NADPH Cell s hard reducing currency

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1 NADPH Cell s hard reducing currency 2. Seminar Biotechnologie Steffen Heiermann Gehalten am Betreuer: Benjamin Stenger Inhalt 1. Einführung NADPH CYP-Mechanismus Ansätze für NADPH Regeneration Beispiele für NADPH-Regenerationssysteme Janocha, S., & Bernhardt, R. (2013) Lee, S. H., Kwon, Y.-C., Kim, D.-M., & Park, C. B. (2013) Hatrongjit, R., & Packdibamrung, K. (2010) Zusammenfassung Quellen

2 1. Einführung NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) ist ein Reduktionsäquivalent und dient dem Elektronentransport in Zellen. Die reduzierte Form NADPH ist die aktivierte Form. NADH, welches sich nur durch eine Phosphatgruppe von NADPH unterscheidet, hat ebenfalls die Aufgabe des Elektronentransportes, bindet jedoch aufgrund struktureller Unterschiede an andere Enzyme. Abbildung 1: Struktur von NADPH. Alberts, B. Johnson, A. Lewis, J. Raff, M. Roberts, K. Walter, P. (2008) NADPH bindet meistens an Enzyme, die anabolische Reaktionen katalysieren, NADH dagegen ist meist bei Reaktionen des Katabolismus beteiligt. Das Verhältnis von NADP + /NADPH in der Zelle ist sehr gering (~ 0,01), sodass ein möglichst niedriges Redoxpotential vorherrscht und genügend NADPH als Reduktionsmittel vorhanden ist. Umgekehrt ist das Verhältnis von NAD + /NADH u.a. für die Oxidation von Kohlenhydraten sehr hoch (~ ). NADPH wird hauptsächlich im oxidativen Teil des Pentosephosphatweges produziert (s. Abbildung 2). Abbildung 2: Oxidativer Teil des Pentosephosphatweg. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2007). In den Schritten vom Glukose-6-Phosphat zur Ribulose-5-Phosphat werden insgesamt 2 NADPH erzeugt. Eine weitere Quelle ist die Isocitratdehydrogenase, welche ebenfalls beim Umsatz von Isocitrat zu 2-Oxoglutarat ein NADPH produziert. Pflanzenzellen besitzen die Möglichkeit reltiv einfach NADPH durch Lichtenergie und dem Photosystem 1 (Ferredoxin-NADP + Reduktase) zu generieren. 2

3 Genutzt wird NADPH im Anabolismus z.b. bei der Fettsäure-, Cholesterin- und der Aminosäuresynthese. Weiterhin wird es für viele Cytochrom P450 Hydroxylierungen benötigt, welche häufig biotechnologisch und pharmazeutisch relevante Metabolite erzeugen. Für solche Prozesse stellt NADPH ein mögliches Bottleneck dar. Mögliche Ansätze werden in Abschnitt 3 Ansätze für NADPH Regeneration genannt. 2. CYP-Mechanismus CYP-Enzyme sind Monooxigenase, d.h. bei der Reaktion wird ein Sauerstoffatom eines Sauerstoffmolküls auf ein Substrat übertragen wodurch dieses aktiviert wird (s. Abbildung 3). Zudem entsteht ein Wassermolekül. Für diese Reaktion ist meist NADPH als Elektronentransporter notwendig. Zusätzlich werden hierbei Elektronentransportsysteme benötigt. Die meisten Bakterien nutzen Ferredoxin (Fdx) und Fdx-Reduktasen (FdR), Eukaryoten nutzen dagegen meist eine NADPH- Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (CPR) um die Elektronen vom NADPH zum Substrat zu transportieren. Abbildung 3: CYP-Reaktion 3. Ansätze für NADPH Regeneration Durch die Implementierung von Dehydrogenasen lässt sich parallel zum eigentlichen Prozess NADPH generieren. In einer unabhängigen Nebenreaktion wird hier ein Substrat unter NADPH-Erzeugung umgesetzt. Ein weiterer Ansatz ist die Hochregulierung des Pentosephosphatweges, um so die Produktion von NADPH zu steigern. NADPH könnte durch Einführung von NADH-Kinasen erzeugt werden, wozu jedoch ATP notwendig ist. Des Weiteren gibt es Beispiele für den Einsatz von nichtenzymatischen Mediatoren um Elektronen auf NADP + zu übertragen. 3

4 4. Beispiele für NADPH-Regenerationssysteme 4.1 Janocha, S., & Bernhardt, R. (2013) In diesem Projekt wurden die Einschritthydroxylierung von abietantyp Harzsäuren des CYP105A1 untersucht. Abietinsäure wurde durch 15-Hydroxylierung zu 15-Hydroxyabietinsäure umgesetzt, welche ein Kontaktallergen für Baumharze ist und u.a. in Allergietests eingesetzt wird. In einem Whole- Cell System (E. coli JM109) wurde neben den Elektronentransferproteinen und dem CYP aus eine Alkoholdehydrogenase des Lactobacillus brevis als NADPH Regenerationssystem transformiert, welche Propan-2-ol in Aceton umsetzt. Abbildung 4: Ergebnisse des Umsatzes von Abietinsäure zu 15-Hydroxyabietinsäure. Plasmisde: pacyc_105a1 = CYP105A1 ptwin_pom = Elektronentransferprotein Arh1 und Etp1 PTriple_pom = Arh1, Etp1 und ADH Janocha, S., & Bernhardt, R. (2013). In Abbildung 4 erkennt man eine Umsatzsteigerung von ~ 10 %, welche durch den Einsatz eines Regenerationssystems mit Alkoholdehydrogenase erreicht worden ist. 4.1 Lee, S. H., Kwon, Y.-C., Kim, D.-M., & Park, C. B. (2013) Diese Gruppe hat mittels in vitro Tests eine O-Dealkylierung von 7-Ethoxycoumarin zu 7- Hydroxycoumarin mit dem Enzymkomplex Cytrochrome P450 BM3 (P450 + CPR, Cytochrome P450 Reduktase) durchgeführt. In Abbildung 5 ist die in dem Versuch genutzte Elektronentransportkette. Eosin Y wird durch Lichtenergie angeregt und gibt daraufhin ein Elektron an [Cp*Rh(bpy)H 2 O] ab. Erneut reduziert wird Eosin Y durch Triethanolamin. Das reduzierte [Cp*Rh(bpy)H 2 O] gibt ein Elektron an NADP + ab, welche daraufhin an das Enzym binden kann. [Cp*Rh(bpy)H 2 O] wird hierbei als Mediator eingesetzt um die Formierung von inaktiven NADPH Isomeren und Dimeren zu verhindern. Abbildung 5: Elektronentransportkette. TEOA = Triethanolamine, EY = Eosin Y, M = [Cp*Rh(bpy)H 2 O]. Lee, S. H., Kwon, Y.-C., Kim, D.-M., & Park, C. B. (2013) 4

5 In Abbildung 6 sind die Ergebnisse des Umsatzes in hellen und dunklen Konditionen dargestellt. Im Dunkeln ist kein großer Unterschied des Umsatzes zwischen den Systemen mit und ohne Regenerationssystem zu erkennen. Beide zeigen lediglich eine geringe Anfangsaktivität, welche nach 5 h gesättigt ist. Bei Licht erkennt man eine deutliche Steigerung des Umsatzes im Vergleich zur Kontrolle ohne Regenerationssystem. Abbildung 6: Umsatz von 7-Ethoxycoumarin angegeben in Konzentration von 7-Hydroxycoumarin im Verlauf von 24 h. Lee, S. H., Kwon, Y.-C., Kim, D.-M., & Park, C. B. (2013) 4.1 Hatrongjit, R., & Packdibamrung, K. (2010) Das Ziel dieses Projektes war es eine NAD(P) + -Formiat Dehydrogenase (FDH) zu finden, welche eine hohe Spezifität gegenüber NADP + zeigt. FDHs haben diverse Vorteile wie ein billiges Substrat und ein inertes Produkt (CO 2 ), welches leicht abgeführt werden kann und somit nahezu 100 % Umsetzungsraten erreicht werden können. Zudem sind FDHs in einem breitem ph-bereich (6-9) aktiv. Alle bekannten FDHs zeigen allerdings eine höhere Spezifität gegenüber NAD +. Durch ein Screening von Bodenbakterien konnten fünf Stämme des Burkholderia cepacia Komplexes isoliert werden, welche FDH produzierten die NADP + mit einer Spezifität von ~ 2,6 im Verlgiech zu NAD + bevorzugen. Diese Enzyme zeigen ein gutes Potential für den Einsatz als preiswertes und effizientes NADPH Regenerationssystem. 5. Zusammenfassung NADPH ist als Reduktionsmittel ein wichtiger Kofaktor in vielen biologischen Prozessen in der Zelle, vor allem bei anabolischen Reaktionen. Aufgrund der strikten Reagulation steht für biotechnologische Prozesse mit dem Ziel eines möglichst hohen Ertrages, was in Konkurrenz zum Streben der Zelle nach Wachstum steht, oft nicht genügend NADPH zur Verfügung. Die NADPH Verfügbarkeit stellt daher oft ein Bottleneck in solchen Prozessen dar. Aufgrund des relativ hohen Preises von NADPH ist es nicht wirtschaftlich, es einfach zu supplementieren. Aus diesem Grund ist man auf der Suche nach geeigneten Systemen um NADPH während des Prozesses zu regenerieren. Mögliche Ansätze wurden in dieser Arbeit vorgestellt. Es ist festzuhalten, dass es zu diesem Zeitpunkt noch kein perfektes System gibt. Für jeden Prozess muss ein System ausgewählt und optimiert werden. 5

6 6. Quellen Alberts, B. Johnson, A. Lewis, J. Raff, M. Roberts, K. Walter, P. (2008). Molecular Biology of the Cell, 5th Edition. Perspective. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2007). Stryer Biochemie. Biochemistry textbook. Hannemann, F., Bichet, A., Ewen, K. M., & Bernhardt, R. (2007). Cytochrome P450 systems-biological variations of electron transport chains. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, 1770(3), Hatrongjit, R., & Packdibamrung, K. (2010). A novel NADP+-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis 15516: Screening, purification and characterization. Enzyme and Microbial Technology, 46(7), Janocha, S., & Bernhardt, R. (2013). Design and characterization of an efficient CYP105A1-based wholecell biocatalyst for the conversion of resin acid diterpenoids in permeabilized Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(17), Lee, S. H., Kwon, Y.-C., Kim, D.-M., & Park, C. B. (2013). Cytochrome P450-Catalyzed O-Dealkylation Coupled With Photochemical NADPH Regeneration. Biotechnol. Bioeng, 110(2), Liu, W., & Wang, P. (2007). Cofactor regeneration for sustainable enzymatic biosynthesis. Biotechnology Advances, 25(4), Urlacher, V. B., & Girhard, M. (2012). Cytochrome P450 monooxygenases: an update on perspectives for synthetic application. Trends in Biotechnology, 30(1),