Die Regulation des Na + 2Cl - K + -Cotransporters in der basolateralen Membran der Rattenkolonkrypte

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1 Aus dem Physiologischen Institut der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Die Regulation des Na + 2Cl - K + -Cotransporters in der basolateralen Membran der Rattenkolonkrypte INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Dirk Heitzmann aus Lahr/Schwarzwald Freiburg i. Br. 2000

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3 Dekan: Erster Gutachter: Prof. Dr. med. Dr. h.c. H. E. Blum PD Dr. med. M. Bleich Zweiter Gutachter: Prof. Dr. med. K. Starke Jahr der Promotion: 2001

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5 Meinen Eltern

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7 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Der Na + 2Cl - K + -Cotransporter Die Morphologie und Funktion des Kolonepithels Mechanismus des sekretorischen NaCl- und Wassertransports in der Kolonkrypte Mechanismus der ph i -Regulation in der Kolonkrypte Fragestellung 6 2. Methoden Messung der Aktivität des Na + 2Cl - K + -Cotransporters mit der NH 3 /NH + 4 -Puls-Technik Intrazelluläre ph-messung mit dem Fluoreszenzfarbstoff BCECF/AM Eichung des BCECF/AM-Fluoreszenzsignals Meßaufbau Versuchstiere Präparation isolierter Kolonkrypten Lösungen und Substanzen Statistik Ergebnisse Faktoren, die die zweite Phase des NH 3 /NH + 4 -Pulses beeinflussen Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters durch Verminderung von [Cl - ] i Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters durch Zellschrumpfung Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters durch Carbachol (CCH) Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters durch camp Diskussion Die NH 3 /NH + 4 -Puls-Technik zur Untersuchung der Na + 2Cl - K + -Cotransportrate Mechanismus der Na + 2Cl - K + -Cotransporter-Aktivierung in der Kolonkrypte Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf Veröffentlichungen 40

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9 1. Einleitung Der Na + 2Cl - K + -Cotransporter Bereits im Jahre 1984 wurde nach elektrophysiologischen Untersuchungen zur NaCl- Sekretion an der Rektaldrüse des Dornhais (Squalus acanthias) von Greger und Schlatter ein K + -abhängiger NaCl-Symport über die basolaterale Membran mit der Stöchiometrie von 1 Na + -Ion, 2 Cl - -Ionen und 1 K + -Ion postuliert [26]. Zehn Jahre später gelang Gamba [18] und Forbush [52,70] die Klonierung verschiedener Isoformen des Na + 2Cl - K + -Cotransportproteins aus der Henle-Schleife der Niere von Ratte und Kaninchen (absorbtiver Typ in der luminalen Membran) sowie aus der Rektaldrüse des Dornhais und aus dem menschlichen Kolon (sekretorischer Typ in der basolateralen Membran). Alle Proteine haben eine Länge von ca Aminosäuren, ein Molekulargewicht zwischen 110 und 130 kda, 12 transmembranäre Domänen und ein bis zwei mögliche Phosphorylierungsstellen. Sowohl das Aminowie auch das Carboxyende des Proteins liegen intrazellulär. Abb. 1 zeigt die Struktur eines Cotransportproteins in der Zellmembran. extrazellulär Zellmembran intrazellulär P P Abb. 1: Modell des Na + 2Cl - K + -Cotransportproteins aus dem menschlichen Kolon basierend auf der Analyse der cdna [52]. Insgesamt besitzt das Protein 1212 Aminosäuren. Mögliche Glykosylierungsstellen sind durch schwarze Kreise gekennzeichnet, die mit P bezeichneten Kreise stellen phosphorylierte Threoninreste dar, während der Stern die einzig mögliche Phosphoprylierungsstelle durch die camp-abhängige Proteinkinase A (PKA) kennzeichnet. Die Blockformationen entsprechen alpha-helikalen Proteinabschnitten. Diese Sekundärstruktur mit 12 transmembranären Domänen und großen intrazellulären NH 2 - und COOH- Enden ist auch gemeinsames Merkmal anderer Na + 2Cl - K + -Cotransportproteine, darunter die aus der Niere der Ratte und des Kaninchens [18] und der Rektaldrüse des Dornhais [70].

10 2 Das Protein bindet auf der extrazellulären Seite 1 Na + -Ion, 2 Cl - -Ionen und 1 K + -Ion und gibt diese unter Konformationsänderung seiner dreidimensionalen Struktur ins Zellinnere ab. Schleifendiuretika wie Furosemid und Azosemid hemmen diesen Transport weitgehend spezifisch [19,59]. Der Transport erfolgt sekundär aktiv, wobei die Triebkraft durch den Na + -Gradienten zwischen Zytosol und Extrazellulärraum gebildet wird. Dieser wird durch die Na + /K + -ATPase aufrechterhalten. Cl - trägt, abhängig von den Konzentrationsverhältnissen, ebenfalls zur Triebkraft für den Cotransporter bei, während K + bergauf transportiert wird. Berücksichtigt man die Affinität des Cotransporters für Na + (< 5 mmol/l), K + (ca. 1 mmol/l) und Cl - (30-50 mmol/l), sowie die Konzentrationen dieser Ionen auf der extrazellulären Seite, wird klar, daß die Verfügbarkeit von K + und vor allem von Cl - für den Cotransport limitierend werden kann [25,26]. Die besondere Eigenschaft über die K + -Bindungsstelle auch NH + 4 -Ionen zu transportieren, wird bei der Messung der Aktivität des Cotransporters ausgenutzt [51]. Allerdings kann NH + 4 auch über andere Membranproteine in die Zelle gelangen. Zu den zusätzlichen Einstromwegen für NH + 4 zählen unter anderem K + -Kanäle und die Na + /K + -ATPase. Transportsysteme, die hauptsächlich der zytosolischen ph-regulation dienen, wie der Na + /H + -Austauscher oder die Na + /Cl - /HCO und Cl - /HCO - 3 -Austauscher beeinflussen die durch NH Transport hervorgerufene zytosolische ph-änderung [5,42]. Na + 2Cl - K + -Cotransport ist mittlerweile in vielen epithelialen Geweben wie der Rektaldrüse des Dornhais, der Niere, dem Darm, den Lungen und den Speicheldrüsen sicher nachgewiesen. Ebenso verfügen praktisch alle nichtepithelialen Gewebe, wie z. B. glatte Muskelzellen, Fibroblasten, Erythrozyten oder Ehrlich Aszites Tumorzellen über dieses Protein [20,29]. Das Na + 2Cl - K + -Cotransportsystem ist nicht nur notwendig, um Cl - für die epitheliale Sekretion bereitzustellen [25,26], sondern es dient in nichtepithelialen wie in epithelialen Zellen der Volumenregulation [35,43,44] und der Aufrechterhaltung von Ionengradienten über die Membran [28,47,69]. An der Rektaldrüse des Dornhais konnten Forbush [47], Warth [66] und Greger [24] zeigen, daß ein zellulärer Cl - -Verlust, Zellschrumpfung und Phosphorylierungsereignisse eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters spielen. Für das Cotransportprotein in der Kolonkrypte der Ratte gibt es hierzu noch keine Daten.

11 1.2. Die Morphologie und Funktion des Kolonepithels 3 Das Kolonepithel als Grenzgewebe gegenüber der Außenwelt besteht aus einem soliden Zellverband dichtstehender, einschichtiger, hochprismatischer Zellen, wobei vier verschiedene Zelltypen unterschieden werden: Stammzellen, Becherzellen, enterochromaffine Zellen und die zahlenmäßig überwiegenden Saumzellen. Charakteristischerweise bildet die Schleimhaut eng aneinander liegende reagenzglasartige Einstülpungen, die sogenannten Krypten. Neben der immunologischen und mechanischen Barriere stellt das Kolonepithel mit den Saumzellen eine wichtige Oberfläche für den transepithelialen Wasser- und Elektrolyttransport dar. Sie bewirken vor allem an der Kryptbasis eine aktive NaCl-Sekretion, deren Ausmaß durch die vegetative Innervation reguliert wird [11] (Transmitter sind hierbei z. B. Acetylcholin und verschiedene lokale Hormone wie Prostaglandin E 2, Guanylin, Sekretin oder VIP). An der Kryptoberfläche sind die Saumzellen befähigt, NaCl und Wasser zu resorbieren [14] Mechanismus des sekretorischen NaCl- und Wassertransports in der Kolonkrypte Ein Modell für die NaCl-Sekretion in der Kolonkrypte wurde auf der Basis von Untersuchungen an der intakten Mukosa [31] und an in vitro perfundierten Krypten [13,23] erstellt (Abb. 2) und läßt sich auf viele sekretorisch aktive Zellen übertragen [17,53]. Dieses Modell besagt, daß die neurogene und parakrine Regulation der Sekretion bei der Signalübertragung auf Zellebene über die sekundären Botenstoffe Ca 2+ und camp erfolgt. camp führt initial zu einer Öffnung luminaler CFTR-Cl - -Kanäle [21], was aufgrund des negativen Membranpotentials zu einem intrazellulären Cl - -Abfall um bis zu 20% führt [24,28]. Zusätzlich werden durch Ca 2+ und camp basolaterale K + -Kanäle vom SK4- und K V LQT1-Typ aktiviert [22,67,68]. Der Abfall der zytosolischen Cl - -Konzentration ([Cl - ] i ) zu Beginn der Sekretion führt zusammen mit dem Ausstrom des Gegenions K + und von Wasser zur Zellschrumpfung um bis zu 20% [15,24]. Dies stellt eine bedrohliche Situation für die Zelle dar, der sie durch verstärkte Elektrolyt- und Osmolytaufnahme und damit osmotische Wasserbindung entgegenwirkt [8,36,49].

12 4 luminal CCH basolateral [Ca 2+ ] Volumen? ATP 3Na + 2K + Ouabain Cl -? K + K + [Cl - ]? [camp]? K + 2 Cl - Na + Ba 2+ Azosemid PGE 2 Abb. 2: Modell der NaCl-Sekretion in der Kolonkrypte. Die beiden wesentlichen intrazellulären Botenstoffe der Sekretionsaktivierung sind Ca 2+ und camp. Beide Stoffe bewirken eine Öffnung von Ionenkanälen in deren Folge das Zellvolumen und die intrazelluläre Cl - -Konzentration abfallen (CCH: Carbachol, PGE 2 : Prostaglandin E 2 ). Zur Aufrechterhaltung der Sekretion ist es also zwingend notwendig, daß auch die Na + /K + -ATPase und der Na + 2Cl - K + -Cotransporter ihre Transportraten erhöhen [12,16,20,28,47,48,57], denn nur hierdurch können die für die Sekretion benötigten Cl - -Ionen und die notwendige Triebkraft bereitgestellt werden. Der Na + 2Cl - K + -Cotransporter nimmt Cl - über die basolaterale Membran auf und durch die Rezirkulation von K + über die basolaterale Membran wird das Membranpotential über dem Nullstrompotential von Cl - gehalten. An der Rektaldrüse des Dornhais konnte gezeigt werden, daß sich die Triebkräfte für die transportierten Ionen über die basolaterale Membran während der Sekretion im Vergleich zur unstimulierten Zelle nicht erhöhen, was für eine direkte Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters spricht [28]. Aufgrund der luminalen Cl - -Leitfähigkeit und der basolateralen K + -Leitfähigkeit besteht über das Epithel ein lumennegatives transepitheliales Potential, welches Na + parazellulär in das Lumen der Krypte treibt. Die NaCl-Sekretion erzeugt über das Epithel einen Konzentrationsgradienten für Wasser, dem folgend es von der basolateralen auf die luminale Epithelseite fließt.

13 1.4. Mechanismus der ph i -Regulation in der Kolonkrypte 5 Der zytosolische ph-wert (ph i ) von Kolonkryptzellen liegt unter HCO - 3 -freien Bedingungen bei ungefähr 7,2 [30,32] und wird in engen Grenzen konstant gehalten, da für die Zelle lebenswichtige Stoffwechselfunktionen ph i -abhängig sind. An der isoliert perfundierten Kolonkrypte konnte gezeigt werden, daß an der Regulation des ph i der Kryptzelle nicht nur bestimmte Membranproteine beteiligt sind, sondern daß auch die Membran selbst je nach Lokalisation und Zusammensetzung einen nicht unerheblichen Beitrag zur ph i -Homöostase leistet [30]. Schwache organische Säuren und Basen können in den Fäces z.b. als + NH 3 /NH 4 oder als kurzkettige Fettsäuren in relativ hohen Konzentrationen vorkommen. Die luminale Membran ist im Gegensatz zur basolateralen Membran auch für die ungeladenen Formen ausgesprochen undurchlässig [30,62]. In der basolateralen Membran befindet sich ein durch HOE 694 spezifisch hemmbarer Na + /H + -Austauscher [6,30] und ein DIDS-hemmbarer, Na + -abhängiger HCO - 3 /Cl - - Austauscher [30,46], die bei ph i -Änderungen eine schnelle Rückführung auf den Sollwert bewirken. Abb. 3 faßt den Sachverhalt auch im Hinblick auf die Experimente mit NH 3 /NH + 4 in einem Zellmodell zusammen. luminal NH 4 + basolateral NH 3 K + Na + ATP NHE1 K + / NH 4 + Na + H + HOE 694 Na HCO 3 Cl - DIDS NH 3 Abb. 3: Zellmodell zur ph i -Regulation in der Kolonkrypte. Die luminale Membran ist selbst für das ungeladene NH 3 -Molekül praktisch undurchlässig, während die Permeabilität basolateral sehr viel größer ist. NH 4 + -Ionen gelangen durch Diffusion durch K + -Kanäle oder Transport über die Na + /K + -ATPase in die Zelle. Zur Aufrechterhaltung der ph-homöostase besitzt die Zelle einen HOE 694-hemmbaren Na + /H + -Austauscher (NHE1) und einen DIDShemmbaren, Na + -abhängigen HCO 3 - /Cl - -Austauscher.

14 6 Die starke Permeabilität der basolateralen Membran für Säure/Basen-Paare und die ph i -regulierenden Proteine beeinflussen experimentelle ph i -Änderungen und können die Messungen verzerren, insbesondere dann, wenn wie in der vorliegenden Arbeit aus dem Verlauf des ph i indirekt auf die Funktion nicht vorrangig der ph i - Regulation dienender Proteine geschlossen werden soll. Deshalb wurde im Vorfeld der Einfluß NH 3 /NH + 4 -transportierender und ph i - regulierender Proteine auf die Messungen untersucht Fragestellung In der vorliegenden Arbeit wurden Faktoren untersucht, die den Na + 2Cl - K + - Cotransporter während der Cl - -Sekretion steuern. Unter den genannten Gesichtspunkten ist es denkbar, daß die Aktivierung des Cotransportproteins im ersten Schritt der Sekretionsstimulation zusammen mit der Öffnung luminaler Cl - -Kanäle und basolateraler K + -Kanäle durch eine intrazelluläre Erhöhung der Ca 2+ - und camp-konzentration geschieht. Eine andere Möglichkeit wäre eine Aktivierung erst durch die Folgeerscheinungen der Sekretion, nämlich Abfall des intrazellulären Cl - oder Zellschrumpfung. Für die beiden letztgenannten Möglichkeiten spricht, daß das System außerhalb der Sekretion in erster Linie der Volumenregulation und der Aufrechterhaltung von [Cl - ] i dient. Mit der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, welchen Einfluß eine intrazelluläre Ca 2+ - oder camp-erhöhung, eine intrazelluläre Cl - -Erniedrigung oder eine Zellschrumpfung auf die Transportrate des Na + 2Cl - K + -Cotransporters in Kolonkryptepithelzellen haben. Zusätzlich wurde im Vorfeld untersucht, welche Transportsysteme außer dem Na + 2Cl - K + -Cotransporter die zweite Phase des NH 3 /NH + 4 -Pulses, der für die Messung der Na + 2Cl - K + -Cotransporteraktivität verwandt wurde, beeinflussen.

15 2. Methoden Messung der Aktivität des Na + 2Cl - K + -Cotransporters mit der NH 3 /NH + 4 -Puls-Technik Paulais und Turner [51] setzten diese Technik 1992 erstmalig ein, um die Transportaktivität des Cotransportproteins in den Ohrspeicheldrüsen von Ratten zu + untersuchen. Das Prinzip beruht auf der Bindung und dem Transport von NH 4 anstelle des K + -Ions durch den Cotransporter und ist in Abb. 4 dargestellt. Wird eine wässrige Lösung mit 20 mmol/l NH 4 Cl versetzt findet zuerst eine Dissoziation und die Bildung des NH + 4 /NH 3 -Säure/Basenpaares bis zur Gleichgewichtseinstellung entsprechend dem vorgegebenen ph statt. Wird eine Kolonkryptzelle mit dieser Lösung umspült, dringt NH 3 als ungeladenes Molekül über die Zellmembran ins Zytosol, nimmt dort zur Einstellung des Dissoziationsgleichgewichts ein Proton auf und führt damit zum ph i -Anstieg und zur Bildung von NH + 4 -Ionen. Dieser Vorgang ist schnell, da die passive Diffusion nicht durch eine Transportrate begrenzt und durch einen hohen Gradienten für NH 3 getrieben wird. Mißt man gleichzeitig den ph i mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffs kann man den ph i -Anstieg als Anstieg des Fluoreszenzquotienten (FQ) verfolgen. Der Fluoreszenzquotient ist dabei das Verhältnis der Emissionswerte bei Anregung mit den Wellenlängen 488 nm und 439 nm. Während der Anwesenheit der NH 4 Cl-Lösung konkurriert NH + 4 mit K + um die Bindungsstelle am Cotransportprotein und wird in die Zelle transportiert. Die zytosolische NH + 4 -Konzentration nimmt zu, was zur Umkehr der Gleichgewichtsreaktion führt. Das intrazelluläre NH + 4 dissoziiert zu NH 3 unter Protonenabgabe und ph i -Abfall. Da [NH 3 ] i und [NH 3 ] a in dieser Phase im Gleichgewicht stehen, ist der ph i -Abfall alleine auf die Erhöhung der [NH + 4 ] i durch den Transport über die basolaterale Membran und die beständige Gleichgewichtseinstellung zwischen NH + 4 und NH 3 durch Dissoziation und Bildung von H + zurückzuführen. Deshalb kann man die Änderung des Fluoreszenzquotienten in dieser Phase als Maß für die Transportrate des Cotransporters heranziehen. Hierzu wurde der Verlauf des Fluoreszenzquotienten mit einer Exponentialfunktion beschrieben, um daraus die Steigung zu Beginn des ph i -Abfalls berechnen zu können. Wird die NH 4 Cl-Lösung gegen Kontrollösung ausgetauscht kommt es zu einem schnellen ph i -Abfall. Der Gleichgewichtszustand zwischen [NH 3 ] i und [NH 3 ] a ist

16 8 aufgehoben und Ammoniak verläßt die Zelle. NH + 4 dissoziiert und setzt dadurch Protonen frei. Der Anstieg von [H + ] i führt zu einem ph i -Abfall, der langsam durch zelleigene ph-regulationssysteme ausgeglichen wird. Der Na + /H + -Austauscher hat dabei den größten Anteil. alkalisch sauer Fluoreszenzquotient 488nm/439nm a NH 4 + b 1 min c a b c K + 2Cl - Na + NH 3 NH 3 NH 4 + 2Cl - Na + K + 2Cl - Na + NH 3 [H + ] NH 3 NH 4 + NH [H + 3 ] + NH 4 [H + ] NH 4 + Abb. 4: Links: Darstellung des Fluoreszenzquotienten (488 nm/439 nm) während der Gabe von 20 mmol/l NH 3 /NH + 4. Man erkennt drei Phasen: a: schnelle Alkalinisierung bei Gabe von NH 3 /NH + 4, b: langsame Azidifizierung in Anwesenheit von NH 3 /NH + 4, c: schnelle Azidifizierung bei Wegnahme von NH 3 /NH + 4. Rechts: Zellmodell für die Erklärung der ph i -Änderungen. a: NH 3 diffundiert in die Zelle und puffert ein H + schnelle Alkalinisierung, b: NH + 4 wird über den Cotransporter in die Zelle transportiert und gibt dort H + ab langsame Azidifizierung, c: NH 3 verläßt die Zelle unter Zurücklassen von H + schnelle Azidifizierung. Der Abfall des BCECF-Fluoreszenzquotienten pro Zeiteinheit (= Azidifizierungsrate) in Anwesenheit von NH + 4 ließ sich sehr gut mit folgender Exponentialfunktion y -t/k = a + b e beschreiben. Dabei gilt: a + b = Fluoreszenzquotient zum Zeitpunkt null, a = Fluoreszenzquotient zum Zeitpunkt, k = Zeitkonstante der Fluoreszenzänderung, t = Zeit. Die Höhe des Quotienten -b/k (initiale Azidifizierungsrate) wird im mu/s angegeben und dient als Maß für die Geschwindigkeit des NH Einstroms in die Zelle. Dabei entspricht eine Einheit U der Änderung des Fluoreszenzquotienten um 1.

17 2.2. Intrazelluläre ph-messung mit dem Fluoreszenzfarbstoff BCECF/AM 9 Die intrazelluläre ph-messung mit Fluoreszenzfarbstoffen beruht auf der Eigenschaft dieser Substanzen, ihre Fluoreszenzeigenschaften in Abhängigkeit vom ph zu ändern. Bei den in einem abgedunkelten Raum vorgenommenen Messungen wird der Farbstoff mit Licht bestimmter Wellenlängen angeregt und die dadurch hervorgerufene Fluoreszenz (Emission) registriert. 2,7 -Biscarboxyethyl-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF), ein Fluorescein-Derivat [56], ist die am meisten verwendete Substanz. Das Anregungsmaximum von BCECF liegt bei 503 nm, das Emissionsmaximum bei 525 nm. Die Amplituden dieser Maxima sind ph-abhängig. Eine Alkalinisierung erhöht, eine Azidifizierung erniedrigt sie [56,65]. Der isosbestische Punkt im Anregungsspektrum von BCECF liegt zwischen nm [2]. Da der zytosolische ph der meisten Zellen bei etwa 7,2 liegt [58], sollte ein guter Indikator zur ph i -Bestimmung einen pk-wert in diesem Bereich haben. Hierdurch wird gewährleistet, daß die Substanz für ph i -Änderungen in beide Richtungen maximal empfindlich ist. Dies wird durch BCECF gewährleistet, das im Vergleich zum Fluorescein drei zusätzliche Carboxylgruppen besitzt. Zwei dieser Carboxylgruppen sind über kurze Alkylreste an das Grundgerüst gebunden und erhöhen den pk-wert von 6,4 auf 6,98 [56,65]. Die Strukturformeln beider Moleküle sind in Abb. 5 zu sehen. Um eine membrangängige Form zu erhalten werden alle hydrophilen Carboxylatgruppen als Acetoxymethylgruppen (AM) verestert, die nach Diffusion in die Zelle wieder durch unspezifische Esterasen abgespalten werden. Dadurch wird BCECF stark hydrophil und in der Zelle gefangen [64]. Da das veresterte Molekül ungeladen ist, ist sein Verteilungsverhalten vom extrazellulären ph unabhängig [63]. O O COO O R O O O H 2 C R CH 2 R R1: CH 2 O O R R2: CH 2 O O CH 3 Fluorescein BCECF/AM Abb. 5: Strukturformeln von Fluorescein und 2,7 -Biscarboxyethyl-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF). Bei BCECF/AM sind alle Carboxylatgruppen (R1) als Acetoxymethylgruppen (-CH 2 COOCH 3 ; R2) verestert. In dieser lipophilen Form kann es durch Diffusion in die Zelle gelangen. Im Zytosol wird BCECF/AM von unspezifischen Esterasen gespalten und bleibt als hydrophiles BCECF gefangen.

18 10 Der entscheidende Vorteil der ph i -Bestimmung mit Fluoreszenzfarbstoffen ist die Möglichkeit der kontinuierlichen Messung des ph i selbst in sehr kleinen Zellen und die Einfachheit der Methode im Vergleich zur früher gebräuchlichen Verwendung von ph-empfindlichen Mikroelektroden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß mit den heute verwendeten Farbstoffen ausschließlich der zytosolische ph gemessen wird, da die Farbstoffe kaum in membranumhüllte intrazelluläre Kompartimente gelangen [50,56]. Ein Nachteil der Methode ist der exponentielle Fluoreszenzverlust durch Ausbleichen und Auswaschen des Farbstoffs im Laufe des Experiments [56]. Dies kann zu Fehlern bei der Bestimmung absoluter ph-werte führen, wenn größere Zeiträume zwischen Eichung und zu bestimmendem ph i liegen [33]. Um einer Verfälschung der Messwerte durch exponentielle Abnahme des Fluoreszenzsignals aus dem Weg zu gehen, wird der Fluoreszenzquotient der Emissionswerte nach Anregung bei 488 nm und 439 nm gebildet. Damit erhält man ein Maß, das von den genannten Störgrößen, wie Auswaschen, Ausbleichen oder Export des Farbstoffs aus der Zelle [1] weitgehend unabhängig ist. Dieses Vorgehen erleichtert außerdem den Vergleich innerhalb eines Experiments sowie zwischen verschiedenen Experimenten. In der vorliegenden Arbeit wurde der zytosolische ph als Summensignal der BCECF-Fluoreszenz von mehreren Zellen in einem Beobachtungsfenster von 30 µm Durchmesser gemessen Eichung des BCECF/AM-Fluoreszenzsignals Für die Eichung des Fluoreszenzsignals wurden die Kolonkryptzellen mit Lösungen unterschiedlichen ph-wertes umspült, die 145 mmol/l K + und den K + /H + -Austauscher Nigericin in der Konzentration 0,2 mmol/l enthielten. Eine Erhöhung der extrazellulären K + -Konzentration auf den intrazellulären Wert war notwendig, um den Einfluß des K + -Gradienten auf den K + /H + -Austauscher zu vermeiden. Unter diesen Bedingungen nehmen intrazellulärer und extrazellulärer ph den gleichen Wert an [37,42,63]. Abb. 6a zeigt ein Beispiel eines solchen Eichexperiments. Alle Eichexperimente wurden ungepaart im gleichen Zeitraum wie die entsprechenden ph i - Messungen durchgeführt. Die ermittelte Eichkurve (Abb. 6b) verläuft im Bereich von ph 6,5-8,0 nahezu linear. Da die einzelnen Eichungsexperimente in hohem Maße reproduzierbar waren, wurde die gezeigte Eichkurve durchgängig zur Bestimmung

19 11 des ph i aus dem Fluoreszenzquotienten (488 nm/439 nm) benutzt. Der ph i unter Kontrollbedingungen wurde jeweils zu Beginn der Experimente bestimmt. Er betrug 7,30 ± 0,02 (n = 60). Fluoreszenzquotient 488 nm/439 nm a ph 6.5 ph 7.0 ph 7.5 ph min Nig Nig Nig Nig Fluoreszenzquotient 488 nm/439 nm b n = 7 ph = (FQ ) / ph Abb. 6: Eichung des ph-abhängigen Fluoreszenzquotienten. a: Originalexperiment zur Ermittlung der Eichkurve. Der ph der Badlösung (145 mmol/l K + ) wird in Schritten von 0,5 ph-einheiten im Bereich 6,5 bis 8,0 variiert. Man erkennt, daß erst die Zugabe von Nigericin (Nig) (0,2 mmol/l) einen Angleich von ph i und ph a ermöglicht. Ohne Nigericin kann die Zelle ihren ph i selbst bei stark saurem ph a (6,5) in einem engen Bereich aufrechterhalten. Bei darauffolgenden Gaben von Nigericin wird keine zusätzliche Wirkung beobachtet. b: Der Fluoreszenzquotient (FQ) als Funktion des intrazellulären ph-wertes. Die zusammengefaßten Ergebnisse (n = 7) zeigen eine annähernd lineare Beziehung zwischen Fluoreszenzquotient und ph i im Bereich von ph 6,5 8,0.

20 Meßaufbau Die Experimente wurden an einem inversen Mikroskop (Axiovert 10, Zeiss, Oberkochen, BRD) auf einem schwingungsgedämpften Tisch durchgeführt. Den Aufbau des Meßplatzes zeigt Abb. 7. Die Anregungslichtquelle bestand aus einer Xenon-Kurzbogenlampe (XBO 75W/2, Osram, München, BRD), deren Lichtstrahl sich durch eine Verschlußblende blockieren ließ, um ein unerwünschtes Beleuchten und Ausbleichen des Präparates zu vermeiden. Ein in den Filterhalter gelegtes Tempaxglas (Typ 114, Schott, Mainz, BRD) mit einem Transmissionsmaximum von nm schützte die nachfolgende Filteroptik durch Absorption des langwelligeren Lichtanteils vor Wärmeschäden. Dahinter befand sich eine den Lichtstrahl begrenzende Lochblende (Durchmesser 3 mm). Der Wechsel der Anregungswellenlängen wurde durch ein motorgetriebenes Filterrad ermöglicht (Physiologisches Institut, Universität Freiburg, BRD), das mit zwei Bandpaßfiltern für 439 nm und 488 nm ( ± 5 nm) (Optisk Laboratorium, Lyngby, Dänemark) ausgestattet war. Die Rotationsfrequenz betrug 10 Hz. An einem Farbteiler (FT 500, Optisk Laboratorium, Lyngby, Dänemark) wurde das Anregungslicht reflektiert und durch ein 100 Ultrafluar-Objektiv (Zeiss, Oberkochen, BRD) auf das Präparat gespiegelt. Das vom Präparat emittierte Fluoreszenzlicht passierte den Farbteiler und wurde nach Umlenkung mit einem Spiegel durch einen nm Bandpaßfilter (Optisk Laboratorium, Lyngby, Dänemark) zur Photonenzählröhre (H , Hamamatsu, Japan) geleitet. Diese wurde mit einer Spannung von 1100 Volt betrieben und das Signal über einen Vor- und Anpassungsverstärker in eine A/D-Wandlerkarte (Biocard) eingespeist. Die am Physiologischen Institut der Universität Freiburg entwickelte Karte (Dr. Fröbe, Dr. Jona) wandelt die durch die auftreffenden Photonen an der Zählröhre entstehenden Spannungswerte in Binärdaten um. Diese Daten wurden auf der Festplatte eines Computers gespeichert und mit dem Computerprogramm Biocount (Dr. Fröbe) in Zahlenwerte umgewandelt. Zur graphischen Darstellung der Daten wurden jeweils zehn Meßwerte gemittelt und der Fluoreszenzquotient (488 nm/439 nm) errechnet. Die Auswertung der Daten erfolgte mit Standardsoftware. Ein rotes Glas (OG 630, Schott, Mainz, BRD) im Auflichtstrahlengang erlaubte es, die mit BCECF beladenen Zellen ohne Signalverlust vor und während der Messung zu betrachten. Die Qualität der Beladung wurde vor jedem Experiment mit dem bloßen Auge bei Anregung mit 488 nm überprüft. Die Autofluoreszenz der Kolonkryptzellen bei 488 nm und 439 nm war vernachlässigbar

21 13 gering. Die verstellbare Irisblende vor der Photonenzählröhre wurde so eingestellt, daß bei 1000facher Vergrößerung das emittierte Licht aus einem Kryptdurchmesser erfaßt wurde. Für die Inkubation der Krypten wurde BCECF/AM in einer Konzentration von 2 µmol/l zusammen mit Pluronic (80 µmol/l) verwendet. Pluronic ist ein amphiphiles Molekül, das die Löslichkeit des hydrophoben BCECF/AM in wässriger Lösung und die Beladung der Zellen mit dem Farbstoff verbessert [60]. Eine isolierte Kolonkrypte wurde im Bad oder in einer separaten feuchten Kammer für 30 Minuten mit BCECF/AM bei Raumtemperatur beladen. Im Bad wurde die Krypte mit Haltepipetten fixiert, die Zellen fokussiert und das Meßfeld mit der Blende festgelegt. Nach der Inkubation wurde die Krypte für Minuten mit Kontrollösung umspült, um den im Extrazellulärraum noch vorhandenen Farbstoff auszuwaschen. Die Stromstärke der Badperfusion betrug ungefähr 20 ml/min. Bei einem Badvolumen von 0,4 ml entspricht dies einer Wechselrate von 50 /min. Alle Messungen erfolgten bei 37 C. Kondensor OG 630 nm Computer Haltepipetten x/y-tisch Krypte Photonenzählröhre A/D-Wandler Verstärker Xenon-Lampe XBO 75 Linse Objektiv 488 nm Bandpaßfilter nm Blende Farbteiler 500 nm Spiegel Okular nm 439 nm Verschlußblende Wärmefilter Lochblende 3mm Filterrad Spiegel Spiegel Abb. 7: Schematischer Aufbau der Meßapparatur. Erläuterung im Text.

22 Versuchstiere Als Versuchstiere dienten ca. 60 Albinoratten beiderlei Geschlechts vom Stamm Wistar (Charles River, Sulzfeld, BRD) mit einem Körpergewicht von g. Die Tiere wurden in keimarmer Umgebung bei konstanter Temperatur in einem natürlichen Tag-Nacht-Rhythmus gehalten. Sie wurden mit der Standarddiät Altromin 300 R (Altromin GmbH, Lage, BRD) und Leitungswasser ad libitum ernährt Präparation isolierter Kolonkrypten Nach Dekapitation und anschließender Entblutung wurde der Bauchraum der Ratte eröffnet, das Kolon vorsichtig freigelegt, im distalen Abschnitt durchtrennt und mit eiskalter Ca 2+ -haltiger Kolonpräparationslösung (Lsg. I) gespült. Mit Hilfe eines Glasstabes wurde ein ca. 4 cm langes Stück des distalen Kolons transrektal evertiert und am Übergang zum Rektum abgeschnitten. Die weitere Präparation erfolgte bei 0 C. Nach Einführen eines Polyethylen-Katheters wurden beide Enden des Darmstückes abgebunden. Es entstand ein Sack, der über den Katheter mit Ca 2+ -freier Kolonpräparationslösung (Lsg. II) prall gefüllt wurde. Nach der Entfernung des Katheters wurde der Kolonsack 10,3 Minuten bei 37 C inkubiert. Das Umspülen der basolateralen Membran mit Ca 2+ -freier Lösung bewirkte eine Lockerung der Krypten vom submukösen Gewebe. Kräftiges Schütteln des Kolonsacks führte zur Abtrennung von Krypten und Epithelflecken. Durch vorsichtiges Auf- und Abwärtsbewegen der Gewebestücke in einer weitlumigen Pipette konnten einzelne Krypten mechanisch herausgelöst werden. Die Aufbewahrung der Krypten erfolgte für maximal drei Stunden in Ca 2+ -haltiger Kolonpräparationslösung bei 4 C. Im Dunkelfeld eines Durchlichtmikroskops (Wild, Heerbrugg, BRD) wurden einzelne Krypten bei 10-50facher Vergrößerung zum Experiment ausgewählt. Jeweils eine isolierte Krypte wurde mit einer Pasteurpipette in das Experimentierbad übertragen und mit den Haltepipetten stabil am Badboden fixiert.

23 Lösungen und Substanzen Tab. 1 zeigt die Zusammensetzung der verwendeten Bad- und Kolonpräparationslösungen, denen im folgenden die in der Tabelle und im Text verwendeten Nummern zugeordnet werden. I Kolonpräparationslösung (Ca 2+ -haltig); II Kolonpräparationslösung (Ca 2+ -frei); III Kontrollösung (HCO - 3 -haltig); IV NH 4 Cl-Lösung (HCO - 3 -haltig); V Kontrollösung (Na + -frei); VI NH 4 Cl-Lösung (Na + -frei); VII Kontrollösung (147 mmol/l Cl - ); VIII NH 4 Cl-Lösung (147 mmol/l Cl - ); IX Kontrollösung (2 mmol/l Cl - ); X NH 4 Cl-Lösung (22 mmol/l Cl - ); XI Kontrollösung (hyperton); XII NH 4 Cl-Lösung (hyperton) Substanzen: Lsg. I Lsg. II Lsg. III Lsg. IV Lsg. V Lsg. VI Lsg. VII Lsg. VIII Lsg. IX Lsg. X Lsg. XI Lsg. XII NaCl Na Gluconat NMDG Cl KCl 5 5 Glukose MgCl Na- 5 5 Pyruvat HEPES CaCl 2 1,25 EDTA 5 KH 2 PO 4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 K 2 HPO 4 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 Ca- 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 Gluconat NH 4 Cl Mannitol Na 3 HCO CO 2 1,2 1,2 Tab. 1: Zusammensetzung der verwendeten Lösungen, alle Angaben in mmol/l.

24 16 Azosemid, Ba 2+, die Agonisten zur Stimulation der Sekretion sowie die Substanzen zur Untersuchung der NH + 4 -Einstromwege wurden den Lösungen nachträglich zugegeben. In Lösungen, denen 1 mmol/l BaCl 2 zugefügt wurde liegt die Cl - -Konzentration dementsprechend um 2 mmol/l höher als in der Tabelle angegeben. Der ph aller Lösungen wurde unmittelbar vor Verwendung mit NaOH bzw. HCl auf 7,4 eingestellt; bei den Lösungen mit niedriger Cl - -Konzentration wurde nur NaOH und bei den Na + -freien Lösungen nur HCl zur Titration verwendet. Der ph der HCO - 3 -haltigen Lösungen ([HCO - 3 ] a = 24 mmol/l, [CO 2 ] a = 1,2 mmol/l, pk s -Wert = 6,1) stellte sich, entsprechend der Henderson-Hasselbalch-Gleichung (ph = [Base] mmol/l pk + log ) bei 7,4 ein. [Säure] mmol/l Experimentell eingesetzte Wirkstoffe und deren Eigenschaften: Forskolin stimuliert die Aktivität der Adenylatzyklase und erhöht [camp] i zusammen mit IBMX (3-Isobutyl-1-Methylxantin), das intrazelluläre Phosphodiesterasen hemmt [23]. Carbachol (CCH) bindet an M 3 -Rezeptoren und erhöht [Ca 2+ ] i [23]. Azosemid hemmt den Na + 2Cl - K + -Cotransporter [13], HOE 694 hemmt den Na + /H + -Austauscher [9,60], DIDS (4,4`-Diisothiocyanostilben-2,2`-disulphonat) hemmt HCO transportierende Systeme, wie den HCO - 3 /Cl - -Austauscher und den Na + /HCO - 3 /Cl - - Austauscher [7,45], Ouabain hemmt die Na + /K + -ATPase [41], Ba 2+ ist ein Hemmstoff von K + -Kanälen [20], Gadolinium (Gd 3+ ) und Flufenamat hemmen nicht-selektive Kationenkanäle [61]. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde als Lösungsvermittler für HOE 694 und DIDS bis zu einer Konzentration von 1 ml/l eingesetzt. Alle verwendeten Substanzen der Firmen Merck (Darmstadt), Sigma (Deisenhofen), Aventis (Frankfurt a. M.), Boehringer (Mannheim), Molecular Probes (Eugene, OR, USA) waren von höchstem Reinheitsgrad. Abb. 8 zeigt die Strukturformeln der organischen Wirkstoffe.

25 17 N H 2 S Cl O 2 H N N N N N Azosemid S SC N S O 3 DIDS S O 3 SCN H 3 H 3 C C N C H 2 C H 2 O O C H 3 C Carbachol (CCH) N H 2 COOH NH CF 3 Flufenamat O C H 3 O N O N C C C C H 2 H 2 H 2 H 3 N N O CH OH 3 CH CH 3 3 O CH CH 2 OH OOCCH CH 3 3 CH 3 OH Forskolin O HO O CH 3 OH OH OH OH CH 3 OH CH 2 OH OH O N H H 3 C S N N O O O N HOE 694 H 2 H 2 IBMX Ouabain Abb.8: Strukturformeln der verwendeten Substanzen Statistik Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittelwertes (SEM) angegeben, wobei n für die Anzahl der entsprechenden Experimente steht. s SEM = n 1 n mit der Standardabweichung s n-1. Zur Überprüfung statistisch signifikanter Unterschiede innerhalb einer experimentellen Serie wurde der gepaarte Student-t-Test mit einem p-wert von 0,05 verwendet. Signifikanz wird in den Abbildungen mit einem Stern gekennzeichnet.

26 18 3. Ergebnisse 3.1. Faktoren, die die zweite Phase des NH 3 /NH 4 + -Pulses beeinflussen Aus Abb. 9 ist ersichtlich, daß die zweite Phase des NH 3 /NH + 4 -Pulses durch das Schleifendiuretikum Azosemid (500 µmol/l) deutlich abgeschwächt wird. Azosemid wurde der Kontrollösung (Lsg. VII) zwei Minuten vor dem NH 3 /NH + 4 -Puls (Lsg. VIII + Azosemid) hinzugefügt, um eine vollständige Hemmung des Na + 2Cl - K + - Cotransporters zu erreichen. Anschließend wurde es 15 Minuten lang mit Kontrollösung (Lsg. VII) ausgewaschen, um für den nächsten NH 3 /NH + 4 -Puls wieder ein funktionsfähiges Transportprotein zur Verfügung stehen zu haben. Die Dauer des einzelnen Pulses betrug zwischen 1 und 1,5 Minuten. NH 4 + NH 4 + Fluoreszenzquotient 488 nm/439 nm a 1 min b c Azosemid NH 3 NH 4 + NH 3 /NH 4 + Azosemid 2Cl - Na + Abb. 9: Wirkung von Azosemid auf die zweite Phase des NH 3 /NH 4 + -Pulses. Im Vergleich zum Kontrollpuls (a) führt Azosemid (500 µmol/l) zu einer Abflachung der zweiten Phase des NH 3 /NH 4 + -Pulses (b). Azosemid hemmt den Na + 2Cl - K + -Cotransporter und damit den NH 4 + -Import. Die Abflachung ist jedoch nicht vollständig, was für weitere, vom Na + 2Cl - K + -Cotransporter unabhängige NH 4 + -Einstromwege spricht.

27 19 Offensichtlich ist der Na + 2Cl - K + -Cotransporter zu einem großen Teil am NH + 4 -Einstrom in die Zelle beteiligt. Allerdings ist die Hemmung der langsamen Azidifizierung nicht vollständig, was zeigt, daß noch weitere Mechanismen diese Phase beeinflussen. Aus diesem Grund wurden Experimente durchgeführt, die der Untersuchung der daran beteiligten Transporter und Kanäle dienten. Diese Transportsysteme könnten entweder eine zusätzliche NH + 4 -Aufnahme bewirken oder zur Grundausstattung der Zelle für H + - und HCO - 3 -Export gehören und damit an der ph i -Regulation der Zelle gegen die initiale Alkalinisierung beteiligt sein. Dabei stellte sich heraus, daß es sowohl Systeme gibt, die zu einer Zunahme der Geschwindigkeit der zytosolischen Azidifizierung beitragen, als auch solche, die zu einer Abnahme führen. Abb. 10 faßt die Daten zusammen. Azidifizierungsrate (mu/s) Azidifizierungsrate (mu/s) a n = 12 n = 8 n = 5 Kontrolle DIDS Kontrolle 0 Na + Kontrolle HOE 694 n = 5 n = 7 b Abb. 10 a: Zusammenfassung aller Experimente zur Wirkung von DIDS (500 µmol/l), Na + (0 mmol/l) und HOE 694 (500 µmol/l) auf die Azidifizierungsrate in der zweiten Phase des NH 3 /NH + 4 -Pulses. DIDS und HOE 694 führen zu einer signifikanten Erhöhung, Na + -Entzug zu einer signifikanten Abnahme der Azidifizierungsrate im Vergleich zur Kontrolle. b: Zusammenfassung aller Experimente zur Wirkung von Ouabain (1 mmol/l) und Ba 2+ (1 mmol/l) auf die Azidifizierungsrate in der zweiten Phase des NH 3 /NH Pulses. Beide Substanzen verringern die Azidifizierungsrate im Vergleich zu Kontrollbedingungen signifikant. 0.0 Kontrolle Ouabain Kontrolle Ba 2+

28 20 In einem ersten Ansatz wurde die mögliche Beteiligung eines DIDS-hemmbaren, HCO - 3 -importierenden Systems untersucht. Dazu wurde ein NH 3 /NH + 4 -Kontrollpuls (Lsg. VIII) unter Kontrollbedingungen (Lsg. VII) mit einem Puls in der Anwesenheit von DIDS (Lsg. VIII µmol/l DIDS) verglichen. Um den HCO - 3 -Transporter vollständig zu hemmen, wurde DIDS bereits zwei Minuten vor dem NH 3 /NH + 4 -Puls der Kontrollösung (Lsg. VII) hinzugefügt. DIDS in dieser Konzentration hatte keinen Einfluß auf das BCECF-Fluoreszenzsignal durch Eigenfluoreszenz. Unter Kontrollbedingungen betrug die Geschwindigkeit der Azidifizierung 2,59 ± 0,33 mu/s (n = 12) und wurde durch DIDS signifikant auf 3,16 ± 0,34 mu/s erhöht. In einer weiteren Serie untersuchten wir die Na + -Abhängigkeit der Azidifizierung bei NH 3 /NH + 4 -Gabe (Lsgn. V und VI). Um eine vollständige Na + -Verarmung der Badlösung zu erreichen, wurde zwei Minuten vor dem NH 3 /NH + 4 -Puls unter Na + - freien Bedingungen von der normalen Kontrollösung (Lsg. VII) auf die Na + -freie Kontrollösung (Lsg. V) gewechselt. Der Vergleichspuls wurde unter normalen Kontrollbedingungen (Lsgn. VII und VIII) durchgeführt. Die Interpretation der Wirkung von Na + -Entfernung auf die Azidifizierung ist schwierig, da gleichzeitig mehrere Transportsysteme betroffen sind. Einerseits wird der NH + 4 -Import und die damit verbundene Azidifizierung durch den Na + 2Cl - K + -Cotransporter gehemmt, andererseits könnte die verminderte Aktivierung des Na + /H + -Austauschers und des Na + /2HCO - 3 /Cl - -Austauschers zu einer vermehrten Azidifizierung der Zelle führen. In den Experimenten überwog die Hemmung des Cotransporters. Die Azidifizierungsrate nahm von 1,90 ± 0,17 mu/s unter Kontrollbedingungen auf 0,85 ± 0,10 mu/s (n = 5) in Abwesenheit von Na + ab. Wurde allerdings der Na + /H + -Austauscher durch HOE 694 (500 µmol/l) spezifisch gehemmt, kam es zu einer Zunahme der Azidifizierungsrate von 1,64 ± 0,13 mu/s auf 2,16 ± 0,15 mu/s (n = 8). Auch hier wurde ein NH 3 /NH + 4 -Puls unter normalen Kontrollbedingungen (Lsgn. VII und VIII) mit einem Puls unter Zugabe von HOE 694 (Lsg. VIII µmol/l HOE 694), dem eine zwei Minuten dauernde Vorlaufzeit mit dieser Substanz (Lsg. VII µmol/l HOE 694) voranging, verglichen. Ein H + -Ausstrom über den Na + /H + -Austauscher und die HCO - 3 -Aufnahme über einen DIDS-hemmbaren Transporter schwächen also die zweite Phase des NH 3 /NH Pulses. Dies führt zu einer falsch niedrigen Einschätzung der Transportrate des Cotransporters, insbesondere in Experimenten mit HCO - 3 -haltigen Badlösungen (Lsgn. III und IV).

29 21 Die Beteiligung der Na + /K + -ATPase am NH + 4 -Einstrom wurde mit Ouabain (1 mmol/l) untersucht. Ouabain führte zu einer Abschwächung der Azidifizierungsrate von 3,25 ± 0,75 mu/s auf 2,24 ± 0,52 mu/s (n = 5). Hierbei wurde ein NH 3 /NH Puls (Lsg. VIII) unter Kontrollbedingungen (Lsg. VII) mit einem NH 3 /NH + 4 -Puls (Lsg. VIII + 1 mmol/l Ouabain), dem eine zwei Minuten dauernde Vorlaufzeit (Lsg. VII + 1 mmol/l Ouabain) zur vollständigen Hemmung der Na + /K + -ATPase voranging, verglichen. Die mögliche Aufnahme von NH + 4 -Ionen über K + -Kanäle wurde durch den Vergleich der Azidifizierungsraten in An- und Abwesenheit von Ba 2+ (Lsgn. VII und VIII ± 1 mmol/l Ba 2+, Vorlaufzeit von Ba 2+ vor den experimentellen Pulsen von zwei Minuten) überprüft. Die Azidifizierungsrate fiel in dieser Serie durch die Anwesenheit von Ba 2+ von 3,98 ± 0,53 mu/s auf 2,45 ± 0,47 mu/s (n = 7). Sowohl die Na + /K + -ATPase als auch K + -Kanäle sind also am NH + 4 -Import beteiligt und ihre Aktivität bewirkt damit eine falsch hohe Einschätzung der Cotransportrate. Flufenamat (100 µmol/l) und Gadolinium (10 µmol/l), Hemmstoffe des nichtselektiven Kationenkanals, hatten keine signifikante Wirkung auf den NH + 4 -Einstrom. Nicht-selektive Kationenkanäle haben also keinen Einfluß auf die Azidifizierung bei NH 3 /NH + 4 Gabe. Vor dem Hintergrund dieser Experimente stellte sich die Frage, wie ein eindeutig dem Na + 2Cl - K + -Cotransporter zuzuordnendes Signal erhalten werden kann. Eine theoretische Möglichkeit bestünde darin, alle, die Phase der langsamen Azidifizierung beeinflussende Systeme außer dem Cotransporter zu hemmen. Dieses ist aber mit dem Überleben der Zelle nur kurzfristig vereinbar. Eine weitaus schonendere und genauere Methode, ein spezifisches Cotransportersignal zu erhalten, ist seine spezifische Hemmung mit einem Schleifendiuretikum. Die wirksamste Substanz aus dieser Stoffgruppe in der basolateralen Membran der Rattenkolonkrypte ist Azosemid [13]. Wird nun ein NH 3 /NH + 4 -Puls unter Azosemid mit einem Puls ohne Azosemid gepaart, kann aus den unterschiedlichen initialen Steigungen der Phase der langsamen Azidifizierung auf die Aktivität des Cotransportproteins geschlossen werden, ohne daß die anderen Einstromwege für NH + 4 die Messung verfälschen (Abb. 9).

30 22 Folgendes experimentelle Protokoll zur Untersuchung der Regulation des Na + 2Cl - K + -Cotransporters wurde aufgrund dieser Voruntersuchungen gewählt: Alle Experimente wurden streng gepaart durchgeführt und bestanden jeweils aus vier NH 3 /NH + 4 -Pulsen. Jeweils zwei Pulse, einer in Abwesenheit, einer in Anwesenheit von 500 µmol/l Azosemid, erfolgten unter Kontroll- bzw. Versuchsbedingungen. Die Vorlaufzeit von Azosemid betrug bei den entsprechenden Pulsen jeweils zwei Minuten, um den Cotransporter vollständig zu hemmen. Nach jedem NH 3 /NH + 4 -Puls wurde die Erholung des ph i bzw. des Fluoreszenzquotienten von der zytosolischen Azidifizierung nach Wegnahme der Ammoniumlösung auf den Ausgangs-pH i abgewartet, ehe ein erneuter NH 3 /NH + 4 -Puls durchgeführt wurde. Die Experimente wurden permutiert durchgeführt, um systematische Fehler zu vermeiden. Ein prinzipielles Problem bei den geplanten Versuchen bestand darin, einen Parameter isoliert zu verändern. Wird z. B. camp oder Ca 2+ erhöht kommt es durch die Aktivierung der Cl - -Sekretion zudem zum Cl - -Verlust und in dessen Folge zur Zellschrumpfung. Aus diesem Grund wurde allen Lösungen 1 mmol/l Ba 2+ hinzugefügt. Ba 2+ führt durch die Hemmung von K + -Kanälen zur Depolarisation und damit zum Stillstand der Cl - -Sekretion und eher zu einer Zunahme der intrazellulären Cl - -Konzentration. Eine indirekte Aktivierung des Cotransporters durch eine abfallende Cl - -Aktivität oder durch Zellschrumpfung sollte also verhindert werden [66] Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters durch Verminderung von [Cl - ] i Zunächst untersuchten wir die Auswirkung einer zytosolischen [Cl - ]-Erniedrigung auf die Aktivität des Cotransporters. Hierzu wurden Kolonkrypten vor dem eigentlichen Experiment für Minuten mit einer HCO - 3 -freien Ringer Lösung umspült, die anstatt 149 mmol/l Cl - (Lsg. VII + 1 mmol/l BaCl 2 ) nur 4 mmol/l Cl - (Lsg. IX+ 1 mmol/l BaCl 2 ) enthielt, um die intrazelluläre Cl - -Konzentration passiv abzusenken. Danach wurden zwei Ammoniumpulse durchgeführt, wobei die Cl - -Konzentration bei Ammoniumgabe auf 24 mmol/l erhöht wurde um die Funktion des Na + 2Cl - K + - Cotransporters zu gewährleisten (Lsg. X + 1 mmol/l BaCl 2 ). Die Pulse unter Kontrollbedingungen wurden mit den Lösungen VII und VIII (+ 1 mmol/l BaCl 2 ) durchgeführt. Abb. 11 zeigt in der oberen Hälfte den BCECF-Fluoreszenzquotienten von vier Pulsen und in der unteren Hälfte die Zusammenfassung aller Experimente.

31 23 Unter Kontrollbedingungen (149 mmol/l Cl - ) führte die Gabe der Ammoniumlösung zu dem charakteristischen Fluoreszenzquotientenverlauf. Azosemid verringerte die Steigung der zweiten Phase. Nach Inkubation mit der 4 mmol/l Cl - -Lösung nahm diese Steigung im Vergleich zur Kontrolle signifikant zu und konnte auch hier mit Azosemid abgeschwächt werden. Aus der Zusammenfassung aller Experimente (n = 20) dieser Serie wird ersichtlich, daß eine Verminderung der zytosolischen Cl - -Konzentration die Azidifizierungsrate von 1,70 ± 0,11 mu/s auf 2,45 ± 0,27 mu/s erhöhte. Der Azosemid-hemmbare Anteil nahm von 0,29 ± 0,08 mu/s auf 1,25 ± 0,26 mu/s zu. Diese Experimente zeigen, daß eine niedrige [Cl - ] i die Na + 2Cl - K + -Cotransportrate erheblich erhöht. FQ 488 nm/439 nm Azidifizierungsrate (mu/s) a Kontrolle Azo 4 Cl - 4 Cl - /Azo b 150s n=20 Abb. 11: Wirkung der Vorinkubation mit 4 mmol/l Cl - auf den Verlauf des Fluoreszenzquotienten (FQ) und die Azidifizierungsrate in der zweiten Phase des NH 3 /NH Pulses. a: Originalexperiment mit vier Pulsen. Die Steilheit der Fluoreszenzquotientenkurve in Anwesenheit von Azosemid (500 µmol/l) sowohl unter Kontrollbedingungen als auch unter 4 mmol/l Cl - fällt geringer aus, als beim jeweiligen Puls ohne Azosemid (Azo). Durch die Vorinkubation der Krypte mit 4 mmol/l Cl - nimmt die Steigung gegenüber dem Kontrollpuls stark zu. b: Aus der Zusammenfassung aller Experimente wird deutlich, daß der Azosemidhemmbare Anteil an der Azidifizierungsrate durch Vorinkubation mit 4 mmol/l Cl - erheblich gesteigert werden konnte.

32 3.3. Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters durch Zellschrumpfung 24 In einer zweiten Serie wurde untersucht, ob die Rate des Azosemid-hemmbaren NH + 4 -Einstroms durch eine hyperosmolare Lösung zunimmt. Durch Zugabe von 100 mmol/l Mannitol zur Kontrollösung (Lsg. VII bzw. Lsg. XI) und Vorinkubation der Krypten in dieser Lösung für Minuten konnte eine Zellschrumpfung durch osmotischen Wasserausstrom aus der Zelle erreicht werden. Dann wurde unter der gleichen Osmolarität ein NH 3 /NH + 4 -Puls-Protokoll durchgeführt (Lsg. XII). Die NH 3 /NH + 4 -Pulse unter Kontrollbedingungen (Lsg. VII) wurden mit der Lösung VIII durchgeführt. Die Ergebnisse und ein Originalexperiment zeigt Abb. 12. FQ 488 nm/439 nm Azidifizierungsrate (mu/s) a 150s Iso Iso/Azo Hyper Hyper/Azo b n=5 Abb. 12: Wirkung von hypertoner Lösung (Hyper, 400 mosm/l) gegenüber Kontrollbedingungen (Iso) auf den Verlauf des Fluoreszenzquotienten (FQ) und die Azidifizierungsrate in der zweiten Phase des NH 3 /NH 4 + -Pulses. a: Originalexperiment mit vier Pulsen. Wiederum ist die Steilheit der Fluoreszenzquotientenkurve unter Azosemid (Azo) geringer als unter dem zugehörigen Kontrollpuls. Der Kontrollpuls unter hypertonen Bedingungen verläuft jedoch deutlich steiler als bei isotonen Bedingungen. b:. Aus der Zusammenfassung aller Experimente wird deutlich, daß der Azosemid-hemmbare Anteil an der Azidifizierungsrate durch hypertone Lösung erheblich gesteigert werden konnte.

33 25 Die Zugabe von Mannitol verursachte eine Erhöhung der Azidifizierungsrate von 1,94 ± 0,17 mu/s auf 2,84 ± 0,43 mu/s (n = 5), wobei der Azosemid-hemmbare Anteil von 0,49 ± 0,20 mu/s auf 1,51 ± 0,37 mu/s anstieg. Da eine Zellschrumpfung zunächst eher mit einer Erhöhung von [Cl - ] i einhergeht, kann gefolgert werden, daß eine Zellschrumpfung unabhängig von [Cl - ] i durch eine Erhöhung der Osmolarität zu einer merklichen Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters führt Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters durch Carbachol (CCH) Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Auswirkung einer intrazellulären Ca 2+ -Erhöhung auf den Na + 2Cl - K + -Cotransporter zu untersuchen. Hierzu verwendeten wir CCH (100 µmol/l), einen Agonisten der Cl - -Sekretion an der Kolonkrypte. CCH wurde den Lösungen VII (Kontrolle) und VIII (NH 4 Cl) hinzugefügt, wobei die Vorlaufzeit vor dem eigentlichen Puls ca. 20 Sekunden betrug um bereits zu Beginn des Pulses eine zytosolische Ca 2+ -Erhöhung zu gewährleisten. Die Vergleichspulse wurden wie immer mit den Lösungen VII und VIII durchgeführt. Abb. 13 zeigt ein Originalexperiment und die Zusammenfassung aller Experimente (n = 11). Die Wirkung von CCH war im Vergleich zur [Cl - ] i -Erhöhung und Zellschrumpfung nur gering ausgeprägt und führte zu einer signifikanten Steigerung der Azosemidwirkung von 0,12 ± 0,13 mu/s auf 0,64 ± 0,24 mu/s. Die Ergebnisse zeigen, daß die Transportrate des Na + 2Cl - K + -Cotransporters auch durch CCH leicht gesteigert wird. Die Azidifizierungsrate war 2,06 ± 0,35 mu/s unter Kontrollbedingungen bzw. 2,40 ± 0,30 mu/s nach Gabe von CCH.

34 26 FQ 488 nm/439 nm Azidifizierungsrate (mu/s) a 150s Kontrolle Azo CCH CCH/Azo b n=11 Abb. 13: Wirkung von Carbachol (CCH, 100 µmol/l) auf den Verlauf des Fluoreszenzquotienten (FQ) und die Azidifizierungsrate in der zweiten Phase des NH 3 /NH 4 + -Pulses. a: Originalexperiment mit vier Pulsen. Der Puls bei alleiniger Gabe von CCH verläuft etwas steiler als die übrigen Pulse, die annähernd die gleiche Steigung aufweisen. b: Aus der Zusammenfassung aller Experimente wird deutlich, daß der Azosemid-hemmbare Anteil an der Azidifizierungsrate durch CCH leicht gesteigert werden konnte Aktivierung des Na + 2Cl - K + -Cotransporters durch camp Mit diesen Experimenten wurde untersucht, ob eine intrazelluläre camp-erhöhung und die damit verbundene Aktivierung der Proteinkinase A den Na + 2Cl - K + -Cotransporter aktiviert. Dazu wurden zuerst Kolonkrypten unter Kontrollbedingungen (Lsgn. VII und VIII) beobachtet und im Anschluß IBMX (100 µmol/l) und Forskolin (5 µmol/l) (Stim) in die Badlösung (Lsg. VII) gegeben. Nach 10 Minuten wurden erneut zwei NH 3 /NH + 4 -Pulse - davon einer Azosemid-gehemmt - durchgeführt (Lsg. VIII µmol/l IBMX und 5 µmol/l Forskolin). Im oberen Abschnitt von Abb. 14 ist ein Originalexperiment zu sehen, im unteren Abschnitt die Zusammenfassung der gesamten Serie (n = 24).