Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Michael Nauck Dienstort: Diabeteszentrum Bad Lauterberg

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1 Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Michael Nauck Dienstort: Diabeteszentrum Bad Lauterberg Untersuchungen der Inkretinhormone Gastric Inhibitory Peptide (GIP) und Glukagon Like Peptide 1 (GLP-1) nach Hemmung der Dipeptidylpeptidase IV mit Di-[3N-((2S,3S)-2-amino-3-methyl-pentanoyl)1,3-thiazolidine]fumarat (P32/98) INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Kirstin Iwanow aus Jena 2005

2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. M. Nauck Koreferent: Priv. Doz. Dr. med. B. Henning Tag der mündlichen Prüfung:

3 Für meinen lieben Ioannis Gebt mir einen Hebel, der lang genug und einen Angelpunkt, der stark genug ist, dann kann ich die Welt mit einer Hand bewegen. (Archimedes ( ))

4 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG Seite 1.1 Der Inkretin-Effekt Bekannte Inkretinhormone Gastric Inhibitory Peptide (GIP) Metabolisierung und Eliminierung von GIP Glukagon-like Peptide 1 (GLP-1) Die entero-insuläre Achse beim Typ 2 Diabetes Therapeutische Möglichkeiten mit GLP Inhibition der Dipeptidyl-Peptidase IV Fragestellung der Arbeit 10 2 PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN 2.1 Studienprotokoll Einschlusskriterien Probandencharakteristika und Voruntersuchung Studiendesign Testmahlzeit Blutentnahmen Laborbestimmungen Plasma-Glukosekonzentrationen Hormonbestimmungen Prinzip des Immunoassays Insulin C-Peptid Glukagon Gastric Inhibitory Polypeptide (Gesamtkonzentration) Aktives GIP [1-42 Amid] Totale GLP-1 [1-36 Amid] Aktives GLP-1 [7-36 Amid] Triglyceride Messung der Magenentleerung Berechnungen Anthropometrische Berechnungen Statistische Methoden 29 I

5 Inhaltsverzeichnis 3 ERGEBNISSE 3.1 Plasma-Konzentrationen Glukoseinfusionsraten Plasma-Glukosekonzentration Dipeptidyl-Peptidase IV Aktivität Gesamt GLP-1 Plasmakonzentration Plasmakonzentration des aktiven GLP-1 [7-36 Amid] Plasmakonzentration des intakten GIP [1-42] Plasmakonzentration des degradierten GIP [3-42] Plasmakonzentration des gesamten GIP Plasma-Insulin-Konzentrationen Plasma C-Peptid-Konzentrationen Plasma-Glukagon-Konzentrationen Plasma-Triglycerid-Konzentrationen C-Atemtest Nebenerscheinungen 51 4 DISKUSSION 4.1 Ergebnisse der pharmakologischen Hemmung der DPP IV Einfluss der DPP IV Inhibition auf die Inkretinhormone GIP und GLP Auswirkungen auf die Blut-Glukose/Insulin-Konzentration Zusätzliche Beobachtungen Weitere Ausblicke 59 5 ZUSAMMENFASSUNG 61 6 LITERATURVERZEICHNIS 73 7 DANKSAGUNG 79 LEBENSLAUF 80 II

6 Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abkürzungen Abb Abbildung AS Aminosäure BMI Body-Mass-Index DPP IV Dipeptidyl-Peptidase IV ELISA Enzym-linked-immuno-sorbent-assay GIP Gastric Inhibitory peptide GLP-1 Glukagon-like Peptide 1 Glc Glukose h Stunde HOMA homeostasis model assessment HWZ Halbwertszeit IR Immunoreaktiv i.v. intravenös Min Minuten mmhg Millimeter Quecksilbersäule NaCl Natrium-Chlorid OGTT Oraler Glukose Toleranz-Test RIA Radioimmunoassay RR Blutdruck-Messung nach Riva-Rocci SD Standardabweichung SEM Standardfehler des Mittelwertes Tab Tabelle U Units vs versus WHO World-Health-Organisation WHR Waist-Hip-Ratio P32/98 Di-[3N-((2S,3S)-2-amino-3-methyl-pentanoyl)1,3- thiazolidine]fumarat III

7 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Der Inkretin-Effekt Durch orale Zufuhr von Glukose kommt es beim gesunden Menschen zu einer adäquaten Sekretion von Insulin aus den B-Zellen der endokrinen Pankreas. Wird die gleiche Menge Glukose intravenös verabreicht, kommt es zu einer signifikant geringeren Insulinsekretionsantwort. Dieses Phänomen wird als Inkretin-Effekt bezeichnet [Elrick et al. (1964), Creutzfeldt (1979), Nauck et al. (1986 a), Nauck et al. (1986 b)]. Schon zu Beginn unseres Jahrhunderts gab es Hinweise, dass Extrakte aus Dünndarmmukosa die Insulinsekretion stimulieren können [Moore et al. (1906)]. In der Dünndarmmukosa entdeckte LaBarre schon 1929 Stoffe, die die Sekretion der Pankreas beeinflussen. Als Exkretine definierte er Bestandteile, welche die exogene und als Inkretine, jene die die endokrine Sekretionsleistung der Pankreas beeinflussen [(Zunz, LaBarre (1929)]. In Versuchen von Elrick et al., sowie McIntyre zeigte sich, dass der Insulinanstieg nach oraler Applikation von Glukose in das Dünndarmlumen höher ausfiel als nach intravenöser Gabe, bei der der Glukoseanstieg geringer ausfiel [Elrick et al. (1964), McIntyre et al. (1965)]. Es zeigte sich, dass dieser Inkretin-Effekt bei normal- und übergewichtigen Probanden mit normaler Glukosetoleranz für etwa zwei Drittel der integrierten Insulinanstiege nach oraler Glukosebelastung verantwortlich ist, wohingegen er bei Patienten mit Typ2-Diabetes quantitativ weniger zu den Insulinanstiegen beiträgt [Perley und Kipnis (1967), Nauck et al. (1986 a)]. Dieser Anstieg der Insulinkonzentrationen ist nicht nur auf eine gesteigerte Freisetzungsrate durch die Inkretinwirkung zurückzuführen, sondern basiert auch auf einer gleichzeitigen Verminderung der metabolischen Insulinclearance [Nauck et al. (1986 a), Nauck et al. (1986 b), Shuster et al. (1988), Tillil et al. (1988)]. Somit ist es von Bedeutung, bei der Berechnung des Inkretin-Effektes die Plasmaanstiege des C-Peptids zugrunde zu legen. Der Beitrag des Inkretin-Effekts an der Insulinsekretion beträgt je nach applizierter Glukosemenge auf diese Weise zwischen 20 bis 60 % [Nauck et al. (1986 a), Shuster et al. (1988), Tillil et al. (1988)]. 1

8 1 Einleitung 1.2 Bekannte Inkretinhormone Es gibt bis jetzt zwei bekannte Peptidhormone, die für den Inkretin-Effekt des menschlichen Glukosestoffwechsel von Bedeutung sind. Es handelt sich zum einen um das Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) und zum anderen um das Glukagon-like Peptide 1 (GLP-1) [Nauck et al. (1992)]. Im Gegensatz zu GLP-1, welches in seiner insulinotropen Form [7-36 Amid] aus den L-Zellen des Ileums, Kolons und Rektums abgegeben wird [Ørskov et al. (1989), Eissele et al. (1992)], wird GIP von den K-Zellen sezerniert, welche insbesondere im oberen Dünndarm (Duodenum, Jejunum) vorkommen [Buffa et al. (1975), Buchan et al. (1978)]. Für den Inkretin-Effekt ist der Anteil von GIP wahrscheinlich bedeutender als der des GLP-1 [Nauck et al. (1989), Nauck et al. (1993 c)] und wird beim Menschen mit etwa 75% beziffert [Creutzfeldt und Nauck (1992), Nauck et al. (1993c)] Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) Entdeckt wurde das Gastric Inhibitory Polypeptide in einer cholezystokininreichen Fraktion der Dünndarmmukosa von Schweinen [Brown et al. (1970), Brown (1982)]. Im Tierversuch (Ratten) stimuliert GIP die Insulin-Sekretion [Pederson und Brown (1978)], jedoch ist nur im hyperglykämischen Bereich eine bedeutende insulinotrope Wirkung zu beobachten [Dupré et al. (1973), Nauck et al. (1986a)]. Die GIP-Konzentration ist abhängig von der Nahrungsaufnahme. Im nüchternen Zustand ist sie niedrig. Jedoch steigt sie nach einer Mahlzeit oder der isolierten Aufnahme von Glukose, Aminosäuren oder Triglyceriden deutlich an [Cleator und Gourlay (1975), Krarup et al. (1988)]. Um den quantitativen Einfluss des GIP auf die Insulin-Sekretion zu bestimmen, wurde diese einmal nach oraler Gabe von Glukose und einmal nach intravenöser Gabe von GIP und Glukose verglichen. Zwar wurden nach exogener Gabe von porcinem GIP und Glukose erhöhte Plasma-Glukosekonzentrationen und eine gesteigerte GIP-Immunoreaktivität beobachtet, jedoch blieb der erwartete Anstieg der Insulin-Konzentration entsprechend dem nach oraler Glukosegabe aus [Sarson et al. (1980), Sarson et al. (1982)]. Zu diesem Zeitpunkt war noch nicht bekannt, dass sich die Aminosäuresequenz des humanen intestinalen GIP, vom porcinen in zwei Positionen unterschied (AS 18 und 34) [Jörnvall et al. (1981)]. Dieser Unterschied bewirkte, dass in einigen Radioimmunoassays GIP der humanen Sequenz nicht mit der gleichen Affinität um Bindungsstellen am Antikörper konkurrierte wie porcines GIP [Amland et al. (1984)], da die 2

9 1 Einleitung für dieses Testverfahren benötigten Antikörper durch Immunisierung mit porcinem GIP gewonnen wurden. Nauck et al. zeigten 1993, dass bei Verwendung von synthetischem GIP der humanen Aminosäuresequenz als intravenöse Infusion die Immunoreaktivität in den Bereich angehoben werden konnte, der auch nach oraler Glukosegabe bei Stoffwechselgesunden durch endogene Sekretion erreicht wird. Bei konstanter Glukosekonzentration von 8 mmol/l (hyperglykämischer Clamp -Versuch) und bei isoglykämischer intravenöser Glukoseinfusion war die B-Zell-Sekretion (integrierte Anstiege von Plasmainsulin und C- Peptid) bei gleichzeitiger GIP-Infusion nicht signifikant unterschiedlich zur B-Zell-Sekretion nach oraler Glukosegabe [Nauck et al. (1993 c)]. Dies führte zu dem Schluss, dass GIP als Inkretinhormon bei der Vermittlung des Inkretin-Effektes nach oraler Glukoseaufnahme wirkt, bzw. eine insulinotrope Wirkung nach gemischter Nahrungsaufnahme hat. Eine steigernde Wirkung von GIP auf die Glukagonsekretion konnte im Rattenversuch und auch neuerlich beim Menschen nachgewiesen werden. [Pederson und Brown (1978), Meier et al. (2003)] Metabolisierung und Eliminierung von Gastric Inhibitory Peptide Die Dipeptidyl-Peptidase IV (DPP IV) ist ein Enzym, welches Peptide hydrolysiert, die mit der NH 2 -terminalen Aminosäuresequenz Xaa-Pro oder Xaa-Ala enden. Mentlein et al. (1993), Kieffer et al. (1995) und Pauly et al. (1996) konnten zeigen, dass die Metabolisierung von GIP [1-42 Amid] mit der Proteolyse durch DPP IV beginnt. Andere durch diese Peptidase deaktivierte Proteine sind GLP-1, Pankreatisches Polypeptid (PP), Peptid YY (PYY) und Neuropeptid Y (NPY) [Pauly et al. (1996)] In Versuchen von Brown et al. (1981) und Moody et al. (1981) konnte gezeigt werden, dass das N-terminale Spaltprodukt GIP [3-42 Amid] jegliche insulinotrope Aktivität verloren hat. Ursächlich dafür ist die aufgehobene N-terminal vermittelte Aktivierung des Rezeptors (und daraus resultierende insulinotrope Wirkung) des GIP [3-42Amid] [Gallwitz et al. (1990)]. Die Halbwertszeit von 125 J- markiertem GIP [1-42 Amid] konnte nach einem Versuch von Kiefer et al. mit zwei Minuten angegeben werden. Bei diesem Versuch wurde das einer Ratte intravenös applizierte 125 J-GIP innerhalb von zwei Minuten durch DPP IV in die Spaltprodukte Tyr-Ala und GIP [3-42 Amid] hydrolysiert [Kieffer et al. (1995)]. Die weitere hydrolytische Spaltung des GIP [3-42 Amid] erfolgt durch schrittweise NH 2 -terminale 3

10 1 Einleitung Spaltung durch Serum-Aminopeptidasen und führt zu den Spaltprodukten GIP [8-42 Amid], [11-42 Amid], [12-42 Amid], [13-42 Amid], [15-42 Amid], [18-42 Amid], [21-42 Amid] und [22-42 Amid] [Pauly et al. (1996)]. Berücksichtigen muss man, das bei bezifferten in-vivo Halbwertszeiten von immunoreaktivem GIP beim Menschen nach exogener Infusion von 20 Minuten [Elahi et al. (1979), Sarson et al. (1982), Kreymann et al. (1987), Nauck et al. (1993 c)], diese Spaltprodukte bei den bisher zur Verfügung stehenden Assays zum großen Teil mitgemessen werden, da diese mit dem COOH-terminalen Ende des GIP-Moleküls reagieren. Da für aktives GIP [1-42 Amid] bisher noch kein spezifischer Assay verfügbar war, existierten auch noch keine Daten über die Plasma-Halbwertszeit des intakten Moleküls [Deacon et al.(2000)] Abb.1: Schema der proteolytischen Spaltung von GIP [modifiziert nach Moody et al. (1984)] verweist auf die Position an der in vivo die Spaltung durch die Dipeptidyl-Peptidase IV erfolgt [Kiefer et al. (1995)]. 4

11 1 Einleitung Glukagon-like Peptide 1 GLP-1 wird sowohl in den L-Zellen, des terminalen Ileums, Kolons und Rektums [Ørskov und Holst (1987), Ørskov (1992), Eissele et al. (1992), Ørskov (1994)], als auch in den A- Zellen der Pankreas produziert [Ørskov et al. (1987), Eissele et al. (1992)]. Durch gewebespezifisches posttranslationales Prozessing entstehen verschiedene Endprodukte [Ørskov et al. (1987), Mojsov et al. (1986)]. Ørskov et al. charakterisierten 1992 die Art und Weise, in der das Proglukagon im Darm und in der Pankreas prozessiert werden (Abb.1). So wird in der Pankreas aus dem Proglukagon (PG) Glukagon, N-terminales Glicentin-related Pancreatic Peptide (GRPP; entsprechend PG-AS 1-30) und das C-terminale Major Pancreatic Proglukagon Fragment gebildet (MPGF; entsprechend PG-AS ). Das MPGF des Pankreas enthält die Aminosäuresequenzen der beiden Glukagon-like Peptides (GLP-1 und -2), entsprechend der Aminosäuren (AS) , sowie Im Darm wird das Proglukagon zu Glicentin (PG-AS 1-69), Oxyntmodulin, sowie in das GLP-1 (PG-AS ) und das GLP-2 (PG-AS ) gespalten [Mosjov et al.(1986), Ørskov et al. (1987)] (Abb.2). GLP-1 liegt in zwei Sequenzen vor: Zum einen in der anilierten- ([7-36]Amid) und zum anderen in der glycin-extendierten Form ([7-37]Amid). Der Beginn der Nummerierung mit der Aminosäure 7 beruht auf einer früheren irrtümlichen Annahme über die Peptidsequenz [Mojsov et al. (1987), Holst et al. (1987), Ørskov et al. (1994)]. Beide, modifizierte Moleküle haben identische biologische Effekte, als starke die Insulinsekretion fördernde und die Glukagonsekretion hemmende Peptide [Ørskov et al. (1993), Ørskov et al. (1992), Holst et al. (1996)]. Weitere Wirkungen von GLP-1 sind eine Magenentleerungs-verzögernde [Wettergen et al. (1993), Nauck et al. (1995), Willms et al. (1996)], eine appetithemmende Wirkung im ZNS [Turton et al. (1996)], eine die Transkription von Insulin, Hexokinase und Glukosetransporter-1 stimulierende [Thorens et al. (1996)], sowie die Thyreotropinausschüttung beeinflussende Wirkung [Beak et al. (1996)]. 5

12 1 Einleitung Abb.2: Schematische Darstellung der verschiedenen Prozessierungen von Proglukagon in den pankreatischen A-Zellen und den intestinalen L-Zellen [Ørskov et al. (1987 und 1991)]. Das biologisch inaktive 37 AS lange GLP-1 des Intestinums wird nach Abspaltung von sechs N- terminalen AS zur biologisch aktiven Form. Nach oraler Zufuhr von Glukose oder nach Nahrungsaufnahme kommt es zu einem GLP-1 bedingten Inkretin-Effekt. [Creutzfeld und Ebert (1985), Kreymann et al. (1987), Ørskov et al. (1991), Schjoldager et al. (1989)] Diese Tatsache machte es interessant als potentielles Therapeutikum, in so fern als dass es bei Patienten mit Typ 2 Diabetes nach intravenöser Applikation den Blut-Glukose-Spiegel normalisieren konnte [Nauck et al. (1993)]. 6

13 1 Einleitung 1.3 Die entero-insuläre Achse beim Typ 2 Diabetes Der Typ 2 Diabetes mellitus ist die häufigste Diabetesform. Pathophysiologische Grundlage ist eine Kombination aus einer verminderten Wirksamkeit von Insulin auf den Glukosestoffwechsel (Insulinresistenz) [Olefski (1981), DeFronzo (1985)] und aus Störungen der Insulinsekretion [Ward et al. (1984), Polonsky et al. (1988)]. Es konnte gezeigt werden, dass der Insulingehalt in den Langerhans schen Inseln [Rahier et al. (1983), Butler et al. (2003)] nur wenig reduziert ist, jedoch wird sowohl nach physiologischer [Polonsky et al. (1986)] als auch pharmakologischer [Ward et al. (1986)] Stimulation nur zögerlich Insulin sezerniert (Sekretionsstarre) [Pfeiffer (1969)]. Der Typ 2 Diabetes mellitus wird maßgeblich durch den glukosestimulierten Sekretionsdefekt der Insulinfreisetzung bestimmt [Brunzell et al. (1976), Ward et al. (1986)]. In wieweit Inkretinhormone, wie GIP oder GLP-1, nach oraler Glukosezufuhr bei Typ 2 Diabetikern sezerniert werden und die Insulinfreisetzung beeinflussen wurde eingehend untersucht[perley und Kipnis (1967), Nauck et al. (1986 a), Nauck et al. (1986 b), Shuster et al. (1988), Tillil et al. (1988)]. So wird das Gastric Inhibitory Polypeptid auch bei Patienten mit Typ 2 Diabetes nach oraler Glukose- und gemischter Nahrungsaufnahme sezerniert [Crockett et al. (1976), May und Williams (1978), Nauck et al. (1986 b), Jones et al. (1995)], jedoch sind zum Teil konträre Aussagen über die Menge gegenüber Normalpersonen publiziert worden. Es wurde über erhöhte [Crockett et al. (1976)], gleiche [Nauck et al. (1986 b)] und erniedrigte [Toft- Nielsen et al. (1999)] GIP-Spiegel berichtet. In wieweit das individuelle Sekretionsmuster genetisch determiniert ist oder von Variablen wie Ernährungsgewohnheiten abhängt, ist nicht bekannt. Es konnte gezeigt werden, dass bei Patienten mit Typ 2 Diabetes? trotz der konträren Studien über die GIP-Sekretion? der Inkretin-Effekt nach oraler Glukosegabe vermindert ist [Nauck et al. (1986 a), Nauck et al. (1986 b)], so dass die Insulinsekretion bei diesen Patienten vornehmlich durch die postprandiale Hyperglykämie bestimmt wird. Bei erhaltener GIP-Sekretion ergibt sich hieraus, dass die Wirkung von GIP bei Patienten mit Typ 2 Diabetes reduziert sein muss [Amland et al. (1985), Jorde und Burhol (1987), Krarup et al. (1988)]. Dies konnten Nauck et al. im hyperglykämischen Clamp -Versuch zeigen. Hier wurde durchschnittlich eine Wirkung von nur 54% von humanem GIP bei Patienten mit Typ 2 Diabetes gegenüber Stoffwechselgesunden gemessen [Nauck et al. (1993 b)]. Eine Senkung des Blutzuckers in den euglykämischen Bereich bei Patienten mit Typ 2 Diabetes war jedoch nur durch das andere, exogen zugeführte Inkretinhormon Glukagon-like Peptide 1 [7-36 Amid] möglich [Nauck et al. (1993 a), Nauck et al. (1993 c)]. Zurückzuführen 7

14 1 Einleitung ist dies auf den erhaltenen insulinotropen Effekt des GLP-1 bei Patienten mit Typ 2 Diabetes [Nauck et al. (1993 a), Nauck et al. (1993 b), Nauck et al. (1993 c)]. Eine bisher ungeklärte Frage ist, warum die insulinotrope Wirkung des GIP bei Patienten mit Typ 2 Diabetes weitgehend verloren, die des GLP-1 [7-36 Amid] jedoch erhalten ist. 1.4 Therapeutische Möglichkeiten mit GLP-1 Eine Senkung sowohl des Nüchternblutzuckers, als auch des postprandialen Glukosespiegels kann durch intravenöse oder subkutane Applikation von GLP-1 erreicht werden. [Gutniak et al. (1992), Nathan (1992), Ruchmann et al. (1997)]. Bei Patienten mit Typ 2 Diabetes und erhöhten Nüchternblutzuckerspiegeln konnte eine Normalisierung des Blutzuckerwertes nach 3-4 stündiger GLP-1 Infusion mit einer Konzentration von ca pmol/l (i.v. mit 1,2 pmol x kg -1 x min -1 ) erreicht werden [Nauck et al. (1993)]. Subkutan appliziertes GLP-1 verbesserte ebenfalls die Nüchternhyperglykämie bei Patienten mit Typ 2 Diabetes mellitus, intravenös verabreichtes GLP-1 die Nüchternhyperglykämie bei den Patienten mit Typ 1 Diabetes mellitus [Gutniak et al. (1994), Nauck et al. (1996), Creutzfeldt et al. (1996)]. Ein Problem, das jedoch bei der Applikation auftritt, ist die relativ kurze Plasma- Halbwertszeit von weniger als fünf Minuten [Deacon et al. (1996)] und damit seine kurze Wirkdauer von weniger als zwei Stunden nach subkutaner Injektion [Gutniak et al. (1994), Nauck et al. (1996), Ritzel et al. (1995), Schirra et al. (1997)]. 1.5 Inhibition der Dipeptidyl-Peptidase IV Ein Grund für die kurze Plasma-Halbwertszeit der Inkretinhormone GIP und GLP-1 ist die schnelle Inaktivierung durch eine N-terminale Abspaltung von Dipeptiden durch das Enzym Dipeptidyl-Peptidase IV (DPP IV) [Mentlein et al. (1984), Heins et al. (1984), Rahfeld et al. (1991)]. Zunächst wurde angenommen, dass die Substitution des vorletzten Alanins im GLP- 1 Analoga generieren würde, die nicht durch die DPP IV gespalten werden könnten. Diese Strategie hatte sich schon bei der Herstellung DPP IV-resistenter Analoga des growthhormone-releasing factor (GHRF) bewährt [Martin et al. (1993)]. 8

15 1 Einleitung In vitro Studien konnten zeigen, dass durch Substitution des vorletzten N-terminalen Alanins durch verschiedene andere Aminosäuren (Glycin, Serin, Threonin oder a- Aminoisobutylsäure) eine verringerte Degradation geschah [Deacon et al. (1995)]. Eine weitere Möglichkeit ist die zusätzliche Gabe von Pharmaka, die die proteolytische Degradation von GLP-1 verhindern (DPP IV Inhibitoren) [Deacon et al. (1998)]. Inhibitoren der DPP IV stabilisieren die bioaktiven Formen der endogen sezernierten Inkretinhormone [Deacon et al. (1998), (2002), Holst et Deacon (1998), Pauly RP et al. (1996)]. Nach vorklinischen Untersuchungen konnte so die Substanz Di-[3N-((2S,3S)-2-amino-3-methylpentanoyl)1,3-thiazolidine]fumarat (P32/98) als oral verfügbarer DPP IV-Inhibitor identifiziert werden, der in-vivo zu einer erhöhte Glukose-Toleranz führte [Freyse et al. (1999), Pederson (1998), Deacon et al. (1998a,b)]. Neben diesem werden zur Zeit weiterer DPP IV-Inhibitoren entwickelt und auf ihre Eignung als orale Antidiabetika getestet. Eine weitere Klasse bilden N-terminal substituierte glycyl-2-cyanopyrrolidinen, z.b. 1-[2-[5-cyanopyridin-2- yl)amino]ethylamino]acetyl-2-cyano-(s)-pyrrolidine (NVP-DPP728) oder als Nachfolge Substanz [(1-[[(3-hydroxy-1-adamantyl) amino] acetyl]-2-cyano-(s)-pyrrolidine) (LAF237). Eine Testung dieser Substanzen erfolgte sowohl im Tierversuch (fettleibige Zucker fa/fa Ratten) als auch in klinischen Studien am Menschen. Die Ergebnisse dieser Studien lassen darauf schließen, dass eine verbesserte metabolische Kontrolle von Patienten mit Typ-2 Diabetes mellitus durch Inhibition der DPP IV mit diesen Substanzen möglich ist. [Villhauer et al. (2003), Ahren et al. (2004)]. 9

16 1 Einleitung 1.6 Fragestellung der Arbeit Glukagon-like Peptide 1 [7-36 Amid] (GLP-1) und Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) sind Darmhormone mit Glukose-abhängiger insulinotroper und glukagonostatischer Wirkung [Nauck et al. (1993,1997), Kreyman (1987)]. Da die Wirkung von GLP-1 im Gegensatz zu GIP bei Patienten mit Typ 2 Diabetes erhalten ist [Nauck et al. (1993)], und bei geringfügig (drei- bis vierfach) über physiologischen postprandialen Konzentrationen liegende Dosierungen (z.b. 1,2 pmol x kg -1 x min -1 i.v.) selbst bei Patienten mit Sulfonylharnstoff- Sekundärversagen innerhalb von 3-4 Stunden eine völlige Normalisierung der Nüchternhyperglykämie bewirken [Nauck et al. (1993), Willms et al. (1996)], wird über einen therapeutischen Einsatz von GLP-1 [7-36]Amid nachgedacht [Nauck et al. (1997)]. Unglücklicherweise ist die Pharmakokinetik von GLP-1 bei intravenöser oder subkutaner Injektion so ungünstig, dass nur über kurze Zeit, das heißt maximal zwei Stunden, eine Wirkung erzielt werden kann [Gutniak et al.(1994), Ritzel et al.(1995)]. Dies reicht nicht, um die nach intravenöser Dauerinfusion erreichbare Normalisierung des Blutzuckers zu erreichen. Deshalb muss über eine Verlängerung der Wirkungsdauer von GLP-1 nachgedacht werden. Möglichkeiten sind die Modifikation (GLP-1 Analoga) [Deacon et al. (1998)] oder die zusätzliche Gabe von Pharmaka, die die proteolytische Degradation von GLP-1 verhindern (DPP IV Inhibitoren) [Deacon et al. (1998)]. Mit P32/98 (Isoleucyl Thiazolidid Hemifumarat) liegt ein im Tierexperiment und in Phase I- Studien bei gesunden freiwilligen Testpersonen befindliches, vielversprechendes Medikament vor, dass im Tierexperiment die Wirkung von endogenen Inkretinhormonen (GIP und GLP-1) verstärkt [Pederson et al. (1998), Pauly et al. (1999)]. Aus den vorliegenden Phase 1-Studienergebnissen und Tierexperimenten bei verschiedenen Spezies ergibt sich eine gut Verträglichkeit bei P32/98 (Isoleucyl Thiazolidid Hemifumarat) und vorerst eine Eingrenzung des vorläufigen Dosisbereiches um 7,5 bis 60 mg pro Einzeldosis (siehe Investigator`s Broschure, 2. Auflage, , probiodrug Gesellschaft für Arzneimittelforschung GmbH). Eine Abschätzung der medikamentösen Wirksamkeit bei Patienten mit Typ 2 Diabetes würde sich aus einem Nachweis der Insulinsekretionssteigernden Wirkung von P32/98 bei gesunden, aber hyperglykämischen Probanden ergeben. Dies ergibt sich aus der ausgeprägten Glukoseabhängigkeit der insulinotropen Wirksamkeit von GIP und GLP-1 [(Kreymann et al. (1987), Nauck et al. (1993), Göke et al. (1993), Qualmann et al. (1995)]. Deshalb ist bei Gesunden mit normaler Glukosetoleranz, d.h. postprandialer Euglykämie keine ausgeprägte Wirkung zu erwarten. Oberhalb des 10

17 1 Einleitung Schwellenwertes (der bei circa 110 mg/dl liegt und mit 150 mg/dl sicherlich überschritten ist [Nauck et al. (1993), Qualmann et al (1995), Göke et al. (1988)] ist jedoch mit einer ausgeprägten Insulinsekretionssteigerung durch die Inkretinwirkung von GIP und GLP-1 zu rechnen. Es ist Ziel der vorliegenden Untersuchung eine Steigerung der Insulinsekretion durch P32/98 nach einer Testmahlzeit bei gesunden Versuchspersonen mit normaler Glukosetoleranz nachzuweisen, denen vor der Mahlzeit über 60 Minuten im hyperglykämischen Clamp"- Verfahren [Nauck et al. (1993)] eine Glukosekonzentration von 150 mg/dl eingestellt wurde. Die so gefundene Glukoseinfusionsrate soll über die restliche Versuchsdauer (4h) beibehalten werden. In diesen Experimenten soll versucht werden die Hemmung der DPP IV und eine verminderte Degradation von GIP und GLP-1 zu GIP [3-42] bzw. GLP-1 [9-36 Amid] unter dem Einfluss von P32/98 zu demonstrieren. Da bereits bei geringen Erhöhungen der Plasma- GLP-1 Konzentrationen eine Verzögerung der Magenentleerungsgeschwindigkeit zu erwarten ist [Nauck et al. (1997)], sollte mit einer nicht invasiven 13 C-Oktanoat-Atemtestmethode die Magenentleerungsgeschwindigkeit gemessen werden. 11

18 2 Material und Methoden 2 Patienten, Material und Methoden 2.1 Studienprotokoll Das Studienprotokoll mit der Registriernummer 1386 wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum hinsichtlich rechtlicher und ethischer Bedenken begutachtet. Mit dem Schreiben vom bestanden keine Bedenken gegen die Durchführung der Studie in der vorgelegten Form. Alle Probanden und Patienten wurden vollständig aufgeklärt und erteilten schriftlich ihre Zustimmung zur Teilnahme an den Versuchsreihen. 2.2 Einschlusskriterien Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Studiengröße war auf 10 gesunde, freiwillige, männlichen Probanden, mit normaler oraler Glukosetoleranz (WHO-Kriterien), und deren Teilnahme an zwei Versuchstagen, festgelegt. Das Alter der Probanden durfte nach Studienprotokoll zwischen 18 und 45 Jahren betragen. Probanden mit bekannten Stoffwechselerkrankungen oder hierfür positiver Familienanamnese wurden ebenso wie Probanden mit laborklinischen Auffälligkeiten (siehe unten) von der Teilnahme an der Studie ausgeschlossen. 2.3 Probandencharakteristika und Voruntersuchung Zur Voruntersuchung erschienen insgesamt 13 potentielle Probanden. Von diesen lehnte ein Proband nach Durchführung der Voruntersuchung und Darlegung der Versuchsanordnung aus persönlichen Bedenken die Versuchsteilnahme ab. Ein weiterer stoffwechselgesunder potentieller Proband ohne bekannte Vorerkrankungen zeigte im Rahmen der Voruntersuchung eine Erhöhung der Transaminasen GOT auf 25 U/l, sowie der GPT auf 75 U/l. Als Grenze für Transaminasen und Cholestaseenzyme galt das Doppelte des oberen Normalwertes. Für das Plasma-Kreatinin galt ein Grenzwert von 1,4 mg/dl (inklusive), da bei höhergradigen Einschränkungen der Nierenfunktion mit einer veränderten Pharmakokinetik von GLP-1 zu rechnen ist (renale Elimination) [Ørskov et al. (1992)]. Der Proband wurde auf die erhöhten 12

19 2 Material und Methoden Leberwerte hingewiesen. Ihm wurde eine weiterführende Abklärung der Werte angeboten, die er jedoch nicht in Anspruch nahm. Dieser Proband wurde von der Teilnahme an der Studie ausgeschlossen. Ein dritter Proband brach die Versuchsreihe nach dem ersten Versuchstag aus persönlichen Gründen ab. Die Daten dieser 3 Probanden wurden für die Analysen im Rahmen dieser Arbeit nicht berücksichtigt, alle gemachten Angaben beziehen sich auf die in die Studie eingeschlossenen 10 stoffwechselgesunden Probanden mit normaler oraler Glukosetoleranz (WHO-Kriterien), die an beiden Versuchstagen an dem Experiment teilnahmen. Im Rahmen der Voruntersuchung wurden alle Probanden mit Hilfe eines standardisierten Schemas anamnestiziert und untersucht. Zunächst wurde eine Familienanamnese hinsichtlich eines Typ 2-Diabetes erhoben und die anthropometrischen Daten Gewicht, Größe, Bauchund Hüftumfang sowie der arterielle Blutdruck und Puls der Probanden gemessen. Zusätzlich wurde bei allen Versuchspersonen ein Oraler-Glucose-Tolleranz-Test (75 g; Boehringer O.G.T., Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) durchgeführt (siehe Tabelle 1). Anhand der durchgeführten venösen Blutabnahme wurden die Parameter der Leber- und Nierenfunktion sowie des Fettstoffwechsels untersucht, ausserdem das Blutbild auf mögliche Veränderungen überprüft. Weiterhin erfolgte die Bestimmung des spezifischen Gewichts, der Glukosekonzentration, des ph-wertes, sowie verschiedener weiterer Parameter im Urin. Das Alter der 10 Probanden lag zwischen 19 und 45 Jahren. Weder in der eigenen noch in der Familienanamnese der Probanden waren Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes, oder andere Stoffwechselerkrankungen bekannt. Die Standard-Laborwerte (Elektrolyte, Leber- und Nierenfunktionsparameter) lagen im Normbereich (siehe Tabelle 2). Die innerhalb der einzelnen Gruppen errechneten Mittelwerte für die hämatologischen Untersuchungsergebnisse, sowie die der Urindiagnostik sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Zusammenfassend konnten nach der Voruntersuchung der in die Studie eingeschlossenen Probanden weder im Zuge der Anamnese, noch in den venösen Blutuntersuchungen oder der Urindiagnostik besondere Auffälligkeiten festgestellt werden. 13

20 2 Material und Methoden Tabelle 1: Charakteristika der untersuchten Probanden und Patienten Parameter [Einheit] Probanden (n = 10) Anthropometrische Daten Alter [Jahre] 25,6 ± 7,7 BMI [kg/m 2 ] 24,5 ± 3,1 Waist-to-Hip-Ratio 0,87 ± 0,03 RR systolisch [mmhg] 124 ± 9 RR diastolisch [mmhg] 75 ± 5 Puls 77 ± 12 Raucher 5 Diabetesstatus und metabolische Kontrolle Glucose-Toleranz-Status: Normal 10 Nüchtern-Glc. [mg/dl] 94 ± min-Glc. + [mg/dl] 100 ± 13 Mittelwerte ± SD + : 120 min nach 75 g oraler Glukose 14

21 2 Material und Methoden Tabelle 2: Ergebnisse der klinisch-chemischen Voruntersuchungen Parameter [Einheit] Probanden (n = 10) Serum-Diagnostik Kreatinin [mg/dl] 1,0 ± 0,1 Bilirubin [mg/dl] 0,9 ± 0,6 GOT [U/l] 10 ± 2,9 GPT [U/l] 14 ± 4,5 AP [U/l] 109 ± 24?-GT [U/l] 14 ± 6,5 Cholesterin [mg/dl] 179 ± 21 HDL-Cholsterin [mg/dl] 43 ± 17 LDL-Cholsterin [mg/dl] 118 ± 23 VLDL [mg/dl] 18,5 ± 9,8 LDL/HL [mg/dl] 3,7 ± 2,9 Triglyceride [mg/dl] 116 ± 72 Bilirubin [mg/dl] 0,9 ± 0,6 Na + [mval] 138 ± 2,9 K + [mval] 4,1 ± 0,4 Ca 2+ [mval] 4,8 ± 0,3 Mittelwert ± SD 15

22 2 Material und Methoden Tabelle 3: Ergebnisse der hämatologischen und Urin Voruntersuchungen Parameter [Einheit] Probanden (n = 10) Hämatologie Leukozyten [/µl] ± 830 Erythrozyten [/pl] 5,9 ± 0,4 HB [g/dl] 15 ± 1,2 Hkt [%] 44 ± 3,5 MCV [fl] 85 ± 2,6 MCH [pg] 30 ± 0,9 MCHC [g/dl] 35 ± 1,1 Thrombozyten [/µl] ± Urin SG 1,023 ± 0,005 PH 6 ± 1 Leukozyten +/- b 2/8 Nitrat +/- b 0/10 Protein +/- b 4/6 Glukose normwertig 10 Ketonkörper +/- b 0/10 Urobilin +/- b 1/9 Erythrozyten +/- b 4/6 Mittelwert ± SD b : +/- = im Urin vorhanden / nicht vorhanden An die Voruntersuchung anschließend erfolgte die Randomisierung der in die Studie eingeschlossenen 10 Probanden nach der Zufallsmethode, für welche ein Würfel benutzt wurde. Zuvor wurde festgelegt, dass bei ungeraden Zahlen (1; 3; 5) zuerst ein Versuch mit der DPP IV-Inhibitorsubstanz P32/98 und bei geraden Zahlen (2; 4; 6) zuerst ein Placeboversuch erfolgt. Den Versuchsprobanden war dieser Beschluss nicht bekannt, sie 16

23 2 Material und Methoden wussten somit nicht, an welchem Tag sie an welchem der beiden Versuche teilnahmen (einfache Verblindung). 2.4 Studiendesign Alle 10 Probanden nahmen an zwei Versuchstagen teil (zwischen den Versuchstagen verging mindestens eine Woche) Der Versuchsbeginn war jeweils für 9.00 Uhr morgens festgelegt. Die Probanden bekamen die Anweisung am Tag vor dem Versuch, tagsüber eine normale Ernährung einzuhalten und ab Uhr keine Flüssigkeit und keine Nahrung mehr bis zum Versuchsbeginn am nächsten Morgen zu sich zu nehmen (mindestens zehnstündige Nahrungs- und Flüssigkeitskarenz). Eine distale Unterarmvene wurde mit einer Teflonkanüle (Moskito 123, 18 g, Vygon, Aachen) punktiert und mit physiologischer Kochsalzlösung durchgängig gehalten. Durch diese Verweilkanüle erfolgten die Blutentnahmen (siehe 2.4.2). Zur Infusion von Glukoselösung (Glukose 40 % sowie Glukose 20%) wurde eine zweite Verweilkanüle in einem großlumigen Gefäß am kontralateralen Arm unter Bevorzugung der Cubitalvene plaziert. Alle Versuchsteilnehmer verharrten während des Versuchsablaufes in einer halbliegenden Position. Die während des Versuchs durchgeführten Glukosemessungen wurden in kapillärem Blut (Ohrläppchen) durchgeführt, da so praktisch identische Werte wie in arteriellem Plasma gemessen werden [Whichelow et al. (1967); Förster et al. (1972)]. Initial erfolgte eine venöse und eine kapilläre Blutentnahme zum Zeitpunkt 15 min, d.h. 15 Minuten vor der intravenösen Glukoseinfusion. 15 Minuten später zum Zeitpunkt 0 min wurde den Probanden eine weitere basale Blutprobe (venös und kapillär) entnommen. Direkt im Anschluß daran wurde den Versuchspersonen 40 %ige Glukoselösung als Bolus injiziert, mit dem Ziel, den Plasmaglukosespiegel vom Nüchternwert auf annähernd 150 mg/dl (8,33 mmol/l) anzuheben, bevor mit dem eigentlichen Clamp -Experiment begonnen werden konnte. Anschließend erfolgte die weitere Einstellung des Plasmaglukosespiegels mittels 20%-tiger Glukoselösung, über die folgenden 60 Minuten um eine Glukosekonzentration von ca. 150 mg/dl zu erreichen und aufrecht zuhalten. Die Bestimmung der Glukosekonzentration erfolgte über in fünfminütlichen Abständen entnommene kapilläre Blutabnahmen bis 17

24 2 Material und Methoden einschließlich zum Zeitpunkt 60 min. Die so ermittelte Steady-State - Glukoseinfusionsmenge wurde für den Rest des Versuches beibehalten (Zeitpunkt min). Die Zielgröße der Plasma-Glukosekonzentration von 8,33 mmol/l wurde deshalb gewählt, weil sich gezeigt hatte, daß die Wirkung der insulinotropen Hormone GIP [1-42 Amid] und GLP-1 [7-36 Amid] Plasmaglukose-abhängig ist [Dupré et al. (1973); Elahi et al. (1979); Kreymann et al. (1987); Nauck et al. (1989); Nauck et al. (1993 c)]. Weiterhin erfolgten venöse Blutabnahmen zu den Zeitpunkten 15 min, 30 min und 45 min. 45 Minuten (Zeitpunkt 45 min) nach der 40%tigen Glukose-Bolusinjektion wurde den Probanden eine Tablette entweder ein Placebo, oder P32/98 (Isoleuzyl Thiazolidid Hemifumarat) gegeben. Bei der Wahl der Placebotablette wurde darauf geachtet, dass sie in ihrer Farbe (weiß), Form (rund) und Grösse möglichst der Verumtablette entsprach. Sie bestand aus Lactose und Magnesiumstearat und war ebenso geschmacksneutral, wie die Verumtablette. 15 Minuten nach Applikation der P32/98 oder Placebotablette, erfolgte der initiale Atemtest, sowie eine weitere venöse Blutabnahme. Direkt im Anschluss wurde den Probanden eine gemischte Testmahlzeit (siehe 2.4.1), einschließlich einer 13 C-Oktanoat-Markierung gereicht (Zeitpunkt 60 min). Während des weiteren Versuchablaufs ( min) wurde in fünfzehnminütigen Abständen und dann ab der 180. Minute bis zum Ende des Versuches (300 min), halbstündig kapillar Blut entnommen und unmittelbar daran anschließend der aktuelle Plasmaglukosewert bestimmt. Die Glukoseinfusion wurde entsprechend dieser Werte reguliert. Der Zeitpunkt und die Änderung der Glukoseinfusionsraten als Maß der Insulinwirkung wurden protokolliert. Die Venösen Blutentnahmen erfolgten zunächst fünfzehnminütig (Zeitpunkt 0 90 min), danach bis zum Versuchende halbstündig (Zeitpunkt min). Der 13 C-Oktanoat-Atemtest wurde ab dem Zeitpunkt 60 min bis zum Zeitpunkt 180 min zehnminütig, anschließend 20minütig durchgeführt ( min). Abbildung 3 zeigt schematisch den Ablauf des Versuches und die Zeitpunkte der verschiedenen Probenentnahmen. 18

25 2 Material und Methoden Abbildung 3: Schematische Darstellung des über 315 Minuten dauernden Versuchablaufs. Dargestellt sind die Zeitpunkte der venösen (rote Dreiecke) und kapillären Blutabnahmen (grüne Punkte), sowie die Zeitpunkte der 13 C-Oktanoat-Atemtests (gelbe Raute). Nach den basalen Blutabnahmen erfolgte die zunächst eine Glukosebolusinfuion (40% Glukose), danach die genaue Einstellung des Plasmaglukosewertes mithilfe 20%tiger Glukoselösung bis zur 60. Minute. Die Applikation des DPPIV-Inhibitors P32/98 bzw. der Placebotablette (Kapselsymbol) erfolgte 45 Minuten nach der initialen Glukoseinfusion. 15 Minuten später (Zeitpunkt 60 min) wurde den Probanden die mit 13 C-Oktanoat markierte Testmahlzeit (Ei) verabreicht. 19

26 2 Material und Methoden Testmahlzeit Zum Zeitpunkt 60min wurde ein standarisiertes Testfrühstück mit je zwei Scheiben Weizentoastbrot und jungem Goudakäse (45% Fett), sowie einem Rührei, 20 g Halbfettmargarine und einer Tasse Früchtetee ohne Zusatz (565,9 kcal, 29,4 % Kohlenhydratanteil, 30 % Eiweißanteil, 36,4 % Fettanteil) eingenommen. Der Testmahlzeit wurde eine geeignete Menge 13 C-Oktanoat (100 mg) zugefügt, indem sie vor der Zubereitung des Rühreis gleichmäßig in das Eigelb eingespritzt wurde. Über 4 Stunden wurde die 13 C-CO 2 -Konzentration in der Atemluft bestimmt ( 13 C-CO 2 - Exhalation), alle zehn Minuten in den ersten zwei Stunden, halbstündig während der übrigen Zeit (weitere zwei Stunden), um hieraus die Geschwindigkeit der Magenentleerung ableiten zu können Blutentnahmen Für die Messungen von Insulin, C-Peptid, Triglyceriden, P32/98 und DPP IV wurde Blut in 4,9 ml-monovetten, für GIP [1-42 Amid], GLP-1 und Glukagon wurde Blut mit 9 ml-monovetten (EDTA-Zusatz; Firma Sarstedt, Nümbrecht) entnommen. Den Monovetten für die Bestimmung von GIP, GLP-1 und Glukagon wurde Aprotinin als Proteinase-Inhibitor (Trasylol, KIU/ ml, 200 µl auf 10 ml Blut; Bayer AG, Leverkusen) zugesetzt. Alle Blutproben wurden nach Lagerung auf Eis so schnell wie möglich bei 4 o C zentrifugiert (10 min bei 3600 Umdrehungen/min). Die Plasmaproben für die DPP IV- Bestimmung wurden bei +4 o C, die restlichen Proben wurden bei 70 o C eingefroren und gelagert. Zur Messung jedes Hormons wurden jeweils noch nicht aufgetaute Abfüllungen verwendet. Kapillare Blutproben (ungefähr 100 µl) zur sofortigen Messung der Plasma- Glukosekonzentration wurden in NaF (Microvette CB; Sarstedt, Nümbrecht) abgenommen. 20

27 2 Material und Methoden 2.5 Laborbestimmungen Plasma-Glukose-Konzentrationen Die Messung der Plasma-Glukosekonzentrationen wurde mit Hilfe eines Beckmann Glukose-Analyser 2 durchgeführt (Beckman Instruments, München, Glukose-Oxidase- Methode). Da die aktuellen Plasmaglukose-Werte zur Steuerung der Glukoseinfusion herangezogen werden mußten, erfolgte ihre Bestimmung unmittelbar nach Zentrifugation der Proben (Eppendorf Tischzentrifuge, 30 Sekunden). Zwischen dem Beginn der Blutentnahme und der Ausgabe des ersten Meßwertes dieser Probe lagen durchschnittlich etwa 75 Sekunden. Bei wiederholter Messung einer Plasmaprobe am gleichen Tag lag der Variationskoeffizient unter 2 % Hormonbestimmungen Prinzip des Immunoassays Die Bestimmung der Hormone Insulin, C-Peptid, GIP, GLP-1 und Glukagon erfolgte durch Immunoassays. Die Entdeckung des Prinzips der immunologischen Hormonbestimmung durch Berson und Yalow zu Beginn der 60er Jahre hat die Endokrinologie in ihrer heutigen Form erst möglich gemacht [Berson und Yalow (1962)], da nur dieses Verfahren in seinen inzwischen mannigfaltigen Variationen die nötige Spezifität und Sensitivität für Plasmahormonbestimmungen liefert. Die Methode beruht auf einer kompetitiven Konkurrenz einer konstanten Menge markierten Hormons mit unterschiedlichen Mengen nicht-markierten Hormons (aus der Probe) um eine limitierte Zahl von Bindungsstellen auf einer konstanten Menge eines für das Hormon spezifischen Antikörpers. Die Menge an nicht-markiertem Hormon bestimmt also den Anteil des markierten Hormons, der sich an den Antikörper koppelt. Die Markierung des Antigens kann durch Einführung eines radioaktiven Isotops (radioimmunologische Bestimmung, RIA) oder durch kovalente Koppelung an ein Enzym (enzymimmunologische Bestimmung, ELISA) erfolgen. Die Menge an markiertem Hormon kann durch Radioaktivitätsmessungen, bzw. mit Enzymaktivitätsmessungen bestimmt werden. Die Trennung von freiem bzw. gebundenem Hormon geschieht mittels Elektrophorese, Aussalzung, Fällung mit einem 21

28 2 Material und Methoden gegen den Hormon-Antikörper-Komplex gerichteten zweiten Antikörper oder mittels Adsorption des freien Hormons an Aktivkohle oder Ionenaustauscher. Der Vorteil der immunologischen Hormonbestimmung liegt bei gegebenen Voraussetzungen in der Einfachheit ihrer Durchführung und ihrer hohen Empfindlichkeit. Nachteilig ist, daß auch Hormonvorstufen oder Abbauprodukte, wenn sie die für die Antikörperbindung nötige Peptidsequenz noch enthalten, mit gleicher oder ähnlicher Affinität an das Bindungsprotein gebunden werden ( Kreuzreaktivität ). 22

29 Tabelle 4: Technische Daten der eingesetzten Immunoassayas zur Hormonbestimmung in den gewonnenen Proben Assay Standardbereich Herkunft des Kreuzreaktivität Variationskoffizient a Variationskeffizient a Antiserums intra-assay inter-assay IR-Insulin mu/l Maus, monoklonal Proinsulin: 0,005 % < 4 % < 7 % Rinderinsulin: 13 % Schweineinsulin: 90 % IR-C-Peptid 0,07-5,3 nmol/l polyklonal Proinsulin:0,5 % < 10 % < 9 % IR-Proinsulin pmol/l monoklonal (65,66)-Proinsulin: 100% 3,2-5,7 % 3,6-6,0 % (31,32)-Proinsulin: 100 % Insulin: < 0,1 % C-Peptid: < 0,1 % IR-Glukagon 1-50 pmol/l Schwein (AS 4305) Enteroglukagon: 0,1 % 6,7 % 16 % Gesamt-GIP pmol/l Kaninchen (R65) GIP [3-42 Amid]: 100 % < 6 % 8 % N-GIP pmol/l Kaninchen (96171) GIP [3-42 Amid]: < 0,01 % < 6 % 8 % GLP-1 [7-36 Amid]: < 0,01 % GLP-1 [9-36 Amid]: < 0,01 % GLP-2 [1-33 Amid]: < 0,01 % GLP-2 [3-33 Amid]: < 0,01 % Glukagon: < 0,01 % Gesamt-GIP polyklonal GLP-1 [7-36 Amid]: 100% GLP-1 [7-37 Amid]: 100% GLP-1 [9-36 Amid]: >0,1% N-GLP-1 monoklonal GLP-1 [7-36 Amid]: 100% GLP-1 [7-37 Amid]: 100% a : berechnet aus dem Quotienten aus Standardabweichung und Mittelwert, angegeben in Prozent 23

30 2 Material und Methoden Insulin Die Messung der IR-Insulinwerte erfolgte mit einem Mikropartikel-Enzym-Immunoassay, dessen Partikel mit monoklonalen Maus-Antikörpern beschichtet sind (MEIA Abott IMx Insulin, Abott Laboratories, Wiesbaden). Die Kalibrierung erfolgte mit humanem Insulin. Die errechnete Empfindlichkeit des Assays war gleich oder besser als 1.0 mu/l. Proben mit Insulinkonzentrationen größer 300 mu/l mußten manuell verdünnt werden. Kreuzreaktivitäten mit C-Peptid oder Glukagon traten nicht auf, mit Proinsulin betrugen sie %, mit Rinder- oder Schweineinsulin 13 % bzw. 90 %. Intra- und Inter-Assay- Variationskoeffizienten lagen bei unter 4 bzw. unter 7 % C-Peptid Für die Bestimmung der C-Peptid-Werte wurden mit polyklonalem C-Peptid Antiserum beschichtete Mikrotiter-Wells benutzt (C-Peptid MTPL EIA, DRG Instruments GmbH, Marburg). Das C-Peptid aus dem Standard oder der Patientenprobe konkurriert mit einer definierten Menge an C-Peptid-Konjugat um die freien Antikörper-Bindungsstellen auf der Solid-Phase. In einem zweiten Schritt bindet ein Enzymkomplex an das C-Peptid-Konjugat. Der nicht gebundene Enzymkomplex wird durch einen Waschschritt entfernt, Substratlösung wird hinzugegeben und die Farbentwicklung nach einer definierten Zeit gestoppt. Die gemessene optische Dichte ist umgekehrt proportional der C-Peptid-Konzentration in der Probe. Die kleinste nachweisbare C-Peptid-Konzentration, die vom Nullstandard unterschieden werden konnte, betrug 0.05 ng/ml (0.017 nmol/l). Proben mit C-Peptid- Konzentrationen größer 16 ng/dl (5.3 nmol/l) mußten mit Nullstandard vorverdünnt werden. Proinsulin zeigte in diesem Assay eine Kreuzreaktivität von 0,5 %, Kreuzreaktivitäten zu anderen Peptiden waren nicht nachweisbar. Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten lagen jeweils unter 10 %. 24

31 2 Material und Methoden Glukagon Das pankreatische Glukagon wurde unter Verwendung des Antikörpers 4305 [Holst (1982)] in Äthanol-extrahiertem Plasma untersucht. Dieser Radiouimmunoassay, bei dem vom Schwein stammendes Glukagon (NOVO Research Institute, Kopenhagen, Dänemark) als Standard und 125 J-markiertes Glukagon als Tracer verwendet wurde, ist hochspezifisch für das Glukagon des Pankreas. Die Trennung von freiem und antikörpergebundenem Tracer wurde auch hier mit plasmaüberzogener Aktivkohle (Merck, Darmstadt) durchgeführt Gastric Inhibitory Polypeptide (Gesamtkonzentration) Die Messung der Gesamt-GIP-Konzentrationen erfolgte mit einem Radioimmunoassay, dessen wichtigsten Charakteristika durch Krarup et al. beschrieben worden sind [Krarup (1988 a)]. Während in früheren Beschreibungen natürliches porcines GIP als Standard verwendet worden war, wurde für diese Untersuchung synthetisches humanes GIP (Peninsula Laboratories Europe, Ltd, St. Helens, Merseyside, UK) als Standard verwendet. So war gewährleistet, daß in menschlichen Blutproben GIP-Konzentrationen ohne Verfälschung durch unterschiedliche Affinität des Antikörpers zu GIP der humanen (endogene Sekretion) und porcinen (frühere Standardkurve) Aminosäuresequenz [Amland et al. (1984); Jorde et al. (1985)] angegeben werden konnten. Es wurde ein durch Immunisierung gewonnener, mit Albumin gekoppelter, synthetischer Antikörper verwendet (R 65). Da dieser Antikörper gegen das C-terminale Ende des GIP-Moleküls gerichtet ist, wurde mit diesem Assay die Gesamt- GIP-Konzentration gemessen, welche sich aus dem biologisch aktiven GIP [1-42 Amid] und dem GIP [3-42 Amid], das durch N-terminale Proteolyse durch das Enzym Dipeptidyl- Peptidase IV aus dem aktiven Hormon entsteht, zusammensetzt. Als Tracer wurde 125 J- markiertes synthetisches, humanes GIP verwendet (Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Litle Chalfont, Buckinghamshire, UK); die Koppelung erfolgte mittels Chloramin-T und die Trennung mittels isokratischer High-Performance-Liquid-Chromatography (Nucleosil C- 18-Säule, 0,1 % Trifluoressigsäure, 20 % Acetonitril), die Trennung von freiem und antikörpergebundenem Tracer mit plasmaüberzogener Aktivkohle (Merck, Darmstadt). Die Nachweisgrenze lag bei < 2 pmol/l. Die Intra- bzw. Inter-Assay-Variationskoeffizienten lagen bei < 6 % bzw. 8 %. 25

32 2 Material und Methoden Aktives GIP [1-42 Amid] Die Messung des biologisch aktiven GIP [1-42 Amid] ohne Kreuzreaktivität mit dem inaktiven GIP [3-42 Amid] wurde mittels eines von Deacon et al. entwickelten Radioimmunoassays durchgeführt. Hierzu wurde der polyklonale Antikörper verwendet, welcher gegen das Fragment GIP [1-10 Cys] gerichtet und somit spezifisch für den NH 2 -Terminus des GIP [1-42 Amid] ist. Als Tracer wurde ebenfalls 125 J-markiertes synthetisches, humanes GIP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Litle Chalfont, Buckinghamshire, UK) verwendet. Als Standard diente humanes GIP (Peninsula Laboratories Europe, Ltd, St Helens, Merseyside, UK). Die Trennung von freiem und antikörpergebundenem Tracer wurde auch hier mit plasmaüberzogener Aktivkohle (Merck, Darmstadt) durchgeführt. Zum Assay-Puffer wurde Valin-Pyrolidid zu einer Endkonzentration von 0,01 mmol/l hinzugefügt. Diese Substanz verhindert die Degradierung des GIP [1-42 Amid] während der Inkubationen im Verlaufe des Assays. Die Nachweisgrenze lag bei 5 pmol/l. Der Standardbereich umfaßte Konzentrationen von pmol/l. Kreuzreaktivitäten mit dem NH 2 -terminal degradierten GIP [3-42 Amid], mit GLP-1 [7-36 Amid], GLP-2 [1-33 Amid], GLP-2 [3-33 Amid] und Glukagon lagen bei < 0,01 %. Intrabzw. Inter-Asay-Variationskoeffizienten lagen bei 6 bzw. 10 % Totale GLP-1 [1-36 Amid] Um die Konzentration des gesamten GLP-1 im Serum zu messen, wurde ein RIA-Kit der Firma Linco Research verwendet (Glucagon-Like Peptide-1 (Active) RIA Kit; 125 Tubes (Cat.# GLP1A-35HK)) [ Morgan et al. (1963), Westgard et al. (1981), Holst JJ et al. (1997)] Der Antikörper hierbei ist spezifisch gegen das GLP-1(7-36) Amide oder GLP-1(7-37) Amid gerichtet. Eine Kreuzreaktivität zu GLP-1(1-36) Amide, GLP-1(1-37) Amid, GLP-1(9-36) Amide, oder GLP-1(9-37) Amid besteht nur in geringem Maße (>0,1%). Als Tracer diente ein mit 125 Jod markierter Antikörper ( 125 I-GLP-1 (monoiodiniert, HPLC gereinigt, 20,000 CPM/Röhrchen). Als Referenz diente eine Standardkurve mit bekannten Konzentrationen von unmarkiertem Antigen. 26

33 2 Material und Methoden Aktives GLP-1 [7-36 Amid] Für die Quantifizierung des biologisch akitven GLP-1 im Serum wurde eine von der Firma Linco Research entwickeltes ELISA-Kit verwendet (Glucagon-Like Peptide-1 (Active) ELISA KIT ; 96-Well Plate (Cat. # EGLP-35K) ) [Nathan DM et al (1992), Kieffer TJ et al. (1995), Tijsen P et al. (1985)]. Dieses Kit ermöglicht die Bestimmung von GLP-1 (7-36 amide) und GLP-1 (7-37) im Plasma und anderen biologischen Medien [Holst JJ et al. (1997)]. Die Methode basiert auf 1) Markierung und Bindung von aktivem GLP-1 aus Proben mittels eines monoklonalen Antikörpers, anschließender Immobilisation auf sogenannten microwell plates, die speziell die N-terminale Region des aktiven GLP-1 Moleküls binden, 2) mehreren Waschschritten, um ungebundenes Material zu entfernen, 3) Inkubation und Konjugation von Anti-GLP-1 alkalischer Phosphatase am immobilisierten GLP-1, 4) erneute Waschschritte, um ungebundene Konjugate zu entfernen und 5) Quantifizierung der gebundenen Konjugate durch Hinzufügen von MUP ( Methyl- Umbelliferyl-Phosphat), welches in der Präsenz der alkalischen Phosphatase den Fluoreszenzfarbstoff Umbelliferol herstellt [Christopoulos TK et al. (1996)]. Da die Menge der generierten Fluoreszenz direkt proportional der Konzentration des aktiven GLP-1 in unbekannter Konzentration ist, kann diese durch Interpolation an einer Refernz-Kurve, welche mit gleichem Assay bei bekannten GLP-1 Konzentrationen hergestellt ist, abgelesen werden Triglyceride Für die Bestimmung der Triglyceridwerte wurde ein enzymatischer in vitro Farbtest verwendet. Triglyceride sind Ester des dreiwertigen Alkohols Glycerin mit drei langen Fettsäuren. Unter Verwendung einer Lipoproteinlipase aus Mikroorganismen erfolgt schnell und vollständig die Hydrolyse von Triglyceriden zu Glycerin mit anschließender Oxidation zu Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid. Das entstandene Wasserstoffperoxid bildet unter katalytischer Wirkung der Peroxidase mit 4-Aminophenazon und 4-Chlorphenol in einer Endpunktreaktion nach Trinder [Trinder et al. (1969)] einen roten Farbstoff. 27