAG2-Proteine werden dabei an den codierenden Sequenzen Haarnadelstrukturen gebildet. In unphosphoryliertem

39 Einleitung 29 Zustand besitzt Artemis eine ssdna-spezifische 5-3 -Exonuklease-Aktivität. Die Phosphorylierung von Artemis durch DNA-PK bewirkt zusätzlich die Aktivierung einer Endonuklease-Aktivität. Die beiden Proteine bilden einen Komplex, und die Endonuklease- Aktivität des auf diese Weise aktivierten Artemis ermöglicht die Öffnung der Haarnadelstrukturen, so dass die codierenden Enden durch die Komponenten des NHEJ verbunden werden können (Ma et al., 2002; Le Deist et al., 2004). Mittlerweile ist bekannt, dass Artemis nicht nur eine Rolle bei der V(D)J-Rekombination einnimmt, sondern auch an der Reparatur von DSBs nach IR beteiligt ist. An stationären Artemis-defizienten Fibroblasten konnte gezeigt werden, dass diese nach IR etwa 10-15% der DSBs über einen Zeitraum von mehreren Tagen unrepariert belassen (Riballo et al., 2004). Da nach IR die Bruchenden der DSBs oftmals weitere Modifikationen wie ESBs oder Basenschäden aufweisen, wird die Nuklease-Aktivität von Artemis benötigt, um diese komplexen Enden zu prozessieren, bevor sie von den Komponenten des NHEJ ligiert werden können (Riballo et al., 2004; Jeggo & Löbrich, 2005). Dabei kann Artemis sowohl von ATM als auch von DNA-PK phosphoryliert werden (Riballo et al., 2004; Zhang et al., 2004; Poinsignon et al., 2004), wobei die genaue Bedeutung dieser Phosphorylierungen nicht endgültig geklärt ist. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass DNA-PK für die Rekrutierung von Artemis zu DNA-Enden und für dessen Endonuklease-Aktivität essentiell ist (Goodarzi et al., 2006). Die Rolle von ATM in diesem Artemis-abhängigen Reparaturweg ist noch unklar. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass ATM-defekte Zellen denselben Reparaturdefekt aufweisen wie Artemis-Zellen. Epistasis-Analysen legen nahe, dass ATM und Artemis dabei an demselben Unterweg des NHEJ beteiligt sind, welcher für die Reparatur komplexer Brüche benötigt wird (Riballo et al., 2004) Weitere Chromosomeninstabilitätssyndrome Neben den beschriebenen Syndromen existieren weitere Krankheiten, welche in Zusammenhang mit Defiziten in der DNA-Schadensantwort gebracht werden können. So wurde z.b bei einem zehnjährigen Jungen mit Mikrocephalie, Störungen in der geistigen und körperlichen Entwicklung und einer Immundefizienz die autosomal rezessive Krankheit Nijmegen-Breakage-Syndrom (NBS) beschrieben. Außerdem wies der Junge sowie einige Vertreter aus der engeren Verwandtschaft eine erhöhte Translokationsrate auf (Weemaes et al., 1981). Aufgrund des zu AT ähnlichen Krankheitsbildes, wurde NBS lange Zeit als eine Variante von AT angesehen. Heute weiß man jedoch, dass NBS-Patienten einen Defekt in dem für das Protein Nibrin (NBS1) codierenden Gen besitzen (Varon et al., 1998;

40 Einleitung 30 Carney et al., 1998). Auch auf zellulärer Ebene weist NBS große Ähnlichkeiten zu AT auf. So sind NBS1-defiziente Zellen äußerst strahlenempfindlich und weisen ein erhöhtes Maß an chromosomaler Instabilität auf (Taalman et al., 1983). Wie AT-Zellen zeigen auch NBS- Zellen einen RDS-Phänotyp, was auf einer verminderten Fähigkeit zur Induktion des intras- Checkpoints beruht (Sullivan et al., 1997; Lim et al., 2000a; Falck et al., 2002). Während in Hefen weiterhin eine eingeschränkte Induktion des G1- und des G2-Checkpoints gefunden wurde (Grenon et al., 2001), ist die Rolle von NBS1 in der Zellzykluskontrolle von Vertebraten noch nicht vollständig aufgeklärt. Es wurde jedoch berichtet, dass auch humane NBS-Zellen leichte Defizite bei der Induktion des p53-abhängigen G1/S-Checkpoints aufweisen (Yamazaki et al., 1998; Matsuura et al., 1998), während die Induktion des G2/M- Checkpoints durch eine NBS1-Defizienz wahrscheinlich nicht beeinträchtigt ist (Yamazaki et al., 1998; Xu et al., 2001). NBS1 bildet zusammen mit Mre11 und Rad50 den MRN- Komplex, wobei NBS1 für die Rekrutierung des MRN-Komplexes an den DSB essentiell ist (Carney et al., 1998; Desai-Mehta et al., 2001). Im weiteren Verlauf der Schadensantwort ist der MRN-Komplex an der Weiterleitung des Schadenssignals an die Reparaturproteine beteiligt. Die starke Strahlenempfindlichkeit sowie die Immundefizienz der betroffenen Patienten lässt sich wahrscheinlich durch den Defekt in der DSB-Reparatur, welcher in NBS- Zellen beobachtet wurde, erklären (Girard et al., 2000). Die phänotypische Ähnlichkeit der beiden Krankheiten deutet darauf hin, dass ATM und NBS1 ähnliche Funktionen haben und in den Signalwegen nach IR-induzierter DSBs eng zusammen arbeiten (Featherstone & Jackson, 1998; Kobayashi et al., 2004). So ist bekannt, dass NBS1 nicht nur ein Substrat von ATM ist, sondern dass umgekehrt NBS1 auch die Aktivität von ATM nach Auftreten eines DSBs stimuliert (Gatei et al., 2000; Lee & Paull, 2004). Ein klinisch ähnliches Bild weisen auch Patienten mit dem Lig4-Syndrom auf, welche einen Defekt in der für das NHEJ essentiellen DNA-Ligase4 besitzen. Die Symptome umfassen im Allgemeinen Mikrocephalie, Panzytopenie (Mangel an allen drei Zellreihen des Blutsystems) sowie Entwicklungs- und Wachstumsverzögerungen, Immundefizienz und eine ausgeprägte Strahlenempfindlichkeit. Anhand von Studien in Mäusen konnte gezeigt werden, dass ein Knock-out von DNA-Ligase4 embryonal letal ist (Barnes et al., 1998; Frank et al., 2000). Die bisher beschriebenen Patienten weisen daher hypomorphe Mutationen der DNA-Ligase4 auf. Die Restaktivität der gebildeten Proteine variiert dabei sehr stark zwischen den einzelnen Patienten. Dies führt dazu, dass die Symptomatik der verschiedenen Patienten unterschiedlich stark ausgeprägt ist. So zeigte der im Jahre 1999 erste beschriebene Lig4-Patient keine klinischen Auffälligkeiten, bis er im Alter von 14 Jahren Leukämie entwickelte und auf die

41 Einleitung 31 anschließende Strahlentherapie auf dramatische Weise überreagierte (Riballo et al., 1999). Weitere Lig4-Patienten dagegen zeigten die verschiedenen Symptome in stärker ausgeprägter Form (O'Driscoll et al., 2001; O'Driscoll et al., 2004). Ligase4 ist eine der Hauptkomponenten des NHEJ, welches in humanen Zellen den wichtigsten Weg zur Reparatur von DSBs darstellt. DNA-Ligase4-defiziente Zellen zeichnen sich somit durch einen starken Reparaturdefekt aus, sind aber im Gegensatz zu NBS- und zu AT-Zellen Checkpointprofizient (Badie et al., 1997; Riballo et al., 1999; Rothkamm et al., 2001). Während der V(D)J-Rekombination werden DSBs gezielt erzeugt, so dass ein Defekt bei der Ligation dieser DSBs zu Immundefizienzen führt. Ebenso lässt sich die ausgeprägte Strahlenempfindlichkeit der Patienten durch das eingeschränkte DSB-Reparaturvermögen erklären. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Zellen von hypomorphen Lig4- Patienten DSBs zwar mit langsamerem Zeitverlauf reparieren, die Reparatur dabei aber öfters fehlerbehaftet ist, was zu einer erhöhten Mutationsrate und damit verbundenen Krebsprädisposition führen kann (Smith et al., 2003a; O'Driscoll et al., 2004). Patienten mit einem Defekt in Mre11 leiden unter der Krankheit ATLD (Ataxia Teleangiectasia-like disorder). Charakterisiert wurde die Krankheit erstmals in Patienten zweier Familien, bei denen aufgrund ihres klinischen Bildes AT diagnostiziert wurde, genetische Analysen jedoch keine ATM-Mutation erkennen ließen. Die betroffenen Personen zeigten u. a. die für AT typische chromosomale Instabilität, sowie eine progressive zerebelläre Ataxie. Nachfolgende Studien zeigten, dass bei diesen Patienten das für Mre11-codierende Gen defekt war (Hernandez et al., 1993; Stewart et al., 1999). Das Mre11-Gen ist in der Nähe des ATM-Gens auf dem langen Arm von Chromosom 11 lokalisiert, so dass detaillierte genetische Analysen zur Unterscheidung von ATLD und AT notwendig sind. Es wird daher vermutet, dass ein Teil der Patienten, bei denen AT diagnostiziert wurde, unter ATLD leidet (Stewart et al., 1999). Ob ATLD-Patienten eine erhöhte Krebsprädisposition aufweisen, kann aufgrund des seltenen Auftretens dieser Krankheit noch nicht mit Sicherheit gesagt werden. Jedoch gibt es Hinweise, dass zumindest transgene Mäuse mit homozygoter C-terminaler Trunkation im Mre11-Gen Tumore nicht mit erhöhter Rate entwickeln (Theunissen et al., 2003). Auch auf zellulärer Ebene zeigen ATLD-Zellen Ähnlichkeiten zu AT-Zellen. So reagieren Mre11-defiziente Zellen empfindlich auf IR. Mre11 besitzt sowohl eine 3-5- Exonuklease-Aktivität, als auch eine Endonuklease-Aktivität und ist in der Lage, Haarnadelstrukturen zu öffnen. Dies legt die Vermutung nahe, dass Mre11 die Enden eines DSBs prozessiert, bevor diese repariert werden können (Paull & Gellert, 1998; Jeggo, 1998b).

42 Einleitung 32 Wie AT- und NBS-Zellen zeigen Mre11-defiziente einen RDS-Phänotyp, wobei dieser milder ausgeprägt zu sein scheint als in AT-Zellen (Stewart et al., 1999; Falck et al., 2002). Bei dem 1960 erstmals beschriebenen Seckel-Syndrom handelt es sich um eine autosomal rezessive Krankheit. Die betroffenen Patienten zeichnen sich besonders durch Wachstumsverzögerungen aus. Besonders auffällig sind dabei u. a. die bereits pränatal auftretende Kleinwüchsigkeit, die schwere Mikrozephalie mit einer Vogel-ähnlichen Gesichtsform sowie die mentale Retardierung. Das Seckel-Syndrom wird meist auf einen Defekt in dem für das Protein ATR (ataxia teleangiectasia and Rad3-related protein) codierenden Gen zurückgeführt. Über das Vorhandensein einer chromosomalen Instabilität in ATR-defizienten Zellen existieren widersprüchliche Untersuchungen. Während einige Studien von einer spontan auftretenden chromosomalen Instabilität berichten (Butler et al., 1987; Woods et al., 1995), konnte in anderen Studien eine Erhöhung an Chromosomenaberrationen erst nach Behandlung mit der DNA-Crosslinks-erzeugenden Chemikalie MitomycinC oder ähnlichen Replikationsstress erzeugenden Agenzien gefunden werden (Brown & Baltimore, 2000; Bobabilla-Morales et al., 2003; Casper et al., 2004). ATR gehört zu der Familie der PIKKs und besitzt große Ähnlichkeiten mit ATM. Die Aktivierung von ATR erfolgt jedoch, anders als bei ATM, in erster Linie nicht über das Auftreten von DSBs, sondern über lange einzelsträngige DNA-Bereiche wie sie z.b. nach einer UV-Bestrahlung oder bei stagnierenden Replikationsgabeln auftreten (Brown & Baltimore, 2000; Shechter et al., 2004b; O'Connell & Cimprich, 2005). Zielproteine von ATR während der S-Phase sind dabei u. a. die an der Induktion des intras-phase-checkpoints beteiligten Proteine Chk1 und BRCA1 (breast cancer protein) (Tibbetts et al., 2000). Defekte in ATR führen somit zu einem RDS-Phänotyp, wodurch sich die genomische Instabilität ATR-defekter Zellen erklären lässt (O'Driscoll et al., 2004) Nachweisverfahren von DNA-Doppelstrangbrüchen Pulsfeld-Gelelektrophorese Die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) wurde erstmals zur Auftrennung der Chromosomen von S. cerevisiae eingesetzt (Schwartz & Cantor, 1984; Carle & Olson, 1985). Im Laufe der Jahre wurde diese Technik weiter entwickelt und ist heute als Standardmethode zum Nachweis von DSBs etabliert (Birren et al., 1988; Löbrich et al., 1993). Wie auch die konventionelle Gelelektrophorese beruht das Prinzip der PFGE auf der Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrem Molekulargewicht in einem Agarosegel durch Anlegen eines

43 Einleitung 33 elektrischen Feldes. Dabei wandern DNA-Fragmente mit geringem Molekulargewicht schneller als Fragmente mit größerem Molekulargewicht. Eine zusätzliche Auftrennung der Fragmente wird bei der PFGE durch ein regelmäßiges Ändern der Richtung des elektrischen Feldes erreicht, wodurch sich die DNA-Fragmente immer wieder neu orientieren müssen. Dies geschieht bei kleineren Fragmenten ebenfalls schneller als bei großen Fragmenten, so dass Fragmenten mit geringerem Molekulargewicht mehr Restzeit zur Wanderung im Gel verbleibt. Während die konventionelle Gelelektrophorese nur die Auftrennung von Fragmenten einer Größe <20kbp erlaubt, können bei der PFGE DNA-Fragmente bis zu einer Größe von 10Mbp aufgetrennt werden. Größere Fragmente verbleiben dagegen in der Tasche. Um eine Fragmentierung der DNA durch Scherkräfte bei einer DNA-Präparation in Lösung zu vermeiden, werden die Zellen vor der Elektrophorese in Agaroseblöckchen eingegossen und in diesen vollständig lysiert. Durch einen Proteinase-Verdau werden die Proteine entfernt, so dass die DNA in den Blöckchen in reiner Form vorliegt. Diese werden anschließend in die Taschen des Pulsfeldgels eingesetzt. Um mit dieser Methode DSB-Reparatur messen zu können, ist es notwendig, sehr hohe, nichtphysiologische Dosen an IR einzusetzen. Die Quantifizierung der aus der Tasche heraus gewanderten DNA (Schmier) erfolgt in der Regel über die Auswertung des Fluoreszenzsignals anhand des Ethidiumbromid-gefärbten Gels. Alternativ ist es möglich, den Zellen vor der Bestrahlung 3 H- oder 14 C-markierte Nukleotide zum Einbau in die DNA anzubieten und bei der Auswertung die aus der Tasche herausgelaufene Radioaktivität zu messen. Der Quotient der aus der Tasche herausgelaufenen DNA und der Gesamt-DNA ergibt dabei den FAR-Wert (fraction of radioactivity released). Durch die Messung von Induktionsproben verschiedener Dosen, welchen nach der Bestrahlung keine Reparaturzeit gegeben wurde, lässt sich eine Eichkurve erstellen. Anhand dieser Eichkurve kann der FAR-Wert einer Reparaturprobe in ein Dosis-Äquivalent umgerechnet werden, und es kann eine Aussage über die verbliebene Restschädigung getroffen werden. Die PFGE ist eine vielseitige Methode, welche sich für die Untersuchungen der DSB-Reparatur in verschiedenen Organismen und Zelltypen eignet Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) In Folge eines DSBs wird eine große Anzahl verschiedener Proteine an die Bruchstelle rekrutiert. Zu diesen gehören sowohl Komponenten der DSB-Reparatur als auch an der Induktion der Checkpoints beteiligte Proteine. Einige dieser Proteine treten im Bereich des Bruchs in so gehäufter Zahl auf, dass sie immunfluoreszenz-mikroskopisch in Form so

44 Einleitung 34 genannter Foci sichtbar gemacht werden können. Da besonders IR sowie radiomimetische Chemikalien DSBs induzieren, spricht man dabei auch von IRIFs (ionising radiation induced foci). Seit einigen Jahren werden diese Foci auf vielfältige Weise als Marker für DSBs herangezogen. Ein Protein, welches sich zum Nachweis von DSBs eignet, ist das Histon H2AX. Dieses wird innerhalb von Minuten nach Auftreten eines DSBs im Bereich von mehreren Mbp um den Bruch am Ser139 phosphoryliert (γh2ax) und kann nach einer Färbung mit Phosphorylierungs-spezifischen Antikörpern in der Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) in Form diskreter Foci sichtbar gemacht werden (Rogakou et al., 1999). Mit zunehmender Reparaturzeit nimmt die Zahl γh2ax-foci im Zellkern aufgrund der mit der Reparatur der DSBs einhergehenden Dephosphorylierung ab. Vergleichende PFGE-Experimente zeigten, dass der Zeitverlauf der Abnahme der Foci identisch zu dem der Reparatur der DSBs ist und dass dabei ein γh2ax-focus einen DSB widerspiegelt (Sedelnikova et al., 2002; Rothkamm & Löbrich, 2003). Während für die Messung der DSB-Reparatur mittels PFGE sehr hohe Dosen IR benötigt werden, ermöglicht die Quantifizierung von Foci auf Einzelzellebene die Analyse von Zellen, welche mit physiologischen Dosen im Bereich weniger Gy bis hin zu wenigen mgy bestrahlt wurden. Reparaturproteine wie Ku70/Ku80, DNA-PK oder Lig4 liegen am Bruch in so geringer Anzahl vor, dass sie keine fluoreszenz-mikroskopisch sichtbaren Foci ausbilden. Dagegen existieren neben dem Chromatin-gebundenen γh2ax eine Reihe weiterer Proteine, welche nach Auftreten eines DSBs in großer Anzahl an den Bruch rekrutiert werden, so dass sie in Form von Foci visualisiert werden können. Dabei unterscheiden sich die Foci-ausbildenden Proteine z.b. in der Größe der Foci sowie der Zellzyklusphase ihres Auftretens (Bradbury & Jackson, 2003; Bekker-Jensen et al., 2006). So wird eine Gruppe von Proteinen in allen Zellzyklusphasen in dem gesamten, aufgrund des DSBs modifizierten Chromatinbereich angehäuft und co-lokalisiert dabei mit γh2ax. Zu diesen Proteinen gehören beispielsweise die Checkpoint-Signalproteine Mdc1, BRCA1 und 53BP1, sowie ATM und die Komponenten des MRN-Komplexes (Maser et al., 1997; Celeste et al., 2002; Kitagawa et al., 2004; Stucki & Jackson, 2004; Aten et al., 2004; Bekker-Jensen et al., 2006; Schlegel et al., 2006). Eine weitere Gruppe von Proteinen bildet relativ kleine Foci (Mikrofoci) aus, welche innerhalb der ausgedehnten γh2ax-bereiche liegen. Zu dieser Gruppe gehören Proteine, welche an der Entstehung und Stabilisierung langer einzelsträngiger Bereiche z.b. durch Resektion eines DSB-Endes beteiligt sind bzw. durch diese induziert werden. Die Ausbildung von Mikrofoci wurde u. a. für die an der HR beteiligen Proteine Rad51 und RPA, sowie ATR und BRCA1

45 Einleitung 35 beschrieben. Für die an der HR beteiligten Proteine beschränkt sich das Auftreten der Foci dabei auf die S- und die G2-Phase des Zellzyklus (Maser et al., 1997; Paull et al., 2000; Cortez et al., 2001; Bekker-Jensen et al., 2006; Adams et al., 2006; Schlegel et al., 2006). Die Größe der Foci, der Zeitpunkt ihres Auftretens nach der Induktion eines DSBs sowie die Dauer ihres Bestehens am DSB stehen im engen Zusammenhang mit ihrer Funktion in der Schadenssignalkaskade. So zeigten beispielsweise Essers et al., dass die Mitglieder der Rad52-Epistasis-Gruppe mobile Proteine sind, welche nur im Zusammenhang mit DSBs funktionelle Holoenzyme ausbilden. Während dabei das für die Stranginvasion bei der HR benötigte Rad51 stabile Foci ausbildet, diffundieren die regulatorischen Komponenten Rad52 und Rad54 schnell ins umgebende Nukleoplasma (Essers et al., 2002). Ähnliches zeigte auch ein Vergleich von NBS1, ATM und Chk2. Da NBS1 als Komponente des MRN-Komplexes und ATM neben ihrer Funktion an der Checkpoint-Regulation auch eine direkte Rolle in der DSB-Reparatur übernehmen, bilden sie über einen längeren Zeitraum hinweg diskrete Foci aus. Dagegen wird Chk2 in der direkten Umgebung des DSBs durch ATM phosphoryliert und verteilt sich anschließend im gesamten Zellkern, um das Schadenssignal an weitere Checkpoint-Effektoren weiterzuleiten (Lukas et al., 2003; Lukas et al., 2004a). Innerhalb weniger Minuten nach Induktion eines DSBs auftretende Foci werden von γh2ax, ATM, NBS1, 53BP1, Mdc1 oder anderen an der Schadenserkennung beteiligten Proteinen gebildet. Erst zu späteren Zeiten treten Foci von Proteinen auf, welche an der HR beteiligt sind (z.b. Rad51) oder durch die Bindung an lange einzelsträngige DNA-Bereiche aktiviert werden (z.b. RPA, ATR). Aus dem zeitlichen Auftreten der Foci lassen sich somit auch Rückschlüsse auf die Mechanismen der Schadenserkennung und die Weiterleitung des Signals sowie die Reparaturmechanismen ziehen. Eine technische Weiterentwicklung der konventionellen IFM mit fixierten Zellen stellt in den letzten Jahren das Aufkommen der Lebend-Zell-Mikroskopie dar (Lukas et al., 2005). Die Fusion bestimmter Foci-bildender Proteine mit fluoreszierenden Proteinen ermöglicht die Beobachtung der Ausbildung und das mit der Reparatur der DSBs verbundene Verschwinden von Foci in der lebenden Zelle. Solche Konstrukte existieren mittlerweile z.b. für 53BP1, Mdc1, Rad51 und NBS1 (Lukas et al., 2004a; Bekker-Jensen et al., 2005) Chromosomenaberrationen Durch das Auftreten eines DSBs ist die durchgehende Struktur des Zucker-Phosphat- Rückgrats des DNA-Moleküls unterbrochen. Nach Kondensation der Chromosomen manifestiert sich dies oft in Form von mikroskopisch sichtbaren Chromosomenbrüchen. Die

46 Einleitung 36 Chromosomen liegen die meiste Zeit des Zellzyklus in loser, dekondensierter Form vor, so dass Brüche nicht direkt mikroskopisch sichtbar gemacht werden können. Die Kondensation der Chromosomen kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Auf natürlichem Wege kondensieren Chromosomen während der Prophase der Mitose und lagern sich in der Metaphase in der Äquatorialebene der Zelle an. In der darauf folgenden Anaphase werden die beiden Chromatiden jedes Chromosoms durch den Spindelfaserapparat getrennt und an die gegenüberliegenden Pole der Zelle gezogen. Die Zugabe von Spindelgiften unterbindet die Trennung der Chromatiden und somit die Zellteilung. So verhindert das aus der Herbstzeitlose gewonnene Colcemid (Demecolcin) die Depolymerisation der Mikrotubuli und zerstört den Spindelfaserapparat, so dass die Chromosomen in der Äquatorialebene verbleiben (Kanda et al., 1994; Urbani et al., 1995). Alternativ wird häufig Nocodazol eingesetzt, welches durch die Bindung an β-tubulin den Aufbau und die Funktion des Spindelfaserapparats zerstört und somit ebenfalls die Zellteilung unterbindet (Jordan et al., 1992). Eine Untersuchung der Chromosomen ist weiterhin in der G0/G1-Phase und der G2-Phase möglich. Da das Chromatin in diesen Zellzyklusphasen in dekondensierter Form vorliegt, muss die Kondensation künstlich induziert werden. Diese vorzeitige Chromosomenkondensation (PCC; premature chromosome condensation) in Interphase-Zellen ist z.b. durch die Fusion der zu untersuchenden Zellen mit mitotischen Zellen möglich (Johnson & Rao, 1970; Cornforth & Bedford, 1983). Die genauen Mechanismen der PCC sind noch nicht vollständig verstanden. Eine Rolle scheint u. a. der Proteinkomplex MPF (maturation/mitosispromoting factor) zu spielen, welcher aus p34cdc2/cyclinb besteht. In seiner dephosphorylierten aktiven Form bewirkt MPF die Chromosomenkondensation. Nach der Fusion mit mitotischen Zellen stimuliert das aktive MPF somit die Chromosomenkondensation in den Interphase-Zellen. (Dunphy et al., 1988; Moreno et al., 1989). Die Kondensation der Chromosomen von Interphase-Zellen lässt sich weiterhin chemisch induzieren. So bewirkt die Zugabe von Calyculin A oder Okadaic Acid, welche spezifisch die Aktivität der Protein-Phosphatasen 1 und 2A (PP1, PP2A) inhibieren, dass cdc25 in seiner phosphorylierten aktiven Form vorliegt und somit durch Dephosphorylierung MPF aktiviert (Kumagai & Dunphy, 1992; Izumi et al., 1992; Kinoshita et al., 1993; Asakawa & Gotoh, 1997; Gotoh et al., 1999). Da eine Komponente des MPF-Komplexes das nur in der G2-Phase in großen Mengen vorhandene CyclinB ist, werden auf diese Weise hauptsächlich G2-Phase- Chromosomen kondensiert (Durante et al., 1998; Gotoh & Durante, 2006). Anhand kondensierter Chromosomen lässt sich u. a. das Reparaturverhalten bestrahlter Zellen untersuchen. Dabei resultiert jedoch nicht jeder DSB in einem mikroskopisch sichtbaren

47 Einleitung 37 Chromosomenbruch. Es wird geschätzt, dass nur jeder dritte bis sechste DSB als Chromosomenbruch sichtbar wird. Die Ursachen dieser Diskrepanz sind dabei noch nicht vollständig geklärt, liegen aber vermutlich in den der Entstehung von Chromosomenbrüchen zugrunde liegenden Mechansimen (Bedford & Goodhead, 1989; Cornforth & Bedford, 1993).

48 Einleitung Zielsetzung DSBs sind für die Zelle die schwerwiegendsten Läsionen, da sie bei ausbleibender Reparatur zum Zelltod bzw. bei fehlerhafter Reparatur zur Entstehung von Chromosomenaberrationen führen können. Die Zelle besitzt in erster Linie zwei Mechanismen zur Vermeidung von Chromosomenaberrationen. Durch Reparaturmechanismen werden DNA-Schäden beseitigt. Die Induktion von Checkpoints in verschiedenen Phasen des Zellzyklus ermöglicht es der Zelle währenddessen, die Proliferation zu stoppen oder zu verlangsamen, so dass sie mehr Zeit für die Reparatur der DNA-Schäden besitzt. Der Ausfall eines oder beider Mechanismen führt dazu, dass die Zelle mit DNA-Schäden den Zellzyklus durchläuft, woraus häufig die Ausbildung einer chromosomalen Instabilität oder die Entartung der Zelle resultiert. Ein korrektes Zusammenspiel von Reparatur und Zellzykluskontrolle ist daher wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität. Die Mechanismen, die zur Entstehung von Chromosomenaberrationen führen, sind bis heute nicht vollständig geklärt. Neben der Aufklärung der Reparaturmechanismen und der Checkpoint-Kontrolle lassen sich Rückschlüsse auch aus der Betrachtung von Dosis-Effekt-Kurven ziehen Messung von Chromosomenaberrationen nach Bestrahlung mit niedrigen Dosen ionisierender Strahlung Es ist bekannt, dass Dosis-Effekt-Kurven für Chromosomenaberrationen im höheren Dosis- Bereich einen linear-quadratischen Verlauf zeigen. Eine Messung im Niedrig-Dosis-Bereich (< 500mGy) erweist sich aufgrund der geringen Effekte als schwierig. Chromosomen sind eine der Hauptursachen für die Entstehung von Krebs. Epidemiologische Studien lassen darauf schließen, dass das Krebsrisiko im Niedrig-Dosis-Bereich einen linearen Verlauf zeigt. Da jedoch auch hier keine zuverlässigen Daten über die Entstehung von Krebs im Dosis- Bereich von wenigen mgy vorliegen, wird bis heute die Dosis-Effekt-Kurve linear extrapoliert. Dennoch wäre es möglich, dass diese Extrapolation das tatsächliche Krebsrisiko von wenigen mgy unter- oder überschätzt, was erhebliche Folgen für den Strahlenschutz hätte. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, ein System zu entwickeln, um Chromsomenaberrationen im Niedrig-Dosis-Bereich zu messen und aus den gewonnenen Daten Dosis- Effekt-Kurven zu erstellen. Dies sollte ermöglichen, Rückschlüsse auf das Krebsrisiko in diesem Dosis-Bereich zu ziehen. Weiterhin ermöglicht die Messung von Dosis-Effekt-Kurven Einsichten in die Mechanismen der Entstehung von Aberrationen.

49 Einleitung Untersuchungen zum Zusammenspiel von DSB-Reparatur und Zellzykluskontrolle Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel von DSB-Reparatur und Zellzykluskontrolle bei der Vermeidung chromosomaler Instabilität näher zu charakterisieren. Dabei wurde besonders Wert auf die Reparatur in der G2-Phase sowie die Regulation des G2/M-Checkpoints gelegt. Dazu sollten Zellsysteme etabliert werden, welche entweder Reparatur- oder Checkpoint-defizient oder in beiden Funktionen profizient bzw. defizient sind. Patienten mit einem Defekt in dem ATM-Protein besitzen eine hochgradige chromosomale Instabilität. ATM ist eines der ersten Proteine, welches in der DSB-Schadensantwort aktiviert wird. Seit langem ist bekannt, dass ATM dabei als Signalprotein u. a. bei der Regulation des G2/M-Checkpoints eine wichtige Rolle spielt. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass ATM in stationären G0/G1-Zellen zusammen mit der Nuklease Artemis auch für die Reparatur einer Unterklasse von DSBs benötigt wird, so dass eine Defizienz in einem der beiden Proteine zu demselben Reparaturdefekt führt (Riballo et al., 2004). Ausgehend von diesem Wissen wurde vermutet, dass sich diese Zelllinien zusammen mit WT-Zellen und Checkpoint-inhibierten WT-Zellen als geeignete Zellsysteme für die Untersuchung des Zusammenspiels von Reparatur und Checkpoints eignen könnten. Über die Reparaturfunktion von ATM und Artemis in der G2-Phase sind keine Informationen vorhanden, und über die Checkpointfunktionen von Artemis existieren in der Literatur widersprüchliche Aussagen. Daher sollten zunächst Reparatur- und Checkpointstudien in der G2-Phase in diesen Zelllinien sowie in WT-Zellen und Checkpoint-inhibierten WT-Zellen durchgeführt werden. Nach Etablierung der benötigten Zellsysteme sollte ein neu entwickeltes Konzept zur Betrachtung mitotischer Brüche angewendet werden, welches eine Bewertung des Anteils der Checkpoint- und der Reparaturfunktion bei der Entstehung chromosomaler Brüche erlaubt.

50 Material und Methoden Material und Methoden 3.1. Materialien und Geräte Brutschränke Binder CB150, Heraeus B5061EK, Jouan IG150 Deckgläschen Roth, 18x18mm und 24x60mm Durchflusszytometer Becton Dickinson FACScan TM Fluoreszenz-Mikroskop Zeiss Axioplan2, Zeiss Axioskop Invers-Mikroskop Nikon Eclipse TS100 Mikroskop-Kamerasystem Zeiss AxioCam MRm Kryoröhrchen CryoTube Vials,1,8ml Kühlzentrifuge Eppendorf 5804R Neubauer-Zählkammer Roth Objektträger Menzel-Gläser SuperFrost, 76x26mm Pulsfeld-Gelelektrophorese-System BioRad Chef-DR III Röntgenröhre Philips MCN 165 / Rundbodenröhrchen BD Falcon, 5ml Sterilwerkbänke Napco NapFlow, Holten LaminAir Szintillationsgefäße Perkin Elmer, Polyehtylen-Vials TM 20ml Szintillationszähler Packard, Tri-Carb 2700 TR Tischzentrifugen Heraeus Biofuge pico, Eppendorf 5415C Transilluminator Biometra Zellkultur-Flaschen TPP, 25cm 2 und 75cm 2 Zellkultur-Schalen Nunc, 8,8cm 2 und 21,5cm 2, 6-Well-Platten Zentrifugenröhrchen TPP, 15 ml und 50ml 3.2. Chemikalien und Zusammensetzung verwendeter Lösungen Verwendete Chemikalien Aphidicolin Borsäure BrdU BSA Calyculin A Colcemid Sigma, 1mg/ml DMSO Roth BD Pharmingen TM, 1mM in PBS Roth, Albumin Fraktion V Calbiochem, 50µg/ml in DMSO Sigma, 100µg/ml in DMSO

51 Material und Methoden 41 DAPI Sigma, 1mg/ml in PBS DMSO Roth, Rotipuran DNAse Fluka, 1 mg/ml in 50% Glycerin + 0,15M NaCl Essigsäure Roth Ethanol, vergällt zentrales Chemikalienlager der Universität des Saarlandes, 99% vergällt mit 1% MEK Ethidiumbromid Roth, 10mg/ml FCS Biochrom Formaldehyd Roth, 37% Formamid Merck Giemsa Sigma Diagnostics, modified, 0,4% (w/v) in Methanol HAM s F10 Biochrom Hionic Fluor TM Szintillationsflüssigkeit Perkin Elmer KCl USB KH 2 PO 4 Roth Low-Melting-Point-Agarose Agarose Typ VII, Sigma β-mercaptoethanol Sigma Methanol Roth MgCl 2 Roth Minimal Essential Medium (MEM) Biochrom Mounting Medium Vector Laboratories, Vectashield Na 2 -EDTA Roth Na 2 HPO 4 USB Natriumhypochloritlösung Roth, 12% Cl Natrium-Tetraborat-Decahydrat Roth N-Laurosyl-Sarcosin Merck Nocodazol Sigma, 50µg/ml in DMSO Non-essential amino acids Biochrom 10x PBS PBS Dulbecco Instamed-Pulver Penicillin-Streptomycin Biochrom Pepsin Sigma, 20mg/ml in H 2 O dest. PronaseE Merck Pulsed Field Certified Agarose BioRad RNAseA Sigma, 10mg/ml PBS, 20min bei 75 C hitzeinaktiviert Salzsäure Roth SB Calbiochem, 1mM in DMSO Tris Roth Triton X-100 Roth Trypsin Biochrom Tween20 Sigma XCP chromosome painting probe #1 MetaSystems, FITC-gekoppelt

52 Material und Methoden 42 XCP chromosome painting probe #1 XCP chromosome painting probe #2 XCP chromosome painting probe #4 Yeast Chromosome PFG Marker MetaSystems, TexasRed -gekoppelt MetaSystems, FITC-gekoppelt MetaSystems, TexasRed -gekoppelt NEB Verwendete Lösungen 20x SSC 3,0M NaCl 0,3M C 6 H 5 Na 3 O 7 * 2 H 2 O 2x SSCT 0,01% Tween20 in 2x SSC, ph7,0-7,5 Einfriermedium 20% (v/v) Zellkulturmedium 20% (v/v) DMSO 60% FCS Inkubationspuffer 60mM Tris 0,6mM MgCl 2 1mM β-mercaptoethanol 1µg/ml DNAse Lyse-Puffer 1% (w/v) N-Laurosyl-Sarcosin 1mg/ml PronaseE 0,5M Na 2 -EDTA, ph8 Postfixierungs-Lösung 1% (v/v) Formaldehyd 50mM MgCl 2 in PBS Sonden-Mix 1/6 XCP chromosome painting probe #1, FITC-gekoppelt 1/6 XCP chromosome painting probe #1, TexasRed -gekoppelt 1/3 XCP chromosome painting probe #2 1/3 XCP chromosome painting probe #4

53 Material und Methoden 43 1x TBE-Puffer 44,5mM Tris 44,5mM Borsäure 1mM Na 2 -EDTA, ph8 1x TE-Puffer 10mM Tris/HCl 1mM Na 2 -EDTA, ph8 Trypsin-EDTA-Lösung 0,1% Trypsin 0,5mM Na 2 -EDTA, ph8 in PBS Propidiumiodid-Lösung 50µg/ml Propidiumiodid 0,5mg/ml RNAse in PBS Antikörper mouse-anti-brdu IgG mouse-anti-γh2ax (Ser139) rabbit-anti-γh2ax (Ser139) rabbit-anti-cenp-f rabbit-anti-cyclina rabbit-anti-phosphoh3 (Ser10) goat-anti-rabbit Alexa Fluor 594 goat-anti-rabbit Alexa Fluor 488 goat-anti-mouse Alexa-Fluor 488 BD Pharmingen, fertige Gebrauchslösung aus FITC-conjugated mouse monoclonal Antibodyset, IgG Upstate, IgG, 2µg/ml Upstate, IgG, 1µg/ml Santa Cruz, IgG, 200µg/µl Santa Cruz, IgG, 200µg/ml Upstate, IgG, 1µg/µl MoBiTec, IgG, 2mg/ml MoBiTec, IgG (H+L), 2mg/ml MoBiTec IgG, 2mg/ml

54 Material und Methoden Zelllinien und Zellkultur Zelllinien HSF1: HSF1-Zellen sind humane primäre Hautfibroblasten eines gesunden Spenders. Sie wurden von Dr. K. Dittmann (Eberhard-Karls-Universität, Tübingen) zur Verfügung gestellt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Minimal Essential Medium (MEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Non-essential amino acids (NEAA), 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin. MRC-5: Bei MRC-5-Zellen handelt es sich um humane primäre Lungenfibroblasten eines 14 Wochen alten männlichen Fötus (Jacobs et al., 1970). Sie wurden von der European Collection of Animal Cell Cultures bezogen (ECACC-Nr ). Die Zellen wurden in MEM mit 10% FCS, 1% NEAA, 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin kultiviert. C2906: Bei diesen Zellen handelt es sich um primäre humane Hautfibroblasten eines gesunden Spenders. Sie wurden von Dr. M. Frankenberg-Schwager (Georg-August-Universität, Göttingen) zur Verfügung gestellt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in MEM mit 20% FCS, 1% NEAA, 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin. AT1BR: Die AT1BR-Zellen sind humane primäre Hautfibroblasten mit einem homozygot defekten ATM-Gen. Sie stammen von einem Menschen mit der Erbkrankheit Ataxia telangiectasia (AT). Diese AT-Zellen wurden von der European Collection of Animal Cell Cultures bezogen (ECACC-Nr. BM0020). Die Zellen wurden in HAM s F10-Medium mit 15% FCS, 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin kultiviert. AT7BI: Die AT7BI-Zellen sind humane primäre Hautfibroblasten mit einem Defekt im ATM-Gen. Diese AT-Zellen wurden von Dr. P.A. Jeggo (University of Sussex, Brighton, UK) zur Verfügung gestellt Die Zellen wurden in HAM s F10-Medium mit 15% FCS, 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin kultiviert.

55 Material und Methoden 45 F01-240: Diese primären humanen Hautfibroblasten stammen von einem Patienten mit einem defekten Artemis-Gen. Sie wurden von Dr. P. A. Jeggo (University of Sussex, Brighton, UK) zur Verfügung gestellt. Die Kultivierung der Artemis-Zellen erfolgte in MEM mit 20% FCS, 1% NEAA, 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin. CJ179: Bei diesen Zellen handelt es sich um primäre humane Hautfibroblasten eines Patienten mit einem Defekt in dem Artemis-Gen. Sie wurden von Dr. P. A. Jeggo (University of Sussex, Brighton, UK) zur Verfügung gestellt. Kultiviert wurden die Artemis-Zellen in MEM mit 20% FCS, 1% NEAA, 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin. 82-6hTert: 82-6hTert-Zellen sind primäre humane Wildtyp-Zellen, die mit einem htert-exprimierenden (human Telomerase reverse transcriptase) Retrovirus immortalisiert wurden (Kim et al., 1999). htert ist die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase, so dass eine Verkürzung der Telomere und somit das Altern der Zellen aufgehalten wird. Diese Zelllinie wurde von Prof. Dr. R. Schiestl (UCLA Schools of Medicine and Public Health, Los Angeles, USA) zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in MEM mit 20% FCS, 1% NEAA, 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin kultiviert. CJ179hTert: Bei den CJ179hTert-Zellen handelt es sich um die primären humanen CJ179-Zellen, die ebenfalls mit einem htert-exprimierenden Retrovirus immortalisiert wurden. Diese Zellen wurden von Dr. P. A. Jeggo (University of Sussex, Brighton, UK) zur Verfügung gestellt. Die Kultivierung dieser Artemis-Zellen erfolgte in MEM mit 20% FCS, 1% NEAA, 0,1mg/ml Streptomycin und 100Units/ml Penicillin Zellkultur Alle Zelllinien wurden bei 37 C in einer Wasserdampf-gesättigten Atmosphäre und 5% CO 2 - Anteil kultiviert. Zur Subkultivierung wurden die adhärenten Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Um die Zellen vom Boden des Zellkultur-Gefäßes zu lösen, wurden die Zellen anschließend für 5-10min bei 37 C mit Trypsin-EDTA-Lösung behandelt. Die Zellsuspension

56 Material und Methoden 46 wurde in Medium aufgenommen und entsprechend der Split-Rate (1:2-1:3 bei primären, 1:5-1:6 bei htert-immortalisierten Zelllinien) auf neue Zellkultur-Gefäße aufgeteilt. Für Experimente mit exponentiell wachsenden Zellen wurde die Zellzahl durch Zählen in der Neubauer-Kammer bestimmt. Die Zellen wurden zwei Tage vor dem Experiment in einer Zelldichte von Zellen pro cm 2 ausgesät. Dies geschah bei den chromosomalen Studien, den phosphoh3-facs-experimenten sowie den PFGE-Experimenten in 75cm 2 -Zellkultur- Flaschen, bei den BrdU-FACS-Experimenten in 25cm 2 - oder 75cm 2 -Zellkultur-Flaschen. Bei Immunfluoreszenz-Experimenten wurden die Zellen auf Deckgläschen ( 12mm) in Zellkultur-Schalen ausgesät Kryokonservierung von Zellen Die Zellen wurden mittels Trypsin-EDTA-Behandlung vom Boden des Zellkultur-Gefäßes gelöst und in wenigen Millilitern Medium aufgenommen. Durch Zählen in der Neubauer- Zählkammer wurde die Zellzahl bestimmt, und die Zellsuspension wurde für 8min bei 300g und 4 C zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in 0,9ml kaltem Medium pro einzufrierendem Aliquot aufgenommen und auf Eis gelagert. Die Suspension wurde mit derselben Menge an kaltem Einfriermedium gemischt und jeweils 1,8ml in Kryoröhrchen gegeben. Die Zellen wurden in einem geeigneten Styroporgefäß langsam auf -80 C gekühlt und nach 1-2 Tagen in flüssigen Stickstoff überführt, wo sie bis zum Auftauen gelagert wurden Auftauen von Zellen Das Auftauen von Zellen erfolgte möglichst rasch, indem die Zellen bei 37 C für ca. 2min aufgetaut und direkt in 5ml warmes Medium überführt wurden. Die Suspension wurde für 8min bei 300g und 4 C zentrifugiert, die Zellen in frischem Medium aufgenommen, in ein Zellkulturgefäß überführt und bei 37 C, 5% CO 2 und Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre kultiviert Röntgenbestrahlung Für die Bestrahlung der Zellen wurde eine Röntgenröhre mit einer Wolfram-Anode verwendet. Die Bestrahlung wurde bei einer Spannung von 90kV und einer Stromstärke von 19mA bei einer Filterung mit 1mm Aluminium durchgeführt. Im Abstand von 30cm zum

57 Material und Methoden 47 Beryllium-Austrittsfenster ergab sich somit eine Dosisleistung von 1,96Gy/min. Bei einem Abstand von 39cm bzw. 45cm zum Austrittsfenster lag die Dosisleitsung bei 0,96Gy/min bzw. bei 0,79Gy/min. Die Dosisleistungen wurden durch Fricke-Dosimetrie sowie durch Messung mit einem PTW-Weichstrahlkammer-Dosimeter bestimmt. Bestrahlungen mit einer Dosis von 1Gy oder höher, sowie die Experimente zur Dosis- Abhängigkeit von Aberrationen wurden bei einer Dosisleistung von 0,96Gy/min oder 1,96Gy/min durchgeführt. Studien mit niedrigeren Dosen wurden bei 0,79Gy/min bestrahlt. Bei Pulsfeld-Gelelektrophorese-Experimenten wurde die Aluminiumplatte, die als Filter und als Trägerplatte für die Kulturflaschen diente, vorgekühlt. Bei Bestrahlung auf Glas-Deckgläschen ist zu beachten, dass aufgrund der hohen Ordnungszahl des Materials Wechselwirkungen zwischen der Röntgenstrahlung und der Materie auftreten. Die durch den Photoeffekt zusätzlich entstehenden Sekundärelektronen besitzen eine genügend hohe Reichweite, um die adhärenten Zellen zu schädigen, können jedoch durch Dosimeter oder mittels Fricke-Dosimetrie nicht detektiert werden. Die effektive Dosis ist somit bei Bestrahlung auf Glas-Deckgläschen um den Faktor 1,5-2 höher als bei Bestrahlung in Kunststoff-Zellkulturflaschen (Manuskript in Vorbereitung). Sofern nicht anders beschrieben, wurde dieser Umstand bei der Angabe der Dosis berücksichtigt Chromosomale Analysen Bei den G2-Studien mit exponentiell wachsenden Zellen wurde direkt nach Bestrahlung 3µg/ml Aphidicolin zugegeben. Diese Chemikalie inhibiert während der Replikation benötigte Polymerasen und sollte verhindern, dass Zellen aus der S-Phase in die G2-Phase progressieren Metaphasen-Präparation auf Objektträgern Um die Zellen in der Mitose zu arretieren und somit kondensierte Chromosomen zu erhalten, wurden die Zellen 2h vor Ablauf der Reparaturzeit (1h bei dem 2h-Reparaturpunkt, 4h bei dem 12h-Reparaturpunkt) mit 100ng/ml Colcemid behandelt. Anschließend wurden die Zellen mittels Trypsin-EDTA-Behandlung geerntet. Dabei wurde darauf geachtet, dass sämtliche Überstände gesammelt und vereint wurden, da sich mitotische Zellen abrunden und daher während der Waschschritte leichter vom Boden der Zellkultur-Flasche lösen. Die Zellsuspension wurde bei 300g und 4 C für 10min zentrifugiert. Es folgte eine hypotonische Behandlung, um die Zellen zum Aufquellen zu bringen. Dabei wurde das Zellpellet in 5ml

58 Material und Methoden 48 75mM KCl aufgenommen und für 20min bei 37 C inkubiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (200g, 4 C, 10min) wurden die Zellen durch langsame Zugabe von 10ml Fixativ unter permanentem Vortexen fixiert. Nach 10minütiger Inkubation bei RT und einem Zentrifugationsschritt (200g, 4 C, 10min) wurden die Zellen erneut in 10ml Fixativ gewaschen und für 1h oder über Nacht bei 4 C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension erneut zentrifugiert und zum dritten Mal in 10ml Fixativ aufgenommen. Nach 30minütiger Inkubation auf Eis und erneuter Zentrifugation (200g, 4 C, 10min) wurde der Überstand bis auf 0,5-1ml abgesaugt und die Zellsuspension in der Restflüssigkeit resuspendiert. Zur Herstellung der Chromosomenspreitungen wurden 30µl der Zellsuspension auf einen feuchten Objektträger aufgetropft und bei RT luftgetrocknet. Die Objektträger wurden vor einer weiteren Behandlung für mindestens einen Tag bei RT gelagert PCC (premature chromosome condensation) in G2 Um die Chromosomen in der G2-Phase zu kondensieren, wurde 30min vor Ablauf der Reparaturzeit Calyculin A in einer Konzentration von 50ng/ml zugegeben. Die Ernte der Zellen erfolgte durch Trypsin-EDTA-Behandlung, wobei auch hier alle Überstande gesammelt wurden. Die anschließende Metaphasen-Präparation erfolgte wie unter beschrieben Giemsa-Färbung Zur einheitlichen Färbung der Chromosomen mit Giemsa-Lösung wurden die Objektträger für 3min in einer 3%igen Giemsa-Lösung bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Präparate zweimal in H 2 O dest. gespült und entweder bei RT oder bei 50 C auf der Heizplatte luftgetrocknet. Die Lagerung der gefärbten Objektträger erfolgte bei RT Aufnahme und Auswertung der Giemsa-gefärbten Präparate Die Giemsa-gefärbten Objektträger wurden bei 100facher Vergrößerung mit Hilfe des Moduls MSearch der Software Metafer (MetaSystems, Altlußheim) nach Chromosomenspreitungen abgesucht. Die aufgefundenen Chromosomenspreitungen wurden anhand der gespeicherten Koordinaten relokalisiert, und mit der Software Isis (MetaSystems, Altlußheim) wurden bei 630facher Vergrößerung Bilder aufgenommen. Diese wurden anschließend manuell analysiert und die Chromatidbrüche quantifiziert.

59 Material und Methoden 49 Bei Experimenten mit Calyculin A wurden pro bestrahlter Probe Chromosomenspreitungen ausgewertet, bei unbestrahlten Kontrollen Da die Metaphasenanreicherung mittels Colcemid aufgrund des niedrigen mitotischen Index (MI) der primären Fibroblasten sowie des nach Bestrahlung einsetzenden G2/M-Checkpoints weniger effektiv ist als die Anreicherung von in der G2-Phase kondensierten Chromosomen, mussten bei diesen Experimenten 4-5 mal mehr Objektträger abgesucht werden. Dies führte zu einer Ausbeute von ca Metaphasen pro Probe und Experiment. Die angegeben Werte stellen die Mittelwerte aller Chromosomenspreitungen der verschiedenen Experimente dar, die Fehlerbalken geben den Standardfehler der Mittelwerte wieder. Um die Signifikanz der Ergebnisse zu überprüfen, wurde bei ausgewählten Experimenten ein ungepaarter t-test durchgeführt Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) Protein-Verdau und Vorbehandlung der Objektträger Die Hybridisierung wurde nach dem XCyte lab manual der Firma MetaSystems (Altlußheim) durchgeführt. Um unspezifische Hintergrundsignale zu minimieren, wurden die Objektträger vor der Hybridisierung einem Protein-Verdau unterzogen. Dafür wurden die Objektträger 3min bei 37 C in 100ng/ml Pepsin in 10mM HCl inkubiert und anschließend für 3min in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden mit 100µl Postfixierungs-Lösung überschichtet, mit einem 24x60mm 2 Deckglas abgedeckt und 10min bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger dreimal für 3min in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden in vorgewärmtes 2x SSC überführt und bei 70 C inkubiert. Nach 30min wurde die Glasküvette mit den Objektträgern aus dem Wasserbad genommen und bei RT auf ca. 37 C abgekühlt (ca. 20min). Im Anschluss wurden die Objektträger in 0,1x SSC für 1min bei RT inkubiert. Die anschließende DNA-Denaturierung erfolgte in 0,07M NaOH für 1min bei RT. Es folgten ein 1minütiger Inkubationsschritt in 0,1x SSC bei 4 C, sowie ein 1minütiger Inkubationsschritt in 2x SSC bei 4 C. Abschließend wurden die Objektträger in einer aufsteigenden Ethanol-Reihe dehydriert. Dazu wurden die Objektträger bei RT für je 1min in 30%, 50%, 70% und 100% Ethanol inkubiert und anschließend luftgetrocknet Denaturierung der Sonden und Hybridisierung Pro zu hybridisierendem Objektträger wurden 7µl des DNA-Sonden-Mixes für 5min bei 75 C denaturiert, kurz auf Eis abgekühlt und anschließend bei 37 C inkubiert. Nach 30min wurden

60 Material und Methoden 50 7µl auf einen Objektträger mit denaturierten Chromosomenpräparaten gegeben und mit einem 18x18mm 2 -Deckgläschen abgedeckt. Das Deckgläschen wurde mit Fixogum abgedichtet und die Chromosomen für 2 Tage bei 37 C in der Feuchtekammer hybridisiert Post-Hybridisierung bei 3-Farben-FISH Mit Abschluss der Hybridisierung wurden die Deckgläschen vom Objektträger gelöst und die Objektträger für 2min in vorgewärmtem 2x SSC bei 75 C inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger in 2x SSCT überführt und für 1min bei RT inkubiert. Abschließend wurden die Objektträger für 2min in PBS gewaschen, luftgetrocknet und mit 20µl Mounting Medium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) überschichtet und mit einem 24x60mm 2 -Deckgläschen abgedeckt. Die Lagerung der Objektträger erfolgte bei kürzerer Lagerungsdauer (wenige Tage) bei 4 C, bei längerer Lagerungsdauer bei -20 C im Dunkeln Aufnahme und Auswertung der Fluoreszenz-Bilder Die Objektträger mit den Metaphasenpräparaten wurden vor der Hybridisierung am Mikroskop mit dem Modul MSearch der Software Metafer (MetaSystems, Altlußheim) bei 100facher Vergrößerung im Durchlicht nach Metaphasen abgescannt und deren Koordinaten auf dem Objektträger gespeichert. Anhand der Anzahl der Chromosomenspreitungen sowie deren Qualität wurden daraufhin die Objektträger für die Hybridisierung ausgewählt. Nach der Hybridisierung wurden von den Metaphasen im Fluoreszenz-Modus Bilder mit einer 630fachen Vergrößerung aufgenommen. Dies geschah z. T. manuell mit der Software Isis, oder es wurde das Software-Modul Autocapt (MetaSystems, Altlußheim) verwendet. Dieses ist in der Lage, anhand der gespeicherten Koordinaten die Metaphasen zu relokalisieren und automatisch Bilder aufzunehmen. Die Bilder wurden anschließend in das Programm Isis (MetaSystems, Altlußheim) exportiert und dort manuell im Hinblick auf Chromosomenaberrationen ausgewertet. Die angegebenen Werte stellen die Mittelwerte der Chromosomenspreitungen aller Experimente dar, die Fehlerbalken repräsentieren die Standardfehler der Mittelwerte.

61 Material und Methoden Immunfluoreszenz-Studien Fixierung von Zellen für Immunfluoreszenz-Färbung Die Fixierung erfolgte in 100% Methanol bei -20 C für 30min. Anschließend wurden die Zellen für 1min bei -20 C in 100% Aceton permeabilisiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS mit 1% FCS wurden die Deckgläschen bis zur Antikörper-Färbung in PBS mit 1% FCS bei 4 C gelagert CENP-F/γH2AX-Doppelfärbung Die fixierten Deckgläschen wurden in einer Feuchtekammer auf Parafilm ausgelegt und mit 30µl primärer Antikörper-Lösung (rabbit-anti-cenp-f, 1:200; mouse-anti-γh2ax, 1:200; in PBS mit 1% FCS) überschichtet. Die Inkubation erfolgte 1h bei RT. Anschließend wurden die Deckgläschen dreimal für 10min in PBS mit 1% FCS gewaschen. Die Deckgläschen wurden mit 40µl sekundärer Antikörper-Lösung (goat-anti-rabbit AlexaFluor 594; goat-anti-mouse AlexaFluor 488; 1:500 in PBS mit 1% FCS) überschichtet und wiederum 1h bei RT im Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Deckgläschen viermal für 15min in PBS gewaschen. Die Gegenfärbung der Zellkerne erfolgte durch Inkubation mit 0,2µg/ml DAPI in PBS für 3-5min und anschließendem Waschen in PBS für ca. 10min. Abschließend wurden die Deckgläschen auf Objektträger mit 3µl Mounting Medium gelegt und mit Nagellack versiegelt. Die Lagerung der Präparate erfolgte bei 4 C im Dunkeln ΒrdU/γH2AX-Doppelfärbung Um wachsende Zellen mit 5-Bromo-2 deoxy-uridin (BrdU) zu markieren, wurde dem Medium 10nM BrdU zugegeben. Nach 1h wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit frischem Medium versetzt. Nach Bestrahlung und Ablauf der Reparaturzeit wurden die Zellen wie unter beschrieben fixiert und bis zur Färbung bei 4 C gelagert. Die fixierten Deckgläschen wurden auf Parafilm in einer Feuchtekammer ausgelegt, mit 30µl primärem γh2ax-antikörper (rabbit-anti-γh2ax, 1:200 in PBS mit 1% FCS) überschichtet und für 1h bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläschen zweimal für 10min in PBS mit 1% FCS und einmal für 10min in PBS gewaschen. Um die Bindung des Antikörpers zu verstärken, wurden die Deckgläschen für 20min in PBS mit 2,5% Formaldehyd inkubiert und danach erneut dreimal 10min in PBS mit 1% FCS gewaschen. Die Inkubation mit dem primären BrdU-Antikörper (mouse-anti-brdu, 1:200 in Inkubationspuffer) erfolgte für 1h bei

62 Material und Methoden C. Anschließend wurden die Deckgläschen dreimal für 10min in PBS mit 1% FCS gewaschen. Für die Inkubation mit den sekundären Antikörpern wurden die Deckgläschen erneut auf Parafilm in der Feuchtekammer ausgelegt und mit 40µl der Antikörper-Lösung (goat-anti-rabbit AlexaFluor 488, goat-anti-mouse AlexaFluor 594; jeweils 1:500 in PBS mit 1% FCS) überschichtet und für 1h bei RT inkubiert. Die Deckgläschen wurden viermal für 15min in PBS gewaschen. Die Zellkerne wurden anschließend mit 0,2µg/ml DAPI in PBS gegengefärbt. Die Deckgläschen wurden abschließend für 10min in PBS gewaschen, auf einen Objektträger mit 3µl Mounting Medium aufgebracht und mit Nagellack versiegelt. Die Lagerung der Präparate erfolgte bis zur Auswertung bei 4 C im Dunkeln Auswertung der γh2ax-foci Zur Bestimmung des Reparaturvermögens wurde die Abnahme in der Anzahl der γh2ax- Foci herangezogen, welche ein Maß für die Anzahl der Doppelstrangbrüche sind. Bei niedrigen Foci-Zahlen pro Zelle (< 40 Foci pro Zelle) erfolgte die Auswertung bei 630facher Vergrößerung direkt am Mikroskop. Lagen höhere Foci-Zahlen pro Zelle vor (> 40 Foci pro Zelle) wurden mittels der Software Isis (MetaSystems, Altlußheim) bei 630facher Vergrößerung Bilder aufgenommen, und das Auszählen erfolgte am Bildschirm. Dabei mussten bei jedem Präparat zwei Bedingungen erfüllt werden: zum einen mussten mindestens 40 Zellen gezählt werden und zum anderen mindestens 40 Foci. Die angegebenen Werte stellen dabei die Mittelwerte aller Experimente dar, die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) Zellkultivierung, Markierung mit Methyl- 3 H-Thymidin Für die Reparaturstudien mittels PFGE in exponentiell wachsenden Zellen wurden die Zellen zwei Tage vor dem Experiment in einer Dichte von Zellen/cm 2 in 75cm 2 -Flaschen ausgesät. Um spezifisch die Reparatur in G2-Phase-Zellen zu untersuchen, wurden die Zellen durch Zugabe von Methyl- 3 H-Thymidin zum Medium radioaktiv markiert. Dazu wurde Methyl- 3 H-Thymidin mit einer spezifischen Aktivität von 2,81TBq/mmol in einer radioaktiven Konzentration von 37kBq/ml eingesetzt. Nach 1h Inkubationszeit wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, und frisches Medium wurde zugegeben.

63 Material und Methoden Isolierung genomischer DNA für Pulsfeld-Gelelektrophorese Direkt nach Bestrahlung bzw. nach Ablauf der Reparaturzeit wurden die Zellen zweimal mit je 10ml eiskaltem PBS gewaschen und durch Zugabe von 2ml eiskalter Trypsin-EDTA- Lösung bei 4 C für 30-60min vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Die Zellsuspension wurde in 5ml eiskaltem Medium aufgenommen und für 8min bei 300g und 4 C zentrifugiert. Anschließend wurde das Zellpellet in 5ml eiskaltem PBS gewaschen und erneut zentrifugiert (300g, 8min, 4 C). Nach Abgießen des Überstandes wurden die Zellen in 50µl PBS aufgenommen, mit 50µl 1,4%iger Low-Melting-Point-Agarose vermischt und in vorgekühlte Blockformer gegossen. Die Blöckchen wurden bis zum Erstarren bei 4 C gelagert und anschließend für mindestens 30min bei 4 C in Lyse-Puffer äquilibriert. Um die Zellen zu lysieren, wurden die Blöckchen über Nacht bei 50 C inkubiert. Nach der Lyse wurden die Blöckchen in 0,5M EDTA bei 4 C gelagert Pulsfeld-Gelelektrophorese Vor der Gelelektrophorese wurden die Blöckchen zweimal 30min in TE-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Blöckchen in die Taschen eines 0,8%igen Agarose-Gels in 0,5x TBE eingesetzt und die Taschen mit 0,8%iger Low-Melting-Point-Agarose verschlossen. Nach einer 30minütigen Äquilibrierung im 0,5x TBE-Laufpuffer wurde die DNA für 92h bei einem Feldwinkel von 120, einer elektrischen Feldstärke von 1,5V/cm und Pulszeiten von s bei 14 C aufgetrennt. Die Laufbedingungen wurden dabei so gewählt, dass DNA- Fragmente bis zu einer Größe von 8Mbp aufgetrennt werden konnten. Als Längenstandard wurden die Chromosomen von Saccharomyces cerevisiae verwendet Gelfärbung und dokumentation Nach Ende der Gelelektrophorese wurden die Gele über Nacht in 1µg/ml Ehtidiumbromid in 0,5x TBE im Dunkeln gefärbt und anschließend für wenige Stunden in 0,5x TBE entfärbt. Die Aufnahme der Gelbilder erfolgte unter UV-Transillumination bei 302nm mit einem digitalen Kamerasystem und der Software Isis (MetaSystems, Altlußheim).

64 Material und Methoden Eluierung der genomischen DNA aus den Agarose-Blöckchen, Szintillationsmessung und Auswertung Da Tritium als β-strahler nur eine sehr geringe Reichweite hat, musste die markierte DNA zur Messung der Radioaktivität aus der Agarose eluiert werden. Dazu wurden die Geltaschen, die Kompressionszone sowie das Gel bis etwa 4cm unterhalb der Kompressionszone in gleich große Blöckchen geschnitten. Die Gelblöckchen wurden in 1ml Hypochlorit für 45min bei 50 C aufgelöst. Anschließend wurde die DNA-Suspension mit 10ml Szintillationsflüssigkeit gemischt. Um zu verhindern, dass chemische Reaktionen die Messung beeinflussen, wurden die Proben erst nach 24h im Szintillationszähler vermessen. Um den FAR-Wert für die radioaktiv markierte DNA zu erhalten, wurde pro Spur die Gesamtaktivität errechnet. Anschließend wurde die Aktivität der aus der Tasche herausgelaufenen DNA durch die Gesamtaktivität dividiert. Der erhaltene Wert entsprach dabei dem Anteil der radioaktiv markierten DNA, die nach Bestrahlung und Reparaturzeit ins Gel gelaufen war Durchflusszytometrische Untersuchungen BrdU-Markierung und Fixierung für Durchflusszytometrie Exponentiell wachsende Zellen wurden für 1h mit 10µM BrdU markiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und neues, BrdU-freies Medium zugegeben. Nach Bestrahlung und Ablauf der Reparaturzeit wurden die Zellen mittels Trypsin-EDTA- Behandlung geerntet und die Zellsuspension in ein Rundboden-Röhrchen überführt. Nach einer Zentrifugation bei 400g und 4 C für 10min wurden die Zellen in 2ml PBS gewaschen und erneut zentrifugiert (400g, 4 C, 10min). Die Zellen wurden durch langsames Zugeben von 2ml 70% Ethanol (-20 C) unter permanentem Vortexen fixiert. Die Lagerung der FACS- Proben bis zur Färbung und Messung erfolgte bei -20 C BrdU-Färbung für Durchflusszytometrie Die in 70% Ethanol bei -20 C gelagerten Proben wurden bei 400g und 4 C für 10min zentrifugiert. Anschließend wurde das Zellpellet in 2ml PBS gewaschen und die Suspension erneut zentrifugiert (400g, 4 C, 10min). Um die Bindung des anti-brdu-antikörpers an das in die DNA eingebaute BrdU zu gewährleisten, muss die DNA denaturiert werden. Um dies zu erreichen, wurden die Zellen in 1ml 2M HCl in PBS resuspendiert und für 20min bei RT

65 Material und Methoden 55 inkubiert. Anschließend wurde 1ml PBS mit 1% FCS zugegeben und die Proben erneut zentrifugiert (400g, 4 C, 10min). Zur partiellen Renaturierung der DNA wurden die Zellen in 500µl 0,1M Natrium-Tetraborat, ph8,5 aufgenommen und für 2min bei RT inkubiert. Es wurde erneut 1ml PBS mit 1% FCS zugegeben und zentrifugiert (400g, 4 C, 10min). Das Zellpellet wurde in 20µl FITC-konjugiertem anti-brdu-antikörper-lösung aufgenommen und 30min im Dunkeln bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 1ml PBS mit 1% FCS wurden die Zellen pelletiert (400g, 4 C, 10min) und in 500µl Propidiumiodid-Lösung resuspendiert. Nach 30min Inkubation im Dunkeln bei RT konnten die Proben im Durchflusszytometer vermessen werden. Dabei wurden sowohl der DNA-Gehalt als auch die Intensität des BrdU- Signals aufgenommen und quantitativ ausgewertet phosphoh3-färbung für Durchflusszytometrie Die in 70% Ethanol bei -20 C gelagerten Proben wurden bei 400g und 4 C für 10min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde zweimal in 2ml PBS gewaschen und zentrifugiert (400g, 4 C, 10min). Zur Permeabilisierung wurden die Zellen in 1ml kaltem PBS mit 0,25% Triton X-100 resuspendiert und für 15min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation (400g, 4 C, 10min) wurden die Zellen in 2ml PBS mit 1% BSA aufgenommen und zum Blockieren für mindestens 5h bei 4 C inkubiert. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert (400g, 4 C, 10min) und in 100µl primärer Antikörper-Lösung (7,5µl/ml anti-phosphoh3-antikörper in PBS mit 1% BSA) über Nacht bei 4 C inkubiert. Den Proben wurde 2ml PBS mit 1% BSA beigefügt und 10min bei RT inkubiert. Nach Zentrifugation bei 400g (4 C, 10min) wurden die Zellen in 100µl sekundärer Antikörper-Lösung (anti-rabbit AlexaFluor 488, 1:500 in PBS mit 1% BSA) für 1h bei RT im Dunkeln inkubiert. Die Proben wurden mit 2ml PBS mit 1% BSA versetzt und nach 10min erneut zentrifugiert (400g, 4 C, 10min). Abschließend wurden die Zellen in 500µl Propidiumiodid-Lösung aufgenommen und nach 30minütiger Inkubation bei RT im Dunkeln im Durchflusszytometer vermessen, wobei sowohl der DNA-Gehalt als auch die Intensität des phosphoh3-signals aufgenommen und quantitativ ausgewertet wurden Messung am Durchflusszytometer Die Messung und Auswertung der Proben erfolgte mittels der Software CellQuest (Becton Dickinson). Dabei wurden bei den Analysen der BrdU-Experimente jeweils Zellen gezählt, bei den phosphoh3-analysen Zellen. Das Durchflusszytometer verfügt über

66 Material und Methoden 56 einen Argon-Laser mit einer Anregungswellenlänge von 488nm. Das Propidiumiodid-Signal wurde im Fluoreszenzkanal 2 (FL2) im Bereich von nm aufgenommen. Das phosphoh3- bzw. das BrdU-Signal wurde im FL1-Kanal zwischen nm erfasst.

67 Ergebnisse Ergebnisse 4.1. Dosis-Effekt-Kurve nach niedrigen Dosen ionisierender Strahlung Im ersten Teil der Arbeit sollten Dosis-Effekt-Kurven für Chromosomenaberrationen im Niedrig-Dosis-Bereich unterhalb von 1Gy Röntgenstrahlung anhand der Vielfarben- Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) bestimmt werden. Da durch die Bestrahlung mit niedrigen Dosen IR nur sehr wenige Aberrationen induziert werden, war es notwendig, eine hohe Anzahl an Chromosomenspreitungen zu untersuchen. Hierfür benötigt man ein Zellsystem, welches eine hohe Wachstumsrate und dennoch eine niedrige Spontanrate an Aberrationen aufweist. In dieser Arbeit wurde daher die Wildtyp-Zelllinie 82-6hTert verwendet, welche aufgrund ihrer Immortalisierung eine erhöhte Proliferationsrate und Lebensdauer aufweist, sich ansonsten aber nicht von einer primären humanen Fibroblasten- Zelllinie unterscheidet. Des Weiteren wurde zur Erhöhung der Effektivität, und somit des Durchsatzes, angestrebt, das Absuchen der Objektträger nach Chromosomenspreitungen sowie die anschließende Aufnahme der Bilder weitestgehend zu automatisieren. Dies erfolgte in Zusammenarbeit mit der Firma MetaSystems GmbH (Altlußheim). Die Durchführung der Experimente dieses Arbeitsteils erfolgte in ähnlicher Weise, wie sie seit Jahrzehnten zur Bestimmung von Dosis-Effekt-Kurven zur Anwendung kommt. Dabei wurden stationäre Zellen bestrahlt und nach einer Reparaturzeit von 24h durch Passagieren zum Wachsen angeregt. Anstatt die Zellen jedoch mittels Colcemid in der ersten Mitose nach Bestrahlung zu arretieren, wurde hier die Chromosomenkondensation chemisch bereits in der ersten G2-Phase nach der Bestrahlung induziert Untersuchung des Zellzyklusverhaltens mittels Durchflusszytometrie (FACS) nach ionisierender Bestrahlung Da die Ausbeute an Metaphasen möglichst hoch sein sollte, wurde zunächst mittels zweidimensionaler Durchflusszytometrie (FACS) der optimale Zeitpunkt der Zellernte bestimmt. Dazu wurden die Zellen in konfluentem Zustand mit 0,25Gy, 0,5Gy und 1Gy bestrahlt. Des Weiteren wurde eine unbestrahlte Kontrolle mitgeführt. Nach 24h Reparaturzeit wurden die Zellen passagiert, und das Medium wurde mit dem Thymidinanalogon 5-Bromo- 2 deoxy-uridin (BrdU) versetzt, welches von proliferierenden Zellen während der Replikation anstelle von Thymidin in die DNA eingebaut wird. Nach dem Passagieren

68 Ergebnisse 58 wurden in regelmäßigen Zeitintervallen von jeder Dosis sowie von der unbestrahlten Kontrolle jeweils eine Probe geerntet und für die Durchflusszytometrie fixiert. Nach der Färbung mit einem BrdU-Antikörper und dem interkalierenden Farbstoff Propidiumiodid (PI) zur Unterscheidung der Zellzyklusphasen wurden die Proben im FACS vermessen. Abb. 4.1 zeigt exemplarisch DotPlots für ein Experiment. Bei der Messung wird jeder einzelnen Zelle anhand ihrer PI-Intensität sowie ihrer BrdU-Intensität eine Position innerhalb des DotPlots zugeordnet, so dass jeder einzelne Punkt einer Zelle entspricht. Dargestellt ist auf der Abszisse der DNA-Gehalt der Zellen, welcher anhand der Intensität des PI-Signals quantifiziert werden kann. Auf der Ordinate ist in logarithmischer Form der BrdU-Gehalt der Zellen quantifiziert. Die Population der BrdU-positiven Zellen erscheint dabei höher als die Zellen, welche kein BrdU eingebaut haben. Auf diese Weise lassen sich die Zellen, welche nach dem Passagieren durch die S-Phase gelangt sind, von den weiterhin stationären Zellen unterscheiden. Diese Methode erlaubt es, den zeitlichen Verlauf der Zellzyklusprogression einer Population von Zellen zu verfolgen. In diesem Fall ist zu erkennen, dass bereits nach 16h Zellen BrdU einbauen und in die S-Phase progressieren. Zu späteren Zeiten erscheinen Abb. 4.1 : DotPlots BrdU-markierter 82-6hTert WT-Zellen 16h, 28h, 36h und 48h nach dem Passagieren. Die Zellen wurden in konfluentem Zustand mit 1Gy bestrahlt bzw. unbestrahlt belassen. Nach 24stündiger Reparaturzeit wurden die Zellen passagiert und in BrdU-haltigem Medium inkubiert. In regelmäßigen Zeitintervallen wurden Proben für die Durchflusszytometrie fixiert und im FACS vermessen. Auf der Abszisse ist dimensionslos linear der DNA-Gehalt anhand des PI-Signals abgebildet. Auf der Ordinate wurde in logarithmischer Darstellung dimensionslos die BrdU-Intensität dargestellt. Jeder Punkt entspricht dabei einer Zelle. G1-Zellen befinden sich bei einem DNA-Gehalt von 2n, G2-Zellen bei einem DNA-Gehalt von 4n. Die Zahlen oberhalb der Rechtecke geben den Anteil der BrdU-positiven Zellen als Prozent aller Zellen wider. Die Zahlen neben den Rechtecken entsprechen dem Anteil der BrdU-positiven G2-Zellen.

69 Ergebnisse 59 diese Zellen bei einem DNA-Gehalt von 4n, d.h. sie befinden sich in der G2/M-Phase. Nachdem sich die Zellen geteilt haben, nimmt die Population der BrdU-positiven G1-Zellen (2n) zu, während die Population der BrdU-positiven G2-Zellen geringer wird. Um eine Aussage darüber zu treffen, wann sich die meisten Zellen in der ersten G2-Phase nach dem Bestrahlen und Passagieren befanden, wurde der Anteil der BrdU-positiven G2-Phase-Zellen quantifiziert (Abb. 4.2A). Nach 28h befinden sich unabhängig von der Strahlendosis die meisten Zellen in der ersten G2-Phase nach dem Passagieren. Dennoch ist eine leichte Verzögerung in der Zellzyklusprogression von ungefähr 2h bei den mit 0,5Gy und 1Gy bestrahlten Proben gegenüber derer mit niedriger Dosis oder unbestrahlt verbliebenen Zellen zu erkennen, was sich in einem geringeren Abfall der BrdU-positiven Zellen nach 32h äußert. Das Minimum 40h nach Bestrahlung zeigt, dass sich zu diesem Zeitpunkt nahezu alle BrdUpositiven Zellen geteilt haben und wieder in der G1-Phase befinden. Abb. 4.2: Zellzyklusprogression BrdU-markierter Zellen nach Bestrahlung. Stationäre WT-Zellen (82-6hTert) wurden mit 0,25Gy, 0,5Gy oder 1Gy bestrahlt bzw. unbestrahlt belassen. Nach 24h Reparaturzeit wurden die Zellen passagiert und in BrdU-haltigem Medium inkubiert. Nach 0h, 16h, 24h, 28h, 32h, 36h, 40h, 44h und 48h wurden die Zellen fixiert und im FACS vermessen. (A) Verlauf der BrdU-positiven G2-Zellen in Abhängigkeit von der Zeit nach dem Passagieren. Aufgetragen ist der Anteil der BrdU-positiven G2-Zellen als Prozent aller Zellen. (B) Akkumulation aller BrdU-positiven Zellen in Abhängigkeit von der Zeit nach dem Passagieren. Aufgetragen ist der Anteil aller BrdU-positiven Zellen als Prozent aller gemessenen Zellen. Bei den unbestrahlten Kontrollen sowie den mit 0,25Gy bestrahlten Proben steigt die Kurve nach 40h wieder an. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Zellen, welche sich bereits geteilt hatten, erneut in die G2-Phase eintreten. Bei den mit 0,5Gy und 1Gy bestrahlten Proben ist dies nicht der Fall und deutet erneut auf eine Verlangsamung der Proliferation in Abhängigkeit von der applizierten Dosis hin.

70 Ergebnisse 60 Die grafische Darstellung des Anteils an BrdU-positiven G2-Zellen lässt vermuten, dass in unbestrahlten Proben mehr Zellen proliferieren als in den bestrahlten. Trägt man die Gesamtzahl an BrdU-positiven Zellen als Anteil aller Zellen auf, so ist deutlich zu erkennen, dass der Anteil der Zellen, welcher nach der Bestrahlung und dem Passagieren wieder in eine Wachstumsphase übergeht, abhängig von der applizierten Dosis ist (Abb. 4.2B). Während in der unbestrahlten Kontrolle etwa 90% der Zellen innerhalb des beobachteten Zeitraums proliferieren, sind dies in den mit 1Gy bestrahlten Proben nur noch etwa 70%. Im Gegensatz zur Auftragung der BrdU-positiven G2-Zellen steigt die Kurve der Gesamtzahl an BrdUpositiven Zellen auch nach dem 28h-Punkt weiter an, da zum einen Zellen, die sich geteilt haben, weiterhin als BrdU-positive Zellen in die Auswertung mit einfließen, zum anderen weiterhin Zellen in die S- und die G2-Phase progressieren. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Zellen in den nachfolgenden Metaphasen- Experimenten zu verschiedenen Zeitpunkten im Bereich von 28-44h nach Passagieren fixiert. Da sich in Abhängigkeit vom Alter der Zellen bezüglich des Maximums an G2-Zellen Schwankungen von bis zu 8h zeigten, wurden in allen Experimenten parallel FACS-Proben mitgeführt. Für die Präparation der Objektträger wurden jeweils die Proben herangezogen, welche die meisten Zellen in der G2-Phase besaßen und somit die höchste Ausbeute an Chromosomenspreitungen in Aussicht stellten Bestimmung der Dosis-Effekt-Kurve in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Zu den anhand der FACS-Experimente als optimal ermittelten Zeitpunkten wurden die chromosomalen Studien durchgeführt. Dabei wurden konfluente Zellen mit 0,25Gy, 0,5Gy und 1Gy bestrahlt oder unbestrahlt belassen und nach 24h Reparaturzeit passagiert. Zur vorzeitigen Kondensation der Chromosomen in der G2-Phase wurde der Phosphatase- Inhibitor Calyculin A zugegeben. Die Zellen wurden 30min nach Zugabe von Calyculin A geerntet, fixiert und auf Objektträger aufgetropft. Die Objektträger wurden am Mikroskop nach Chromosomenspreitungen abgesucht und die Koordinaten der Spreitungen gespeichert. Im Anschluss wurden die Objektträger mit Sonden für die Chromosomen 1, 2 und 4 hybridisiert, wodurch ca. 22% des gesamten Genoms abgedeckt waren. Weiterhin erfolgte eine unspezifische Gegenfärbung aller Chromosomen mittels DAPI. Anhand der gespeicherten Koordinaten wurden die Spreitungen relokalisiert, und Bilder wurden

71 Ergebnisse 61 Abb. 4.3: Fluroreszenzmikroskopische Aufnahmen hybridisierter Chromosomenspreitungen bei 630facher Vergrößerung in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung. Es wurden Sonden gegen das Chromosom 1 (gelb), das Chromosom 2 (grün) und das Chromosom 4 (rot) verwendet. Alle Chromsomen wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. (A) Chromosomensatz einer unbestrahlten Kontrolle. Es liegen keine Aberrationen vor. (B) Chromsomensatz einer mit 0,5Gy bestrahlten Probe. Es liegt eine inkomplette Translokation zwischen einem Chromosom 4 und einem nicht spezifizierten Chromosom vor. (C) Chromosmensatz einer mit 0,5Gy bestrahlten Probe. Das Chromosom 2 ist gebrochen. (D) Chromosomensatz einer mit 1Gy bestrahlten Probe. Es liegt eine komplette Translokation zwischen dem Chromosom 1 und dem Chromosom 4 vor. aufgenommen (Abb. 4.3). Die Aufnahme der Bilder erfolgte anfangs noch manuell. Da es jedoch für die Auswertung wichtig war, eine möglichst hohe Anzahl an Chromosomenspreitungen zu analysieren, wurde im Laufe dieser Arbeit von der Firma MetaSystems die Bildaufnahme durch die Entwicklung des Software-Moduls AutoCapt automatisiert, was zu einer erheblichen Erhöhung der Effizienz bei der Bildaufnahme führte. Bei der anschließenden manuellen Auswertung der Chromosomenspreitungen wurden verschiedene Arten von Chromosomenaberrationen unterschieden. Ausgewertet wurden hierbei immer nur die gefärbten Chromosomen 1, 2 und 4: 1. unreparierte Brüche; diese unreparierten Chromosomenbrüche manifestieren sich in zusätzlichen Chromosomenfragmenten. 2. inkomplette Translokationen; diese treten auf, wenn ein Teil eines gebrochenen Chromosoms an ein anderes Chromosom angehängt wird. Dabei handelt es sich um ein Fehlreparatur-Ereignis.

72 Ergebnisse komplette Translokationen; diese treten auf, wenn beide Teile eines gebrochenen Chromosoms mit jeweils einem anderen Chromosomenteil verknüpft werden. Ein reziproker Austausch zwischen zwei Chromosomen kann dabei nur detektiert werden, wenn beide Chromosomen mit einer Sonde hybridisiert wurden. Hierbei handelt es sich ebenfalls um ein Fehlreparatur-Ereignis. Fand ein reziproker Austausch zwischen zwei gefärbten Chromosomen statt, so wurde dieser als zwei komplette Translokationen gewertet (einmal für jedes gefärbte Chromosom) (Abb. 4.3D). Fehlreparaturereignisse wie Ringchromosomen oder komplexe Aberrationen, bei denen mehr als zwei Chromsomen in der Austauschreaktion involviert waren, traten aufgrund der niedrigen Dosen nur sehr selten auf. Da deren Anzahl nicht für eine aussagekräftige Auswertung ausreichte, wurden diese nicht berücksichtigt. In Tabelle 4.1 sind die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Insgesamt wurden dabei 6193 Spreitungen auf Aberrationen untersucht: Anzahl der ausgewerteten Chromosomenspreitungen Kontrolle 0,25Gy 0,5Gy 1Gy Aberrationen gesamt unreparierte Brüche Translokationen gesamt davon: inkomplette Translokationen komplette Translokationen Tab. 4.1: Anzahl der ausgewerteten Chromosomenspreitungen und der Aberrationen in der ersten G2-Phase nach der Bestrahlung und 24h Reparaturzeit. Aus den erhaltenen Daten wurde eine Dosis-Effekt-Kurve erstellt, indem die Anzahl der Aberrationen gegen die Dosis aufgetragen wurde (Abb. 4.4A). Bei den unbestrahlten Proben kommt die Höhe der Aberrationsrate dabei zum größten Teil durch unreparierte Brüche zustande, während Translokationen hier nur sehr seltene Ereignisse darstellen. Nach Bestrahlung steigen sowohl die unreparierten Brüche als auch die Translokationen mit der Dosis an. Die Dosis-Effekt-Kurven der Gesamtaberrationen zeigen im Wesentlichen ein lineares Verhalten, wobei der 0,25Gy-Punkt besonders bei den unreparierten Brüchen höher liegt, als eine lineare Extrapolation erwarten ließe. Eine Bestrahlung mit 0,25Gy führt zu einer Verdopplung der unreparierten Brüche. Eine weitere Erhöhung der Dosis auf 0,5Gy bzw. 1Gy

73 Ergebnisse 63 Abb. 4.4: Durch PCC erhaltene Dosis-Effekt-Kurven von Chromosomenaberrationen nach verschiedenen Dosen Röntgenbestrahlung in der ersten G2-Phase nach der Bestrahlung und 24h Reparaturzeit. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung aller Chromosomenspreitungen aus drei unabhängigen Experimenten dar. (A) Anzahl der unreparierten Chromosomenbrüche, die Gesamtanzahl der Translokationen sowie die daraus resultierende Anzahl an Gesamtaberrationen pro 100 Chromosomenspreitungen. (B) Die Anzahl der Translokationen unterteilt in komplette und inkomplette Translokationen. führt dagegen zu keiner weiteren Verdopplung der Brüche. Dieses Verhalten war in zwei der drei Experimente signifikant und deutet auf eine mögliche Selektion zu Zellen mit wenigen Brüchen bei höheren Dosen durch den G1/S-Checkpoint hin. Die Translokationen zeigen dagegen einen nahezu linearen Anstieg mit der Dosis. Unterteilt man die Translokationen in komplette und inkomplette (Abb. 4.4B), so lässt sich ebenfalls eine Linearität der Dosis- Effekt-Kurven erkennen. Dabei treten komplette und inkomplette Translokationen zu annähernd gleichen Teilen auf. Hierbei ist es jedoch möglich, dass bei manchen der als inkomplett gewerteten Translokationen ein transloziertes Chromosomenfragment so klein war, dass die Auflösung des Mikroskops nicht zu dessen Visualisierung ausreichte. Es ist somit nicht auszuschließen, dass einige der kompletten Translokationen fälschlicherweise als inkomplett gewertet wurden. Es konnte somit gezeigt werden, dass sowohl unreparierte Chromosomenbrüche als auch Translokationen nahezu linear mit der Dosis ansteigen. Unreparierte Brüche treten dabei häufiger auf als fehlreparierte Brüche.

74 Ergebnisse Bestimmung der Dosis-Effekt-Kurve nach zweiwöchiger Wachstumsphase nach Bestrahlung (Lang-Zeit-Experimente) In den vorhergehenden Experimenten wurden die Chromosomen noch vor der ersten Zellteilung nach der Bestrahlung untersucht und zeigen somit die unmittelbare Auswirkung verschiedener Dosen IR auf das Genom. Man erhält somit eine Art Induktionswert. Es ist allerdings davon auszugehen, dass viele dieser Aberrationen für die Zelle letal sind. Für biologische Prozesse wie die Krebsentstehung und die damit einhergehende Risikoabschätzung ist es jedoch wichtig, den Anteil an Aberrationen zu untersuchen, welcher für die Zelle nicht letal ist und über viele Generationen hinweg vererbt werden kann. Daher wurden in einem weiteren Experiment die Zellen nach der Bestrahlung im konfluenten Zustand nicht direkt in der ersten G2-Phase geerntet, sondern weiter in Kultur und durch regelmäßiges Passagieren am Wachsen gehalten. Nach zwei Wochen wurde durch Zugabe von Calyculin A die Chromosomenkondensation induziert, die Zellen geerntet und fixiert. Das weitere Vorgehen erfolgte analog zu den in Kapitel beschriebenen Experimenten. Tabelle 4.2 fasst die Ergebnisse von 7794 ausgewerteten Chromosomenspreitungen zusammen: Anzahl der ausgewerteten Chromosomenspreitungen Kontrolle 0,25Gy 0,5Gy 1Gy Aberrationen gesamt unreparierte Brüche Translokationen gesamt davon: inkomplette Translokationen komplette Translokationen Tab. 4.2: Anzahl der ausgewerteten Chromosomenspreitungen und der Aberrationen 14 Tage nach der Bestrahlung. Die Dosis-Effekt-Kurve zeigt für die Gesamt-Anzahl an Aberrationen auch 14 Tage nach der Bestrahlung und regelmäßiger Subkultivierung ein lineares Ansteigen (Abb. 4.5A). Hierbei liegt jedoch die Aberrationsrate insgesamt deutlich niedriger als in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung. Der Anstieg der Aberrationen in Abhängigkeit von der applizierten Dosis ist hier in erster Linie auf einen Anstieg der Translokationen zurückzuführen. Die Rate der unreparierten Brüche bleibt bei allen Dosis-Punkten nahezu konstant auf dem Niveau der unbestrahlten Kontrolle. Dies ist nicht weiter überraschend, da unreparierte Brüche in

75 Ergebnisse 65 proliferierenden Zellen als letale Ereignisse angesehen werden. Betrachtet man die Translokationen getrennt nach kompletten und inkompletten Translokationen (Abb. 4.5B), so überwiegen bei der Kontrolle und dem 0,25Gy-Punkt die kompletten Translokationen, während bei den höheren Dosis-Punkten die inkompletten Austauschreaktionen häufiger auftreten. Jedoch ist es auch hierbei möglich, dass manche Chromosomenfragmente aufgrund ihrer geringen Größe nicht visualisiert werden konnten, und somit komplette Translokationen als inkomplett gewertet wurden. Eine zweiwöchige Kultivierung führt somit bei allen Dosen zu einer Verminderung der Gesamtaberrationsrate. Da in den bestrahlten Proben nahezu keine Erhöhung der unreparierten Brüche gegenüber der unbestrahlten Probe gemessen werden kann, setzen sich die Strahlen-induzierten Aberrationen in erster Linie aus Fehlreparaturereignissen zusammen. Abb. 4.5: Dosis-Effekt Kurven von Chromosomenaberrationen nach verschiedenen Dosen Röntgenbestrahlung und zweiwöchiger Subkultivierung. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung aller Chromosomenspreitungen eines Experiments dar. (A) Aufgetragen sind unreparierte Chromosomenbrüche, die Gesamtanzahl der Translokationen sowie die daraus resultierende Anzahl an Gesamtaberrationen pro 100 Chromosomenspreitungen. (B) Die Anzahl der Translokationen wurde unterteilt in komplette und inkomplette Translokationen.

76 Ergebnisse Untersuchungen zur Entstehung von Chromosomenaberrationen nach ionisierender Strahlung In den bisherigen Experimenten wurde das Auftreten von Chromosomenaberrationen in Abhängigkeit von der Dosis untersucht und die erhaltenen Dosis-Effekt-Kurven im Niedrig- Dosis-Bereich betrachtet. Die dabei untersuchten Zellen wurden im konfluenten Zustand, also in der G0/G1-Phase des Zellzyklus bestrahlt. Die Analyse der Chromosomen erfolgte dagegen in der G2-Phase. Dass in dieser Phase Chromosomenaberrationen gemessen werden können, deutet darauf hin, dass Zellen mit Aberrationen und mit Doppelstrangbrüchen den Zellzyklus durchlaufen. Das Auftreten von Chromosomenaberrationen in der G2-Phase wirft somit die Frage nach deren Entstehung auf. Bei der Erhaltung der genomischen Integrität spielen zwei Mechanismen eine bedeutende Rolle. Reparaturmechanismen dienen dem Wiederherstellen der chromosomalen Kontinuität, während die Zellzykluskontrolle durch Einsetzen von Checkpoints den Reparaturmechanismen Zeit für die Beseitigung der Schäden zur Verfügung stellt. Im folgenden Teil dieser Arbeit sollte das Zusammenspiel von DSB-Reparatur und Checkpoints nach Bestrahlung untersucht werden. Es ist bekannt, dass AT-Zellen chromosomal instabil sind. Vorherige Arbeiten zeigten, dass AT-Zellen sowohl einen Defekt in der Zellzykluskontrolle als auch in der Reparatur einer Unterklasse von DSBs aufweisen. ATM ist dabei zusammen mit der Nuklease Artemis an einem Unterweg des NHEJ beteiligt, welcher für die Reparatur komplexer Brüche essentiell ist (Riballo et al., 2004). Im Folgenden sollte untersucht werden, welchen Beitrag an der chromosomalen Instabilität von AT-Zellen deren Reparaturdefekt und welchen Beitrag deren Checkpointdefekt leistet. Um die Rolle des Reparaturdefekts bewerten zu können, wurde ein Zellsystem benötigt, welches denselben Reparaturdefekt wie AT-Zellen aufweist, aber Checkpoint-profizient ist. Dagegen wurde für die Untersuchung der Checkpointfunktion von ATM ein Zellsystem benötigt, welches zwar denselben Checkpointdefekt wie AT-Zellen aufweist, aber Reparatur-profizient ist. Um diese Zellsysteme zu etablieren, wurden im Laufe dieser Arbeit Reparatur- und Zellzyklusstudien an AT- und Artemis-Zellen sowie an WT- Zellen in An- und Abwesenheit eines Checkpoint-Inhibitors durchgeführt.

77 Ergebnisse Auswirkungen einer Bestrahlung in der S-Phase auf Zellzyklusprogression und DSB-Reparatur Die Studien im Niedrig-Dosis-Bereich deuten darauf hin, dass Zellen mit Brüchen die S- Phase durchlaufen. Daher sollte die Auswirkung einer Bestrahlung in verschiedenen Zellzyklusphasen auf die DSB-Reparatur und die Zellzykluskontrolle untersucht werden. Dabei wurde zunächst die Zellzyklusprogression von AT- und Artemis-Zellen im Vergleich zu WT- Zellen nach Bestrahlung mit verschiedenen Dosen in der S-Phase untersucht. Dazu wurden exponentiell wachsende Zellen für 1h mit BrdU markiert und direkt nach der Markierung mit 1,3Gy oder 6Gy Röntgenstrahlung bestrahlt. Zu verschiedenen Zeiten nach Bestrahlung wurden die Zellen fixiert, gefärbt und im FACS vermessen. Um einen Vergleich zu der Zellzyklusprogression unbestrahlter Zellen zu haben, wurden identische Proben ohne Bestrahlung mitgeführt. Ausgewertet wurde dabei jeweils der Anteil der BrdU-positiven G2- Zellen an der BrdU-positiven Gesamtpopulation (Abb. 4.6). 1h nach Bestrahlung liegt bei allen Proben der Anteil BrdU-positiver G2-Zellen bereits bei 30-40% (Abb. 4.6A). Dies ist einerseits darauf zurückzuführen, dass Zellen während der Markierungsphase in die G2-Phase progressieren, zum anderen ist die Grenze zwischen später S-Phase und G2-Phase anhand der DotPlots schwer zu definieren. Eine Verzögerung der Progression von Artemis- und WT-Zellen gegenüber den AT-Zellen aufgrund einsetzender intras-checkpoints konnte nicht beobachtet werden, was an der zur Detektion von intras- Checkpoints ungenügenden Sensitivität der verwendeten Methode liegen könnte. In den unbestrahlten Proben aller Zelllinien befinden sich 4h nach der Markierung zwischen 60% und 80% der BrdU-positiven Zellen in der G2-Phase. Anschließend fällt die Kurve wieder ab, da sich die Zellen teilen. 24h nach der Markierung treten die ersten Tochterzellen erneut in die G2-Phase ein, was an dem leichten Anstieg der Kurven zu erkennen ist. Dieser ist jedoch im Vergleich zum ersten Anstieg nur sehr gering, was vermutlich mit der zunehmenden Kontaktinhibition der wachsenden Zellkultur sowie dem asynchronen Wachstum primärer Fibroblasten zusammenhängt. Dabei zeigen alle Zelllinien etwa dasselbe Zellzyklusverhalten. Nach Bestrahlung auftretende Unterschiede zwischen den Zelllinien sind somit auf die Bestrahlung zurückführen und nicht auf Zelllinien-spezifische Unterschiede in der Zellzyklusprogression. Nach Bestrahlung mit 1,3Gy akkumulieren bei allen Zelllinien ~ 80% aller BrdU-positiven Zellen bis 8h in der G2-Phase, was auf das Einsetzen des G2/M-Checkpoints zurückzuführen ist (Abb. 4.6B). Dieser wird 12h nach Bestrahlung wieder aufgehoben, was sich in einem Abfall der BrdU-positiven G2-Zellen ausdrückt. Allerdings verläuft dieser Abfall in den AT-

78 Ergebnisse 68 und Artemis-Zellen langsamer. Während WT-Zellen 16h nach Bestrahlung nur noch einen Anteil von ~ 25% BrdU-positiven G2-Zellen aufweisen, so befinden sich in den defizienten Zelllinien zu diesem Zeitpunkt noch ~ 50% der BrdU-positiven Zellen in der G2-Phase. Noch deutlicher wird dieser Effekt nach Bestrahlung mit 6Gy (Abb. 4.6C). In WT-Zellen ist nach 6Gy eine Abnahme der G2-Population erst nach 12-16h zu beobachten. Dabei ist der Anteil der sich teilenden Zellen geringer als nach Bestrahlung mit 1,3Gy. AT- und Artemis-Zellen dagegen zeigen auch 24h nach Bestrahlung keine signifikante Abnahme der BrdU-positiven G2-Zellen. Abb. 4.6: Durchflusszytometrische Untersuchung des G2/M- Checkpoints nach Bestrahlung in der S-Phase. Exponentiell wachsende Zellen wurden für 1h mit BrdU markiert und anschließend bestrahlt oder unbestrahlt belassen. Nach 1h, 4h, 8h, 12h, 16h und 24h sowie 48h, 72h und 96h (nur 6Gy) wurde der Anteil der G2-Zellen an den BrdU-positiven Zellen bestimmt. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler aus 2-3 unabhängigen Experimenten wider. (A) Zellzyklusprogression unbestrahlter Zellen. (B) Zellzyklusprogression nach Bestrahlung mit 1,3Gy. (C) Zellzyklusprogression nach Bestrahlung mit 6Gy.

79 Ergebnisse 69 Um zu untersuchen, ob der G2/M-Checkpoint in AT- und Artemis-Zellen zu späteren Zeiten aufgehoben wird, wurden diese FACS-Analysen auf einen Zeitraum von vier Tagen ausgedehnt (Abb. 4.6C). In diesem Zeitraum verlassen nur ~ 15% der Zellen die G2-Phase. Durch das Fehlen BrdU-positiver S-Phase-Zellen zu diesen Zeiten lässt sich ausschließen, dass dieses konstante Maß an BrdU-positiven G2-Zellen auf ein Gleichgewicht von sich teilenden und erneut in die G2-Phase eintretenden Zellen zurückzuführen ist. Somit scheinen Zellen, welche sich nicht innerhalb der ersten 24h teilen, in einen permanenten Arrest überzugehen. Während dieser Anteil bei WT-Zellen bei < 40% BrdU-positiver G2-Zellen liegt, ist der Anteil bei den defizienten Zelllinien bei konstanten 75%. Des Weiteren zeigen AT- und Artemis-Zellen zu allen Zeiten ein identisches Verhalten. Die Länge der Aufrechterhaltung des G2/M-Checkpoints steigt somit mit zunehmender Dosis an. Die Akkumulation der AT-Zellen in der G2-Phase nach Bestrahlung in der S-Phase ist konsistent mit früheren Untersuchungen. Eine Bestrahlung in der S-Phase führt zur Aktivierung der Kinase ATR, welche den G2/M-Checkpoint induzieren kann, so dass dieser nach Bestrahlung in der S-Phase ATM-unabhängig eingeleitet wird (Liu et al., 2000) Untersuchungen zur DSB-Reparatur nach einer Bestrahlung in der S-Phase mittels γh2ax-immunfluoreszenz-mikroskopie Die durchflusszytometrischen Daten belegen, dass AT- und Artemis-Zellen nach Bestrahlung in der S-Phase eine verlängerte Aufrechterhaltung des G2/M-Checkpoints zeigen. Dabei progressiert nach einer Dosis von 6Gy im Verlauf mehrerer Tage nur ein geringer Anteil an Zellen in die G1-Phase. Da beide Zelllinien zumindest in stationären Zellen einen Reparaturdefekt besitzen, wurde vermutet, dass dieser permanente Arrest durch unreparierte DSBs hervorgerufen wird. Mittels γh2ax-immunfluoreszenz-mikroskopie (IFM) sollte daher die Reparatur der in der S-Phase induzierten DSBs untersucht werden. Die Experimente wurden analog zu den durchflusszytometrischen Messungen durchgeführt. Dabei wurden exponentiell auf Deckgläschen wachsende Zellen für 1h mit BrdU markiert und direkt im Anschluss mit 6Gy bestrahlt. Nach 24h, 48h, 72h und 92h wurden die Zellen fixiert und mit Antikörpern gegen BrdU sowie γh2ax gefärbt. Ausgewertet wurden die γh2ax- Foci in den BrdU-positiven Zellen (Abb. 4.7). 24h nach Bestrahlung ist zwischen WT- und AT- bzw. Artemis-Zellen in der Anzahl der γh2ax-foci pro Zelle kein deutlicher Unterschied zu sehen (Abb. 4.8). In allen Proben liegt

80 Ergebnisse 70 Abb. 4.7: Immunfluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von mit 6Gy bestrahlten WT-Zellen (HSF1) nach 24stündiger Reparaturzeit. In exponentiell wachenden Zellen wurden die S-Phase-Zellen für 1h mit BrdU markiert und anschließend mit 6Gy bestrahlt. In den fixierten Zellen wurde γh2ax (grün) und BrdU (rot) gefärbt. Die DNA wurde mit DAPI (blau) gegengefärbt. Ausgewertet wurden die γh2ax-foci in den BrdU-positiven Zellen. Die Bilder wurden mit 630facher Vergrößerung aufgenommen. die durchschnittliche Foci-Zahl zwischen 60 und 70 Foci pro Zelle. Ab einer Reparaturzeit von 48h wird in AT- und Artemis-Zellen ein Reparaturdefekt deutlich. Während der WT in den folgenden Tagen weiter repariert, bis er ein DSB-Niveau von ~ 10 Foci pro Zelle erreicht hat, stagniert die Reparatur bei den beiden defizienten Zelllinien zwischen 40 und 50 Foci pro Zelle. Der Reparaturdefekt, welcher hier erst 48h nach Bestrahlung gefunden werden konnte, steht nicht im Einklang mit den FACS-Daten nach Bestrahlung in der G2-Phase (Kap , Abb. 4.6C). Dort zeigte sich bereits 24h nach Bestrahlung mit 6Gy ein deutlicher Unterschied in der Zellzyklusprogression zwischen WT und AT- bzw. Artemis-Zellen. Diese Diskrepanz lässt sich vermutlich auf die unterschiedlichen Bestrahlungsbedingungen bei der FACS- Abb. 4.8: Reparaturverhalten primärer humaner WT-, AT- und Artemis- Fibroblasten nach Bestrahlung in der S- Phase. Exponentiell wachsende Zellen wurden für 1h mit BrdU markiert und mit 6Gy bestrahlt. In den BrdU-positiven Zellen wurde nach 24h, 48h, 72h und 96h die Zahl der γh2ax- Foci bestimmt. Die Fehlerbalken stellen die Standardfehler aus 3-4 unabhängigen Experimenten dar. Kontrollen zum Zeitpunkt 4h wurden abgezogen.

81 Ergebnisse 71 Analyse (Bestrahlung in Flaschen) und der Foci-Analyse (Bestrahlung auf Deckgläschen) zurückführen (vgl. Material und Methoden, Kap. 3.4). Die effektive Dosis lag somit bei den hier durchgeführten Foci-Experimenten nicht bei 6Gy, sondern bei 9-12Gy. Durch diese Dosisdifferenz wird der Unterschied in der Zellzyklusprogression zwischen WT- und ATbzw. Artemis-Zellen bereits zu einem Zeitpunkt sichtbar, bei dem aufgrund der höheren Dosis der Reparaturdefekt noch nicht detektiert werden kann. Es konnte somit gezeigt werden, dass der verlängerte Arrest in der G2-Phase bei AT- und Artemis-Zellen mit dem Vorhandensein unreparierter DSBs in Zusammenhang steht. Weiterhin war das Ausmaß des Reparaturdefekts zwischen AT- und Artemis-Zellen, analog zu den in G0/G1-bestrahlten Zellen, auch nach Bestrahlung in der S-Phase gleich DSB-Reparatur nach Bestrahlung in der G2-Phase in AT- und Artemis-Zellen Es konnte gezeigt werden, dass AT- und Artemis-Zellen nach Bestrahlung in der S-Phase einen verlängerten G2-Arrest zeigen, welcher mit einer erhöhten Anzahl an unreparierten DSBs korreliert. Weiterhin besitzen beide Zelllinien denselben Reparaturdefekt, was konsistent mit Daten aus früheren, in stationären Zellen durchgeführten Studien ist (Riballo et al., 2004). Da die Zellen durch die Akkumulation den Großteil der Reparaturzeit in G2 verbleiben, wurde vermutet, dass AT- und Artemis-Zellen auch in der G2-Phase einen Reparaturdefekt besitzen. Im weiteren Verlauf sollte daher das Reparaturverhalten von in der G2-Phase bestrahlten Zellen untersucht werden Die Wirksamkeit von Aphidicolin in primären humanen Fibroblasten Da die nachfolgenden Reparaturstudien sich ausschließlich auf in der G2-Phase bestrahlte Zellen beschränken sollten, musste verhindert werden, dass Zellen, die zum Zeitpunkt der Bestrahlung in der G1- oder der S-Phase waren, während der Reparaturzeit in die G2-Phase progressieren. Aphidicolin inhibiert in eukaryotischen Zellen spezifisch die für die DNA- Replikation verantwortliche DNA-Polymerase α, so dass die Zellen an der DNA-Synthese gehindert werden und somit nicht in die G2-Phase progressieren sollten (Ichikawa et al., 1980).

82 Ergebnisse 72 Abb. 4.9: DotPlots nach BrdU-Einbau und Inkubation in An- oder Abwesenheit von Aphidicolin. Exponentiell wachsende WT-Zellen (HSF1) wurden 1h mit BrdU markiert, mit 1Gy bestrahlt und mit Aphidicolin versetzt. Nach 0h, 4h, 8h und 12h wurden die Zellen fixiert und im FACS vermessen. Auf der Abszisse ist linear und dimensionslos der DNA-Gehalt anhand der Intensität des PI-Signals abgebildet. Auf der Ordinate wurde in logarithmischer Darstellung dimensionslos die BrdU-Intensität gemessen. Zunächst wurde die Wirksamkeit von Aphidicolin in primären humanen Fibroblasten untersucht. Dazu wurden asynchron wachsende WT-Zellen für 1h mit BrdU markiert. Direkt nach der Markierung wurden die Zellen mit 1Gy bestrahlt, und Aphidicolin wurde zugegeben. Parallel wurden Proben ohne Aphidicolin mitgeführt. Nach 4h, 8h und 12h wurden die Zellen geerntet, für die Durchflusszytometrie fixiert und im FACS vermessen (Abb. 4.9). In Abwesenheit von Aphidicolin progressieren die für 1h mit BrdU markierten Zellen in die G2- Phase (4h) und zu späteren Zeiten in die G1-Phase (8h und 12h). In den Proben mit Aphidicolin befinden sich die Zellen auch 12h nach Bestrahlung noch in der S-Phase. Somit konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von Aphidicolin direkt nach Bestrahlung eine Progression im Zellzyklus unterbindet Messung der DSB-Reparatur in der G2-Phase mittels Premature chromosome condensation (PCC) Zunächst sollte das Reparaturvermögen von AT- und Artemis-Zellen in G2 auf chromosomaler Ebene untersucht werden. Dazu wurden exponentiell wachsende Zellen mit 1Gy bestrahlt und unter dem Einfluss von Aphidicolin für unterschiedliche Reparaturzeiten inkubiert. 30min vor Ablauf der Reparaturzeit wurde der Phosphatase-Inhibitor Calyculin A zugegeben, was zu einer vorzeitigen Chromosomenkondensation der G2-Phase-Zellen führte.

83 Ergebnisse 73 Abb. 4.10: Giemsa-gefärbte Chromosomenspreitungen nach PCC mit Calyculin A unbestrahlter und mit 1Gy bestrahlter WT-Zellen nach 6h Reparatur sowie mit 1Gy bestrahlter AT- und Artemis-Zellen nach 6h Reparatur. Die Pfeile markieren Chromatidbrüche. Die Bilder wurden im Durchlicht bei einer 630fachen Vergrößerung aufgenommen. Nach Ernte und Fixierung wurden die Zellen auf Objektträger aufgetropft und einheitlich mit Giemsa-Lösung angefärbt. G2-Phase-Zellen ließen sich von mitotischen Chromosomenspreitungen unterscheiden, da im Gegensatz zu mitotischen Chromosomen bei in der G2Phase kondensierten Chromosomen das Zentromer nur schwer erkennbar ist und die Schwesterchromatiden oftmals nicht getrennt sichtbar sind (Abb. 4.10). Des Weiteren ist der Anteil an G2-Zellen gegenüber mitotischen Zellen um ein Vielfaches höher, so dass die hohe Ausbeute an Chromosomenspreitungen größtenteils auf G2-Zellen beruhte. Ausgewertet wurden Chromatidbrüche und zusätzliche Chromosomenfragmente, welche als zwei

84 Ergebnisse 74 Chromatidbrüche gewertet wurden (aufgrund der beiden Chromatiden von G2-Phase- Chromosomen). Zusätzliche Chromosomenfragmente machten dabei nur einen sehr geringen Anteil an der Gesamtbruchzahl aus. Rekombinationsereignisse traten nur selten auf, so dass diesbezüglich keine zuverlässige Auswertung durchgeführt werden konnte. Pro Experiment wurden bei den bestrahlten Proben 20-50, bei den unbestrahlten Kontrollen Chromosomenspreitungen ausgezählt. Tab. 4.3 gibt die Mittelwerte der Chromatidbrüche pro Zelle aller Chromosomenspreitungen aus 2-3 unabhängigen Experimenten wieder. Reparaturzeit Zelllinie Kontrolle 2h 4h 6h HSF1 (WT) 0,23 7,05 3,68 2,70 C2906 (WT) 0,28 7,01 3,81 2,87 AT1BR (AT) 0,45 6,85 4,48 3,64 AT7BI (AT) 0,39 7,20 4,85 3,94 CJ179 (Art) 0,37 7,71 4,79 3,57 F (Art) 0,26 7,44 5,10 3,88 Tab. 4.3: Chromatidbrüche pro Chromosomenspreitung in der G2-Phase 2h nach Bestrahlung ist kein signifikanter Unterschied in der Anzahl der Chromosomenbrüche zwischen den verschiedenen Zelllinien zu erkennen (Abb. 4.11). Bei dem 4h- und dem 6h-Reparaturpunkt zeigt sich dagegen ein Reparaturdefekt in den AT- und Artemis-Zellen. Diese weisen 4h nach Bestrahlung etwa 25-30%, 6h nach Bestrahlung etwa 30-35% mehr Brüche auf als WT-Zellen. Die Signifikanz der Werte zwischen den AT- bzw. Artemis-Zelllinien und den WT-Zelllinien wurde mit einem ungepaarten t-test untersucht. Dabei lag der P-Wert bei 2h für alle Zelllinien bei p 0,05. Bei dem 4h- und dem 6h-Punkt lagen die P-Werte dagegen bei p 0,01, was auf eine hohe Signifikanz der Ergebnisse schließen lässt. Die entsprechenden P- Werte lagen für die defizienten Zelllinien untereinander bzw. die WT-Zelllinien untereinander zu allen Zeiten bei p 0,05. Dies zeigt, dass sich die defizienten Zelllinien bzw. die WT- Zelllinien untereinander nicht signifikant unterscheiden. Mit dieser Methode konnte somit auf chromosomaler Ebene ein Reparaturdefekt der AT- und Artemis-Zellen, die in der G2-Phase bestrahlt und analysiert wurden, nachgewiesen werden. Der Reparaturdefekt manifestiert sich erst nach längeren Reparaturzeiten und ist damit konsistent mit den Ergebnissen aus Untersuchungen in stationären Zellen.

85 Ergebnisse 75 Abb. 4.11: Chromosomenbruchanalyse in der G2-Phase mittels PCC nach 1Gy Röntgenstrahlung. Aufgetragen sind die Chromatidbrüche pro Zelle nach 2h, 4h und 6h Reparaturzeit. Die Experimente wurden in Anwesenheit von Aphidicolin durchgeführt. Die Kontrollwerte wurden abgezogen. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler aller Chromosomenspreitungen aus 2-3 unabhängigen Experimenten wider Messung der DSB-Reparatur in der G2-Phase mittels Pulsfeld- Gelelektrophorese (PFGE) Die Unterschiede im Reparaturverhalten zwischen Reparatur-profizienten und -defizienten Zellen sind in den PCC-Experimenten relativ gering. Obwohl die Signifikanz der Ergebnisse durch einen t-test bestätigt wurde, sollte der Reparaturdefekt von AT- und Artemis-Zellen durch die Anwendung einer zweiten Methode validiert werden. Dazu wurde die Methode der PFGE verwendet. Exponentiell wachsende WT-, AT- und Artemis-Zellen wurden mit 80Gy bestrahlt bzw. unbestrahlt belassen, nach 24h, 48h und 72h geerntet und in Agarose-Blöckchen eingegossen. Zusätzlich wurde jeweils eine Probe mitgeführt, welche mit 10Gy bestrahlt und direkt geerntet wurde. Die Zellen in den Blöckchen wurden lysiert und die DNA mittels PFGE aufgetrennt. Im Ethidiumbromid-gefärbten FAR-Gel sind in den Kontrollen aller drei Zelllinien nahezu keine DNA-Fragmente unterhalb der Taschen zu erkennen (Abb. 4.12). Somit wies die DNA zum Zeitpunkt der Bestrahlung keine erhöhte Anzahl an DSBs auf und war nicht degradiert. Bei den Induktionsproben dagegen sammelt sich ein Teil der DNA in der Kompressionszone. Bei den Reparaturproben der WT-Zellen ist 24h nach Bestrahlung nur eine schwach ausgeprägte, bei den längeren Reparaturzeiten nahezu keine Kompressionszone zu erkennen. Dies deutet auf eine annähernd vollständige Reparatur bis auf das Niveau der

86 Ergebnisse 76 Abb. 4.12: DSB-Reparatur nach 80Gy Röntgenstrahlung. Repräsentatives Ethidiumbromid-gefärbtes PFGE-Gel exponentiell wachsender, primärer humaner Fibroblasten, die mit 10Gy (Induktion) oder 80Gy (24h, 48h und 72h Reparaturpunkte) bestrahlt wurden, sowie unbestrahlte Kontrollen. unbestrahlten Kontrolle hin. Dagegen ist bei den AT- und Artemis-Zellen die Kompressionszone bei allen Reparaturpunkten noch deutlich zu erkennen und zeigt keine wesentliche Abnahme nach langen Reparaturzeiten. Dies lässt darauf schließen, dass noch DNA unrepariert verblieben ist und der Reparaturdefekt in der Gesamtzahl der exponentiell wachsenden Zellen nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse stehen damit im Einklang mit den Studien an konfluenten Zellen sowie den in dieser Arbeit durchgeführten PCC- Experimenten. Die herkömmliche PFGE ermöglicht nur die Auswertung der Gesamt-DNA aller Zellen der bestrahlten Population. Die spezifische Analyse einzelner Zellzyklusphasen erforderte bisher die Synchronisation der Zellen. Da bei primären Fibroblasten eine Synchronisation aufgrund ihres langsamen und irregulären Wachstumsverhaltens nicht möglich ist, musste die Methode so modifiziert werden, dass sich die DNA der G2-Zellen von der DNA der G1- und S-Zellen unterscheiden ließ. Dies sollte in den folgenden Experimenten anhand einer Markierung der wachsenden Zellen mittels Methyl- 3 H-Thymidin geschehen. Da Methyl- 3 H-Thymidin in der S-Phase eingebaut wird, musste zunächst mittels BrdU- FACS-Analyse festgestellt werden, wann sich die markierten Zellen in der G2-Phase befinden. Dazu wurden exponentiell wachsende Zellen aller drei verwendeten Zelllinien (HSF1, AT1BR, F01-240) für 1h mit BrdU inkubiert. 4h nach einer Markierung befinden sich mit ~ 80% der Großteil der markierten Zellen in der G2-Phase (Abb. 4.13). Anhand der Quantifizierung der BrdU-positiven G2-Zellen konnte weiterhin gezeigt werden, dass sich Zellen, welche zu diesem Zeitpunkt mit 80Gy bestrahlt wurden, während der Reparaturzeit nicht teilen. Auf diese Weise konnte sichergestellt werden, dass die später gemessene Reparatur bzw. evtl. auftretende Defekte nicht auf G1-Zellen zurückzuführen sind. Die hier

87 Ergebnisse 77 Abb. 4.13: Representative FACS- Plots BrdU-markierter primärer humaner Fibroblasten 0h, 48h und 72h nach 80Gy Röntgenstrahlung. Die Bestrahlung erfolgte 4h nach der BrdU-Markierung. Auf der Abszisse ist linear und dimensionslos der DNA-Gehalt anhand des PI-Signals aufgetragen. Auf der Ordinate ist dimensionslos und in logarithmischer Auftragung die BrdU-Intensität dargestellt. In den Rechtecken wurde der Anteil der G2-Zellen an allen BrdU-positiven-Zellen quantifiziert. bestrahlten primären Fibroblasten gehen auch nicht in die Apoptose über, was anhand degradierter DNA in den FACS-Plots sichtbar gewesen wäre. Obwohl es den Zellen nicht mehr möglich ist, innerhalb des betrachteten Zeitraums den Zellzyklus wieder aufzunehmen, gibt es keine Hinweise darauf, dass sie nicht mehr metabolisch aktiv sind und die DSB- Reparatur beeinträchtigt sein könnte. In stationären Zellen wurde u. a. anhand eines MTT- Tests nachgewiesen, dass nach einer Bestrahlung mit 80Gy Röntgenstrahlung die Zellen über einen Zeitraum von 6 Tagen physiologisch aktiv waren (Rief & Löbrich, 2002). In den folgenden PFGE-Experimenten wurden die Zellen 4h nach der Markierung mit 37MBq/ml Methyl- 3 H-Thymidin mit 10Gy bzw. 80Gy bestrahlt und entweder sofort (10Gy) oder nach Ablauf der Reparaturzeit (80Gy) geerntet und wie oben beschrieben weiter behandelt. Um speziell die Reparatur der mit Methyl- 3 H-Thymidin markierten G2-Zellen zu analysieren, wurde jede Spur des Gels in kleinere Blöckchen geschnitten, die Radioaktivität in jedem Blöckchen mittels Szintillation gemessen und daraus der FAR-Wert bestimmt (Abb. 4.14). Nach Abzug der FAR-Werte der unbestrahlten Kontrollen ist die 10Gy-Induktion aller drei Zelllinien nahezu gleich. 24h nach Bestrahlung ist zwischen AT- bzw. Artemis- Zellen und WT-Zellen noch kein signifikanter Unterschied in der Höhe der unrepariert verbliebenen DSBs erkennbar. Deutliche Unterschiede im Reparaturvermögen zeigen sich erst nach 48h bzw. 72h. Während die WT-Zelllinie nach 72h nahezu auf Kontrollniveau repariert hat, verbleiben in der ATM- und der Artemis-defekten Zelllinie DSBs unrepariert. Dabei zeigen die beiden defizienten Zelllinien ein sehr ähnliches Verhalten. Der FAR-Wert

88 Ergebnisse 78 beider defizienter Zelllinien liegt sowohl nach 48h als auch nach 72h etwas über dem Niveau einer mit 10Gy bestrahlten Induktionsprobe. Bei einer applizierten Dosis von 80Gy entspricht dies einem Anteil von ~ 15% unreparierten DSBs. Ein Reparaturdefekt der AT- und Artemis- Zellen, welcher im Ethidiumbromid-gefärbten Gel bereits für die Gesamtpopulation exponentiell wachsender Zellen beobachtet werden konnte, zeigte sich somit auch bei alleiniger Betrachtung der G2-Zellen. Abb. 4.14: Reparaturverhalten von in G2- bestrahlten, 3 H-Thymidin-markierten primären humanen WT-, sowie ATM- und Artemis-defizienten Fibroblasten. Die Zellen wurden 1h mit 3 H-Thymidin markiert und 4h später mit 10Gy (Induktion) oder 80Gy (24h-, 48h- und 72h-Reparaturpunkte) bestrahlt. Die Berechnung des FAR-Wertes erfolgte über Messung der Radioaktivität in den Geltaschen sowie der ins Gel gewanderten DNA. Die Werte der unbestrahlten Kontrollen wurden abgezogen. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler aus 2-4 unabhängigen Experimenten wider. Mittels PFGE konnte der Reparaturdefekt erst nach 2 Tagen gemessen werden, während er bei der PCC bereits nach 4h-6h auftrat, was auf die unterschiedlichen Höhen der applizierten Dosen zurückzuführen sein könnte. Dennoch wurde mit beiden Methoden ein Reparaturdefekt in bestrahlten ATM- und Artemis-defizienten G2-Zellen nachgewiesen, der in beiden Zelllinien gleich stark ausgeprägt ist Etablierung von Zellsystemen zur Untersuchung der Reparatur- und der Checkpoint-Funktion von ATM Ein Ziel dieser Arbeit war es, den Beitrag der Reparatur- und der Checkpointfunktion von ATM an der Erhaltung der chromosomalen Stabilität zu untersuchen. Dabei sollte besonderes Augenmerk auf die Reparatur in der G2-Phase und die Regulation des G2/M-Checkpoints gelegt werden. Für diese Untersuchungen wurden verschiedene Zellsysteme benötigt. Mit AT-Zellen liegt ein Zellsystem vor, welches den dualen Defekt aufweist, während WT-Zellen in beiden Funktionen profizient sind. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit sollten Zellsysteme

89 Ergebnisse 79 etabliert werden, welche entweder nur den Reparatur- oder nur den Checkpoint-Defekt von AT-Zellen besitzen Untersuchung zur Induktion des ATM- abhängigen G2/M-Checkpoints in WT-, AT- und Artemis-Zellen nach Bestrahlung in der G2-Phase In den bisherigen Experimenten sowie weiteren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass AT- und Artemis-Zellen neben der G0/G1-Phase auch in der G2-Phase denselben Reparaturdefekt besitzen. Weiterhin gab es Hinweise, dass Artemis-Zellen Checkpoint-profizient sind (Riballo et al., 2004). Um die Checkpoints genauer zu charakterisieren, wurden zeitgleich zu dieser Arbeit in unserer Arbeitsgruppe Artemis-Zellen auf ihre Fähigkeit untersucht, den ATM-abhängigen G2/M-Checkpoint zu induzieren. Dazu wurden exponentiell wachsende WT-, Artemis- und AT-Zellen mit 1,3Gy oder 6Gy bestrahlt, nach 1h, 4h und 8h geerntet und für die Durchflusszytometrie fixiert. Anschließend wurden die Proben mit Antikörpern gegen die phosphorylierte Form des Histons 3 (phosphoh3) gefärbt, welches als Mitose-Marker herangezogen werden kann. Als Nachweis für die Induktion des G2/M-Checkpoints wurde im Durchflusszytometer der mitotische Index (MI) der einzelnen Proben bestimmt und auf eine unbestrahlte Probe normiert (Abb. 4.15). Abb. 4.15: phosphoh3-analyse primärer humaner Fibroblasten 1h, 4h und 8h nach Bestrahlung mit 1,3Gy (A) und 6Gy (B). Die Werte sind auf unbestrahlte Proben zum Zeitpunkt 0h normiert. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler 3 unabhängiger Experimente dar. Die Experimente wurden von Dr. Andrea Krempler durchgeführt. Nach Bestrahlung mit 1,3Gy sinkt sowohl bei WT- als auch bei Artemis-Zellen der MI 1h nach Bestrahlung auf ~ 20% einer unbestrahlten Kontrolle (Abb. 4.15A). Dies zeigt, dass sich zu diesem Zeitpunkt alle während der Bestrahlung in der Mitose befindlichen Zellen geteilt

90 Ergebnisse 80 haben und auch keine weiteren Zellen mehr in die Mitose gelangen. Dies ist ein Indikator für die Induktion des G2/M-Checkpoints. Bei den WT-Zellen ist nach 4h ein leichter Anstieg des MI s zu erkennen, was auf einen Eintritt von Zellen in die Mitose bzw. auf die Aufhebung des G2/M-Checkpoints schließen lässt. Dieser Anstieg ist bei den Artemis-Zellen erst nach 6h zu beobachten. AT-Zellen progressieren dagegen auch nach Bestrahlung ungehindert in die Mitose, was mit dem in der Literatur beschriebenen Checkpoint-Defekt dieser Zellen konsistent ist. Nach Bestrahlung mit 6Gy ist in dem betrachteten Zeitfenster weder bei den WT- noch bei den Artemis-Zellen ein Anstieg des MI s festzustellen (Abb. 4.15B). Auch bei den AT-Zellen fällt der MI auf ~ 40% ab, um danach wieder anzusteigen. Diese leichte Checkpoint-Induktion mag an der Höhe der applizierten Dosis liegen (mit freundlicher Genehmigung von Dr. Andrea Krempler). In diesen Experimenten konnte somit gezeigt werden, dass Artemis-Zellen einen intakten G2/M-Checkpoint besitzen. Unter Anbetracht der Ergebnisse der vorherigen Reparaturstudien lässt sich somit schließen, dass mit Artemis-Zellen ein Zellsystem zur Verfügung steht, welches zwar denselben Reparaturdefekt wie AT-Zellen aufweist, aber Checkpoint-profizient ist Chemische Inhibierung des G2/M-Checkpoints Nachdem mit Artemis-Zellen ein Zellsystem zur Verfügung stand, welches denselben Reparaturdefekt wie AT-Zellen besitzt, aber Checkpoint-profizient ist, sollte im Folgenden ein Zellsystem etabliert werden, welches denselben Checkpointdefekt wie AT-Zellen aufweist, aber Reparatur-profizient ist. ATM ist eines der ersten Proteine, welches nach Auftreten eines DSBs aktiviert wird, und phosphoryliert die Checkpoint-Kinase Chk2 sowie die für die Induktion des G2/M-Checkpoints benötigte Kinase Chk1. Da aufgrund der embryonalen Letalität keine humanen Chk1-defizienten Zellen existieren, musste die Checkpoint-Defizienz transient durch chemische Inhibierung erfolgen. Im Zuge dessen wurden in unserem Kooperationslabor von P. A. Jeggo verschiedene Inhibitoren für Chk1 und Chk2 getestet. Dabei zeigte sich, dass die alleinige Inhibition von Chk1 nicht zur vollständigen Aufhebung des G2/M-Checkpoints ausreichte, sondern dies erst durch die Inhibition von Chk1 und Chk2 gelang (Penny Jeggo, persönl. Mitteilung). Aufgrund der leichten kommerziellen Erhältlichkeit kam im Rahmen dieser Arbeit das Staurosporin- Analogon SB zum Einsatz, welches die Phosphorylierung von cdc25c vollständig unterbindet (Jackson et al., 2000; Zhao et al., 2002a). Dieses wird zwar in der Literatur als

91 Ergebnisse 81 spezifischer Chk1-Inhibitor beschrieben, bewirkte jedoch eine vollständige Aufhebung des G2/M-Checkpoints. Im Folgenden wird SB daher als Chk1/2-Inhibitor bezeichnet Einfluss des Chk1/2-Inhibitors SB auf den G2/M-Checkpoint Um zu zeigen, dass SB in primären humanen Fibroblasten wirksam und der G2/M- Checkpoint auch nach Bestrahlung inhibiert wird, wurden zunächst phosphoh3-analysen für die in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien unter Anwesenheit des Inhibitors durchgeführt. Dazu wurde exponentiell wachsenden Zellen 30min vor Bestrahlung der Inhibitor zugegeben. Bestrahlung und Regenerationszeit fanden in Anwesenheit des Inhibitors statt. Die Zellen wurden mit 1Gy bestrahlt und nach 1h, 4h und 8h fixiert. Parallel wurden Proben mitgeführt, die ebenfalls dem Inhibitor ausgesetzt waren, jedoch nicht bestrahlt wurden. Anschließend wurden die Proben mit phosphoh3-antikörpern gefärbt und im Durchflusszytometer der MI der einzelnen Proben bestimmt. Um den Effekt der Bestrahlung unter Anwesenheit des Inhibitors zu untersuchen, wurden die Werte der bestrahlten Proben mit Inhibitor durch die jeweiligen unbestrahlten Proben mit Inhibitor dividiert. Anschließend wurden die Werte auf eine unbestrahlte Probe zum Zeitpunkt 0h normiert. Abb. 4.16: phosphoh3-analyse primärer humaner Fibroblasten unter Inhibierung des G2/M-Checkpoints durch den Inhibitor SB Die Zellen wurden 30min vor Bestrahlung mit 1Gy mit dem Inhibitor vorinkubiert und 1h, 4h oder 8h nach Bestrahlung geerntet. Die Reparaturzeit fand in Anwesenheit des Inhibitors statt. Die Werte wurden durch die Werte von Proben dividiert, welche ebenfalls dem Inhibitor ausgesetzt waren, aber nicht bestrahlt wurden, und anschließend auf eine unbestrahlte Kontrolle zum Zeitpunkt 0h normiert. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler aus 3-4 unabhängigen Experimenten dar. Die durchbrochene Linie zeigt den Verlauf des MI s einer WT-Zelllinie nach Bestrahlung in Abwesenheit des Inhibitors (aus: Abb. 4.15A).

92 Ergebnisse 82 In den Proben mit Checkpoint-Inhibitor fällt der MI bei allen Zelllinien auch über 8h hinweg nicht unter 70% des MI s einer unbestrahlten Kontrolle zum Zeitpunkt 0h. Es konnte somit gezeigt werden, dass der Chk1/2-Inhibitor SB in allen Zelllinien wirkt, und der G2/M- Checkpoint auch nach Bestrahlung nicht initiiert wird. Der Einsatz dieses Inhibitors in WT- Zellen ermöglicht folglich die Simulierung eines Defekts des ATM-abhängigen G2/M- Checkpoints in einem Reparatur-profizienten Hintergrund Einfluss des Chk1/2-Inhibitors SB auf die DSB-Reparatur Nachdem gezeigt werden konnte, dass der Chk1/2-Inhibitor SB in den in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien die Induktion des G2/M-Checkpoint unterbindet, musste sichergestellt werden, dass dessen Verwendung nicht zu einer Beeinträchtigung der Reparatur der DSBs in G2-Zellen führt, da dies die Ergebnisse nachfolgender Reparaturstudien beeinflussen würde. Um dies zu untersuchen, wurde der Ansatz der γh2ax-ifm gewählt. Da ausschließlich G2- Zellen untersucht werden sollten, war es notwendig, diese von den G1- und den S-Phase- Zellen zu unterscheiden. Dabei kam der G2-Phase-Marker CENP-F (Zentromer-Protein F) zum Einsatz. Dieses Protein wird während der späten S-Phase und der gesamten G2-Phase bis zur Mitose exprimiert. CENP-F liegt während der G2-Phase noch einheitlich im ganzen Zellkern verteilt vor, in der Mitose ist es dagegen an den Zentromeren lokalisiert. Anhand des unterschiedlichen Färbungsmusters sowie durch die Kondensation mitotischer Chromosomen lassen sich somit mitotische Zellen von G2-Zellen unterscheiden und von der Auswertung Abb. 4.17: Immunfluoreszenzmikroskopische Aufnahmen bestrahlter HSF1- Zellen in Anwesenheit von Aphidicolin. Obere Reihe: γh2ax-foci (grün) wurden in G2-Zellen ausgewertet, welche positiv für den Marker CENP-F waren (rot). Untere Reihe: Durch eine Doppelfärbung mit γh2ax (grün) und Cyclin A (rot) konnte gezeigt werden, dass es sich bei Zellen mit starkem γh2ax-signal um S-Phase- Zellen handelte, welche bei der Auswertung ausgeschlossen wurden. Die Bilder wurden bei 630facher Vergrößerung aufgenommen.

93 Ergebnisse 83 ausschließen (Liao et al., 1995; Kao et al., 2001). Da die Expression von CENP-F bereits in der späten S-Phase beginnt, mussten diese Zellen ebenfalls von der Auswertung ausgeschlossen werden. Durch die Zugabe von Aphidicolin werden aufgrund der Polymerase- Inhibition während der Synthese die Replikationsgabeln angehalten. Die entstehenden langen Bereiche einzelsträngiger DNA führen in S-Phase-Zellen zu einem ausgeprägten, über den gesamten Zellkern verteilten γh2ax-signal. Anhand einer Doppelfärbung von γh2ax mit dem S-Phase Marker CyclinA konnte direkt gezeigt werden, dass es sich bei Zellen mit dieser starken γh2ax-färbung tatsächlich um S-Phase-Zellen handelt (Abb. 4.17). G1-Zellen konnten aufgrund ihrer fehlenden CENP-F-Färbung sowie des fehlenden ausgeprägten γh2ax-signals von der Analyse ausgeschlossen werden. Damit wurden für die Auswertung der γh2ax-foci in G2-Zellen nur die Zellen mit eindeutig erkennbaren Foci herangezogen, die zusätzlich positiv für CENP-F waren. Um einen möglichen Einfluss des Inhibitors auf das Reparaturvermögen oder die Induktion von DSBs zu untersuchen, wurden in diesen Experimenten exponentiell auf Deckgläschen wachsende WT-Zellen mit 1,5Gy Röntgenstrahlung bestrahlt und nach 2h, 4h, 6h und 8h fixiert. Der Inhibitor wurde 30min vor der Bestrahlung zugegeben, die Inkubation während der Reparaturzeit fand sowohl in Anwesenheit des Inhibitors als auch unter dem Einfluss von Aphidicolin statt. Als Kontrolle wurden Proben mitgeführt, die zwar ebenfalls bestrahlt und mit Aphidicolin behandelt wurden, aber ohne den Inhibitor SB inkubiert wurden. Nach Fixierung der Zellen wurden diese mit Antikörpern gegen γh2ax und CENP-F gefärbt. Am Mikroskop wurde jeweils die Anzahl der γh2ax-foci in den G2-Zellen zu den Abb. 4.18: Reparaturverhalten primärer humaner WT-Fibroblasten nach Behandlung mit dem Chk1/2-Inhibitor SB In exponentiell wachsenden, mit 1,5Gy bestrahlten Zellen wurden 2h, 4h, 6h und 8h nach Bestrahlung in G2-Zellen γh2ax- Foci ausgezählt. Die Experimente wurden in Anwesenheit von Aphidicolin durchgeführt. Als Kontrollen wurden die Werte von Proben, welche identischen Zeiten dem Inhibitor ausgesetzt waren, aber nicht bestrahlt wurden, abgezogen. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler von zwei unabhängigen Experimenten dar.

94 Ergebnisse 84 verschiedenen Zeitpunkten ermittelt (Abb. 4.18). Zu allen Zeitpunkten unterscheidet sich die Anzahl der γh2ax-foci bei den Proben mit und ohne Inhibitor nicht signifikant. Der Chk1/2-Inhibitor SB induziert somit in der G2- Phase keine zusätzlichen DSBs, und es ist auch kein signifikanter Unterschied im Reparaturverhalten der Zellen zu erkennen. Durch den Einsatz des Inhibitors in WT-Zellen steht somit ein Zellsystem zur Verfügung, welches zwar denselben Checkpointdefekt wie AT- Zellen besitzt, aber Reparatur-profizient ist Chromosomale Studien in der Mitose nach Bestrahlung in der G2-Phase Anhand der vorherigen Reparatur- und Zellzyklusstudien wurde mit Artemis-Zellen ein Zellsystem etabliert, welches denselben Reparaturdefekt wie AT-Zellen aufweist, aber Checkpoint-profizient ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass WT-Zellen unter Einfluss des Chk1/2-Inhibitors denselben Checkpoint-Defekt wie AT-Zellen in einem Reparaturprofizienten Hintergrund besitzen. Zusammen mit AT-Zellen, welche den dualen Defekt besitzen, und in beiden Funktionen profizienten WT-Zellen standen somit alle für die Untersuchung des Zusammenspiels von Reparatur und Checkpoints benötigten Zellsysteme zur Verfügung. Dieses wurde im Folgenden anhand chromosomaler Studien in der Mitose untersucht. In diesen Experimenten wurden exponentiell wachsende Zellen mit 1Gy Röntgenstrahlung bestrahlt und direkt mit Aphidicolin versetzt. Der Inhibitor SB wurde bei den entsprechenden Proben 30min vor Bestrahlung zugegeben. 2h vor Ablauf der Reparaturzeit wurden die Zellen durch Zugabe des Spindelgifts Colcemid in der Mitose arretiert (4h beim 12h-Punkt). Um zu verhindern, dass Zellen in die Analyse eingehen, welche während der Bestrahlung bereits in der Mitose waren, wurde beim 2h-Punkt das Colcemid erst 1h nach Bestrahlung zugegeben. In den phosphoh3-analysen zeigte sich, dass zu diesem Zeitpunkt Zellen, welche während der Bestrahlung in der Mitose waren, diese verlassen haben (vgl. Kap , Abb. 4.15). Zusätzlich wurden zwei unbestrahlte Kontrollen mitgeführt, die für 2h bzw. 4h Colcemid ausgesetzt waren. Nach 2h, 4h, 6h, 8h und 12h wurden die Zellen geerntet und fixiert. Es wurden Objektträger mit Chromosomenspreitungen hergestellt, welche einheitlich mit Giemsa-Lösung angefärbt wurden. Die Objektträger wurden großteils automatisch nach Metaphasen abgesucht, während die Aufnahme der Bilder von Spreitungen

95 Ergebnisse 85 Abb. 4.19: Aufnahmen Giemsa-gefärbter Metaphase-Spreitungen nach einer 1Gy-Bestrahlung in der G2-Phase. Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 1Gy bestrahlt und in Anwesenheit von Aphidicolin inkubiert. 2h vor Ernte wurden die Zellen durch Zugabe von Colcemid in der Metaphase arretiert (1h beim 2h-Punkt) und Metaphase-Präparate hergestellt. Die Präparate wurden einheitlich mit Giemsa gefärbt und Chromatidbrüche (Pfeile) wurden ausgewertet. manuell erfolgte (Abb. 4.19). Die Ausbeute an Chromosomenspreitungen variierte dabei sehr stark zwischen den einzelnen Zelllinien sowie den verschiedenen Zeitpunkten. Vor allem nach den kurzen Reparaturzeiten war es bei den WT-Zellen und besonders den ArtemisZellen aufgrund des einsetzenden G2/M-Checkpoints notwendig, bis zu 10 Objektträger zu untersuchen, wobei pro Objektträger sehr wenige auswertbare Chromosomenspreitungen gefunden werden konnten. Daher war es nicht immer möglich, von allen Proben die angestrebten 40 Bilder aufzunehmen. Die Auswertung erfolgte analog zu den in Kapitel beschriebenen PCC-Studien. In den Tabellen 4.4 und 4.5 sind die Chromatidbrüche pro Metaphase aller Metaphasen von 2-5 unabhängigen Experimenten aufgeführt:

96 Ergebnisse 86 ohne SB Reparaturpunkte Zelllinie K 2h K 4h 2h 4h 6h 8h 12h MRC-5 (WT) 0,10-3,18 1,76 1,33 1,18 - HSF1 (WT) 0,18 0,18 3,19 1,76 1,14 1,05 1,04 AT1BR (AT) 0,41 0,29 7,86 4,80 3,49 3,07 2,43 AT7BI (AT) 0,19-8,15 4,81 3,54 2,44 - CJ179 (Art) 0,25 0,19 5,37 3,33 2,45 1,96 1,82 F (Art) 0,24 0,18 4,94 3,61 2,34 1,74 1,63 Tab. 4.4: Chromatidbrüche pro Metaphase ohne Inhibierung des G2/M-Checkpoints mit SB Reparaturpunkte Zelllinie K 2h 4h 6h 8h MRC-5 (WT) 0,13 4,01 3,00 2,39 HSF1 (WT) 0,17 4,12 2,89 2,13 AT1BR (AT) 0,30 7,59 4,97 3,64 3,42 CJ179 (Art) 0,21 6,03 4,40 3,46 3,33 F (Art) 0,14 6,54 4,31 3,04 2,66 Tab. 4.5: Chromatidbrüche pro Metaphase nach Inkubation mit dem Chk1/2-Inhibitor SB In allen Zelllinien treten mit zunehmender Reparaturzeit weniger Chromatidbrüche auf (Abb. 4.20A und 4.20B). WT-Zellen besitzen 2h nach Bestrahlung ~ 3 Chromatidbrüche, und zwischen 8h und 12h bildet sich ein Plateau bei ~ 1 Bruch pro Zelle aus (Abb. 4.20A). In den Artemis-Zellen ist zu allen Zeiten eine Erhöhung um 1-2 Chromatidbrüche pro mitotischer Zelle gegenüber den WT-Zellen zu finden. Bei längeren Zeiten (8h und 12h) bildet sich auch in diesen Zellen ein Plateau aus, welches mit 2 Chromatidbrüchen pro mitotischer Zelle etwa doppelt so hoch liegt wie das der WT-Zellen. Obwohl aus den Studien in G0-Zellen bekannt ist, dass AT- und Artemis-Zellen einen identischen Reparaturdefekt aufweisen, zeigen die Reparaturkinetiken für diese beiden Zellen hier große Unterschiede. In den AT-Zellen ist die Anzahl der Brüche nochmals signifikant höher als bei Artemis-Zellen. Der Abfall der Kinetiken ist hier im Vergleich zu den anderen Zelltypen am steilsten. Bei längeren Reparaturzeiten nähern sich die AT-Kinetiken den Kurven der Artemis-Zelllinien an. Dieselben Studien wurden unter Aufhebung des G2/M-Checkpoints durchgeführt. Die Zugabe des Chk1/2-Inhibitors SB zu AT-Zellen führt zu keinem weiteren Anstieg der

97 Ergebnisse 87 Abb. 4.20: Chromosomenbruchanalyse in der Mitose mittels Colcemid nach 1Gy Röntgenstrahlung. Aufgetragen sind die Chromatidbrüche pro Zelle 2h, 4h, 6h, 8h und 12h nach Bestrahlung. Die Experimente wurden in Anwesenheit von Aphidicolin durchgeführt. Die Kontrollen wurden abgezogen. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler aller Metaphasen aus 2-5 unabhängigen Experimenten dar. (A) Chromatidbrüche pro mitotischer Zelle ohne Inhibierung des G2/M-Checkpoints. (B) Chromatidbrüche pro mitotischer Zelle in Anwesenheit des Chk1/2-Inhibitors SB chromosomalen Brüche in der Mitose (Abb. 4.20B), da in AT-Zellen der G2/M-Checkpoint bereits defekt ist. Eine Inhibierung des Checkpoints in Artemis-Zellen bewirkt dagegen, dass das Niveau an mitotischen Chromatidbrüchen auf das Niveau von AT-Zellen angehoben wird. Die Checkpoint-inhibierten WT-Zellen zeigen eine Erhöhung der Chromatidbrüche, jedoch steigt die Anzahl der Brüche nicht auf das Niveau der AT-Zellen. Das alleinige Ausschalten des G2/M-Checkpoints scheint somit das hohe Niveau an Brüchen in AT-Zellen nicht zu erklären. Ein zusätzliches Ausschalten des ATM-abhängigen G2/M-Checkpoints zu dem in Artemis-Zellen bereits vorhandenen Reparaturdefekt bewirkt eine Erhöhung der Chromatidbrüche auf das Niveau der AT-Zellen, so dass zumindest in dieser Art der Analyse beide Zelltypen denselben Phänotyp zeigen. Dies ist erneut ein Hinweis darauf, dass AT- und Artemis-Zellen tatsächlich denselben Reparaturdefekt besitzen. Des Weiteren kann man daraus schließen, dass die Abb. 4.20A beschriebene Differenz zwischen AT- und Artemis- Zellen auf den Checkpointdefekt der AT-Zellen zurückzuführen ist.

98 Ergebnisse Abschätzung der Gesamtzahl an mitotischen Brüchen einer in der G2-Phase bestrahlten Zellpopulation Ein neues Konzept zur Betrachtung von Chromosomenaberrationen Die Ergebnisse der chromosomalen Studien in der Mitose deuteten darauf hin, dass sowohl die Reparatur- als auch die Checkpointfunktion von ATM einen Beitrag zur Erhaltung der genomischen Integrität leisten. Bei der Auswertung der chromosomalen Daten in der Mitose fiel auf, dass die Anzahl der in die Mitose progressierenden Zellen zwischen den einzelnen Zelllinien und Reparaturzeiten stark variierte, was bereits anhand der in unserer Arbeitsgruppe durchgeführten phosphoh3-experimente ersichtlich war (vgl. Kap , Abb. 4.15). Diese Beobachtung führte zu der Überlegung, dass für eine Beurteilung des Beitrags von Reparatur- und Checkpointfunktion zur Erhaltung der chromosomalen Stabilität nicht nur die Anzahl der Brüche pro mitotischer Zelle sondern auch die Anzahl an Zellen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Mitose auftreten, von Relevanz ist. Um die Anzahl an mitotischen Zellen zu einem Zeitpunkt abzuschätzen, wurden im Folgenden Untersuchungen zum Zellzyklusverhalten der verschiedenen Zellsysteme nach Bestrahlung in der G2-Phase durchgeführt. Diese Ergebnisse wurden mit den chromosomalen Daten verrechnet, um die Anzahl mitotischer Brüche hochgerechnet auf eine Population bestrahlter G2-Zellen zu erhalten Abschätzung der Gesamtzahl mitotischer Brüche anhand durchflusszytometrischer Untersuchung BrdU-markierter G2-Zellen nach ionisierender Bestrahlung In den chromosomalen Studien in der Mitose bewirkte die Zugabe eines Spindelgifts, dass Zellen, welche in der G2-Phase bestrahlt wurden, in der Mitose über ein bestimmtes Zeitintervall akkumuliert wurden. Um die Anzahl an Zellen, welche innerhalb des entsprechenden Zeitintervalls in die Mitose progressierten, zu erhalten, wurde im Folgenden ein Ansatz gewählt, durch den die Abnahme der bestrahlten G2-Zellen gemessen werden kann. Dies stellt ein Maß für die sich innerhalb eines Zeitintervalls teilenden und somit die Mitose passierenden Zellen dar. Dazu wurden exponentiell wachsende WT-, Artemis- und AT-Zellen für 1h mit BrdU markiert. Nach 4h (wenn die BrdU-markierten S-Zellen nach G2 fortgeschritten sind, vgl. Kapitel 4.2.1) wurden die Zellen mit 1Gy bestrahlt und nach 2h, 4h, 6h, 8h, 10h und 12h für die Durchflusszytometrie fixiert und mit Antikörpern gegen BrdU gefärbt. Die Zugabe des Chk1/2-Inhibitors SB erfolgte bei den entsprechenden Proben

99 Ergebnisse 89 30min vor Bestrahlung. Bei diesen Experimenten war es nicht notwendig, die Zellen in Gegenwart von Aphidicolin wachsen zu lassen, da sich die Auswertung auf die BrdUpositiven Zellen beschränkte, die zum Zeitpunkt der Bestrahlung in der G2-Phase waren. Nach der Bestrahlung aus der S- in die G2-Phase progressierende Zellen waren BrdU-negativ und gingen nicht in die Auswertung mit ein. Ausgewertet wurde jeweils der Anteil der BrdUpositiven spät-s/g2-zellen von allen BrdU-positiven Zellen (Abb. 4.21). Abb. 4.21: Durchflusszytometrische Untersuchung des G2/M-Checkpoints nach BrdU-Inkorporation. Die Bestrahlung mit 1Gy erfolgte 4h nach einer 1stündigen BrdU- Pulsmarkierung. Die Zellen wurden 2h, 4h, 6h, 8h, 10h und 12h nach der Bestrahlung fixiert und im Durchflusszytometer vermessen. Aufgetragen ist jeweils der Anteil der BrdUpositiven späts/g2-zellen an den BrdU-positiven Zellen. In durchbrochenen Linien sind die Daten der unbestrahlten Zellen aus Abb. 4.6A eingefügt. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler von 2-4 unabhängigen Experimenten dar. Zum Zeitpunkt der Bestrahlung befanden sich bei allen Zelllinien ~ 90% der BrdU-positiven Zellen in der späten S- oder G2-Phase. Unbestrahlte Zellen zeigen innerhalb von 4h-6h einen Abfall der G2-Zellen auf ~ 50%, d.h. die BrdU-positiven Zellen progressieren in die G1- Phase. Bei bestrahlten WT-Zellen verzögert sich dieser Abfall um 4h, da hier der G2/M- Checkpoint aktiviert wurde. 12h nach Bestrahlung befinden sich etwa 90% der in G2 bestrahlten Zellen wieder in der G1-Phase. Artemis-Zellen zeigen nach Bestrahlung ebenfalls die Initiation des Checkpoints sowie eine um 2h verlängerte Aufrechterhaltung gegenüber dem WT. 12h nach Bestrahlung haben sich hier etwa 70% der BrdU-positiven Zellen geteilt. Bei den AT-Zellen sowie dem Checkpoint-inhibierten WT ist ein kontinuierlicher Abfall der BrdU-positiven G2-Zellen zu sehen. Dies zeigt, dass der G2/M-Checkpoint nicht initiiert wurde. Dabei verlangsamt sich ab 6h die Abnahme der BrdU-positiven späts/g2-zellen der AT-Zellen gegenüber den Checkpoint-defizienten WT-Zellen, was auf das Einsetzen eines späteren G2/M-Checkpoints in AT-Zellen hinweisen könnte. Dies führt dazu, dass 12h nach Bestrahlung bei der AT-Zelllinie etwa 75% der BrdU-positiven Zellen in die G1-Phase progressiert sind. Bei den Checkpoint-inhibierten WT-Zellen sowie den unbestrahlten Proben

100 Ergebnisse 90 ist der Anteil der G2-Zellen an den BrdU-positiven Zellen bereits nach 8h auf < 20% gesunken. Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, dass sich nach Bestrahlung innerhalb eines Zeitraums von 12h in allen Zelllinien ein Großteil der BrdU-positiven Zellen geteilt haben. Weiterhin wurde bestätigt, dass Artemis-Zellen im Gegensatz zu AT-Zellen einen intakten G2/M-Checkpoint besitzen und diesen im Vergleich zu WT-Zellen länger aufrechterhalten. Anhand dieser Daten sollte nun die Gesamtzahl an mitotischen Brüchen berechnet werden, welche eine in der G2-Phase bestrahlte Zellpopulation aufweist. Dafür wurde anhand der FACS-Daten die Anzahl an Zellen bestimmt, welche in dem Zeitintervall zwischen zwei Messpunkten in die Mitose progressieren. Dabei wurde zunächst die Differenz der BrdUpositiven späts/g2-zellen zwischen zwei aufeinander folgenden Erntezeitpunkten bestimmt. Diese Differenz stellt ein Maß für den Anteil der Zellen dar, der innerhalb dieses Zeitintervalls die Mitose durchläuft (Abb. 4.22A). Die dabei erhaltenen Kurven lassen erkennen, dass sich bei den WT-Zellen die meisten Zellen zwischen 4h und 8h, bei den Abb. 4.22: Bestimmung der Gesamtzahl an mitotischen Brüchen unter Berücksichtigung der mittels BrdU- Inkorporation gewonnenen durchflusszytometrischen Daten für HSF1, F und AT1BR. (A) Relative Abnahme der BrdU-positiven späts/g2-zellen nach einer Bestrahlung mit 1Gy. Die relative Abnahme wurde aus der Differenz der BrdU-positiven späts/g2-zellen zweier aufeinander folgender Erntezeitpunkte errechnet (z.b. für das Zeitintervall 4-6h wurde die Differenz der BrdU-positiven späts/g2-zellen aus Abb zwischen dem 4h- und dem 6h-Punkt gebildet). (B) Abschätzung der Gesamtanzahl an mitotischen Brüchen einer in der G2-Phase bestrahlten Population von 1000 Zellen. Die Gesamtzahl an mitotischen Brüchen für die jeweiligen Zeitintervalle wurde folgendermaßen errechnet: Anzahl der mitotischen Brüche pro Zelle * relative Abnahme der BrdU-positiven späts/g2-phase * 1000 G2-Zellen. Für das Zeitintervall 8-10h wurden die Brüche pro mitotischer Zelle aus dem 8h- und dem 12h- Punkt interpoliert.

101 Ergebnisse 91 Artemis-Zellen zwischen 6h und 10h nach der Bestrahlung teilen. Somit liegt bei den Artemis-Zellen eine Zeitverzögerung von 2h gegenüber dem WT vor. In den AT-Zellen bleibt der Abfall der BrdU-positiven späts/g2-zellen zu allen Zeiten nahezu konstant und schwankt nur geringfügig im Rahmen der Messgenauigkeit. Um nun die Anzahl mitotischer Brüche pro 1000 bestrahlter G2-Zellen zu berechnen, wurde der Wert der relativen Abnahme mit der Anzahl der chromosomalen Brüche pro mitotischer Zelle des jeweiligen späteren Zeitpunkts multipliziert (Kapitel 4.2.5, Abb. 4.20) und auf 1000 bestrahlte G2-Zellen normiert (x1000). Die erhaltenen Bruchzahlen der WT-Zellen steigen im Zeitintervall von 4h-6h an, erreichen zwischen 6h und 8h ihr Maximum und fallen zu späteren Zeiten wieder ab (Abb. 4.22B). Bei den Artemis-Zellen treten die meisten mitotischen Brüche zwischen 6h und 10h auf, d.h. wiederum etwa 2h später als bei den WT-Zellen. AT-Zellen zeigen die meisten mitotischen Brüche nach kurzen Reparaturzeiten, wobei hier das Schadensniveau etwa 10mal höher liegt als bei den Artemis- und den WT-Zellen. Nach längeren Reparaturzeiten fällt die Kurve der AT-Zellen annähernd kontinuierlich ab. Diese Analyse zeigt, dass in Checkpoint-profizienten Zellen die meisten Brüche in der Mitose zu den Zeiten auftreten, zu denen der G2/M-Checkpoint aufgehoben wird. Dies geschieht bei den Reparatur-defizienten Artemis-Zellen ~ 2h später als bei WT-Zellen. AT-Zellen bilden den Großteil an mitotischen Brüchen zu kurzen Zeiten nach Bestrahlung aus, da zu diesen Zeiten aufgrund der Checkpoint-Defizienz die meisten Zellen in die Mitose progressieren Abschätzung der Gesamtzahl mitotischer Brüche mittels phosphoh3-analyse von in der G2-Phase bestrahlten Zellen Die Verrechnung der FACS-Daten nach BrdU-Einbau mit den chromosomalen Daten zeigte, dass die meisten Brüche in der Mitose zu den Zeitpunkten auftreten, zu denen die Abnahme der BrdU-positiven späts/g2-zellen am größten ist. Dies geschieht bei den Reparaturdefizienten Artemis-Zellen zu einem späteren Zeitpunkt als bei den WT-Zellen. Mit der Methode der FACS-Analyse nach BrdU-Inkorporation lässt sich der Anteil an Zellen bestimmen, welcher sich innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls teilt. Dabei ist jedoch keine Unterscheidung zwischen G2- und mitotischen Zellen möglich. Da die Mitose ebenfalls eine gewisse Zeitspanne umfasst, sind die Ergebnisse bei der Quantifizierung der BrdUpositiven G2-Zellen gegenüber der direkten Messung der mitotischen Zellen leicht zeitversetzt. Um die Ergebnisse zu validieren, wurde daher direkt der Anteil mitotischer Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt mittels phosphoh3-analyse gemessen.

102 Ergebnisse 92 Abb. 4.23: DotPlots einer phosphpoh3-analyse zur Bestimmung des MI s. Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 1Gy bestrahlt und mit Aphidicolin versetzt. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit Antikörpern gegen phosphoh3 sowie mit PI gefärbt. Auf der Abszisse ist linear und dimensionslos der DNA-Gehalt anhand des PI-Signals aufgetragen. Auf der Ordinate ist dimensionslos und logarithmisch die phosphoh3-intensität dargestellt. Die Ellipsen markieren die mitotischen Zellen, welche phosphoh3-positiv sind und einen doppelten DNA-Gehalt besitzen. Dargestellt sind eine unbestrahlte Kontrolle sowie Proben, welche 2h, 4h und 8h nach Bestrahlung mit 1Gy fixiert wurden. In diesen Experimenten wurden analog zu den bisherigen chromosomalen Studien exponentiell wachsende WT-, AT- und Artemis-Zellen mit 1Gy bestrahlt und unter Anwesenheit von Aphidicolin inkubiert. Zusätzlich wurden WT-Zellen mitgeführt, welche 30min vor der Bestrahlung sowie während der gesamten Inkubationszeit dem Chk1/2- Inhibitor SB ausgesetzt waren. Die Zellen wurden nach 2h, 4h, 6h, 8h, 10h und 12h geerntet, mit Antikörpern gegen phosphoh3 gefärbt und im Durchflusszytometer vermessen (Abb. 4.23). In Abb ist der Zeitverlauf des MI s der verschiedenen Zelllinien abgebildet. Dabei wurden alle Werte auf eine unbestrahlte Kontrolle zum Zeitpunkt 0h normiert. Es ist zu erkennen, dass in WT- und Artemis-Zellen der MI 2h nach Bestrahlung auf < 20% abfällt. Dies zeigt, dass hier der G2/M-Checkpoint initiiert wurde und nur noch sehr wenige Zellen

103 Ergebnisse 93 aus der G2-Phase in die Mitose progressieren. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den bereits früher in unserer Arbeitsgruppe erhaltenen Daten (vgl. Kap , Abb. 4.15). In WT-Zellen steigt der MI bereits zwischen 4h und 6h wieder an, d.h. in diesem Zeitraum wird der G2/M-Checkpoint aufgehoben und die Zellen treten wieder in die Mitose ein. Nach 8h fällt der MI bei WT-Zellen ab, da sich nun die meisten zum Zeitpunkt der Bestrahlung in der G2-Phase befindlichen Zellen geteilt haben und aufgrund der Anwesenheit von Aphidicolin keine Zellen aus der S-Phase nachkommen. In Artemis-Zellen bleibt der MI bis 6h auf sehr niedrigem Niveau, um erst bei 8h anzusteigen. Hier lässt sich nach 10h wieder ein Abfall erkennen. Artemis-Zellen zeigen bei der Wiederaufnahme des Zellzyklus somit gegenüber dem WT eine Verzögerung von etwa 2h. Bei AT-Zellen sowie den mit dem Chk1/2-Inhibitor behandelten WT-Zellen ist kein Einsetzen des G2/M-Checkpoints zu erkennen. Da aufgrund des Aphidicolins keine Zellen aus der S-Phase in die G2-Phase progressieren, fällt bei diesen Zellen der MI kontinuierlich ab. Abb. 4.24: Untersuchung des G2/M- Checkpoints durch phosphoh3-analyse nach einer Bestrahlung mit 1Gy. Direkt nach Bestrahlung wurde Aphidicolin zugegeben. Nach 2h, 4h, 6h, 8h, 10h und 12h wurden die Zellen fixiert und im Durchflusszytometer der Anteil der mitotischen Zellen bestimmt. Die Werte wurden auf eine unbestrahlte Kontrolle normiert. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler von 2-5 unabhängigen Experimenten dar. In diesem Ansatz konnte somit erneut gezeigt werden, dass der G2/M-Checkpoint bei WTund Artemis-Zellen sehr schnell nach der Bestrahlung initiiert wird und Artemis-Zellen zusätzlich einen längeren Arrest in der G2-Phase aufweisen. Bei AT-Zellen sowie Checkpoint-inhibierten WT-Zellen wird dagegen der G2/M-Checkpoint nach Bestrahlung nicht initiiert. Um die FACS-Daten mit den Chromosomendaten verrechnen zu können, wurde im Folgenden anhand dieser phosphoh3-daten abgeschätzt, wie groß der zu den jeweiligen Zeiten in die Mitose progressierende Anteil der in der G2-Phase bestrahlten Zellen ist. Da beobachtet wurde, dass der G2-Anteil bei exponentiell wachsenden AT-Zellen wesentlich

104 Ergebnisse 94 höher liegt als bei WT- und Artemis-Zellen und daher im betrachteten Zeitintervall mehr Zellen in die Mitose progressieren, wurde der relative Anteil an mitotischen Zellen zu den jeweiligen Zeitpunkten bestimmt. Dazu wurden die MI s der einzelnen Zeitpunkte durch die Summe der MI s aller Zeiten dividiert (Abb. 4.25A). Durch diese Umrechnung ändert sich die Lage der Kurve der AT-Zellen, welche nun relativ zu den Kurven der WT- und der Artemis- Zelllinie niedriger liegt. Die Kurve der Artemis-Zellen befindet sich im Vergleich zu der WT- Zelllinie auf einem geringfügig höheren Niveau (vgl. Abb. 4.22). Weiterhin wurde berücksichtigt, dass sich die G2/M-Population auch 12h nach Bestrahlung nicht zu 100% geteilt hat. Die Größe der Population, welche im Zeitfenster zwischen 0h und 12h nach Bestrahlung die Mitose durchläuft, unterscheidet sich dabei zwischen den Zelllinien. Der Anteil dieser Zellen wurde anhand der Differenz des 0h-Punkts und des 12h-Punkts der BrdU-positiven späts/g2-zellen bestimmt (Kapitel , Abb. 4.21). Dieser Anteil lag bei den WT-Zellen bei 91%, bei den AT-Zellen bei 77,5% und bei den Artemis-Zellen bei 68,5% und ging als Korrekturfaktor in die folgende Berechnung ein. Um schließlich eine Abschätzung der Anzahl an mitotischen Brüchen zu einem bestimmten Zeitpunkt treffen zu können, wurde die gemessene Anzahl der Brüche pro mitotischer Zelle Abb. 4.25: Bestimmung der Gesamtzahl an mitotischen Brüchen unter Berücksichtigung der mittels phosphoh3- Analyse gewonnen durchflusszytometrischen Daten für HSF1, AT1BR und F (A) Relativer Anteil mitotischer Zellen 2h, 4h, 6h, 8h, 10h und 12h nach einer Bestrahlung mit 1Gy. Der relative Anteil mitotischer Zellen wurde folgendermaßen errechnet: MI eines Zeitpunkt / Summe der MI aller Zeitpunkte. (B) Abschätzung der Gesamtanzahl an mitotischen Brüchen einer in der G2-Phase bestrahlten Population von 1000 Zellen. Die Gesamtanzahl an mitotischen Brüchen für die jeweiligen Zeitpunkte wurde folgendermaßen errechnet: Anzahl der mitotischen Brüche pro Zelle * relativer MI * Korrekturfaktor * 1000 G2-Zellen. Für das Zeitintervall 8-10h wurden die Brüche pro mitotischer Zelle aus dem 8h- und dem 12h-Punkt interpoliert.

105 Ergebnisse 95 (Kapitel 4.2.5, Abb. 4.20) mit dem relativen Anteil an mitotischen Zellen multipliziert (Abb. 4.25A). Dieses Produkt wurde anschließend mit dem Korrekturfaktor multipliziert und auf 1000 G2-Zellen normiert (x1000). Die errechneten Werte für die jeweiligen Zeitpunkte und Zelllinien sind in Abb. 4.25B dargestellt. Die WT-Zellen besitzen bezogen auf 1000 G2- Zellen bis 4h nach Bestrahlung weniger als 200 Brüche. 6h nach Bestrahlung ist ein Anstieg der Bruchzahlen auf ~ 300 Brüche pro 1000 G2-Zellen zu erkennen. Zu diesem Zeitpunkt treten die meisten Zellen in die Mitose ein (Abb. 4.25A). Entsprechend zu dem ab 8h abfallenden MI sowie der geringeren Bruchzahlen pro Mitose fällt nach längeren Reparaturzeiten die Gesamtbruchzahl ab (Abb. 4.25B). Der Kurvenverlauf der Artemis-Zellen ähnelt dem der WT-Zellen. Die Artemis-Zellen besitzen zu den frühen Zeiten ein ähnliches Niveau an mitotischen Brüchen wie die WT-Zellen. Das Maximum ist allerdings erst nach 8h zu erkennen und übertrifft aufgrund des höheren MI s sowie der höheren Anzahl an Brüchen pro mitotischer Zelle mit etwa 370 Brüchen das Maximum der WT-Zellen. Im Gegensatz zu WTund Artemis-Zellen besitzen AT-Zellen nach 2h etwa 1400 mitotische Brüche pro 1000 G2- Zellen. Bei längeren Zeiten fällt die Kurve stetig ab. Somit konnte auch mit dieser Methode gezeigt werden, dass in WT- und Artemis-Zellen nach Bestrahlung in der G2-Phase die meisten Chromosomenbrüche zu den Zeiten in der Mitose auftreten, zu denen der G2/M-Checkpoint aufgehoben wird. Da AT-Zellen Checkpointdefizient sind, weisen diese die meisten Brüche direkt nach Bestrahlung auf. Bei diesen Experimenten fand keine Akkumulation der mitotischen Zellen durch ein Spindelgift statt. Pilotexperimente hatten gezeigt, dass die Zugabe von Colcemid oder Nocodazol eine Verzögerung beim Eintritt in die Mitose bewirkt (s. Anhang I). Die vorher gemessene Differenz beim Eintritt in die Mitose zwischen WT- und Artemis-Zellen konnte daher nicht mehr detektiert werden, was zu einer Verfälschung der Ergebnisse geführt hätte. Daher wurden die phosphoh3-analysen unter Anwesenheit eines Spindelgifts nicht zur Berechnung der Gesamtbruchzahl herangezogen. Basierend auf den Daten anhand zweier methodisch verschiedener Arten der FACS-Analyse sowie chromosomaler Analysen in der Mitose wurde die Anzahl mitotischer Brüche pro 1000 bestrahlter G2-Zellen ermittelt. Beide Methoden führten zu dem Ergebnis, dass bei Checkpoint-profizienten WT- und Artemis-Zellen der Großteil der Brüche zu den Zeiten in der Mitose auftritt, zu denen der G2/M-Checkpoint aufgehoben wird. Dabei konnte gezeigt werden, dass der G2/M-Checkpoint nach Bestrahlung in einem Großteil der Zellen bereits zu Zeiten aufgehoben wird, zu denen jede Zelle 1-2 unreparierte Chromosomenbrüche aufweist. Dies geschieht in Artemis-Zellen ca. 2h später als in WT-Zellen. Die Aufrechterhaltung des

106 Ergebnisse 96 G2/M-Checkpoints scheint somit mit der Höhe der applizierten Dosis bzw. dem Reparaturvermögen der jeweiligen Zelllinie zu korrelieren. Checkpoint-defiziente Zellen besitzen dagegen die meisten mitotischen Brüche zu kurzen Zeiten nach Bestrahlung Weiterführende Pilot-Experimente und Ausblick Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Wirkung niedriger Dosen IR in Bezug auf die Entstehung von Chromsomenaberrationen. Dabei konnte gezeigt werden, dass bereits eine Bestrahlung von 250mGy ausreicht, um die Aberrationsrate einer Zellpopulation signifikant zu erhöhen (vgl. Kap und Kap ). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass bereits diese geringe Dosis ausreicht, um die Proliferationsrate zu beeinflussen, was auf eine hohe Sensitivität des G1/S-Checkpoints schließen lässt (vgl. Kap ). Diese Ergebnisse führten zu Studien über das Zusammenspiel von Reparatur und Zellzykluskontrolle im Hinblick auf die Vermeidung von Chromosomenaberrationen, welches im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht wurde. Dabei konnte gezeigt werden, dass der G2/M-Checkpoint nach Bestrahlung bereits aufgehoben wird, bevor alle induzierten DSBs repariert wurden. Dies warf die Frage nach der Sensitivität des G2/M-Checkpoints auf. In Pilot-Experimenten sollte jetzt weiterführend untersucht werden, welchen Einfluss die Höhe der Dosis und somit die Anzahl der induzierten DSBs auf die Induktion des ATM-abhängigen G2/M-Checkpoints hat. Weiterhin stellte sich die Frage, welche Auswirkungen diese unreparierten Brüche auf das Wachstum der Zellen in der nachfolgenden Zellzyklusphase haben. Die Sensitivität des G2/M-Checkpoints wurde anhand dessen Induktion in Abhängigkeit von der Dosis untersucht. In diesen Experimenten wurden exponentiell wachsende WT-Zellen (MRC-5, HSF1) mit Dosen von 0,1Gy-1Gy bestrahlt. Da sich bereits zum Zeitpunkt der Bestrahlung Zellen in der Mitose befinden und die Induktion selbst eine gewisse Zeit benötigt, konnte die Induktion des Checkpoints nicht direkt nach der Bestrahlung gemessen werden, sondern erst zu einem Zeitpunkt, zu dem sich die in der Mitose bestrahlten Zellen geteilt haben. Die Proben wurden daher 1h nach Bestrahlung fixiert, mit dem phosphoh3- Antikörper gefärbt und im FACS vermessen (Abb. 4.26). Bei einer Dosis von 100mGy sinkt der MI im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle auf ~ 80% ab. Daraus ist ersichtlich, dass nur ein geringer Teil der Zellen den G2/M-Checkpoint induziert oder ein größerer Teil ihn induziert und bereits wieder aufgehoben hat. Mit steigender Dosis sinkt der MI weiter ab. Erst ab einer Dosis von 0,8Gy-1Gy ist er mit ~ 80%

107 Ergebnisse 97 Abb : phosphoh3-untersuchungen zur Induktion des G2/M-Checkpoint in Abhängigkeit von der Dosis. Exponentiell wachsende WT-Zellen (MRC-5 und HSF1) wurden mit 0,1Gy, 0,2Gy, 0,3Gy, 0,4Gy, 0,5Gy, 0,8Gy und 1Gy bestrahlt und nach 1h für die Durchflusszytometrie fixiert. Die Werte sind normiert auf eine unbestrahlte Kontrolle zum Zeitpunkt 0h. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 2 unabhängigen Experimenten dar. bei einem Großteil der Zellen vollständig induziert. Die Induktion des ATM-abhängigen G2/M-Checkpoints erfolgt somit im Bereich < 0,8Gy in Abhängigkeit von der Dosis und ist bei Dosen < 0,3Gy sehr gering. Da selbst bei 0,1Gy noch ~ 4-5 DSBs pro Zelle induziert werden, ist dies ein Anzeichen dafür, dass der G2/M-Checkpoint nicht sehr sensitiv auf DSBs reagiert. Nachdem gezeigt werden konnte, dass sich die Mehrheit einer in der G2-Phase bestrahlten Zellpopulation mit DSBs teilt, stellte sich die Frage, wie sich dies auf das Proliferationsverhalten der Population in der darauf folgenden Zellzyklusphase auswirkt. Da primäre humane Fibroblasten im Vergleich zu transformierten Zellen eine relativ geringe Proliferationsrate aufweisen, wurden die nachfolgenden Experimente mit htertimmortalisierten WT- und Artemis-Fibroblasten durchgeführt (82-6hTert bzw. CJ179hTert). Exponentiell wachsende Zellen wurden für 1h mit BrdU markiert und nach 4h mit 1Gy Röntgenstrahlung bestrahlt. Zu diesem Zeitpunkt waren bei beiden Zelllinien etwa 80% der BrdU-positiven in der G2-Phase. Parallel wurden unbestrahlte Kontrollen mitgeführt. 12h nach Bestrahlung lag der G2-Anteil der BrdU-positiven Zellen sowohl bei den unbestrahlten als auch bei den bestrahlten Proben unter 20%, d.h. mehr als 80% der während der Bestrahlung in der G2-Phase befindlichen Zellen hatten sich geteilt und befanden sich in der G1-Phase. Zu diesem Zeitpunkt wurde Nocodazol zugegeben. Dadurch konnten die proliferierenden Zellen in der darauf folgenden G2/M-Phase akkumuliert werden (Abb. 4.27). Die mit 1Gy bestrahlten Zellen zeigen gegenüber den unbestrahlten Zellen eine deutliche Verzögerung beim Wiedereintritt in den Zellzyklus. Während bei den unbestrahlten Proben beider Zelllinien der G2-Anteil 36h nach Bestrahlung wieder auf über 60% angestiegen ist,

108 Ergebnisse 98 Abb. 4.27: Untersuchung des G1/S-Checkpoints nach BrdU- Inkorporation und Bestrahlung in der G2-Phase. Exponentiell wachsende WT- und Artemis-Zellen wurden 1h mit BrdU markiert und 4h später mit 1Gy bestrahlt oder unbestrahlt belassen. 12h nach Bestrahlung wurde Nocodazol zugegeben. Zu den angezeigten Zeiten nach Bestrahlung wurden die Zellen fixiert und der Anteil der BrdUpositiven G2-Zellen im FACS ermittelt. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler von 2-3 unabhängigen Experimenten dar. liegt der Anteil bei den bestrahlten WT-Zellen nur bei ~ 40%. Bestrahlte Artemis- Zellenzeigen mit einem G2-Anteil von nur etwa 25% eine noch größere Verzögerung. Dass nach Bestrahlung in G2 weniger Zellen in der Lage sind, im darauf folgenden Zellzyklus erneut die G2-Phase zu erreichen, könnte darauf hindeuten, dass aufgrund der verbleibenden Brüche die Zellen nur sehr eingeschränkt in der Lage sind, einen erneuten Zellzyklus zu durchlaufen. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die Zellen nach Bestrahlung in G2 die G1-Phase mit einer Vielzahl an Brüchen erreichen. Diese Experimente geben Hinweise darauf, dass sich der G1/S-Checkpoint und der G2/M- Checkpoint in ihrer Sensitivität unterscheiden. Während der G2/M-Checkpoint durch einen Schwellenwert von 1-2 Chromosomenbrüchen charakterisiert zu sein scheint, könnte der G1/S-Übergang anders funktionieren. In zukünftigen Experimenten sollen die beiden Checkpoints im Hinblick auf ihre Sensitivität und Regulation genauer charakterisiert werden. Dies könnte Rückschlüsse auf ihre Funktion im Zellzyklus ermöglichen. Weiterhin würde dies weitere Einblicke in die Entstehung chromosomaler Instabilität und erhöhter Strahlensensitivität von Reparatur- und Checkpoint-defizienten Zellen ermöglichen.

109 Diskussion Diskussion 5.1. Dosis-Effekt-Kurve im Niedrig-Dosis-Bereich Der erste Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Entstehung von Chromosomenaberrationen im Niedrig-Dosis-Bereich und wurde im Rahmen eines Projekts zur Erforschung der biologischen Wirkung niedriger Dosen IR durchgeführt. Die Relevanz dieses Forschungsgebiets liegt vor allem im Strahlenschutz begründet, die Ergebnisse lassen jedoch auch Rückschlüsse auf Mechanismen zu, welche der Entstehung von Chromosomenaberrationen zugrunde liegen. Aus diesem Grund wurden Dosis-Effekt-Kurven für Chromosomenaberrationen im Dosis-Bereich unterhalb 1Gy Röntgenstrahlung gemessen Vor- und Nachteile der Methode zur Messung von Chromosomenaberrationen im Niedrig-Dosis-Bereich Da die Effekte nach niedrigen Dosen erfahrungsgemäß sehr gering sind, wurde ein Testsystem benötigt, welches die Auswertung einer hohen Anzahl an Chromosomenspreitungen mit einem angemessenen Arbeitsaufwand ermöglichte. Um diese Messungen im Niedrig-Dosis-Bereich durchführen zu können, war die Optimierung verschiedener Parameter notwendig. Im Gegensatz zu den meisten klassischen Chromosomenstudien wurden in dieser Arbeit die Chromosomen nicht in der Mitose durch ein Spindelgift akkumuliert, sondern bereits in der G2-Phase chemisch zur Kondensation angeregt. Da sich zu einem Zeitpunkt wesentlich mehr Zellen in der G2-Phase als in der Mitose befinden, führte die Methode der PCC zu einer Erhöhung der Ausbeute an Chromosomenspreitungen und verringerte somit die Anzahl an Objektträgern, welche hybridisiert und ausgewertet werden mussten. Das Abscannen der Objektträger sowie die Aufnahme der Chromosomenspreitungen erfolgten automatisch, während die Auswertung der Bilder manuell durchgeführt wurde. Auf diese Weise war es letztendlich möglich, insgesamt ~ Chromosomenspreitungen zu erhalten, welche in die Auswertung eingingen. Hybridisiert wurden lediglich die Chromosomen 1, 2 und 4, wodurch ~ 22% des Genoms abgedeckt waren. Hierbei ist der Anteil an detektierbaren Translokationen pro gefärbter DNA-Menge, d.h. sowohl von Austäuschen zwischen gefärbten Chromosomen als auch von Austäuschen zwischen gefärbten und nicht gefärbten Chromosomen, mit ~ 35% relativ hoch (Lucas et al., 1992). Die Effizienz der Translokationsdetektion steigt bei einer Hybridisierung weiterer Chromosomen nur in geringerem Maße an. In dieser Arbeit wurden

110 Diskussion 100 in einem Testexperiment alle 46 Chromosomen mit spezifischen Sonden hybridisiert. Dies ermöglichte die Visualisierung einer wesentlich höheren Anzahl an Aberrationen pro Zelle und resultierte somit in einer Verringerung der zu betrachtenden Chromosomenspreitungen. Zur Auswertung mussten jedoch Karyogramme erstellt werden, was sich schließlich als weniger effizient erwies. Die Erstellung von Karyogrammen war bei einer Hybridisierung von drei Chromosomen nicht notwendig. Die meisten bisherigen Studien wurden an Lymphozyten, Krebszellen oder transformierten Zelllinien durchgeführt, welche häufig genetisch instabil sind. Die hier verwendeten Zellen waren htert-immortalisierte humane Fibroblasten. Durch die Immortalisierung wird die katalytische Untereinheit der Telomerase überexprimiert, was der Verkürzung der Telomere bei der Zellteilung entgegenwirkt. Dadurch verlängert sich die Lebensdauer der Zelllinie, und die Proliferationsrate wird positiv beeinflusst (Morales et al., 1999). Es konnte gezeigt werden, dass htert-immortalisierte humane WT-Zellen einen stabilen Karyotyp besitzen und weder spontan noch nach IR eine genomische Instabilität entwickeln. Des Weiteren wurde berichtet, dass die Immortalisierung zu einer Reduktion der spontanen Aberrationsrate führt (Sharma et al., 2003; Pirzio et al., 2004). Mit dieser Zelllinie stand somit ein Zellsystem zur Verfügung, welches einfach zu kultivieren war und durch eine gute Proliferation eine ausreichende Ausbeute an Chromsomenspreitungen lieferte. Wie anhand der FACS- Ergebnisse ersichtlich ist, konnte selbst nach Bestrahlung von G0/G1-Phase-Zellen mit 1Gy nach dem Überimpfen ein Anteil BrdU-positiver G2-Zellen von bis zu 30% erreicht werden. Weiterhin sollte durch eine niedrige Rate an spontanen Aberrationen die Auswertung geringer Strahleneffekte ermöglicht werden. Die verwendete Zelllinie wies weder nach IR noch spontan eine ausgeprägte chromosomale Instabilität auf. Die spontane Translokationsrate lag mit ~ 5 in 1000 Zellen relativ niedrig. Die Anzahl der Brüche lag jedoch wesentlich höher und zeigte starke Schwankungen. Dieser Hintergrundwert erlaubt damit nur eine aussagekräftige Untersuchung in Dosisbereichen, in welchen sich die entstehenden Aberrationen deutlich vom Hintergrundwert unterscheiden. Aufgrund dieser Einschränkung erwies sich dieses Zellsystem letztendlich als ungeeignet für die Untersuchung von Chromosomenaberrationen im Bereich weniger mgy. Daher wurden keine weiteren Experimente bei niedrigeren Dosen durchgeführt. Prinzipiell wäre eine Messung bei noch niedrigeren Dosen wahrscheinlich möglich, jedoch steigt dabei der Arbeitsaufwand, welcher notwendig wäre, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erlangen, in erheblichem Maße. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese Methode geeignet ist, um in dem in dieser Arbeit untersuchten Dosis- Bereich Chromosomenaberrationen zu messen. Für die Untersuchung von Dosis-Effekt-

111 Diskussion 101 Kurven in dem für den Strahlenschutz relevanten Bereich von wenigen mgy ist sie jedoch vermutlich nicht sensitiv genug Dosis-Effekt-Kurven in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung Um die Entstehung von Chromosomenaberrationen in Abhängigkeit von der Dosis zu untersuchen, wurden stationäre humane Fibroblasten mit verschiedenen Dosen 1Gy bestrahlt und nach 24stündiger Reparaturzeit durch Passagieren zum Wachstum angeregt. In der ersten G2-Phase nach Bestrahlung wurden die Chromosomen chemisch kondensiert und die erhaltenen Chromosomenpräparate mit FISH-Sonden gegen die Chromosomen 1, 2 und 4 hybridisiert. Die Quantifizierung unreparierter Brüche sowie kompletter und inkompletter Translokationen ermöglichte die Erstellung von Dosis-Effekt-Kurven. Unbestrahlt treten nahezu keine Translokationen auf, so dass die Gesamtaberrationsrate hauptsächlich aus unreparierten Brüchen besteht. Dies zeigt, dass die verwendete Zelllinie trotz der htert-immortalisierung nicht genomisch instabil ist. Die Anzahl der unreparierten Brüche stellt den unter den hier gewählten Kultivierungsbedingungen auftretenden Hintergrund dar. Nach Bestrahlung konnte ein Anstieg der unreparierten Brüche mit der Dosis verzeichnet werden. Das Auftreten eines postreplikativen Chromosomenbruchs resultiert wahrscheinlich aus einem DSB in der G0/G1-Phase als initialer Läsion. In dieser Phase besteht ein Chromosom aus nur einer Chromatide. Progressiert eine Zelle mit einem DSB in die S-Phase und kann dieser hier nicht repariert werden, liegt er anschließend aufgrund der semikonservativen Replikation auf beiden Chromatiden an derselben Stelle vor, wodurch ein Chromosomenbruch entsteht. Das Auftreten von Chromosomenbrüchen in der G2-Phase zeigt weiterhin, dass trotz der niedrigen Dosen und der langen Reparaturzeit nicht alle DSBs repariert wurden, obwohl in diesen Experimenten eine Reparatur-profiziente WT-Zelllinie verwendet wurde. Der Anstieg der Chromosomenbrüche verläuft nahezu linear mit der Dosis. Dabei liegt der mit 0,25Gy bestrahlte Punkt höher, als eine lineare Extrapolation erwarten ließ. Dieses Verhalten konnte in der Mehrheit der Experimente beobachtet werden, und die Fehlerberechnungen deuten auf eine Signifikanz dieses Ergebnisses hin. Es ist somit unwahrscheinlich, dass es sich hierbei um eine Schwankung aufgrund der zu ungenauen Messmethode handelt. Dies würde bedeuten, dass die Bestrahlung in der G1-Phase mit einer niedrigen Dosis in der darauf folgenden G2-Phase mehr Chromosomenbrüche verursacht als unter der Annahme einer linearen Extrapolation aus den Daten nach einer höheren Dosis zu

112 Diskussion 102 erwarten wäre. Eine mögliche Ursache wäre, dass nach Bestrahlung mit einer höheren Dosis mehr Zellen mit unreparierten DSBs am G1/S-Checkpoint zurückgehalten werden als bei einer geringeren Dosis. Darauf deuten auch die FACS-Studien hin, bei denen eine Abnahme der proliferierenden Population mit zunehmender Dosis beobachtet werden konnte. Eine weitere Erklärung wäre, dass die DSB-Reparatur bei niedrigen Dosen weniger effizient abläuft als nach Bestrahlung mit höheren Dosen. Dies wäre konsistent mit früheren Studien unserer Arbeitsgruppe, welche zeigten, dass durch IR induzierte DSBs in stationären Zellen nicht vollständig repariert werden (Rothkamm & Löbrich, 2003). Noch mehrere Tage nach IR mit Dosen 200mGy wies etwa jede zehnte Zelle einen DSB auf. Analog zu den Chromosomenbrüchen steigen auch die Translokationen annähernd linear mit der Dosis an. Man geht davon aus, dass die initialen Schäden bei der Entstehung von Translokationen DSBs sind. (Cornforth, 1998). Da die Induktionsrate direkt proportional mit der Dosis ansteigt, würde ein linearer Anstieg der Translokationsrate mit der Dosis darauf hindeuten, dass bereits ein DSB für die Entstehung eines Austauschs zwischen zwei Chromosomen ausreicht. Dies wäre möglich, wenn der DSB durch einen rekombinatorischen Mechanismus unter Zuhilfenahme eines ungeschädigten DNA-Bereichs eines nichthomologen Chromosoms repariert würde und es dabei zu einer Fehl-Verknüpfung käme. Die Existenz ausgedehnter repetitiver Sequenzen im humanen Genom könnte die Grundlage für derartige Austauschreaktionen liefern. Dies würde für die Richtigkeit der one-hit-theorie sprechen, welche von einigen Wissenschaftlern favorisiert wird (Chadwick & Leenhouts, 1998). Bei den hier gemessenen Translokationen handelt es sich allerdings um Chromosomenaberrationen, d.h. der Austausch ist auf beiden Chromatiden an derselben Stelle sichtbar. Dies lässt vermuten, dass der Austausch bereits vor der Replikation in der G0/G1- Phase stattgefunden hat. In dieser Phase ist die HR in höheren Eukaryoten nicht aktiv, was sich u. a. darin äußert, dass z.b. das für die Stranginvasion benötigte Rad51 in dieser Zellzyklusphase nicht exprimiert wird (Yamamoto et al., 1996). Der Hauptreparaturweg in der G0/G1-Phase ist das NHEJ, welches auf der Verknüpfung freier Bruchenden beruht. Mit dem linearen Ansteigen der DSBs steigt die Anzahl der DSB- Enden und somit die Anzahl der Kombinationsmöglichkeiten quadratisch an. Die Dosis- Effekt-Kurve müsste demzufolge ebenfalls quadratisch mit der Dosis ansteigen. Für höhere Dosen Röntgenstrahlung ist dies in der Tat der Fall. Diverse experimentelle Daten anderer Arbeitsgruppen sowie anhand der Daten durchgeführte Computersimulationen favorisieren daher die NHEJ-basierte Entstehung von Chromosomenaberrationen (Hlatky et al., 2002; Cornforth, 2006). Dabei wurde auch immer eine lineare Komponente der Dosis-Effekt-Kurve

113 Diskussion 103 beobachtet. Dies wurde dahingehend interpretiert, dass ein Teil der Brüche nicht unabhängig voneinander entsteht, sondern gelegentlich zwei Brüche durch ein einziges Teilchen, im Falle von Röntgenstrahlung durch ein Sekundärelektron, hervorgerufen werden (Cornforth & Bedford, 1993). Durch die enge räumliche Nähe sind solche Brüche für eine Fehlreparatur prädestiniert. Dass die räumliche und zeitliche Nähe der Bruchenden für die Fehlreparatur eine große Rolle spielt, konnte bereits in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden (Rothkamm et al., 2001; Kühne et al., 2002). Bei niedrigen Dosen, wie sie in dieser Arbeit verwendet wurden, werden 40 DSBs verteilt über den gesamten Zellkern induziert. Die durchschnittliche Entfernung zweier Brüche, die unabhängig voneinander erzeugt werden, ist somit sehr groß, und es bedürfte einer großen Chromatinbewegung, solche unabhängigen Bruchenden in eine räumliche Nähe zu bringen. Somit wäre es möglich, dass gerade im Niedrig-Dosis-Bereich die Fehlreparatur von durch ein Elektron induzierten Brüchen überwiegt, während sie bei höheren Dosen einen geringeren Anteil an der Gesamtaberrationsrate ausmacht. Weiterhin ist nicht auszuschließen, dass auch die in dieser Arbeit erhaltenen Dosis-Effekt-Kurven eine quadratische Komponente besitzen, welche aufgrund der Methode nicht messbar ist und im Vergleich zur linearen Komponente sehr klein ausfällt. Komplette und inkomplette Translokationen treten zu annähernd gleichen Teilen auf. An einer einfachen Translokation sind zwei Chromosomen mit jeweils einem Bruch beteiligt, die bei einer kompletten Translokation mit dem jeweils falschen Chromosom verknüpft werden. Bei inkompletten Translokationen werden zwei Bruchenden fehl-verknüpft, während zwei Bruchenden nicht verbunden werden, was zur Entstehung von zusätzlichen Chromosomenfragmenten führt. Gelegentlich konnte dieses zusätzliche Fragment nicht gesehen werden. Da sich die Zelle vor der Analyse nicht geteilt hatte, ist auszuschließen, dass dieses Fragment aus der Zelle ausgeschlossen wurde. Das Fehlen des zusätzlichen Fragments konnte auch von anderen Arbeitgruppen beobachtet werden. Eine mögliche Erklärung wäre, dass es sich bei dieser Art von inkompletter Translokation nicht um die Verbindung zweier Brüche handelt, sondern dass ein Bruch mit einem Telomer verknüpft wurde (Bailey et al., 2004). So ist bekannt, dass an verkürzten Telomeren alternder Zellen häufig Proteine des NHEJ lokalisiert sind und diese Zellen auch eine erhöhte Anzahl an γh2ax-foci aufweisen (d'adda di Fagagna et al., 2003). Bei den in dieser Arbeit verwendeten Zellen handelte es sich jedoch um htert-immortalisierte Zellen, welche aufgrund der Überexpression der katalytischen Untereinheit der Telomerase keine verkürzten Telomere aufweisen sollten. Ein weiterer Hinweis, dass dies nicht der Fall ist, lieferten in unserer Arbeitsgruppe mittels γh2ax-ifm

114 Diskussion 104 durchgeführte Experimente, in denen keine erhöhte Anzahl an γh2ax-foci in unbestrahlten Zellen beobachtet werden konnten (Petra Friess, persönl. Mitteilung). Eine wahrscheinlichere Erklärung für das häufige Auftreten inkompletter Translokationen könnte die begrenzte Auflösung der Mikroskopie in Verbindung mit der Fluoreszenz-Färbung liefern. So wird geschätzt, dass Chromosomenfragmente mit einer Größe < 10-20Mbp nicht mehr visualisiert werden können (Simpson & Savage, 1996; Singleton et al., 2002; Cornforth, 2006). Dies hätte zur Folge, dass es sich bei einem Teil der hier als inkomplett gewerteten Translokationen um komplette handelt. Weiterhin wäre es auch möglich, dass nicht alle Chromosomenbrüche, welche in Form zusätzlicher Chromosomenfragmente sichtbar werden, visualisiert werden konnten Dosis-Effekt-Kurven nach zweiwöchiger Kultivierung Chromosomenaberrationen, wie sie in der ersten G2-Phase oder Mitose nach Bestrahlung beobachtet werden, können verschiedene Auswirkungen auf die Zelle bzw. eine Population haben. Sie können letal sein aber auch zur Entartung und somit zu uneingeschränktem Wachstum führen. Dies kann jedoch erst mehrere Generationen nach Bestrahlung beurteilt werden, wenn die bestrahlte Population die Möglichkeit zum Wachstum hatte. Es wurde daher untersucht, welche Auswirkungen Aberrationen auf eine proliferierende Population von Zellen haben bzw. wie sich die Aberrationsrate ändert, wenn die Zellen mehrere Zellzyklen durchlaufen haben. Die gemessene Dosis-Effekt-Kurve für die Gesamtaberrationsrate steigt zwei Wochen nach Bestrahlung erneut linear mit der Dosis an. Im Gegensatz zu den vorherigen Experimenten ist der Anstieg in diesem Fall einzig auf eine Erhöhung der Translokationen zurückzuführen. Eine Erhöhung der Chromosomenbrüche wurde nicht beobachtet. Durch Chromosomenbrüche entstehen azentrische Fragmente, welche aufgrund des fehlenden Zentromers nicht auf die Tochterzellen aufgeteilt werden können. Diese Chromosomenfragmente führen zur Entstehung von Mikrokernen, welche in der nächsten Interphase im Cytoplasma vorliegen oder aus der Zelle ausgeschleust werden (Heddle & Carrano, 1977; Norppa & Falck, 2003). Da es sich dabei meist um einen erheblichen Verlust genetischen Materials handelt, führt dies in der Regel zum Zelltod. Während der zweiwöchigen Kultivierung wurden somit Zellen mit einem erhöhten Maß an unreparierten Brüchen aus der Population entfernt. Dies ist konsistent mit früheren Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe. Rothkamm und Löbrich (2003) konnten zeigen, dass das über Tage hinweg erhöhte Maß an DSBs in einer stationären Zellkultur innerhalb weniger Generationen auf das Niveau einer unbestrahlten Population sank, sobald

115 Diskussion 105 die Zellen passagiert wurden. Dafür konnte ein erhöhtes Maß an Mikrokernen nachgewiesen werden. Daraus lässt sich schließen, dass Zellen mit unreparierten DSBs absterben, sobald sie die Möglichkeit zur Proliferation haben (Rothkamm & Löbrich, 2003). Die Tatsache, dass Brüche nach IR nicht vollständig repariert werden, sondern die Zellen vielmehr aus der proliferierenden Population entfernt werden, führt zu der Frage nach der biologischen Bedeutung. Rothkamm und Löbrich diskutierten ein Modell, wonach die unvollständige Reparatur dieser Brüche auf eine Art Risikoabschätzung der Zellpopluation zurückzuführen sein könnte. Die Reparatur von DSBs birgt die Gefahr einer fehlerhaften Verknüpfung der Enden, zumal in G0/G1-Phase-Zellen keine fehlerfreie HR zur Verfügung steht, sondern lediglich das Fehler-behaftete NHEJ. Wenn das Schadensniveau einer Zellpopulation so gering ist, dass nur etwa jede zehnte Zelle einen DSB besitzt, mag es für die Population von Vorteil sein, den Bruch unrepariert zu belassen und nicht das Risiko einer Fehlreparatur und somit einer potentiellen Entartung einer Zelle einzugehen. Wird der Population die Möglichkeit zur Proliferation gegeben, sterben die geschädigten Zellen ab und werden durch neue ersetzt. Die Translokationsrate nach zweiwöchiger Kultivierung steigt linear mit der Dosis an, liegt dabei aber erheblich niedriger als in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung. Dies deutet darauf hin, dass ein Teil der Translokationen, welche in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung auftraten, letale Ereignisse waren. So können durch die Fehlverknüpfung von Bruchenden essentielle Gene zerstört werden, welche die Zelle absterben lassen oder an einer weiteren Proliferation hindern. Translokationen, die nach zweiwöchiger Wachstumsphase gemessen werden können, sind dagegen stabile Aberrationen, welche sich nach mehreren Teilungszyklen in der Population manifestiert haben. Es wäre zu erwarten, dass nach Manifestation einer stabilen Translokation diese überproportional häufig in der Population auftritt. Um eine Aussage über die Häufigkeit verschiedener Translokationen zu treffen, hätte eine genauere Analyse der Bruch- bzw. Fehlverknüpfungsstellen z.b. durch Bänderungsmuster der Chromosomen stattfinden müssen. Die in dieser Arbeit gewählte Färbung von nur drei Chromosomen ließ jedoch keine genaueren Aussagen über die Lokalisation der Translokationen zu. Weiterhin ist die Translokationsrate unter den hier gewählten Versuchsbedingungen sehr gering. Um aussagekräftige Ergebnisse zur Verteilung der Translokationen über das gesamte Genom zu erhalten, hätte eine wesentlich höhere Anzahl an Chromosomenspreitungen untersucht werden müssen. Somit konnte in diesem Versuchsansatz gezeigt werden, dass durch IR induzierte Chromosomenbrüche aus einer proliferierenden Zellpopulation entfernt werden, da sie

116 Diskussion 106 vermutlich letale Ereignisse darstellen. Weiterhin wurde deutlich, dass nicht alle IRinduzierten Translokationen über mehrere Generationen weitergegeben werden, so dass erst nach einer gewissen Zeit der Proliferation Aussagen über deren Stabilität getroffen werden können Dosis-Effekt-Kurven und Krebsrisiko In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits nach niedrigen Dosen IR die Aberrationsrate ansteigt. Die Betrachtung der Dosis-Effekt-Kurven in der ersten G2-Phase nach Bestrahlung liefert einen Induktionswert für die Entstehung von Aberrationen nach verschiedenen Dosen IR. Der Anstieg der Aberrationsrate ist dabei hauptsächlich auf eine Erhöhung von Chromosomenbrüchen zurückzuführen, dennoch konnte auch ein beträchtlicher Anstieg der für die Krebsentstehung relevanteren Translokationsereignisse verzeichnet werden. Dabei führte die Bestrahlung mit der niedrigsten Dosis von 0,25Gy zu einer Erhöhung, die größer war, als eine lineare Extrapolation zwischen den anderen Dosiswerten erwarten ließ. Dies würde bedeuten, dass bereits eine sehr kleine Dosis das Krebsrisiko überproportional steigert. Das allgemein verwendete Modell zur Beschreibung des Krebsrisikos nach IR ist das Linearno-threshold-Modell (LNT-Modell). Eine Richtigkeit des Modells wird dabei nicht impliziert, sondern es wird betont, dass es in erster Linie aus praktischen Gründen Verwendung findet. Das LNT-Modell geht von einer autonomen Antwort jeder einzelnen Zelle auf Bestrahlung aus. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht nur eine einzelne bestrahlte Zelle auf Strahlung reagiert, sondern dass es eine Kommunikation innerhalb des Zellverbands gibt. Experimente in der Zellkultur konnten zeigen, dass auch zunächst ungeschädigte Zellen eine DNA- Schadensantwort initiieren (Nagasawa & Little, 1992; Prise et al., 1998). Dieser Bystander Effect hätte besonders Einfluss bei niedrigen Dosen. Für die Risikoabschätzung würde dies bedeuten, dass das LNT-Modell das Krebsrisiko im Niedrig-Dosis-Bereich unterschätzt (Hall, 2003; Mothersill & Seymour, 2004). Diese Experimente wurden jedoch anhand von Teilchenstrahlung mit niedriger Fluenz oder Microbeam-Bestrahlung durchgeführt, bei denen gezielt nicht alle Zellen geschädigt wurden. In dieser Arbeit wurde jedoch dünn ionisierende Röntgenstrahlung verwendet. Dabei ist davon auszugehen, dass bereits initial jede Zelle geschädigt wurde. Dennoch wäre es möglich, dass besonders bei den hier verwendeten niedrigen Dosen der Bystander Effect einen Beitrag zu der Erhöhung der Aberrationsrate leistet. Andererseits lässt sich nicht absolut ausschließen, dass die Erhöhung des 0,25Gy-

117 Diskussion 107 Punkts nicht auf Ungenauigkeiten aufgrund der Insensitivität der gewählten Methode zurückzuführen ist. Relevanter für die Beurteilung des Krebsrisikos sind die Aberrationsmessungen nach mehreren Teilungszyklen. Erst in der aktiv proliferierenden Population zeigt sich, wie hoch der Anteil stabiler und somit potentiell Krebs-auslösender Translokationen tatsächlich ist. Bei der Dosis-Effekt-Kurve stabiler Translokationen fügt sich der 0,25Gy-Punkt nahezu linear in die Kurve der anderen Dosis-Punkte ein. Dies bedeutet, dass zwar initial bei niedrigen Dosen relativ gesehen mehr Translokationen induziert werden, ein Teil davon aber nicht stabil ist und im Laufe mehrerer Zellteilungen aus der Population entfernt wird. Dies ist ein Hinweis darauf, dass eine niedrige Dosis das Krebsrisiko nicht überproportional erhöht und das Krebsrisiko auch im Niedrig-Dosis-Bereich einen linearen Verlauf zeigt. Dies ist konsistent mit den bisherigen Abschätzungen des LNT-Modells (Hlatky et al., 2002; Preston, 2003). Die Aberrationsrate war auch nach zweiwöchiger Kultivierung der Zellen mit einem Niveau von 1,5 Translokationen pro 100 Zellen pro Gy sehr gering. Zudem wurden kaum Zellen gefunden, welche mehr als eine Translokation in den drei gefärbten Chromosomen aufwies. In anderen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass in einer bestrahlten Population auch viele Generationen nach Bestrahlung Aberrationen de novo entstehen und weitervererbt werden können (Sabatier et al., 1992; Holmberg et al., 1995; Kadhim et al., 1995). Die dieser verspäteten Strahlenantwort zugrunde liegende Mechanismen sind bis heute nicht vollständig geklärt. Es scheint sich jedoch um einen Prozess zu handeln, der viele Zwischenstufen durchläuft, bis es zur genomischen Instabilität mit auf chromosomaler Ebene sichtbaren Veränderungen kommt. Bei den in dieser Arbeit gemessenen Aberrationen kann somit nicht mit Sicherheit gesagt werden, ob es sich um Ereignisse handelt, welche direkt durch die Bestrahlung entstanden sind und über mehrere Generationen stabil vererbt wurden, oder um aufgrund chromosomaler Instabilität neu entstandene Chromosomenaberrationen. Es gibt Hinweise darauf, dass genomische Instabilität der erste kritische Schritt in der Entstehung Strahlen-induzierter Karzinogenese darstellt (Sankaranarayanan & Chakraborty, 1995; Little, 2000). Dies ist konsistent mit der Ansicht, dass die Krebsentstehung mit einer Vielzahl an Genomveränderungen einhergeht, und dass in den wenigsten Fällen eine einzelne Translokation für die Entstehung einer genomischen Instabilität ausreicht. Dabei ist nicht final geklärt, ob die mit Krebs einhergehende genomische Instabilität der Auslöser oder die Konsequenz der malignen Transformation ist (Bertram, 2000; Smith et al., 2003b). Wie sich die Dosis-Effekt-Kurve für die Krebsentstehung im Niedrig-Dosis-Bereich verhält, kann bis zum heutigen Tag nur abgeschätzt werden. Es wird deutlich, dass die

118 Diskussion 108 epidemiologischen Studien sowie die vorliegenden experimentellen Daten nicht ausreichen, um eine zuverlässige Aussage über das Krebsrisiko im Niedrig-Dosis-Bereich zu treffen. Bevorzugt wird zurzeit das LNT-Modell, dennoch existieren Daten, welche auch andere Modelle zulassen. Auch wenn die Unterschiede dieser Modelle sehr gering für den einzelnen Menschen erscheinen, so haben sie doch erhebliche Auswirkungen auf z.b. die Bevölkerung eines Landes. Die Auswirkungen schlagen sich besonders im Strahlenschutz und somit der Gesetzgebung nieder. Daher ist es wichtig, auch zukünftig weitere Daten zu gewinnen, um das Strahlen-induzierte Krebsrisiko möglichst genau abschätzen zu können Über das Reparaturverhalten von AT- und Artemis-Zellen in der G2-Phase Zellen haben verschiedene Strategien entwickelt, mit DNA-Schäden umzugehen. Eine Strategie liegt dabei in der Reparatur dieser Schäden. DSBs sind für eine Zelle die schwerwiegendsten Läsionen, da eine ausbleibende Reparatur zum Verlust genetischen Materials führen kann, während eine Fehlreparatur durch die Entstehung von Chromosomenaberrationen das Absterben oder die Entartung der Zelle begünstigt. Der wichtigste Mechanismus zur Reparatur von DSBs in Säugerzellen ist das NHEJ, dessen Prinzip auf der Verknüpfung von DNA-Enden beruht. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass neben den core- Komponenten des NHEJ die Kinase ATM und die Nuklease Artemis an der Reparatur einer Unterklasse von DSBs über den NHEJ-Mechanismus in der G0-Phase beteiligt sind (Riballo et al., 2004). In dieser Arbeit wurden die Untersuchungen zur DSB-Reparatur von AT- und Artemis-Zellen auf die G2-Phase ausgedehnt. Zur Untersuchung der G2-Phase-spezifischen DSB-Reparatur von AT- und Artemis-Zellen nach IR kamen verschiedene Techniken zum Einsatz. Zunächst wurde die DSB-Reparatur anhand vorzeitig in der G2-Phase kondensierter Chromosomen untersucht (PCC). Dabei weisen 2h nach Bestrahlung mit 1Gy alle verwendeten Zelllinien (WT, AT, Artemis) dasselbe Niveau an Brüchen auf. Nach Reparaturzeiten von 4h und 6h liegt das Schadensniveau in den beiden defizienten Zelllinien etwa um 1 Bruch pro Zelle höher als in den WT-Zellen. Die statistische Auswertung bewertet diesen Unterschied als signifikant. Somit konnte mittels PCC ein Reparaturdefekt von AT- und Artemis-Zellen gegenüber WT-Zellen nach längeren Reparaturzeiten in der G2-Phase nachgewiesen werden. Das Ausmaß dieses Reparaturdefekts lässt sich jedoch aufgrund des fehlenden Induktionswertes nicht abschätzen. Die in diesen Experimenten gemessenen Absolutzahlen des 2h-Punktes stimmen gut mit den Ergebnissen

119 Diskussion 109 einer kürzlich veröffentlichten Studie überein. Terzoudi et al. untersuchten mittels PCC den Einfluss des Checkpoint-Defekts von AT-Zellen auf die Entstehung chromosomaler Brüche in Lymphozyten von AT-Patienten. Dabei wiesen sowohl AT- als auch WT-Zellen nach 1Gy γ- Strahlung und 90minütiger Reparaturzeit etwa 8 PCC-Brüche pro G2-Zelle auf (Terzoudi et al., 2005). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Pilot-Experimente durchgeführt, in denen PCC-Brüche bereits 30min nach Bestrahlung gemessen wurden. Die dabei erhaltenen ~9 Brüche sind konsistent mit von Gotoh et al. veröffentlichten Daten (Gotoh et al., 1999). In dieser Arbeit wurden 30min nach 1Gy IR ~10 PCC-Brüche pro Zelle detektiert. Allerdings zeigten die Zellen im Laufe der Reparaturzeit ein sehr schnelles Verschwinden der Chromatidbrüche. So besaßen die Zellen 2h nach IR nur noch etwa 2 Brüche. Die Autoren schränken die Aussagekraft der Reparaturkinetiken selber ein, indem sie darauf hinweisen, dass in ihrer Arbeit nicht mit synchronisierten, sondern mit exponentiell wachsenden WT- Zellen gearbeitet wurde. Da die S-Phase-Zellen nicht mittels Aphidicolin am Proliferieren gehindert wurden, wäre es möglich, dass bei längeren Zeiten auch Zellen ausgewertet wurden, die während der Bestrahlung in der S-Phase waren. In dieser Phase besitzen die Zellen einen niedrigeren DNA-Gehalt, so dass auch initial weniger DSBs induziert werden. Des Weiteren stehen in der S-Phase möglicherweise andere Reparaturmechanismen zur Verfügung, über welche die DSBs ebenfalls repariert werden können. Der Vergleich mit einer weiteren Studie zeigt dagegen große Diskrepanzen in den Absolutzahlen der PCC-Brüche (Darroudi et al., 2007). In dieser Studie an humanen WT-Fibroblasten wurden 1h nach 0,5Gy nur ~ 0,5 Brüche pro G2-Phase-Spreitung gefunden. Eine Ursache für die Diskrepanz zu den in dieser Arbeit erhaltenen Werten mag dabei in der höheren Einwirkzeit sowie der höheren Konzentration von Calyculin A liegen. Beides führt zu einer stärkeren Kondensation der Chromosomen, wodurch Chromatidbrüche evtl. schwerer zu detektieren sind. In derselben Studie wurden auch Artemis-Zellen mittels G2-PCC untersucht. Dabei fanden die Autoren in Artemis-Zellen bereits nach 1h eine doppelt so hohe Bruchzahl wie in WT-Zellen. Eine mögliche Erklärung mag darin liegen, dass bevorzugt Brüche, welche einer Prozessierung durch Artemis bedürfen, bei stärkerer Kondensation des Chromatins eher zu Chromatidbrüchen werden als Artemis-unabhängige Brüche. Weiterhin ist die frühzeitige Detektion des Reparaturdefekts von Artemis-Zellen vergleichbar mit den in dieser Arbeit durchgeführten chromosomalen Studien in der Mitose. Um den in den PCC-Experimenten gefundenen Reparaturdefekt zu validieren, wurde in der PFGE das Reparaturverhalten Methyl- 3 H-Thymidin-markierter G2-Zellen untersucht. Die PFGE ist eine rein physikalische Methode, und die Auswertung ist im Gegensatz zum Zählen

120 Diskussion 110 von Brüchen frei von subjektiven Einflüssen. Nach Bestrahlung mit 80Gy und 24stündiger Reparaturzeit besitzen alle Zelllinien geringfügig mehr unreparierte DSBs als eine mit 10Gy bestrahlte Induktionsprobe. Ein Reparaturdefekt von AT- und Artemis-Zellen wird 48h nach Bestrahlung sichtbar. Nach einer Reparaturzeit von 3 Tagen ist das Niveau an DSBs in den WT-Zellen nahezu auf den Kontrollwert gesunken. In den AT- und den Artemis-Zellen liegen zum selben Zeitpunkt etwas mehr unreparierte DSBs vor als in einer mit 10Gy bestrahlten Induktionsprobe. Somit konnte auch mit dieser Methode der Reparaturdefekt nachgewiesen werden. Das Ausmaß des Reparaturdefekts entspricht etwa 1/8 der durch die 80Gy induzierten DSBs der Reparaturproben und liegt somit bei etwa 15% der induzierten Brüche. Der in dieser Arbeit beobachtete Reparaturdefekt von AT- und Artemis-Zellen ist konsistent mit Daten aus unserer Arbeitsgruppe, welche mittels der γh2ax-ifm gewonnen wurden (Deckbar et al., 2007). Nach Bestrahlung mit 1,5Gy zeigen AT- und Artemis-Zellen sowohl in der G1- als auch in der G2-Phase nach einer Reparaturzeit von 4h bereits einen kleinen Reparaturdefekt. Nach einer Reparaturzeit von 8h verbleiben in AT- und Artemis-Zellen in der G2-Phase etwa doppelt so viele Brüche unrepariert wie in WT-Zellen. In diesen Experimenten lag das Ausmaß des Reparaturdefekts bei ~ 15% unrepariert verbleibender DSBs. Der Reparaturdefekt von ~ 15% in G2-Phase-Zellen ist vergleichbar mit den Studien in stationären Zellen, in denen der Anteil der in diesen defizienten Zellen unrepariert verbleibenden DSB ebenfalls 10-15% betrug (Riballo et al., 2004; Kühne et al., 2004). Dies lässt vermuten, dass ATM und Artemis in beiden Zellzyklusphasen für die Reparatur einer bestimmten Klasse von DSBs essentiell sind, welche bei der hier verwendeten Röntgenstrahlung einen Anteil von 10-15% der insgesamt induzierten DSBs ausmacht. Durch Einsatz unterschiedlicher DSB-erzeugender Agenzien konnte gezeigt werden, dass ATM und Artemis für die Reparatur komplexer Brüche benötigt werden (Riballo et al., 2004). Analog zu den stationären Zellen, wurden in unserer Arbeitsgruppe γh2ax-experimente mit Etoposid in der G2-Phase durchgeführt. Etoposid induziert als Topoisomerase-Inhibitor nur glatte Brüche. In diesem Ansatz wurde kein DSB-Reparaturdefekt der AT- und Artemis- Zellen sichtbar, was dafür spricht, dass es sich bei den ATM- und Artemis-abhängigen Brüchen in der G2-Phase um ähnliche Brüche wie in G0/G1-Zellen handelt (Dr. Andrea Krempler, persönl. Mitteilung). Die DSB-Reparatur von Reparatur-profizienten Zellen zeigt in der Regel ein zweiphasiges Verhalten, d.h. die Kinetiken bestehen aus zwei Komponenten. Die schnelle Komponente repariert DSBs mit einer Halbwertszeit von 20 Minuten bis zu 1h, während die Reparatur der

121 Diskussion 111 DSBs bei der langsamen Kinetik über mehrere Stunden hinweg abläuft (Metzger & Iliakis, 1991). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Reparaturkinetik von AT- und Artemis-Zellen in den ersten Stunden nach Bestrahlung denselben Verlauf wie die einer WT- Zelllinie besitzt. Der Reparaturdefekt tritt erst mehrere Stunden nach Bestrahlung auf. Zu demselben Ergebnis kamen auch die in früheren Studien durchgeführten Experimente in stationären Zellen (Riballo et al., 2004), sowie weitere Experimente unserer Arbeitsgruppe in G2-Zellen (Deckbar et al., 2007). Die Art des Bruches könnte erklären, weshalb der Reparaturdefekt dieser Zellen erst mehrere Stunden nach der Bestrahlung sichtbar wird. Die Reparatur komplexer Brüche benötigt wahrscheinlich vor der Ligation eine Prozessierung, so dass die langsame Komponente vermutlich die Reparatur der komplexen Brüche widerspiegelt. Demnach ist in der frühen, schnellen Phase der Reparatur bei AT- und Artemis-Zellen gegenüber dem WT kein Reparaturdefekt ersichtlich, und der Defekt wird erst zu Zeiten sichtbar, zu denen alle nicht- komplexen Brüche repariert wurden. Beim Vergleich der PCC-Experimente mit den PFGE-Experimenten fällt auf, dass in den chromosomalen Studien der Reparaturdefekt bereits 4h nach IR sichtbar wird, während dieser in den PFGE-Experimenten erst nach 48h detektierbar ist. Ein Grund für diese Diskrepanz mag in der Höhe der applizierten Dosis liegen. In den PCC-Experimenten wurde den Zellen mit 1Gy eine wesentlich niedrigere Dosis appliziert als bei den PFGE-Experimenten. In letzteren wurden auch in den WT-Zellen 24h nach Bestrahlung erst ~ 80% der ursprünglich induzierten DSBs repariert. In den bisher an stationären Zellen durchgeführten Studien wurden Reparaturkinetiken mit PFGE bei 80Gy und mit der γh2ax-ifm bei 2Gy Röntgenstrahlung durchgeführt. Hierbei konnte kein Unterschied im Verlauf der Reparaturkinetiken in Bezug auf die Dosis gefunden werden, d.h. die Zellen, welche mit 80Gy bestrahlt wurden, reparierten genauso schnell wie Zellen, welchen eine niedrigere Dosis appliziert wurde. Dies führte dazu, dass in beiden Ansätzen der Reparaturdefekt bereits nach 4h-8h sichtbar wurde (Riballo et al., 2004). Tendenziell konnte hier der Reparaturdefekt bei der höheren Dosis sogar früher beobachtet werden als bei der niedrigeren Dosis. Dies ist konsistent mit den Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen, welche nahe legten, dass die Geschwindigkeit der DSB-Reparatur mit einer Erhöhung der Dosis zunimmt (Iliakis et al., 1991). Dass dies in den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimenten nicht der Fall ist, könnte daran liegen, dass hier die Reparatur nicht in stationären, sondern in G2-Phase- Zellen gemessen wurde. Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe deuten darauf hin, dass die DSB-Reparatur in der G2-Phase im Allgemeinen langsamer zu verlaufen scheint als in der G0-Phase (Deckbar et al., 2007).

122 Diskussion 112 Die Tatsache, dass die Reparatur in der G2-Phase langsamer abläuft als in stationären Zellen, führt zu der Frage nach den Mechanismen der DSB-Reparatur in der G2-Phase. In der G2- Phase besteht die Möglichkeit, die DSBs nicht nur über NHEJ sondern auch über HR mit der homologen Schwesterchromatide als Matrize zu reparieren. Während in Hefen die HR der vorherrschende Mechanismus zur Reparatur von DSBs ist (Moore & Haber, 1996; Paques & Haber, 1999; Cromie et al., 2001), herrschen über die Bedeutung der HR in Vertebratenzellen noch einige Unklarheiten. In Hühner-B-Lymphozyten (DT40) wurde gefunden, dass HR in diesem Zellsystem eine wichtige Rolle in den postreplikativen Zellzyklusphasen einnimmt. Mutationen in Rad51 oder Rad54 führen zu einem erhöhten Niveau an spontanen Chromosomenbrüchen sowie zu einer erhöhten Strahlensensitivität (Takata et al., 1998). Ähnliches wurde auch in murinen Rad54 -/- embryonalen Stammzellen gefunden (Essers et al., 1997). Studien an Hamsterzellen zeigten, dass HR keinen oder nur einen minimalen Beitrag zur Reparatur von DSBs in der G1-Phase leistet. Dagegen bilden HR-defekte Zellen einen deutlichen Reparaturdefekt in der späten S- und G2-Phase aus, welcher mit einer erhöhten Strahlensensitivität in diesen Zellzyklusphasen einhergeht (Rothkamm et al., 2003). Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass HR in Vertebratenzellen eine wichtige Rolle bei der DSB-Reparatur in der G2-Phase übernimmt. Aufgrund des der HR zugrunde liegenden Mechanismus operiert diese wahrscheinlich im Vergleich zum NHEJ relativ langsam. Eine langsame Reparatur in der G2-Phase, wie sie in dieser und anderen Arbeiten unserer Arbeitsgruppe beobachtet wurde, würde somit dafür sprechen, dass in der G2-Phase zumindest ein Teil der Brüche über HR repariert wird. Das Ausmaß des Reparaturdefekts von AT- und Artemis-Zellen ist in der G2-Phase genauso groß wie in stationären Zellen. Somit stellt sich die Frage, ob ATM und Artemis wie in der G1-Phase in der G2-Phase ebenfalls an einem Unterweg des NHEJ beteiligt sind. Epistasis- Studien mit einem ATM-Inhibitor in G2-Phase-Zellen, welche analog zu den Experimenten in stationären Zellen durchgeführt wurden (Riballo et al., 2004), zeigten, dass ATM und Artemis wie in G0/G1-Zellen auch in der G2-Phase am selben Reparaturweg beteiligt sind (Deckbar et al., 2007). Allerdings zeigten in diesen Studien AT- und Artemis-Zellen in der G2-Phase im Gegensatz zur G1-Phase kein epistatisches Verhalten zu DNA-PK, welches in den G0/G1 Studien nachgewiesen wurde (Andrea Beucher, persönl. Mitteilung) (Riballo et al., 2004). DNA-PK und ATM/Artemis operieren somit in der G2-Phase in unterschiedlichen Reparaturwegen. Es ist möglich, dass ATM und Artemis in der G2-Phase im HR-Weg wirken und für die Reparatur einer bestimmten Art von DSBs benötigt werden, so wie sie in der G0/G1-Phase für die Reparatur von komplexen Brüchen essentiell sind. Dafür spricht, dass

123 Diskussion 113 das Ausmaß des Reparaturdefekts von AT- und Artemis-Zellen jenem der HR-Mutanten von Rad54 und BRCA2 gleicht (Leopoldine Tchouandong, Andrea Beucher, persönl. Mitteilung). Generell wäre auch denkbar, dass ATM und Artemis sich nicht einem bestimmten Reparaturweg zuordnen lassen, sondern dass ihre Rolle bei der Reparatur einzig von der Art des Bruches abhängt. So könnte die Prozessierung einer bestimmten Klasse von Brüchen nur durch diese Proteine erfolgen. Unabhängig von der Prozessierung könnte anschließend die Reparatur von den in der jeweiligen Zellzyklusphase zur Verfügung stehenden Reparaturwegen durchgeführt werden. Das Ausmaß des Reparaturdefekts würde somit in der G1- und der G2-Phase einzig vom schädigenden Agens abhängen. In stationären Zellen lieferte die Verwendung von Etoposid, Röntgenstrahlung und α-teilchen Hinweise darauf, dass das Ausmaß des Reparaturdefekts von dem schädigenden Agens und somit von der Art des Bruches abhängt (Riballo et al., 2004). In der G2-Phase konnte dies bisher nur der Vergleich von Röntgenstrahlung und Etoposid demonstrieren (Dr. Andrea Krempler, persönl. Mitteilung). Eine weitere Möglichkeit wäre, dass die ATM/Artemis-abhängige Reparatur nicht nur von der Komplexität der Brüche abhängt, sondern auch von ihrer Lokalisation innerhalb des Genoms. Kürzlich wurde gezeigt, dass ATM das für die Relaxation des Chromatins in der Umgebung eines DSBs benötigte KAP1 phosphoryliert (Ziv et al., 2006). Es wäre somit möglich, dass die Aufgabe von ATM bei der DSB-Reparatur u. a. darin besteht, einen komplexen Bruch in stärker kondensierten Chromatinbereichen sterisch für die Prozessierung durch Artemis zugänglich zu machen. So gibt es Hinweise darauf, dass die unreparierten Brüche in AT- Zellen vorwiegend in heterochromatischen DNA-Bereichen auftreten (Penny Jeggo, persönl. Mitteilung). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von DNA-PK und ATM zwar für die Funktionalität von Artemis benötigt werden, die Phosphorylierung von Artemis durch diese Kinasen jedoch nicht essentiell für dessen Endonuklease-Aktivität ist. Phosphorylierungsmutanten weisen keinen Reparaturdefekt auf (Goodarzi et al., 2006). Neben der G0/G1- und der G2-Phase scheinen ATM- und Artemis auch eine Rolle bei der Reparatur von Strahlen-induzierten DSBs in der S-Phase zu spielen. Hinweise liefern die γh2ax-experimente nach 6Gy-Bestrahlung in der S-Phase. Während WT-Zellen nach 48h Reparaturzeit ~ 20 Foci besitzen, weisen AT- und Artemis-Zellen noch ~ 50 Foci pro Zelle auf. Dieses Niveau bleibt in den beiden defizienten Zelllinien über einen Zeitraum von 4 Tagen hinweg konstant erhalten, während es in WT-Zellen weiter absinkt. Es kann davon ausgegangen werden, dass durch die hier applizierte Dosis von 6Gy DSBs pro Zelle induziert wurden. Die verbleibenden 50 DSBs in den AT- und Artemis-Zellen entsprechen

124 Diskussion 114 somit erneut einem Anteil von ~ 15% unreparierten DSBs. Somit konnte gezeigt werden, dass AT- und Artemis-Zellen auch nach einer Bestrahlung in der S-Phase einen Reparaturdefekt besitzen, welcher vom Ausmaß her dem von in der G1- und der G2-Phase bestrahlten Zellen ähnlich ist. Diese Ergebnisse konnten durch weitere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe bestätigt werden (Michael Ensminger, persönl. Mitteilung). Bis jetzt lassen sich jedoch keine direkten Rückschlüsse auf die beteiligten Reparaturwege ziehen Über die Regulation des G2/M-Checkpoints in AT- und Artemis- Zellen Zur Bewertung der chromosomalen Stabilität von Zellen ist es unumgänglich, das Checkpoint-Verhalten der Zelllinien zu studieren. In dieser Arbeit wurde der Übergang von Zellen aus der G2-Phase in die Mitose nach Bestrahlung eingehend untersucht. Die Induktion des Checkpoints wird dabei wesentlich durch die Funktion der PI3-Kinase ATM reguliert. Es ist bekannt, dass AT-Zellen in der Lage sind, einen G2/M-Checkpoint zu induzieren, wenn diese in der S-Phase bestrahlt werden, wohingegen in der G2-Phase bestrahlte Zellen ohne Checkpoint in die Mitose gelangen (Ford et al., 1984; Beamish et al., 1996; Xu et al., 2002). Dem entsprechend wurde die Existenz eines ATM-unabhängigen und eines ATM-abhängigen G2/M-Checkpoints postuliert Regulation des ATM-unabhängigen G2/M-Checkpoints Um das Verhalten des ATM-unabhängigen G2/M-Checkpoints zu untersuchen, wurden in einer exponentiell wachsenden Population die S-Phase-Zellen mit BrdU markiert, bestrahlt und anschließend ihre Progression in die G2- und die darauf folgende G1-Phase betrachtet. Um die Dosisabhängigkeit dieses Checkpoints zu untersuchen, wurden dabei mit 1,3Gy und 6Gy zwei verschiedene Dosen appliziert. Bei beiden Dosen zeigen sowohl AT- und Artemis- Zellen als auch WT-Zellen eine Akkumulation in der G2-Phase. Nach 1,3Gy progressieren bei allen Zelllinien die Zellen zwischen 8h und 12h nach der Bestrahlung in die G1-Phase, wobei der Anteil dieser Zellen in der WT-Zelllinie größer ist als in den defizienten. Nach einer Bestrahlung mit 6Gy erfolgt die Progression in WT-Zellen erst zwischen 12h und 16h. Hierbei verringert sich der Anteil der sich teilenden Zellen gegenüber der niedrigeren Dosis. ATM- und Artemis-Zellen dagegen zeigen bei dieser Dosis keine signifikante Abnahme der G2-Zellen, und auch 4 Tage nach der Bestrahlung befinden sich immer noch ca. 75% der

125 Diskussion 115 Zellen in G2. Die Zellen scheinen somit in einen permanenten Arrest übergegangen zu sein. Die unter denselben Versuchbedingungen durchgeführten γh2ax-experimente zur Messung der DSB-Reparatur zeigten, dass in AT- und Artemis-Zellen über den betrachteten Zeitraum hinweg eine große Anzahl an DSBs unrepariert verbleibt. Dies deutet darauf hin, dass der Checkpoint aufgrund des hohen Schadensniveaus nicht aufgehoben wird. Für AT-Zellen ist seit längerem bekannt, dass sie nach einer Bestrahlung in der S-Phase eine Akkumulation in der G2-Phase zeigen (Ford et al., 1984; Beamish et al., 1996). Ein ähnliches Verhalten wurde auch für NBS1- und BRCA1-defiziente Zellen beschrieben. Dies führte zu der Vermutung, dass diese Akkumulation ein spezifisches Phänomen für Zellen mit Defekten des intras-checkpoints darstellt (Xu et al., 2002). Die Autoren postulierten, dass Zellen mit diesem RDS-Phänotyp nach dem Auftreten von DSBs mit einem erhöhten Maß an Läsionen in die G2-Phase eintreten. Diese Schäden werden als unkorrekt oder nicht vollständig replizierte DNA-Abschnitte erkannt und somit eine Progression in die Mitose unterbunden. Dass in dieser Arbeit ein verlängerter Arrest in Artemis-Zellen gefunden wurde, würde somit auf eine Beteiligung von Artemis bei der Regulation des intras-checkpoints hindeuten. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass eine Artemis-Defizienz sich nicht auf die Regulation des intras-checkpoints auswirkt (Riballo et al., 2004). Vielmehr zeigen die unter denselben Versuchbedingungen durchgeführten γh2ax-experimente zur Messung der DSB-Reparatur, dass in AT- und Artemis-Zellen über den betrachteten Zeitraum hinweg eine große Anzahl an DSBs unrepariert verbleibt. In der Studie von Xu et al. wurde nicht berücksichtigt, dass die beschriebenen Zelllinien Defekte in der Reparatur von DSBs besitzen. NBS-Zellen zeigen einen schwach ausgeprägten RDS-Phänotyp und besitzen zumindest in stationären Zellen einen Reparaturdefekt, welcher ähnlich dem von AT-Zellen ist (Girard et al., 2000; Riballo et al., 2004). NBS1 ist als Komponente des MRN-Komplexes für die Rekrutierung dieses Komplexes an den DSB essentiell. Da der MRN-Komplex in allen Zellzyklusphasen an der Erkennung von DSBs beteiligt ist, lässt sich somit nicht ausschließen, dass NBS-Zellen auch in der S- und der G2-Phase einen Reparaturdefekt aufweisen, welcher den verlängerten G2- Arrest erklären könnte. BRCA1 ist ebenfalls an der DSB-Schadensantwort beteiligt und hat neben seiner Funktion in der Zellzykluskontrolle eine Rolle in der HR, welche DSBs in der S- und G2-Phase reparieren kann (Moynahan et al., 1999; Jasin, 2002). So assoziiert BRCA1 mit Rad50, einer Komponente des MRN-Komplexes, die am Zusammenhalten der Bruchenden beteiligt ist. Weiterhin wird Brca1 für die Rekrutierung von BRCA2 benötigt, welches die Bildung des Rad51-Nukleoprotein-Filaments in der HR unterstützt (Zhong et al., 2002; Valerie & Povirk, 2003; Zhang & Powell, 2005). Es gibt Hinweise darauf, dass BRCA1 auch

126 Diskussion 116 eine Komponente des ATM/Artemis-abhängigen Reparaturwegs in der G1-Phase ist (Penny Jeggo, persönl. Mitteilung). Ausgehend von den im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen kann angenommen werden, dass ein längerer Arrest in der G2- Phase nicht nur als Folge von RDS, sondern vielmehr als Folge des in den jeweiligen Zelllinien beschriebenen Reparaturdefekts und des damit verbundenen erhöhten Maßes an unreparierten DSBs auftritt. Somit widerspricht die Arbeit von Xu et al. nicht direkt den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen. Lediglich die Entstehung des erhöhten Maßes an Läsionen wird auf unterschiedliche Ursachen zurückgeführt. AT-Zellen weisen in hohem Maße Checkpoint-Defekte auf. Dass AT-Zellen nach Bestrahlung in der S-Phase eine Akkumulation in der G2-Phase zeigen, lässt sich darauf zurückführen, dass in der S-Phase neben ATM auch die ATM-ähnliche Kinase ATR aktiviert wird (Li & Zou, 2005). HR stellt während der S-Phase einen bedeutenden Reparaturmechanismus dar. Im Zuge der Prozessierung von DSB-Enden entstehen lange Bereiche ssdna, welche durch das ssdna-bindende Protein RPA stabilisiert werden. Diese RPA-gebundenen ssdna-bereiche führen zur Aktivierung von ATR und der darauf folgenden Phosphorylierung von Chk1 (Brown & Baltimore, 2000; O'Connell & Cimprich, 2005). Dieser Mechanismus der Aktivierung des G2/M-Checkpoints ist von ATM unabhängig und findet daher auch in AT- Zellen statt. Eine Simulierung des Checkpoint-Defekts von ATM in der G2-Phase wurde in dieser Arbeit durch die Inhibierung der Checkpoint-Kinasen Chk1 und Chk2 erreicht. Während der S-Phase kann Chk1 nach IR neben ATM auch von ATR aktiviert werden (Liu et al., 2000; Donzelli & Draetta, 2003). Somit ist in der S-Phase eine Vergleichbarkeit zwischen ATM- und Chk1- defizienten Zellen nicht gegeben. Die Experimente nach IR in der S-Phase konnten daher nicht zur Charakterisierung der Checkpoint-Funktion von ATM herangezogen werden. Dies zeigten auch Pilot-Experimente, in denen Chk1/2-inhibierte WT-Zellen in der S-Phase bestrahlt wurden. Würde die Inhibierung der Checkpoint-Kinasen in der S-Phase denselben Effekt wie eine ATM-Defizienz hervorrufen, so wäre nach Bestrahlung eine Akkumulation dieser Zellen in der G2-Phase zu erwarten gewesen. Die Checkpoint-inhibierten WT-Zellen zeigten jedoch nur einen partiellen Arrest in der G2-Phase, welcher vom Ausmaß her zwischen dem der bestrahlten AT-Zellen und den unbestrahlten Zellen lag (Daten nicht gezeigt). Dies ist konsistent mit anderen Studien, welche nach Herunterregulation von Chk1 mittels RNAi eine Beeinträchtigung des intras- und des G2/M-Checkpoints nach IR in der S- Phase beobachteten (Zhao et al., 2002b). Welcher Mechanismus dazu führt, dass hier trotz Inhibition beider Checkpoint-Kinasen der G2/M-Checkpoint nicht vollständig aufgehoben

127 Diskussion 117 wird, ist unklar. Chk1-defiziente Zellen sind nicht in der Lage, nach DNA-Schädigung während der S-Phase die Replikation zu verlangsamen (Niida et al., 2005). Stattdessen aktivieren Chk1-inhibierte Zellen vor Beendigung der Replikation den CDK1/CyclinB- Komplex und treten vorzeitig mit massiver DNA-Schädigung in die Mitose ein, was zu einer mitotic catastrophe führt (Niida et al., 2005). Des Weiteren phosphoryliert Chk1 in der S- Phase Rad51 und stimuliert dadurch dessen Bindung an das einen DSB umgebende Chromatin, was eine effiziente Reparatur des DSBs über HR ermöglicht (Sorensen et al., 2005). Eine Chk1-Defizienz führt somit direkt zu einer Akkumulation von DSBs, welche in Verbindung mit einer Checkpoint-Defizienz in einem hohen Niveau an Brüchen in der Mitose resultiert. Dies könnte zu Schwierigkeiten bei der Zellteilung führen und damit zu einer Anreicherung dieser Zellen in der BrdU-positiven G2/M-Fraktion Regulation des ATM-abhängigen G2/M-Checkpoints Mit der Methode der FACS-Analyse wurde sowohl mittels BrdU-Inkorporation als auch durch Messung des MI s mittels phosphoh3 das Verhalten des ATM-abhängigen G2/M- Checkpoints nach Bestrahlung in der G2-Phase untersucht. Beide Methoden führten zu gleichen Ergebnissen. Während ATM- und Chk1/2-inhibierte WT-Zellen, wie erwartet, den G2/M-Checkpoint nicht aktivierten, zeigten WT- und Artemis-Zellen eine deutliche Induktion des Checkpoints. Dabei war in den Artemis-Zellen, wie auch bereits in der S-Phase beobachtet, ein verlängerter Arrest gegenüber den WT-Zellen zu sehen. Dies steht wahrscheinlich in Zusammenhang mit den in Artemis-Zellen aufgrund des Reparaturdefekts vorhandenen unreparierten Brüchen. Damit wurde gezeigt, dass Artemis-Zellen zwar den gleichen Reparaturdefekt aufweisen wie AT-Zellen, jedoch vollkommen profizient in der Induktion des G2/M-Checkpoints sind. Eine Arbeit, welche sich mit den Ursachen der Strahlenempfindlichkeit Artemis-defizienter Zellen beschäftigte, untersuchte ebenfalls die Reparatur- und die Checkpoint-Funktion von Artemis (Zhang et al., 2004). Die Profizienz in der Induktion des G2/M-Checkpoints in Artemis-Zellen steht im Einklang mit den Ergebnissen von Zhang et al. Wie auch in den hier durchgeführten Zellzyklusstudien fanden sie in Artemis-defekten Zellen nach Bestrahlung mit 6Gy ein normales Einsetzen des G2/M-Checkpoints. Im Gegensatz zu dieser Arbeit beschrieben Zhang et al. jedoch ein früheres Aufheben des G2/M-Checkpoints in Artemis- Zellen als in den Kontrollzellen. Zwar wurde die Phosphorylierung von Artemis durch ATM nach IR nachgewiesen, in weiteren Untersuchungen konnte Artemis jedoch in keinen mechanistischen Zusammenhang mit weiteren Checkpoint-Mediatoren wie Chk1, Chk2 oder

128 Diskussion BP1 gebracht werden. Daher schlossen die Autoren, dass Artemis zwar nicht an der schnellen Initiation des G2/M-Checkpoints nach IR beteiligt sei. Vielmehr vermuteten Zhang et al., dass die Aufrechterhaltung des G2/M-Checkpoints über die nukleolytische Aktivität von Artemis vermittelt wird. Dies beruht auf Studien, die zeigten, dass für die nukleolytische Aktivität von Artemis eine Komplexierung mit DNA-PK notwendig ist (Ma et al., 2002). Die stärkste Interaktion dieser beiden Proteine tritt dabei erst mehrere Stunden nach IR auf (Zhang et al., 2004). Die Checkpoint-Studien von Zhang et al. wurden in Tumorzelllinien mittels Artemis-RNAi durchgeführt. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass diese Tumorzellen Defekte in der Checkpoint-Regulation besitzen. So ist für die u. a. verwendeten HeLa-Zellen bekannt, dass sie ein stark reduziertes Niveau an p53 aufweisen (Scheffner et al., 1991). p53 ist nicht an der schnellen Aktivierung des G2/M-Checkpoints beteiligt. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass dessen Funktion als Transkriptionsfaktor für die Aufrechterhaltung des G2/M-Checkpoints benötigt wird (Taylor & Stark, 2001). Weshalb jedoch Artemis-depletierte Zellen in diesem Fall den G2/M-Checkpoint zu einem früheren Zeitpunkt aufheben als unbehandelte Tumorzellen, bleibt weiterhin ungeklärt. Da die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen alle an primären humanen Fibroblasten durchgeführt wurden, welche im Gegensatz zu Tumorzellen genetisch stabil sind, ist davon auszugehen, dass das Verhalten von Artemis-Zellen hier der physiologischen Situation nach Bestrahlung näher kommt. Es ist allerdings anzumerken, dass jeweils nur eine primäre humane Artemis-defiziente Fibroblasten-Zelllinie mit einer WT-Zelllinie verglichen wurde. Aufgrund unterschiedlicher genetischer Hintergründe könnte dies zu variablen Ergebnissen führen. Jedoch wurden sowohl in unserer Arbeitsgruppe als auch in der Arbeitsgruppe von P. A. Jeggo weitere Experimente zum Verhalten des G2/M-Checkpoints sowohl mit zusätzlichen primären humanen Fibroblasten-Zelllinien als auch mit embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) durchgeführt, welche alle eine verlängerte Aufrechterhaltung des G2/M-Checkpoints in Artemis-Zellen aufweisen (Deckbar et al., 2007). Die Ursache für die Diskrepanz hinsichtlich der Checkpoint-Aufhebung dieser beiden Arbeiten lässt sich somit nicht eindeutig klären. Eine kürzlich veröffentlichte Nachfolgestudie derselben Arbeitsgruppe zeigte, dass Artemis- Zellen, welche eine Mutation an zwei ATM-abhängigen Phosphorylierungsstellen aufweisen, nach IR länger in der G2-Phase akkumulieren als WT-Zellen (Geng et al., 2007). Es wurde postuliert, dass eine Phosphorylierung an diesen zwei Phosphorylierungsstellen Artemis inaktiviere, wodurch eine Wechselwirkung mit dem CDK1/CyclinB-Komplex unterbunden würde. Die dadurch fehlende Aktivierung des CDK1/CyclinB-Komplexes resultiere in einer

129 Diskussion 119 verlängerten Aufrechterhaltung des G2/M-Checkpoints. Dadurch bekräftigen die Autoren die Rolle von Artemis als Checkpoint-Regulator. Es wurde jedoch keine direkte Interaktion von Artemis mit CDK1 oder CyclinB nachgewiesen. Zusätzlich zum G2/M-Checkpoint untersuchten Zhang et al. und Geng et al. auch das Reparaturverhalten von Artemis-Zellen. Neben in vitro-assays führten Zhang et al. PFGE- Experimente mit bestrahlten Tumorzellen durch, in denen Artemis durch RNAi herunterreguliert wurde (Zhang et al., 2004). Bis 4h nach Bestrahlung sahen die Autoren keinen Unterschied in der DSB-Reparatur zwischen Artemis-Zellen und WT-Zellen und kamen daher zu dem Schluss, dass Artemis keine signifikante Rolle in der DSB-Reparatur durch NHEJ einnähme. Zusätzlich berufen sie sich auf Untersuchungen von Nicolas et al., welche ebenfalls keinen Reparaturdefekt in Artemis-Zellen finden konnten (Nicolas et al., 1996). Geng et al. untersuchten das DSB-Reparaturvermögen der Phosphorylierungsmutanten von Artemis anhand der Detektion des γh2ax-signals im Western Blot und fanden erneut keinen Reparaturdefekt. Es wäre denkbar, dass der Reparaturdefekt dieser Mutanten aufgrund des recht insensitiven Nachweisverfahrens nicht nachgewiesen werden konnte, und dass diese beiden Phosphorylierungsstellen für die DSB-Reparatur essentiell sind. Der von ihnen beobachtete verlängerte G2-Arrest könnte somit auf einen Reparaturdefekt der Phosphorylierungsmutanten zurückzuführen sein. Die verlängerte Inaktivierung des CDK1/CyclinB-Komplexes könnte z.b. auf eine Aufrechterhaltung der Chk1- oder der ATM- Aktivierung durch unreparierte DSBs zurückgeführt werden. Dies wäre konsistent mit den in dieser Arbeit erlangten Ergebnissen. Der Defekt im G2/M-Checkpoint von AT-Zellen wirft die Frage auf, warum dieser nicht wie bei in S-Phase bestrahlten Zellen durch ATR induziert und aufrecht erhalten werden kann. Ursprünglich ging man davon aus, dass ATM und ATR spezifische, nicht-redundante Funktionen haben. Während ATR besonders in der S-Phase aufgrund Replikationsassoziierter DNA-Läsionen sowie nach UV-Strahlung aktiviert werden sollte, sprach man ATM die Aktivierung durch IR-induzierte DSBs zu (Kurz & Lees-Miller, 2004; Li & Zou, 2005). Mittlerweile weiß man jedoch, dass ATR auch außerhalb der S-Phase durch IR aktiviert werden kann. Während ATM nach IR sehr schnell aktiviert wird, findet die Aktivierung von ATR verzögert statt. Auch konnte eine verzögerte, ATR-abhängige Phosphorylierung von p53 am Ser15 in AT-Zellen beobachtet werden (Tibbetts et al., 1999). Dies steht in Einklang mit hier durchgeführten Checkpointstudien an AT-Zellen. In beiden Ansätzen der FACS-Analyse fällt beim Vergleich der AT-Kurve mit der Kurve der Checkpoint-inhibierten WT-Zellen auf, dass AT-Zellen zu frühen Zeiten (2h und 4h) genauso

130 Diskussion 120 schnell in die Mitose progressieren wie Checkpoint-inhibierte WT-Zellen. Bei längeren Zeiten zeigt die Kurve der AT-Zellen dagegen ein leichtes Abknicken, d.h. die Progression der AT- Zellen verlangsamt sich im Vergleich zu den Chk1/2-inhibierten WT-Zellen. Für die BrdU- FACS-Analysen ließe sich argumentieren, dass das Abflachen der Kurve nach längeren Zeiten auf einen G2-Arrest der Zellen zurückgeführt werden könnte, welche zum Zeitpunkt der Bestrahlung noch in der späten S-Phase waren. Die phosphoh3-experimente wurden jedoch unter Anwesenheit von Aphidicolin durchgeführt, so dass hier jegliche S-Phase- Effekte ausgeschlossen werden können. Die Verzögerung muss somit auf Ereignisse während der G2-Phase zurückzuführen sein. Dies könnte darauf hindeuten, dass nach längeren Zeiten auch in AT-Zellen der G2/M-Checkpoint induziert wird. Eine mögliche Erklärung wäre, dass in WT-Zellen die initialen DSBs direkt von ATM erkannt werden, während die durch Prozessierung der DSBs entstehenden Intermediate, z.b. lange Bereiche ssdna wie sie bei der HR auftreten, zur Aktivierung von ATR führen (Brown & Baltimore, 2000; O'Connell & Cimprich, 2005). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass ATM und ATR nach IR in derselben Signalkaskade operieren, welche letztlich in der Aktivierung von Chk1 resultiert. Die Gruppe um S. Jackson entwickelte dabei ein Modell, nach dem die Erkennung des DSBs durch ATM und den MRN-Komplex den initialen Schritt darstellt (Jazayeri et al., 2006). Im zweiten Schritt würde der Bruch durch den MRN- Komplex prozessiert, was zur Entstehung langer einzelsträngiger, RPA-beladener DNA- Bereiche führt. Diese stellten schließlich das Signal für die Aktivierung von ATR und die damit verbundene Chk1-Phosphorylierung dar. Das genaue Zusammenspiel des MRN- Komplexes mit ATM bei der Schadenserkennung und -prozessierung sowie der Signalweiterleitung ist noch nicht vollständig geklärt. So konnte z.b. gezeigt werden, dass die Autophosphorylierung von ATM und somit dessen Aktivierung durch einen funktionellen MRN-Komplex stimuliert wird (Costanzo et al., 2004; Lee & Lim, 2006). Auf der anderen Seite wird sowohl NBS1 als auch Mre11 von ATM phosphoryliert, was möglicherweise die Nuklease-Aktivität von Mre11 beeinflussen könnte (Costanzo et al., 2001; D'Amours & Jackson, 2002). Es wäre daher möglich, dass die direkte Erkennung des DSBs durch den MRN-Komplex erfolgt, dieser die Aktivierung von ATM z.b. durch Veränderungen der Chromatinstruktur fördert, was zu einer weiteren Erhöhung der MRN-Aktivität führen würde (positive Rückkopplung). Es wäre somit denkbar, dass auch in Abwesenheit von ATM eine Prozessierung der Bruchenden durch Mre11 mit geringerer Effizienz durchgeführt werden könnte. Die dadurch entstehenden langen einzelsträngigen DNA-Bereiche könnten nach Bindung von Rad51 und RPA zur ATR- und schließlich zur Chk1- und/oder der p53-

131 Diskussion 121 Aktivierung führen. In diesem Szenario würde der Aktivierung des G2/M-Checkpoints eine, aufgrund fehlenden ATMs eingeschränkte Prozessierung der DSBs vorausgehen, was erklären würde, weshalb die Induktion des Checkpoints in AT-Zellen erst einige Stunden nach der Bestrahlung stattfindet. Gestützt wird diese These durch weitere Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe. Es ist bekannt, dass Rad51 nach Auftreten langer Bereiche ssdna in großer Anzahl an den DNA-Schaden rekrutiert wird und dort immunfluoreszenz-mikroskopisch sichtbare Foci ausbildet (Morrison et al., 1999; Bekker-Jensen et al., 2006). Untersuchungen zur zeitlichen Abfolge des Erscheinens von Rad51-Foci in bestrahlten AT-Zellen zeigten, dass in diesen im Vergleich zu WT-Zellen die Foci zeitlich verzögert und in geringerer Zahl auftreten (Kerstin Längler, persönl. Mitteilung). Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die Prozessierung der Bruchenden in AT-Zellen nach längeren Zeiten stattfindet, jedoch stark beeinträchtigt ist. Dieses geringere und verspätete Auftreten könnte dafür verantwortlich sein, dass in AT-Zellen der G2/M-Checkpoint zwar nach langen Zeiten induziert wird, dass das Ausmaß der ssdna jedoch nicht zu einer vollständigen Aktivierung von ATR ausreicht und somit der Checkpoint nicht effizient induziert werden kann Über das Zusammenspiel von DSB-Reparatur und Checkpoints in der G2-Phase Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Rollen von Checkpoints und DSB-Reparatur bei der Vermeidung chromosomaler Aberrationen zu untersuchen und deren Beitrag zu beurteilen. Die dazu benötigten Zellsysteme wurden etabliert und ihre Reparatur- bzw. Checkpoint- Funktionen charakterisiert. Während mit WT-Zellen ein Zellsystem zur Verfügung stand, Abb. 5.1: Schematische Darstellung der experimentellen Vorgehensweise zur Untersuchung des Zusammenspiels von DSB-Reparatur und Checkpoint-Kontrolle bei der Entstehung chromosomaler Brüche in der Mitose.

132 Diskussion 122 welches in beiden Funktionen profizient ist, konnte gezeigt werden, dass AT-Zellen einen Defekt in beiden Funktionen aufweisen. Mit Artemis-Zellen stand ein Zellsystem zur Verfügung, welches auch in der G2-Phase denselben Reparaturdefekt wie AT-Zellen besitzt, aber Checkpoint-defizient ist. Durch den Einsatz des Chk1/2-Inhibitors in WT-Zellen konnte ein Zellsystem gefunden werden, welches in der G2-Phase denselben Checkpointdefekt wie AT-Zellen besitzt, aber Reparatur-profizient ist. Um nun das Zusammenspiel dieser Funktionen zu untersuchen, wurden chromosomale Studien in der Mitose durchgeführt. Abschließend wurde bewertet, inwieweit der Reparatur- als auch der Checkpoint-Status einer Zelle eine Auswirkung auf die Entstehung chromosomaler Brüche hat Chromosomale Untersuchungen in der Mitose Um das Zusammenspiel von DSB-Reparatur und Regulation des G2/M-Checkpoints zu charakterisieren, wurden chromosomale Studien an mitotischen WT-, Artemis- und AT- Zellen durchgeführt. Diese wurden in der G2-Phase bestrahlt, passierten den G2/M- Checkpoint und wurden anschließend in der Mitose auf Chromosomenbrüche untersucht. Dies geschah sowohl in An- als auch in Abwesenheit des Checkpoint-Inhibitors SB Durch die Akkumulation der in bestimmten Zeitintervallen in die Mitose progressierenden Zellen wurde erreicht, dass alle Zellen, welche im Zeitraum von 1h-12h nach Bestrahlung den G2/M-Checkpoint passierten, in die Auswertung eingingen. Anhand der durchflusszytometrischen Daten ist ersichtlich, dass es sich hierbei um 75-95% aller in der G2-Phase bestrahlten Zellen handelte. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass das Verschwinden der Chromatidbrüche mit dem der DSBs einhergeht und somit auf die Reparatur der Brüche zurückgeführt werden kann (Mozdarani & Bryant, 1987). Somit wurden aus den Werten für die mitotischen Brüche der einzelnen Zeitpunkte nach Bestrahlung Reparaturkinetiken erstellt. Diese zeigen für die einzelnen Zelllinien große Unterschiede. 2h nach Bestrahlung besitzen WT-Zellen ~3 Brüche pro mitotischer Zelle. Bei längeren Reparaturzeiten fällt die Kurve ab, und ab 8h bildet sich ein Plateau bei ~1 Bruch pro Zelle aus. In den Reparatur-defizienten Artemis-Zellen ist zu allen Zeitpunkten eine Erhöhung der Brüche pro mitotischer Zelle um den Faktor 1,5-2 zu erkennen, und analog zu den WT-Zellen bildet sich in dem Zeitrahmen von 8h bis 12h ein Plateau aus. Dieses liegt dabei mit ~2 Brüchen pro mitotischer Zelle etwa doppelt so hoch wie bei den WT-Zellen. Dies ist vergleichbar mit den durch γh2ax-ifm gewonnenen Reparaturkinetiken, in denen Artemis-Zellen nach 8h Reparatur etwa doppelt so viele γh2ax-foci

133 Diskussion 123 aufweisen wie WT-Zellen (Deckbar et al., 2007). Folglich führt ein Reparaturdefekt in der G2-Phase nach IR auch zu einer Erhöhung der mitotischen Brüche pro Zelle. AT-Zellen besitzen ein extrem hohes Maß an mitotischen Brüchen. Ihre Bruchzahlen liegen zu allen Zeiten etwa dreimal höher als die der WT-Zellen, zeigen aber auch ein stärkeres Abfallen der Kinetik. Hier ist keine Ausbildung eines Plateaus zu erkennen, stattdessen nähern sich die Kurven nach längeren Reparaturzeiten derjenigen der Artemis-Zellen an. Die Untersuchung mitotischer Brüche ist der erste experimentelle Ansatz, in dem AT- und Artemis-Zellen unterschiedliche Reparaturkinetiken besitzen. In allen sowohl im Rahmen dieser Arbeit als auch vorher durchgeführten Experimenten zur Reparatur von DSBs in der G1- und G2-Phase zeigten AT- und Artemis-Zellen ein identisches Reparaturverhalten, was zu dem Schluss führte, dass diese beiden Proteine am selben Reparaturweg beteiligt sind. (Riballo et al., 2004; Deckbar et al., 2007). Dabei wurde immer Wert darauf gelegt, mögliche Effekte der Zellzyklusprogression auf die Ergebnisse der Reparaturstudien auszuschließen. Mit den mitotischen Brüchen wurden erstmals DSBs untersucht, welche zwischen Bestrahlung und Analyse einen Checkpoint passieren mussten. Daraus lässt sich schließen, dass die Differenz zwischen AT- und Artemis-Zellen auf den Checkpoint-Defekt der AT- Zellen zurückführen ist. Dies wird durch die Werte nach Inhibierung des G2/M Checkpoints mittels SB bestätigt. Die Inhibierung hat in AT-Zellen erwartungsgemäβ keine Auswirkungen auf die Anzahl der mitotischen Brüche. Dagegen führt die Zugabe des Inhibitors zu Artemis-Zellen zu einer Erhöhung der mitotischen Brüche auf das Niveau der AT-Zellen. Dies untermauert die Ergebnisse, dass ATM und Artemis auch in der G2-Phase denselben Reparaturdefekt besitzen. Der Reparaturdefekt von AT-Zellen (repräsentiert durch Artemis-Zellen) führt damit zu einer moderaten Erhöhung der chromosomalen Brüche in der Mitose, während der zusätzliche Defekt im G2/M-Checkpoint (repräsentiert durch AT-Zellen) eine weitere Erhöhung der mitotischen Brüche bewirkt. Der Effekt der Reparatur-Defizienz und der Effekt der Checkpoint-Defizienz addieren sich dabei auf das Niveau einer doppelten Defizienz. Die Inhibierung der Checkpoint-Funktion von ATM in einem Reparaturprofizienten Hintergrund führt ebenfalls zu einer Erhöhung der mitotischen Brüche, jedoch nicht in dem Maße wie in AT- oder Checkpoint-inhibierten Artemis-Zellen. Folglich wird sowohl ein Defekt in der DSB-Reparatur als auch ein Defekt in der Regulation des G2/M- Checkpoints benötigt, um die hohe Anzahl an mitotischen Brüchen von AT-Zellen zu erreichen. Wie bereits diskutiert, beruht der Reparaturdefekt von AT- und Artemis-Zellen vermutlich auf ihrer Unfähigkeit, komplexe Brüche zu reparieren. Der Reparaturdefekt wird daher erst zu

134 Diskussion 124 Zeiten sichtbar, zu denen alle einfachen Brüche repariert wurden. In den mitotischen Chromosomen ist ein Reparaturdefekt in beiden Zelllinien bereits 2h nach Bestrahlung messbar. Das erhöhte Maß an Brüchen in AT-Zellen lässt sich dabei durch den Checkpoint- Defekt dieser Zellen erklären. Dagegen sind Artemis-Zellen Checkpoint-profizient und zeigten in allen G1- und G2-Reparaturstudien in den ersten Stunden nach Bestrahlung dasselbe Verhalten wie WT-Zellen (Riballo et al., 2004; Deckbar et al., 2007). Somit wurde in den mitotischen Chromosomenstudien zu frühen Zeiten nach Bestrahlung in Artemis- Zellen kein Unterschied zu WT-Zellen erwartet. Die Ursache für die Erhöhung der Bruchzahlen könnte im Entstehungsmechanismus von chromosomal sichtbaren Chromatidbrüchen liegen. So wäre es möglich, dass bevorzugt komplexe Brüche, für deren Reparatur die Prozessierung durch Artemis benötigt wird, zu auf chromosomaler Ebene sichtbaren Brüchen werden. Es wurde beobachtet, dass vor allem komplexe Brüche mit einer langsamen Kinetik repariert werden (Rydberg et al., 2005). Weiterhin wird vermutet, dass gerade Brüche, welche mit langsamer Kinetik repariert werden, zu einer Erhöhung der Aberrationsrate führen (Iliakis et al., 2004). Es wäre z.b. möglich, dass die Enden von Brüchen, welche über längere Zeit unrepariert verbleiben, eher auseinander diffundieren als Brüche, welche schnell repariert werden, und somit eher zu Chromatidbrüchen werden. Eine andere Erklärung wäre, dass sich besonders die Lokalisation der DSBs innerhalb des Genoms auf die Entstehung von Chromatidbrüchen auswirkt. Wie bereits in Kap. 5.2 diskutiert wurde, scheint ATM eine Rolle bei der Relaxation des Chromatins bei Auftreten eines DSBs zu spielen (Ziv et al., 2006). Es wäre denkbar, dass ATM und Artemis besonders für die Reparatur von DSBs, die innerhalb bestimmter Chromatinbereiche auftreten, benötigt werden und dass gerade DSBs in diesen Chromatinbereichen bei der Kondensation bevorzugt zu Chromatidbrüchen werden. Gegen diese Theorie spricht jedoch, dass zu kurzen Zeiten WT-, AT- und Artemis-Zellen dieselbe Anzahl an PCC-Brüchen in der G2-Phase aufweisen. Während AT-Zellen somit vor und hinter dem G2/M-Checkpoint etwa dasselbe Niveau an chromosomalen Brüchen aufweisen, ist dieser in WT- und Artemis-Zellen hinter dem G2/M- Checkpoint signifikant verringert. Dies könnte auf eine Selektion zu Zellen mit wenigen Brüchen durch den Checkpoint hindeuten, welche in WT-Zellen besser funktioniert als in Artemis-Zellen. Über mögliche Mechanismen kann jedoch nur spekuliert werden. Weiterhin wäre es möglich, dass es in der Ausbildung von Chromatidbrüchen Unterschiede zwischen der natürlichen Kondensation in der Mitose und der artifiziellen Kondensation durch Calyculin A gibt, so dass ein direkter Vergleich nicht zwingend gezogen werden kann. Die Erhöhung der mitotischen Brüche in Artemis-Zellen gegebnüber WT-Zellen zu kurzen Zeiten

135 Diskussion 125 nach Bestrahlung wurde auch in einer kürzlich veröffentlichten Studie von Darroudi et al. gefunden. Dabei besaßen Artemis-Zellen 3h nach Bestrahlung etwa drei mal mehr Chromatidbrüche als WT-Zellen (Darroudi et al., 2007). Es ist somit davon auszugehen, dass es sich bei der hier gemessenen Erhöhung nicht um ein Artefakt handelt, auch wenn die zugrunde liegenden Mechanismen nicht vollständig verstanden sind. In derselben Studie an primären humanen Fibroblasten wurde dagegen kein signifikanter Unterschied in der Höhe des Bruchniveaus zwischen Artemis- und AT-Zellen gemessen (Darroudi et al., 2007). Dies widerspricht den Daten dieser Arbeit und könnte mit dem Zeitpunkt der Colcemid-Zugabe zusammenhängen. In der vorliegenden Arbeit wurden nur Zellen ausgewertet, die während der Bestrahlung in der G2-Phase waren. Daher wurde das unterschiedliche Bruchniveau zwischen AT- und Artemis-Zellen auf den Checkpoint-Defekt von AT-Zellen zurückgeführt. Die Zugabe von Colcemid direkt nach Bestrahlung führt dazu, dass in erster Linie Zellen analysiert wurden, die während der Bestrahlung in der Mitose waren, so dass der Checkpoint-Defekt der AT-Zellen nur eine verringerte Rolle spielt. Konsistent mit dieser Arbeit ist, dass auch bei Darroudi et al. der Reparaturdefekt von ATund Artemis-Zellen bereits 3h nach Bestrahlung sichtbar ist. Dies bekräftigt die Theorie, dass bevorzugt die ATM-abhängigen Brüche zur Entstehung von auf chromosomaler Ebene sichtbaren Chromatidbrüchen führen. Vergleicht man die hier gemessenen Absolutzahlen an mitotischen Brüchen mit Werten aus der Literatur, so fällt auf, dass es hierbei teilweise große Unterschiede gibt. Dies lässt sich u. a. auf die verschiedenen verwendeten Zellsysteme zurückführen, aber auch auf die unterschiedlichen Bestrahlungsbedingungen, unterschiedliche Kriterien bei der Auswertung der Metaphasespreitungen und vor allem auf Unterschiede in der Versuchsdurchführung. Daher sollen im Folgenden nur einige Arbeiten exemplarisch diskutiert werden. Terzoudi et al. fanden in lymphoblastoiden WT-Zellen 90min nach 1Gy γ-strahlung etwa 3 Brüche pro mitotischer Zelle, was konsistent mit den Daten dieser Arbeit ist (Terzoudi et al., 2005). In einer anderen Studie an SV40-transformierten Fibroblasten wurden 1h nach 1Gy Röntgenstrahlung ebenfalls ~3 Brüche pro mitotischer Zelle gemessen, während dieser Wert in AT- Zellen 1,5h nach 1Gy bei etwa 5,5 Brüchen lag, was erneut konsistent mit den Ergebnissen dieser Arbeit ist (Mozdarani & Bryant, 1989). In der Studie von Darroudi et al. bildeten WT- Zellen 3h nach 1Gy Röntgenstrahlung ~ 0,5 Brüche pro mitotischer Zelle aus, während der Wert bei AT- und Artemis-Zellen gleichermaßen auf ~ 1,5 Brüche pro mitotischer Zelle anstieg (Darroudi et al., 2007). Die Werte liegen somit um ein Vielfaches niedriger als in dieser Arbeit. In der Studie von Darroudi et al. waren die Zellen dem Colcemid 3h ausgesetzt,

136 Diskussion 126 während dies in der Studie von z.b. Terzoudi et al. sowie in dieser Arbeit nur 1-2h waren. Eine mögliche Erklärung für die Diskrepanz in der Höhe der Chromatidbrüche wäre, dass bei längerer Einwirkzeit des Colcemids die Chromatiden stärker kondensieren und sich weniger Chromatidbrüche ausbilden. Weiterhin wurde bei Darroudi et al. das Colcemid direkt nach Bestrahlung zugegeben, während dies sowohl bei Terzoudi et al. als auch in dieser Arbeit 30min bzw. 1h nach Bestrahlung geschah. Durch die spätere Zugabe sollte verhindert werden, dass Zellen ausgewertet wurden, welche sich während der Bestrahlung in der Mitose befunden hatten. Da WT-Zellen nach Bestrahlung den G2/M-Checkpoint aktivieren, progressieren in den ersten Stunden nach Bestrahlung kaum Zellen in die Mitose. Die Zugabe des Colcemids direkt nach Bestrahlung führt somit dazu, dass ein Großteil der ausgewerteten Zellen bereits während der Bestrahlung in der Mitose war. Hinweise darauf, dass der Zeitpunkt der Colcemidzugabe für die Höhe der erhaltenen Chromatidbrüche von Relevanz ist, liefert eine Arbeit an malignen Hautfibroblasten (Parshad et al., 1982). Dabei konnte gezeigt werden, dass bei Zugabe von Colcemid 1h nach Bestrahlung mit 1Gy und einer weiteren Stunde Reparaturzeit jede Zelle ~3,7 Chromatidbrüche aufwies, während dies bei direkter Zugabe und 2h Reparaturzeit nur ~1,3 Chromatidbrüche waren. Bei primären Hautfibroblasten wurde die Anzahl an Brüchen pro Zelle nur nach direkter Zugabe von Colcemid gemessen, und diese wiesen eine sehr geringe Bruchzahl auf. Es wäre denkbar, dass sich eine Bestrahlung in der Mitose weniger stark auf die Entstehung von Chromatidbrüchen auswirkt als eine Bestrahlung vor der Chromatinkondensation. So könnte während der Kondensation ein DSB eher zur Ausbildung eines Chromatidbruchs führen als ein DSB in bereits kondensiertem Chromatin, da hier aufgrund der sehr dicht gepackten DNA ein DSB wesentlich seltener die chromosomale Kontinuität zerstören könnte. Hinweise darauf lieferten u. a. Arbeiten, in denen Zellen bestrahlt und direkt fixiert wurden, so dass in die Auswertung nur mitotische Zellen eingingen (MacLeod & Bryant, 1992). Die erhaltenen Werte für Chromatidbrüche lagen dabei um den Faktor 10 niedriger als bei einer Probe, welcher 30min nach Bestrahlung Colcemid zugegeben wurde, und die erneut 30min später geerntet wurde. Weitere Hinweise, dass stärker kondensiertes Chromatin weniger Chromatidbrüche ausbildet, lieferte auch die Arbeitsgruppe um M. Durante (Gotoh et al., 1999). Sie brachten bereits vor Bestrahlung durch die Zugabe von Calyculin A das Chromatin zum Kondensieren, um nach der Bestrahlung Chromatidbrüche auszuwerten. Dabei konnten sie zeigen, dass eine starke Kondensation des Chromatins vor der Bestrahlung die Anzahl der Chromatidbüche nach der Bestrahlung um einen Faktor 10 verringerte. Demnach können bereits kleine Änderungen im experimentellen Aufbau große Abweichungen in der Zahl der Chromatidbrüche bewirken.

137 Diskussion Ein neues Konzept zur Betrachtung chromosomaler Studien Bisher wurden sowohl in dieser Arbeit als auch in der Literatur die Brüche pro mitotischer Zelle quantifiziert und miteinander verglichen. Dabei wurden jedoch immer nur jene Zellen in die Auswertung mit einbezogen, welche in dem jeweiligen Zeitintervall die Mitose erreichten, ungeachtet der Gesamtzahl an präparierten Zellen. In den Untersuchungen zum Verhalten des G2/M-Checkpoints konnte gezeigt werden, dass sich die unterschiedlichen Zelllinien in ihrer Progression in die Mitose unterscheiden, d.h. zu den verschiedenen Zeiten eine unterschiedliche Anzahl an Zellen in die Mitose eintritt. Um quantitativ zu erfassen, welchen Beitrag die DSB-Reparatur und welchen Beitrag die Zellzykluskontrolle bei der Erhaltung der chromosomalen Stabilität leisten, wurden die Daten der Chromosomenstudien in der Mitose mit den FACS-Daten nach BrdU-Inkorporation bzw. mit den Daten aus der phosphoh3-analyse zur Aufrechterhaltung des G2/M-Checkpoints verrechnet. Die einzelnen Punkte der erhaltenen Kinetiken geben nun nicht mehr die pro mitotischer Zelle gemessenen Brüche wieder, sondern die Gesamtzahl an Brüchen in der Mitose, welche in einer Population von 1000 bestrahlten G2-Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt auftritt. Obwohl beide Arten der Berechnung auf durch unterschiedliche Verfahren erhaltenen Daten beruhen, bringen sie sowohl qualitativ als auch quantitativ ein sehr ähnliches Ergebnis. Sowohl WT- als auch Artemis-Zellen weisen nach kurzen Zeiten ein sehr niedriges Niveau an chromosomalen Brüchen in der Mitose auf. Bei WT-Zellen treten die meisten mitotischen Brüche im Zeitraum von 6h-8h nach Bestrahlung auf, Artemis-Zellen zeigen dieses Maximum 2h später. AT-Zellen weisen die meisten Brüche in der Mitose direkt nach der Bestrahlung auf, wobei das Ausmaß an mitotischen Brüchen das der WT- und der Artemis-Zellen um ca. den Faktor 10 übersteigt. Mit ansteigender Reparaturzeit nimmt dieser Wert stark ab. Der Vergleich der errechneten Werte für die Gesamtzahl an mitotischen Brüchen mit den ursprünglichen FACS-Daten zeigt, dass die Gesamtzahl an mitotischen Brüchen ihr Maximum jeweils zu den Zeiten aufweist, zu denen sich die meisten Zellen in der Mitose befinden bzw. die Abnahme der G2-Zellen am größten ist. In Checkpoint-profizienten Zellen repräsentiert dies die Aufhebung des G2/M-Checkpoints. Bestrahlte WT- und Artemis-Zellen besitzen nach kurzen Reparaturzeiten ein erhöhtes Maß an Brüchen pro mitotischer Zelle. Da zu diesen Zeiten jedoch nur sehr wenige dieser stark geschädigten Zellen den G2/M- Checkpoint überwinden, ist deren Beitrag zur Gesamtzahl der mitotischen Brüche relativ gering. Bei AT-Zellen ist der Zeitverlauf des Auftretens chromosomaler Brüche in der Mitose ein anderer als bei Artemis- und WT-Zellen. Im Gegensatz zu den Checkpoint-profizienten

138 Diskussion 128 Zellen progressieren diese Checkpoint-defizienten Zellen vor allem zu den kurzen Reparaturzeiten ungehindert in die Mitose, bis sich nahezu keine Zellen mehr in der G2-Phase befinden. Da nach kurzen Zeiten die Anzahl der unreparierten Brüche pro Zelle noch sehr hoch ist, tritt bei AT-Zellen auch der Großteil der mitotischen Brüche nach kurzen Reparaturzeiten auf und übertrifft dabei das Maximum der WT- und Artemis-Zellen um ein Vielfaches. Somit wird deutlich, dass die chromosomale Stabilität einer Zellpopulation nicht von einzelnen Zellen abhängt, die mit einer Vielzahl an Brüchen den G2/M-Checkpoint überwinden. Vielmehr treten Chromosomenbrüche in der Mitose vor allem dann auf, wenn der G2/M-Checkpoint zu Zeiten aufgehoben wird, zu denen die Zellen noch viele DSBs besitzen. Die kombinierte Betrachtung von mitotischen Brüchen und Zellzyklusverhalten verdeutlicht die Kooperation zwischen Reparatur und Checkpoint-Kontrolle. So wird der G2/M- Checkpoint in Reparatur-defizienten Artemis-Zellen länger aufrechterhalten als in WT-Zellen. Durch die längere Aufrechterhaltung des Checkpoints profitieren besonders Reparaturdefiziente Zellen, da diesen auf diese Weise mehr Zeit für die Reparatur der Schäden zur Verfügung gestellt wird. Dies zeigt sich auch in der Addition der errechneten mitotischen Brüche aller Zeitpunkte (Abb. 5.2). Hierdurch erhält man eine Abschätzung, wie viele Brüche eine Population von 1000 in der G2-Phase bestrahlten Zellen in der Mitose aufweist. Dabei übertreffen Artemis-Zellen den WT nur etwa um den Faktor 1,2, während bei AT-Zellen 3,5-4 mal mehr Brüche auftreten. Diese Darstellung lässt erkennen, dass die Checkpoint- Abb. 5.2: Akkumulation der errechneten mitotischen Gesamtbrüche. (A) Akkumulation der mitotischen Brüche anhand der mittels phosphoh3-analyse gewonnenen Gesamtzahl mitotischer Brüche im Zeitraum 1h-12h nach Bestrahlung mit 1Gy. (B) Akkumulation der mitotischen Brüche anhand der mittels BrdU-FACS-Analyse gewonnenen Gesamtzahl mitotischer Brüche im Zeitraum 1h-12h nach Bestrahlung mit 1Gy.

139 Diskussion 129 Profizienz von Artemis-Zellen bis zu einem gewissen Maße für ihren Reparaturdefekt kompensieren kann, so dass das Niveau an mitotischen Brüchen nur minimal gegenüber WT- Zellen erhöht ist. Auf der anderen Seite zeigen Checkpoint-inhibierte WT-Zellen eine deutliche Erhöhung in der Gesamtzahl an mitotischen Brüchen, erreichen jedoch ebenfalls nicht die Anzahl von AT-Zellen. Dies verdeutlicht, dass weder der Reparaturdefekt alleine noch der Checkpointdefekt von AT-Zellen ausreicht, um die Höhe der chromosomalen Brüche in der Mitose zu erklären, d.h. beide Defekte sind an deren Entstehung beteiligt. Dabei leistet der Reparaturdefekt nur einen geringen Beitrag zur hohen chromosomalen Bruchrate von AT-Zellen, während der Checkpointdefekt zu einer deutlich größeren Erhöhung der Gesamtbruchzahl führt. Erst der duale Defekt von Reparatur und Checkpoint-Kontrolle führt zu der ausgeprägten chromosomalen Instabilität von AT-Zellen. Addiert man die Differenz zwischen Artemis- und WT-Zellen (Beitrag des Reparaturdefekts) auf die Differenz zwischen Checkpoint-inhibierten WT-Zellen und Checkpoint-profizienten WT-Zellen (Beitrag des Checkpointdefekts), so erreicht man immer noch nicht das Ausmaß an mitotischen Brüchen von AT-Zellen. Dieser Effekt ist bei der Verrechnung mit den BrdU- Daten deutlicher als mit den phosphoh3-daten. Daraus lässt sich schließen, dass diese beiden Funktionen von ATM synergistisch und nicht additiv wirken. D.h. durch den Ausfall beider Funktionen entsteht ein Ausmaß an chromosomalen Brüchen, welches größer ist als die Summe der chromosomalen Brüche der beiden einzelnen Defekte. Eine Kooperation zwischen NHEJ-Faktoren und Checkpoint-Proteinen im Hinblick auf maligne Transformationen wurde bereits im Mausmodell beschrieben (Nacht et al., 1996; Difilippantonio et al., 2000; Lim et al., 2000b). Der Ausfall eines NHEJ-Faktors führte dabei in der Regel zu einer leichten Erhöhung der chromosomalen Instabilität. Der zusätzliche Ausfall von p53 dagegen bewirkte das gehäufte Auftreten von Lymphomen und resultierte in einer signifikant verringerten Lebensspanne. So zeigte z.b. die Gruppe um F. W. Alt, dass Mäuse mit einem Defekt in Artemis oder p53 in der Regel T-Zell-Lymphome entwickelten (Rooney et al., 2004). Ein Doppel-Knock-Out dagegen führte zu der Entstehung von aggressiveren B-Zell-Lymphomen in einer früheren Lebensphase, so dass die Mäuse wesentlich früher starben. Dies veranlasste die Autoren zu der Vermutung, dass Artemis eine Funktion als Tumorsuppressor besitzt, welche in einem Checkpoint-defizienten Hintergrund zum Vorschein tritt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass AT- und Artemis-Zellen zwar in der G2-Phase denselben Reparaturdefekt besitzen, dass aber AT-Zellen aufgrund des zusätzlichen Checkpoint-Defekts ein wesentlich höheres Maß an chromosomalen Brüchen aufweisen. Dies

140 Diskussion 130 ist konsistent mit der Beobachtung, dass AT-Patienten mehr chromosomale Rearrangements besitzen als Artemis-Patienten. Weiterhin sind AT-Patienten wesentlich Krebs-anfälliger als Artemis-Patienten. Auf der anderen Seite besitzen beide Zelllinien trotz der Unterschiede in der Zellzyklusregulation und ihrer chromosomalen Stabilität eine ähnliche, hohe Strahlensensitivität, welche auch auf zellulärer Ebene anhand von Überlebensexperimenten nachgewiesen werden konnte (Riballo et al., 2004; McKinnon, 2004; O'Driscoll et al., 2004). Daraus ist ersichtlich, dass bereits der Reparaturdefekt ausreicht, um eine Strahlenempfindlichkeit zu verursachen. Aufgrund der zusätzlichen Checkpoint-Defekte proliferieren AT-Zellen nach Bestrahlung trotz unreparierter Brüche und Chromosomenaberrationen. Jedoch führt diese Proliferation nicht zu einer erhöhten Überlebensrate nach Bestrahlung und somit zur Strahlenresistenz der Zellen. Die ähnliche Strahlensensitivität trotz unterschiedlicher Zellzyklusregulation von AT- und Artemis-Zellen lässt spekulieren, dass die Mechanismen, welche zur Entstehung der Strahlensensitivität führen, verschieden sein könnten. Die Strahlensensitivität von AT-Zellen lässt sich vermutlich auf ihre aufgrund der Kombination von Reparatur- und Checkpointdefekt erhöhte chromosomale Instabilität zurückführen. Chromosomale Rearrangements sowie unreparierte Chromosomenfragmente können langfristig, sofern sie nicht zur Entartung der Zelle führen, den Verlust genetischen Materials oder die Inaktivierung essentieller Gene bedingen. Dies könnte zum Absterben der Zelle führen. Im Falle von Artemis-Zellen wäre es dagegen möglich, dass aufgrund des Reparaturdefekts Checkpoints aktiviert und nicht mehr aufgehoben werden, so dass die Zellen nicht mehr proliferieren können, was sich in den Überlebensexperimenten zur Messung der Strahlensensitivität in einem verminderten Überleben äußert Der Schwellencharakter des G2/M-Checkpoints Die Erhöhung der Strahlen-induzierten chromosomalen Brüche in der Mitose von WT- und Artemis-Zellen zu den Zeiten, zu denen der G2/M-Checkpoint aufgehoben wird, zeigt, dass Zellen in die Mitose progressieren, bevor die Schäden vollständig repariert wurden. Während dies nach kurzen Reparaturzeiten aufgrund des G2/M-Checkpoints nur bei einzelnen Zellen der Fall ist, wird nach längeren Zeiten (~6h in WT-Zellen, ~8h in Artemis-Zellen) der Checkpoint bei einem Großteil der Zellen aufgehoben. Die Zellen weisen zu diesen Zeitpunkten in der Mitose 1-1,5 chromosomale Brüche auf, G2-Phase-Zellen noch etwa 3-4 PCC-Brüche, was in beiden Fällen etwa 10mal mehr Brüche als der Hintergrund unbestrahlter Zellen darstellt. Somit besitzt nahezu jede Zelle, welche in die Mitose eintritt, chromosomale

141 Diskussion 131 Brüche. Wie aus den Chromosomendaten ersichtlich, zeigen Artemis-Zellen aufgrund ihres Reparaturdefekts zwar eine langsamere Reparatur, so dass zu einem bestimmten Zeitpunkt mehr Brüche auftreten als in WT-Zellen. Allerdings wird die Mehrzahl der Zellen erst zu einem späteren Zeitpunkt in die Mitose entlassen. Erstaunlicherweise resultiert daraus, dass in WT- und Artemis-Zellen zu den Zeiten, zu denen der Checkpoint aufgehoben wird, das Niveau an chromosomalen Brüchen sehr ähnlich ist. Diese Tatsache führt zur Theorie über die Existenz eines Schwellenwerts, welcher im Bereich von 3-4 PCC-Brüchen bzw. 1-1,5 mitotischen Brüchen liegen müsste. Eine Abschätzung erlaubt auch der Vergleich von Reparaturmessungen in der G2-Phase mittels γh2ax-ifm (Deckbar et al., 2007) mit den in dieser Arbeit gewonnenen FACS-Daten. Dabei weisen sowohl WT-Zellen als auch Artemis- Zellen zu den Zeitpunkten, zu denen der G2/M-Checkpoint aufgehoben wird, etwa 20 γh2ax-foci auf. Zudem wurden im Labor unserer Kooperationspartnerin P. A. Jeggo Experimente durchgeführt, in denen der MI sowie die Anzahl der γh2ax-foci in derselben Probe quantifiziert wurden. Diese führten ebenfalls zu dem Schluss, dass der G2/M- Checkpoint zu Zeiten aufgehoben wird, zu denen die Zelle noch ~ 20 γh2ax-foci aufweist (Deckbar et al., 2007). Diese γh2ax-foci können auch in ähnlicher Anzahl in der Mitose beobachtet werden (Abb. 5.3). Nicht jeder DSB wird in einen auf chromosomaler Ebene sichtbaren Chromatidbruch umgewandelt. Es wurde berichtet, dass ein PCC-Bruch etwa 3-6 DSBs entspricht (Cornforth & Bedford, 1993). Die in dieser Arbeit als Schwellenwert angenommenen 3-4 PCC-Brüche korrelieren somit mit den mittels γh2ax-ifm ermittelten ~ 20 Foci. Abb. 5.3: Immunfluoreszenzmikroskopische Aufnahmen primärerer humaner Fibroblasten in verschiedenen Stadien der Mitose. Die Zellen wurden mit 1Gy bestrahlt, nach 6h fixiert und gegen γh2ax (grün) und phosphoh3 (rot) gefärbt. Die DNA wurde mit DAPI (blau) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit 630facher Vergrößerung aufgenommen.