HERSTELLUNG, REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON GFP

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1 Ludwig-Maximilians Universität München Fakultät für Physik Center für NanoScience Lehrstuhl für angewandte Physik/Biophysik HERSTELLUNG, REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON GFP G4b GFP Expression und Schmelzkurven Version 2013

2 Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von GFP GFP - Ein Multitalent unter Proteinen Moleküle nach Maß - der Traum eines jeden Biophysikers ist realisierbar mit Methoden der modernen Biotechnologie. Dieser Praktikumsversuch bietet einen Einstieg in dieses faszinierende Gebiet und verschafft einen Überblick über das Methodenspektrum der Molekularbiologie. Ziel des Praktikumsversuches ist es anhand des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) grundlegende Methoden der Biotechnologie anzuwenden und zu erlernen. Ausgehend von einer kurzen Datenbankrecherche soll die DNA-Sequenz des Proteins identifiziert werden. Basierend auf der Sequenz wird diese im Labor isoliert und amplifiziert. Im Anschluss sollen E. coli-zellen so modifiziert werden, dass diese GFP produzieren (Vgl. Abb. 2). Abschließend wird mit Hilfe einer Schmelzkurven-Analyse GFP auf dessen Temperaturstabilität näher charakterisiert. GFP ist für die moderne Molekularbiologie so bedeutend, dass es für die Entdeckung 2008 für die Forscher Martin Chalfie, Osamu Shimomura und Roger Y. Tsien den Nobelpreis für Chemie gab. Die Besonderheit Biolumineszenz, d.h. an GFP das ist seine Molekül ist 2: E. coli-zellen im strukturbedingt, nach entsprechender Anregung, in Abbildung Rasterelektronenmikroskop [1] der Lage Energie in Form von Licht abzugeben. Natürlich vorkommend nutzt diesen Effekt der Wirtsorganismus einer Qualle (Aequorea victoria). GFP hat seit seiner Entdeckung rasant an Bedeutung gewonnen, weil es aufwändige Nachweisreaktionen größtenteils überflüssig machte. Es ist nun möglich unsichtbare Reaktionen und Vorgänge live zu verfolgen. Zum Beispiel lässt sich über ein Fusionsprotein aus Abbildung 1: Unterschiedliche Formen von GFP auf einer AgarPlatte [2] GFP und dem zu untersuchenden Gen dessen Produktion, über Fluoreszenz, nachvollziehen. Man ist darüber hinaus in der Lage mit Hilfe von fluoreszenten Proteinen bestimmte Zellstrukturen sichtbar zu machen. Das unglaubliche Potential von GFP spiegelt sich in den zahlreichen Derivaten Quantenausbeute, davon Emission- wieder. und Verschiedenen Absorptionsverhalten Eigenschaften oder wie Lebensdauer, ermöglichen eine Vielzahl an Anwendungen [2]. Abb. 1 zeigt einige der GFPDerivate, welche mit Hilfe von gentechnischen Veränderungen generiert wurden. 2

3 Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von GFP Im Praktikumsversuch selbst wird mit der nativen Form des GFPs und einem enhancedgfp (egfp) gearbeitet. Biophysikalische Parameter von GFP GFP kommt natürlich als Komplex mit einem anderen Protein (Aequorin) vor. Aequorin erzeugt mit Hilfe von Calciumionen Lichtquanten, welche durch Förster Transfer auf GFP übertragen werden [3]. GFP ist das einzige fluoreszierende Protein, das natürlich als Monomer vorkommt. Die Struktur eines Monomers ist in Abb. 3 dargestellt. Abbildung 3 Struktur von GFP aus Aequorea victoria (PDB ID: 1GFL): Im linken Bild ist das komplette GFP dargestellt. Im rechten Bild ist der Chromophor vergrößert dargestellt. GFP besitzt eine β-faßartige Struktur. Die gelben Pfeile symbolisieren sog. β-faltblätter. Bei GFP sind elf β-faltblätter so angeordnet, dass sie einen Zylinder/Faß bilden. Im inneren des Zylinders befindet sich eine a-helix (rot) die den Chromophor (blau) im Zentrum des Zylinders hält. Den Chromophor bilden drei aufeinanderfolgende Aminosäuren: Serin 6 5, Tyrosin 6 6, Glycin 6 7. Insgesamt handelt es sich durch diese zylindrische Struktur um ein sehr stabiles Protein. Die Loops ober- und unterhalb des Zylinders verhindern ein Eindringen anderer Moleküle, was die Fluoreszenz beeinträchtigen könnte [4]. Der Chromophor bildet sich autokatalytisch aus drei benachbarten Aminosäuren (Serin 65, Tyrosin 66, Glycin 67 ). Essentiell für die Emission der Fluoreszenz ist, dass das GFP korrekt gefaltet ist, d.h. dass das Protein in seiner β-faßartigen Struktur vorliegt. Nur so ist GFP in der Lage den Chromophor von seiner Umgebung abzuschirmen. Zusätzlich befinden sich die chromophorbildenden Aminosäuren, nur bei richtiger Proteinfaltung in unmittelbarer räumlicher Nähe und können den Chromophor bilden (vgl. Abb. 4). Der Chromphor besitzt zwei Absorptionsmaxima, da der Chromphor sowohl im protonierten (kurzwellige Bande) als auch im nicht protonierten (langwellige Bande) Zustand Licht absorbieren kann. Die Emission 3

4 Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von GFP der Fluoreszenz geht jedoch nur vom deprotonierten Zustand aus [4]. Abbildung 4: Links in der Abbildung wird GFP (PDB ID: 1EMA) von der Draufsicht gezeigt, in welchem der Chromophor zu erkennen ist. Rot zeigt Sauerstoff, Blau Stickstoff und Grau Kohlenstoff. Im rechten Teilbild ist das Reaktionsschema der Chromophorbildung gezeigt. Das Tripeptid Serin-Tyrosin-Gylcin bildet in einer drei-schritt-reaktion den Chromophor. Zwischen Serin und Glycin findet eine Zyklisierung statt, die von einer Dehydratisierung gefolgt wird. Der zeitbestimmende Schritt ist der letzte Oxidationsschritt der Chromophorbildung. Das Absorptionsspektrum des Chromophors zeigt zwei Maxima, die auf zwei unterschiedliche Formen (eine protonierte und eine deprotonierte 397 bzw. 475 nm) zurückzuführen sind. Für die Emission der Fluoreszenz bei 509 nm ist jedoch nur der deprotonierte Zustand verantwortlich [5]. Abb. 5 zeigt ein Anregungs- und Emissionsspektrum von GFP und egfp. Abbildung 5: Anregungs (links)- und Emissionsspektrum (rechts). GFP besitzt zwei Absorptionsmaxima das höchste Maximum bei 397 nm und den zweithöchsten bei 475 nm, egfp hingegen nur eines bei 489 nm. Bei 509 nm emittiert GFP, sowie egfp. Schematisch erstellt aus [6] und [7]. Tabelle 1 gibt weitere wichtige biophysikalische Parameter wieder, es zeigt unter anderem, dass egfp ein anderes Absorptionsverhalten hat wie GFP. 4

5 Tabelle 1: Biochemische und physikalische Parameter des nativen GFPs und den im Praktikumsversuch verwendete GFP-Konstrkute wtgfp GFP-HIS egfp-his Anzahl Aminosäuren Molekulargewicht [g/mol] Quantenausbeute 0,8 0,8 0,6 Emissionsmaximium [nm] Absorptionsmaximum [nm] 397 und und ε 280 nm [l*mol -1 *cm -1 ] 22015* 22015* 22015* ε 397 nm [l*mol -1 *cm -1 ] [7] [7] - ε 475 nm [l*mol -1 *cm -1 ] 9500 [7] ε 489 nm [l*mol -1 *cm -1 ] [7] *berechnet mit Thermodynamik der Faltung und Stabilität von Proteinen Die Faltung eines Proteins ist der letzte Schritt bei der Proteinbiosynthese in der Zelle. Festgelegt durch die Primärstruktur (Aminosäuresequenz) entsteht dabei eine definierte dreidimensionale Struktur. Die Faltung von Proteinen kann in vivo und in vitro stattfinden. Insbesondere bei der Faltung in vitro ist die Aggregation der Proteinmoleküle ein problematischer Konkurrenzvorgang. Dabei handelt es sich um eine irreversible und unspezifische Zusammenlagerung von Faltungsintermediaten aufgrund von hydrophoben Wechselwirkungen. Die Aggregation bzw. die Faltungsausbeute ist abhängig von der Temperatur, der Proteinkonzentration und den Pufferbedingungen. In vivo stellt die Aggregation normalerweise kein Problem dar, da andere Proteine (sog. Chaperone) die korrekte Faltung des Proteins unterstützen. Wird ein Protein jedoch in großen Mengen überexprimiert, kann die Aggregation zu einem Problem werden. Da die Faltung grundsätzlich spontan abläuft, ist das gefaltete Protein der energetisch günstigste Zustand [8]. Aus thermodynamischer Betrachtungsweise sind Proteine relativ instabile Moleküle. Die freie Stabilisierungsenthalpie (Faltungsenergie) kleiner Eindomänenproteine beträgt nur in etwa 9 bis 90 k B T. Dieser Betrag repräsentiert die Energiedifferenz zwischen dem nativen Protein (gefalteter Zustand) in Wasser und dem ungefalteten Protein in Wasser und ist eine kleine Differenz großer Zahlen. Treibkräfte des Faltungsprozesses sind hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken-Bindungen, ionische Wechselwirkungen und van der Waals Wechselwirkungen. Sie kompensieren nur geringfügig die 5

6 Energie, die für den Entropieverlust der Polypeptidkette im gefalteten Zustand aufgewendet werden muss. Proteine können durch thermische oder chemische Denaturierung relativ leicht entfaltet werden. Für Proteine, die nur aus einer Domäne bestehen, liegt ein Zweizustands-Prozess vor. Das heißt, die Proteinmoleküle liegen entweder im gefalteten (oder nativen) Zustand N oder im ungefalteten Zustand U vor. Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Zuständen wird durch die Gleichgewichtskonstante K eq beschrieben: K eq = [U] [N] = α 1 α (Gleichung 1) wobei α der Anteil an denaturiertem Protein ist: [U] α = [U] +[N] (Gleichung 2) Die Abhängigkeit dieser Gleichgewichtskonstante von der Temperatur (Abb. 6) oder von der Konzentration einer denaturierenden Chemikalie (z.b. Harnstoff oder Guanidinium Hydrochlorid) kann benutzt werden um die thermodynamische Stabilität eines Proteins zu ermitteln. Für die Abhängigkeit von der Temperatur gilt: ΔG Stab = k B T lnk eq (Gleichung 3) Gleichung 4 stellt den Zusammenhang zwischen Gibbs`scher freier Energie mit der Enthalpie und der Entropie des Systems her: ΔG= ΔH TΔS (Gleichung 4) Aus Gleichung 3 und Gleichung 4 erhält man durch Einsetzen folgende Abhängigkeit der Gleichgewichtskonstanten von der Temperatur: lnk eq = ΔG k B T = ΔH k B 1 T + ΔS k B (Gleichung 5) Wenn man lnk eq über 1/T aufträgt ergibt sich einer Gerade mit der Steigung m = - Δ H/R und dem y-abschnitt Δ S/R. Diese Darstellung wird als van`t Hoff Plot bezeichnet (Abb. 6). 6

7 Abb. 6. Beispiele für die temperaturabhängige Entfaltung eines Proteins und Prinzip eines van`t Hoff Plots. Aus dem Anteil an entfaltetem Protein kann die Gleichgewichtskonstante bei der jeweiligen Temperatur bestimmt werden. Anhand eines van`t Hoff Plots werden aus dieser Abhängigkeit Δ H und Δ S ermittelt [9]. Wenn es also möglich ist, K eq bei verschiedenen Temperaturen zu bestimmen, kann man daraus Δ G, Δ H und Δ S ermitteln. Für GFP ist es relativ einfach den Anteil an gefaltetem bzw. ungefaltetem Protein zu ermitteln, da GFP nur im gefalteten Zustand fluoresziert. Eine Messung der Fluoreszenz bei verschiedenen Temperaturen, ermöglicht daher die Ermittlung der notwendigen Daten. Bei anderen Proteinen misst man ebenfalls Fluoreszenz. Jedoch misst man dann im UV-Bereich die Fluoreszenz der Aminosäure Tryptophan. Da diese Aminosäure meist im Inneren des Proteins vorkommt, steigt die Fluoreszenz mit zunehmender Entfaltung [9]. 7

8 Molekularbiologische Grundlagen Gentechnische Vorraussetzungen von Plasmiden Design und Herstellung von Expressionsplasmiden Damit ein Plasmid (doppelsträngige und ringförmige DNA) funktionsfähig ist werden neben dem Wunschgen mehrere essentielle Zusätze benötigt [10]: - Replikationsursprung (ori): Notwendig für die Vermehrung des Plasmides innerhalb des Bakteriums - Antibiotikaresistenz (KanR): Es ist ein Selektionsdruck notwendig, damit die Bakterien das Plasmid (= zusätzliche Arbeit) nicht wieder ausstoßen - Regulatorsequenzen für die Genexpression: Repressor für die Genexpression (laci), Promotorregion zum binden der RNA-Polymerase, Terminatorregion, Ribosombindestelle (RBS) Das Wunschgen und Regulatorseqeuzen wie RBS, laci, Promotor- und Terminatorregion bilden zusammen das Operon. Desweiteren kann das Plasmid mit optionalen Features ausgestattet werden [10]: - Anhänge zur erleichterten Reinigung von Proteinen, z. B. StrepII-, His-Tag - Anhäge zur Unterstützung der Proteinfaltung, z.b. MBP-, GST-Tag - Anhänge zur kovalenten Anbindung des Proteins an Oberflächen, z. B. ybbr-, Snap-Tag - Weitere Replikationsursprünge zur Amplifikation in anderen Organismen wie Hefe oder Viren - Zusätzliche Operons zur Expression mehrerer Gene parallel - Signalsequenzen zum Transport des Proteins an bestimmte Orte der Zelle Durch diese optionalen Zusätze kann die Produktion des Genes, genauso wie nachfolgende Arbeiten an dem Protein erleichtert werden [11]. Man kann eine ganze Reihe von Expressionsplasmiden fertig kaufen, welche je nach Anwendung bereits mit einigen der aufgelisteten Optionen ausgestattet sind. Dazu besitzen diese Plasmide meist eine sog. multiple cloning site. Die multiple cloning site ist eine Abfolge von verschiedenen Schnittstellen mehrerer Restriktionsenzyme. Diese Schnittstellen können verwendet werden, um das Gen des Zielproteins an einer definierten Stelle in das Expressionsplasmid einzusetzen. Abb. 6 zeigt das im Praktikum verwendete Expressionsplasmid und schildert schematisch den Ablauf der Proteinproduktion beginnend bei der DNA-Sequenz. 8

9 Abbildung 6 Schematische Darstellung der Proteinproduktion: 1) Initial ist laci (Gen für den Repressor, welcher am lac-operon bindet) dafür verantwortlich, dass keine Proteinsynthese stattfindet. 2) Wird ein Induktor zugegeben, verändert der Inhibitor seine Konformation und kann nicht mehr inhibitorisch wirken. Die T7-RNA-Polymerase kann nun die mrna bilden. An die RBS der mrna binden nun Ribosomen, welche die Aminosäuren zur Proteinsequenz verbinden. 3) Diese Primärstruktur des Proteins faltet sich nun selbstständig in eine 3D-Struktur. Weitere wichtige Bestandteile des Plasmides sind: ori (Replikationsursprung, wichtig für die Vervielfältigung des Plasmides in den Bakterien); KanR (Kanamycin- Resistenz, womit ein Selektionsdruck aufgebaut werden kann, damit das Bakterium das Plasmid behält). 9

10 Das Plasmid enthält einen T7-Promotor. An diesen Promotor bindet nur eine spezielle Polymerase aus dem Bakteriophagen T7. Das Gen dafür wurde durch gentechnische Veränderung in genomische DNA mancher Bakterienstämme integriert. Der Zusatz DE3 im Genotyp des Bakteriums macht dies kenntlich. Das T7-System wird häufig verwendet, da der T7 Promotor ein sehr starker Promotor ist und somit sehr viel Zielprotein exprimiert wird. Proteinexpression Regulation der Proteinexpression in der Zelle Prinzipiell unterscheidet man zwei Mechanismen der Proteinexpression. Bei der konstitutiven Expression findet die Proteinsynthese immer und unabhängig von äußeren Einflüssen statt. Es wird also kontinuierlich eine gewisse Menge des Proteins hergestellt. Im Gegensatz dazu kann die Expression auch durch äußere Einflüsse, wie z.b. das Vorhandensein bestimmter Nährstoffe, geregelt werden. Man spricht dann von einer Induktion der Expression. Zur Regelung der Expression sind bestimmte artspezifische DNA-Abschnitte notwendig. Bei der negativen Regulation ist die Transkription so lange blockiert wie kein Induktor vorhanden ist. Der Abbildung 7: Induktion des lac- Operons lacz, lacy und laca sind Gene des natürlichen lac-operons. Diese Gene werden in der Gentechnik durch das Wunschgen ersetzt und es bleibt nur noch der lac- Operator zurück, welcher die Proteinexpression bis zur Induktion inhibiert. Ein Induktor ist zum Beispiel Lactose. Lactose wird in den Zellen zu Allolactose umgewandelt, welches dann an den Repressor docken kann. Dieses Andocken bewirkt eine Konformationsänderung, sodass der Repressor nicht mehr am Operator bindet. Die RNA- Polymerase kann nun an den Promotor binden und die mrna transkribieren. Im Falle des natürlichen Lac-Operons werden lacz, lacy und laca synthetisiert. Oft wird die Promotorregion und die hinter dem Operator liegende Gensequenz ausgetauscht. So lässt sich dann durch Zugabe von Lactose oder dessen Derivat IPTG eine Genexpression eines Wunschgenes induzieren und kontrollieren [12]. 10

11 Repressor ist ein Genprodukt des Repressorgens, das sich prinzipiell an einer beliebigen Stelle auf dem Plasmid oder auch auf dem Bakterienchromosom befinden kann. Der Repressor bindet an den Operator und verhindert dadurch, dass die RNA-Polymerase in der Promotorregion binden kann. Sobald ein Induktor vorhanden ist, erfolgt eine Konformationsänderung am Repressor und dieser kann nicht mehr am Operator binden. Dadurch wird die Bindestelle für die RNA- Polymerase frei. Die RNA-Polymerase bindet am Promotor und die mrna wird transkribiert. Der Terminator ist eine DNA-Sequenz, die ein Lösen der RNA- Polymerase bewirkt. Ein Terminator ist nicht essentiell, da sich die Polymerase nach einiger Zeit selbst von der DNA löst. Ein bekanntes Beispiel für eine negative Regulation ist das lac-operon. Die regulatorischen Elemente des lac-operons werden auch häufig zur Expression rekombinanter Proteine verwendet (vgl. Abb. 7) [13]. Expression rekombinanter Proteine Um ein Zielprotein in einem Organismus herzustellen, bringt man dessen DNA- Sequenz in den Organismus ein. Grundsätzlich können rekombinante Proteine in verschiedenen Organismen (Bakterien, Hefen oder Zellkulturen) hergestellt werden. Häufig wird jedoch das Bakterium E. coli verwendet, da es eine Reihe von Vorteilen bietet: Insbesondere seine kurzen Generationszeiten und die hohe Expressionsausbeute ermöglichen die Herstellung von großen Mengen an Zielprotein in kurzer Zeit. Die rekombinante DNA wird in Form eines Vektors in das Bakterium eingeführt. Vektoren sind im Prinzip Hilfsmittel um Gene in den Wirtsorganismus einbringen zu können. Diese sind in der Lage sich in der Zelle selbständig vermehren und werden bei der Zellteilung gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt. Zur Expression in E. coli werden Plasmide als Vektoren benutzt [10]. Abb. 8 beschreibt zusammenfassend die Arbeitsschritte die notwendig ist um ausgehend von einer DNA-Sequenz aus einer Datenbank zum Protein zu kommen. 11

12 Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von GFP Abbildung 8: Schematische Darstellung einer Proteinproduktion. Ausgehend von einem DNA-Fragment, das geeignete Schnittstellen für Restriktionsenzyme besitzt, wird das Expressionsplasmid und das GenFragment mit den gleichen Enzymen geschnitten. Die Enden des Gen-Fragmentes und des Expressionsplasmides werden durch das Enzym Ligase verknüpft. Um die so erzeugten Plasmide zu vermehren, werden damit kompetente E. coli Zellen transformiert. Da die Plasmide einen Selektionsmarker tragen, können sich nur die Zellen vermehren, die diesen Marker also das gewünschte Plasmid besitzen. Die Bakterien synthetisieren nun ganz automatisch das gewünschte Protein. Nach entsprechender Produktionszeit werden die Zellen geerntet und das produzierte Protein von den Zellfragmenten gereinigt. Abschließend steht das Protein für weitere Arbeiten, wie einer Charakterisierung mittels einer Schmelzkurve, zur Verfügung. Produktion des Zielproteins in E. coli Normalerweise verwendet man zur Expression in E. coli induzierbare Promotoren (z.b. lac-promotor oder T7-Promotor), um die Produktion des Zielproteins zu steuern. Ein typischen Expressionsablauf besteht darin, dass man die Zellen erst zu einer bestimmten Zelldichte heranwachsen lässt. Erst dann gibt man den Induktor zu. Induzierte Zellen wachsen langsamer, da sie einen großen Teil ihrer zellulären Ressourcen dazu verwenden das Zielprotein herzustellen. Eine typische Wachstumskurve von E. coli ist in Abb. 9 dargestellt. Die Wachstumskurve wird in vier Phasen eingeteilt [14]: x(t) = x t 0 e µt (Gleichung 6) mit x Biomasse xto Biomasse zum Startzeitpunkt µ Wachstumsrate t Zeit seit dem Startzeitpunkt 12

13 Abbildung 7 Typische Wachstumskurve von E. coli: Das Wachstum von E. coli kann in vier Phasen unterteilt werden. In der lag.-phase (I) erfolgt eine Anpassung an die Kulturbedingungen. In der exponentiellen Phase (II) wachsen die Zellen mit maximaler Geschwindigkeit. Bei optimalen Bedingungen findet bei E. coli etwa alle 20 min eine Zellteilung und damit eine Verdopplung der Biomasse statt. In der stationären Phase (III) nimmt die Wachstumsrate ab. Dies ist bedingt durch eine Abnahme der Nähstoffe und eine Zunahme der Konzentration der Stoffwechselprodukte. In der Absterbephase (IV) findet kaum noch Wachstum statt. Es sterben mehr Zellen als neue gebildet werden. Wenn die Kultur zur Expression eines Proteins verwendet werden soll, erfolgt die Induktion in der frühen bis mittleren exponentiellen Phase. Eine induzierte Kultur wächst mit einer langsameren Wachstumsrate und wächst zu geringeren Zelldichten heran. Will man ein Protein exprimieren, erfolgt die Induktion in der exponentiellen Phase (Abb. 9). Die Ernte erfolgt zu einem Zeitpunkt, an dem die Expression und somit die Konzentration des Zielproteins maximal ist. Um gleichzeitig eine maximale Zellausbeute zu erzielen, wird normalerweise in der späten exponentiellen Phase geerntet. Neben der klassischen Induktion besteht auch die Möglichkeit die Zellen in sog. Autoinduktionsmedien zu züchten. Diese komplexen Medien beinhalten neben wichtigen Bestandteilen, (Puffersystem, Salzlösungen, Nährstoffe), einen Zuckermix (Glucose, Lactose und Glycerin). Die Zellen beginnen nach dem Verbrauch von Glucose ihren Stoffwechsel auf Lactose umzustellen, was gleichzeitig eine lac-operon gesteuerte Proteinproduktion induziert [15]. Nachdem Bakterien das Protein produziert haben, werden die Bakterien durch Zentrifugation geerntet und anschließend aufgeschlossen. Das Protein kann nun von den bakteriellen Überresten gereinigt werden. 13

14 Verwendete Techniken Absorptionsspektroskopie Spektroskopische Methoden beruhen auf der Wechselwirkung zwischen Licht und der zu untersuchenden Substanz. Bei Absorptionsmessungen wird Licht einer bestimmten Wellenlänge von der Substanz absorbiert. Unter den Voraussetzungen, dass die Substanz homogen in Lösung vorliegt, keine Streuung auftritt und keine Photoreaktion in der Lösung stattfinden, gilt das Lambert- Beersche Gesetz: A = log( I o ) = ε c d (Gleichung 7) I mit I 0: Intensität der einfallenden Strahlung I: Intensität der aus der Messlösung austretenden Strahlung c: Konzentration des absorbierenden Stoffes [mol/l] d: Schichtdicke [cm] e: molare Extinktionskoeffizient [l*mol -1 *cm -1 ] Der molare Extinktionskoeffizient ε ist von der Wellenlänge abhängig und wird immer im Zusammenhang mit der Wellenlänge angegeben (siehe Tabelle 1 für GFP). Absorptions- bzw. Extinktionsmessungen werden in diesem Versuch verwendet, um die Dichte der Bakterienzelllen zu messen und um die Reinheit bzw. Aktivität des GFP zu ermitteln [16]. Fluoreszenzspektroskopie Eine weitere Methode zur Ermittlung der Reinheit und Aktivität des GFP ist die Messung der Fluoreszenz. Fluoreszenzmessungen beruhen auf dem Prinzip, dass beim Übergang eines angeregten Elektrons vom angeregten Zustand in den Grundzustand Licht emittiert wird (Abb. 10). Durch einen entsprechenden Messaufbau kann das anregende Licht vom emittierten Licht getrennt werden und auf diese Weise nur das emittierte Licht detektiert werden [17]. 14

15 Abbildung 8 Termschema eines photolumineszierenden Moleküls (Jablonski-Diagramm) mit möglichen Übergängen und deren jeweiliger Zeitskala unter Hervorhebung der Fluoreszenz gegenüber den anderen Prozessen. Zur Vereinfachung sind hier für die strahlungslose Umwandlung von S1 sowie T1 nach S0 die Übergangspfeile weggelassen sowie die Photoprodukt-Bildung insgesamt [17]. Enzymatische Veränderung von DNA Von besonderer Bedeutung für die DNA-Rekombination ist eine Reihe von Enzymen, die im Nucleinsäurestoffwechsel der Zellen vorkommen. Vor allem Restriktionsendonucleasen und Ligasen werden verwendet, um gezielt DNA- Fragmente herzustellen und zu verbinden. Restiktionsendonucleasen spalten doppelsträngige DNA an spezifischen Erkennungssequenzen. Ligasen verbinden zwei DNA-Moleküle oder Fragmente. Restriktionsendonucleasen kommen natürlich in vielen Bakterienarten vor und dienen zum Schutz des Bakteriums vor fremder DNA. Mehrere hundert wurden inzwischen gefunden und rekombinant hergestellt, so dass sie für gentechnische Experimente eingesetzt werden können. Sie werden verwendet um sowohl Fragmente zur Klonierung herzustellen (präparativer Verdau), können aber auch dazu dienen, ein Plasmid zu überprüfen oder die Länge eines Plasmides festzustellen (analytischer Verdau). Restriktionsendonucleasen spalten die DNA symmetrisch, das hat unmittelbar zur Folge, dass die Enden von DNA Fragmenten sowohl zu sich selbst komplementär 15

16 sind, als auch zu Enden anderer Fragmente, die mit demselben Enzym erzeugt worden sind. Diese Enden lagern sich bei niedrigen Temperaturen autonom zusammen und lassen sich durch DNA-Ligase wieder kovalent verknüpfen. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR ermöglicht basierend auf wenig ausgehender Template-DNA spezifisch eine DNA-Sequenz zu amplifizieren. Dies geschieht mittels Primer (kurze DNA- Fragmente), welche spezifisch entworfen werden an bestimmten Stellen der Template-DNA zu binden. Abb. 10 beschreibt das Vorgehen schematisch. Dabei wird die komplette Reaktion Temperatur-abhängig gesteuert. Ein Reaktionszyklus besteht im Allgemeine aus dem Denaturieren (Aufschmelzen der zwei komplementären Stränge), Primer-Hybridisierung und der Amplifikationsreaktion mittels zugegebener DNA-Polymerase. Dieser Zyklus wird mehrmals wiederholt und so geschieht eine sequenzspezifische Amplifikation [10]. Abbildung 10: Schematische Darstellung einer PCR, mit 1: Denaturierung, 2: Primerhybridisierung und 3: Elongation [10]. Elektrophoretische Trennung von DNA und Proteinen Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Unterschiedliche Ladungen und Größen der Teilchen bewirken eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit. Daher kann die Elektrophorese zur Auftrennung verschiedener Teilchen verwendet werden. Elektrophoretische Trennungen können in Lösung oder in stabilisierenden Matrices durchgeführt 16

17 werden. Häufig werden so genannte Gele als Matrices verwendet. Matrices haben den Vorteil, dass sie die Einflüsse der Konvektion verringern und man dadurch eine schärfere Trennung unterschiedlicher Teilchen erhält. Je nach Wahl der Bedingungen kann die Trennung so beeinflusst werden, dass mehr die Größe oder die Ladung die Wanderungsgeschwindigkeit bestimmt. Auf ein geladenes Teilchen wirken in einem elektrischen Feld mit der Feldstärke E folgende Kräfte: eine beschleunigende Kraft F e, die auf die Ladung q des Teilchens wirkt: F e = q E mit q = z e (Gleichung 8) und eine Reibungskraft F fr, die bremsend wirkt: F fr = f c v (Gleichung 9) f c : Reibungskoeffizient v: Geschwindigkeit Das Gleichgewicht dieser beiden Kräfte bewirkt, dass sich das Teilchen mit einer konstanten Geschwindigkeit im elektrischen Feld bewegt: v = q E f c = u E (Gleichung 10) Der Proportionalitätsfaktor zwischen v und E ist die substanzspezifische Größe Mobiltät u. Für kleine kugelförmige Teilchen lässt sich das Stokes`sche Gesetz anwenden, um die Reibungskraft zu berechnen. Für nicht-kugelförmige Teilchen wie DNA oder Proteine lässt sich ein empirischer Zusammenhang zwischen Molekulargewicht MW und Mobilität u angeben: u q MW 2 / 3 (Gleichung 11) [18]. Bei der Verwendung von Gelen als Matrix besteht die Möglichkeit die Porengröße des Gels zu variieren. Da die Teilchen durch die Poren des Gels wandern müssen, hat die Porengröße einen großen Einfluss auf die Reibungskraft und damit auf die Beweglichkeit der Teilchen. Teilchen mit gleicher Ladung, können somit aufgrund ihrer Größe getrennt werden. Gele mit relativ großen Poren z.b. Agarosegele eignen sich für die Trennung von DNA-Fragmenten (200 bp bis ca bp). Für kleinere DNA-Fragmente oder Proteine verwendet man 17

18 Polyacrylamid-Gele. Damit ein Strom zwischen den Elektroden fließen kann, werden Elektrophoresen in Puffer durchgeführt. Dabei ist jedoch zu beachten, dass der ph-wert des Puffers auch die Ladung und damit auch die Beweglichkeit der Teilchen beeinflussen kann. Zur Trennung von DNA-Fragmenten, z.b. nach dem Schneiden mit Restriktionsenzymen, verwendet man Agarosegele (0,7 % bis 2 % Agarose). Da DNA von Natur aus negativ geladen ist, werden die Fragmente in der Nähe der Kathode auf Gel aufgetragen und eine Spannung angelegt. Um die Länge der Fragmente zu ermitteln, vergleicht man diese mit einem DNA-Längenstandard, der ebenfalls auf das Gel geladen wird. Um die DNA im Gel sichtbar zu machen verwendet man einen Farbstoff. Dieser Farbstoff lagert sich an die DNA. Für Proteine gibt es verschiedene elektrophoretische Verfahren. Verschiedene Proteine besitzen unterschiedliche Ladungen. Bei der nativen Elektrophorese werden die Proteine nicht vorbehandelt auf das Gel aufgetragen. Da solche Trennungen meist schwer zu interpretieren sind, werden Proteine meist mit Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) aufgekocht. SDS ist ein ionisches, negativgeladenes Detergenz, welches die Proteine denaturiert und an sie bindet. Dadurch entstehen aus jedem Protein negativ geladene Teilchen. Da sehr viel SDS an ein Protein bindet, wird die natürliche Ladung überdeckt. Trägt man die so behandelten Proteine auf ein Gel auf, erfolgt die Trennung auch hier im Wesentlichen aufgrund der Größe der Teilchen. Diese Methode nennt man SDS- PAGE (PolyAcrylamid-GelElektrophorese). Die Proteine können mit Coomassie- Brilliant-Blau sichtbar gemacht werden. Auch bei einer SDS-PAGE wird die Größe des Proteins mit Hilfe eines Längenstandards bestimmt [10]. Zentrifugation Das physikalische Prinzip der Zentrifugation ist eine Trennung von Teilchen nach Größe und Dichte. Zentrifugation ist daher gut geeignet, Bakterienzellen vom Kulturmedium abzutrennen. (Bakterienzellen haben eine Dichte von 1,05-1,2 g/cm 3 und einen Durchmesser von 5 µm). Auf ein Teilchen, das mit konstanter Winkelgeschwindigkeit um eine Drehachse bewegt wird, wirkt eine Zentrifugalkraft F Z, die das Teilchen nach außen beschleunigt. Die Beschleunigung B ist von der Winkelgeschwindigkeit ω und dem Abstand r von der Rotorachse abhängig: B = ωr 2 (Gleichung 12) Für ω gilt folgende Beziehung zur Rotationsgeschwindigkeit v r in Rotationen pro Minute (rpm) 18

19 ω = π v r 30 (Gleichung 13) Die Beschleunigung wird auf die Erdbeschleunigung bezogen und als relative Zentrifugalbeschleunigung RZB in Vielfachen der Erdbeschleunigung angegeben: RZB = ω r 9,81 m (Gleichung 14) s 2 Die RZB ist die Beschleunigung, die effektiv auf das Teilchen wirkt und ist die entscheidende Größe für den Zentrifugationsvorgang. Auf vielen Zentrifugen werden jedoch nur Werte für die Rotationsgeschwindigkeit in rpm angegeben. Die Zentrifugalkraft F Z ist jedoch nicht die einzige Kraft, die während der Zentrifugation auf die Teilchen wirkt. Auftrieb F A und Reibungskräfte F R (mit dem Reibungskoeffizienten f) wirken der Bewegung der Teilchen entgegen. Bei der Sedimentationsgeschwindigkeit v gilt folgendes Kräftegleichgewicht: F Z + F A + F R = 0 (Gleichung 15) mit F Z = m Partikel ω 2 r (Gleichung 16) F A = m Medium ω 2 r (Gleichung 17) F R = f v (Gleichung 18) Löst man die Gleichung nach v auf, erhält man die Svedberg-Gleichung (Gleichung 19). Sie beschreibt die Sedimentationsgeschwindigkeit v von sphärischen Partikeln in einer viskosen Flüssigkeit: mit: d: Durchmesser des Teilchens ρ P : Dichte des Teilchens v = d 2(ρ P ρ M )RZB 18η m Medium ω 2 r (Gleichung 19) ρ M : Dichte des Mediums η : Viskosität des Mediums Setzt man die Sedimentationsgeschwindigkeit in Beziehung zur Beschleunigung 19

20 erhält man den Sedimentationskoeffizienten s. Dieser ist eine charakteristische Größe für das Verhalten eines Teilchens in einem Zentrifugalfeld. Der Sedimentationskoeffizient wird in Svedberg-Einheiten S (1 S entspricht Sekunden). Für Bakterienzellen gilt s = S. Bei der Zentrifugation werden im Wesentlichen zwei Techniken unterschieden: differentielle Zentrifugation Hier werden die unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeiten verschiedener Teilchen ausgenutzt. Grosse und schwere Teilchen sedimentieren schneller und befinden sich schon bei niedrigen Zentrifugationsgeschwindigkeiten im Niederschlag (Pellet). Gradientenzentrifugation In ein Zentrifugenröhrchen werden Medien unterschiedlicher Dichte geschichtet. Mit größerem Abstand von der Achse nimmt die Dichte zu. Wenn ein Teilchen sich soweit bewegt, bis das umgebende Medium die gleiche Dichte aufweist wie das Teilchen, wandert das Teilchen nicht weiter. Nach der Svedberg-Gleichung bleiben Teilchen im Schwebezustand, wenn ihre Dichte und die des umgebenden Mediums gleich ist (v = 0) [19]. Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography (IMAC) Ausgehend von der Entdeckung, dass manche Proteine an immobilisierte zweiwertige Übergangsmetallionen (Ni 2+, Zn 2+ oder Cu 2+ ) binden, identifizierte man Aminosäuren, die Komplexe mit den freien Koordinationsstellen der Metallionen bilden. In erster Linie erfolgt die Komplexbildung mit ungeladenen Seitengruppen von Histidinen. Die Stärke der Bindung ist von der Anzahl und Anordnung der Histidine auf der Proteinoberfläche abhängig. Da verschiedene Proteine Histidine auf ihrer Oberfläche besitzen, fusioniert man an das Zielprotein mehrere Histidine in direkter Abfolge. Der Vorteil der Fusionen, die als His-Tag bezeichnet werden, liegt darin, dass diese fester binden als die übrigen Proteine, da sich mehrere Histidine in unmittelbarer Nähe befinden. Heute werden standardmäßig sechs Histidine als Tag verwendet. Zur Immobilisierung der Metallionen werden NTA- (nitrilotriacetic acid) Gruppen verwendet. (Abb.12). Der Imidazolring bindet nur im deprotonierten Zustand an die freien Koordinationsstellen der Ni2+ -Ionen. Auf der Grundlage dieser Wechselwirkungen ergeben sich drei Möglichkeiten für die Elution des Zielproteins. Zum einen kann der ph-wert deutlich unter dem pk a -Wert 20

21 von Histidin abgesenkt werden. Dies führt zur Protonierung des Imidazolringes und damit zur Zerstörung der Grundlage der Bindung. Zum andern führt ein Imidazolhaltiger Puffer mit einer Konzentration von 100 mm bis 250 mm zu einer Verdrängung der His-Seitenketten von der Säule. Die Chelatoren EDTA oder EGTA zerstören den Komplex aus NTA-Matrix und Metallion, indem sie selbst Komplexe mit dem Ion bilden [21]. Abbildung 9 Grundprinzip von IMAC. Nitrilotriacetic acid (NTA) ist an einer festen Phase immobilisiert. NTA kann vier der sechs Koordinationsstellen eines Ni 2+ -Ions binden. Die zwei freien Koordinationsstellen können mit dem Imidazolring der Aminosäure Histidin interagieren. An jeder der freien Koordinationsstelle eines Ni 2+ - Ions kann ein Imidazolring binden. Da ein Protein mit Histag mehrere direkt aufeinander folgende Histidine besitzt, bindet dieses Protein fester als andere Proteine, die Histidine auf ihrer Oberfläche tragen. Die Trennung der Bindung erfolgt z.b. kompetitiv durch Zugabe von Imidazol [20]. 21

22 Verständnisfragen - Wie ist der Arbeitsablauf angefangen bei einer Gensequenz bis zum fertig gereinigten Protein? - Was passiert in der Zelle, wenn ein Protein exprimiert wird (natürlich oder von uns gesteuert)? Welche DNA-Abschnitte muss ein Expressionsplasmid daher unbedingt haben, warum? - Wieso leuchtet GFP? - Wie funktioniert das Trennprinzip der Chromatographie? Wie funktioniert das Trennprinzip der Elektrophorese? Was sind die Unterschiede zwischen den beiden Methoden? - Wie funktioniert Fluoreszenzspektroskopie? Wie nimmt man ein Fluoreszenz- Anregungsspektum auf und was sagt es aus? Wie nimmt man ein Fluoreszenz- Emissionsspektrum auf und was sagt es aus? - Unter welchen Bedingungen gilt das Lambert Beersche Gesetz und was sagt es aus? 22

23 Aufgabenstellung Konstruktion und Analyse Expressionsplasmids via PCR Es werden Teilschritte zur Herstellung des Expressionsplasmides zur Expression von GFP durchgeführt. Insbesondere soll überprüft werden, ob das sich das GFP- Gen im Expressionsplasmid befindet. Dazu soll eine analytische PCR mit zwei noch zu bestimmenden Primern durchgeführt werden. Die Länge der entstandenen Fragmente wird mit Hilfe von Agarose-Gelelektrophorese ermittelt. Dazu werden an Tag 1 Primer für eine entsprechende PCR-Reaktion entworfen und GFP-DNA von einer unbekannten Probe isoliert und amplifiziert. Diese wird anschließend mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten und mit einem ebenso geschnittenen Expressionsvektor zusammenligiert. Im Anschluss daran werden E. coli Zellen mit der DNA transformiert und an Tag 2 analysiert. Expressionskultur von E.coli Ein bereits fertig konstruiertes Expressionsplasmid mit egfp wurde in E. coli transformiert und davon eine Vorkultur angesetzt. Aus der Vorkultur soll eine Expressionskultur mit einer OD 600 von 0,1 angesetzt werden. Das Wachstum der Bakterien wird in stündlichen Abständen überprüft. Aus den erhaltenen Daten soll eine Wachstumskurve angelegt werden. Aufgrund des verwendeten Autoinduktionsmediums ist eine manuelle Induktion nicht notwendig. Es werden weiterhin OD-Messungen durchgeführt. Zur Verfolgung der Produktbildung werden Proben für eine SDS-PAGE Analyse entnommen. Die Kulturen werden bei 25 C über Nacht inkubiert und an Tag 2 durch Zentrifugation geernet. Zellaufschluss und Reinigung von egfp-(his) 6 mit IMAC Die frisch geernteten Zellen werden in Lysepuffer resuspendiert und mit Hilfe des Sonicators aufgeschlossen. Die Zellbruchstücke werden abzentrifugiert. Der Überstand mit den löslichen Proteinen (Rohextrakt) wird auf eine mit Bindepuffer äquilibrierte Ni-NTA-Säule geladen. Von jeder Fraktion (incl. dem Rohextrakt) werden Proben für eine SDS-PAGE Analyse hergestellt. SDS-PAGE Zur Untersuchung der Reinheit und der Anreicherung von egfp während des ganzen Prozesses werden die vorbereiteten Proben auf ein Gel aufgetragen und eine Trennung durchgeführt. Die Proteine werden anschließend mit Coomassie 23

24 Brilliant Blau nachgewiesen. Bestimmung der GFP-Konzentration Von gereinigtem egfp wird ein Absorptionsspektrum gemessen. Aus der bei 397 nm gemessenen Absorption wird die egfp-konzentration ermittelt und mit dem bei 280 nm ermittelten Wert verglichen. Messung eines Fluoreszenz Anregungs- und Emissionsspektrums Im Fluoreszenzspektrometer werden Anregungs- und Emissionsspektren von egfp exprimierenden Zellen, des Rohextraktes und von gereinigtem GFP gemessen. Thermische Denaturierung von GFP Anhand der Fluoreszenz wird die Denaturierung von GFP in Abhängigkeit von der Temperatur gemessen. Die Messdaten dienen zur Ermittlung der Schmelztemperatur T m sowie von ΔH, ΔS und ΔG anhand eines Van`t Hoff Plots. 24

25 Literatur [1] Wikipedia (13. Juli 2013), aufgerufen am 15. Juli 2013: [2] Wikipedia (15. Juli 2013), aufgerufen am 15. Juli 2013: [3] Wikipedia (10. April 2013), aufgerufen am 19. Juli 2013: [4] M. Zimmer (2002): Green Fluorescent Protein (GFP): Applications, Structure, and Related Photophysical Behavior, Chemical Reviews, 102, [5] Robert E. Campbell (2008), Scholarpedia, 3, 7, 5410 [6] M. Mickler, R. Dima, H. Dietz, C. Hyeon, D. Thirumalai, M. Rief (2007): Revealing the bifurcation in the unfolding pathways of GFP by using single-molecule experiments and simulations, PNAS, 104, 51, , Supporting Information [7] G. Patterson, S. Knobel, W. Sharif, S. Kain, D. Piston (1997): Use of the Green Fluorescent Protein and Its Mutants in Quantitative Fluorescene Microscopy, Biophysical Journal, 73, [8] UCDAVIS BioWIKI (10. November 2012), aufgerufen am 22. Juli 2013: [9] UCDAVIS BioWIKI (10. November 2012), aufgerufen am 22. Juli 2013: g [10] J. Sambrook et al. (2001): Molecular Cloning, 3te Ausgabe Cold Spring Harbor, New York [11] Wikipedia (4. Juli 2013), aufgerufen am 15. Juli 2013: [12] Wikipedia (15. Mai 2012), aufgerufen am 15. Juli 2013: [13] B. Alberts, et al. (2003): Molekularbiologie der Zelle, Wiley/VCH, Weinheim [14] Wikipedia (15. April 2013), aufgerufen am 15. Juli 2013: [15] W. Studier (2005): Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures, Protein Expression and Purification, 41, [16] Wikipedia (16. Juni 2013), aufgerufen am 15. Juli 2013: 25

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